Đồ án tốt nghiệp: Thử nghiệm tạo thức uống probiotic từ nước cam

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:79

Thêm vào BST

Báo xấu

70
lượt xem 10
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đồ án tốt nghiệp này được thực hiện với mục tiêu nhằm tìm ra những điều kiện lên men tốt nhất cho Lactobacillus acidophilus trong môi trường nước ép cam có bổ sung đường và nước, tiến hành tối ưu hóa thực nghiệm tạo sản phẩm thức uống probiotic có giá trị dinh dưỡng và cảm quan thích hợp. Bước đầu xây dựng được quy trình sản xuất thức uống probiotic từ nước ép cam. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đồ án tốt nghiệp: Thử nghiệm tạo thức uống probiotic từ nước cam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM TẠO THỨC UỐNG PROBIOTIC TỪ NƯỚC CAM Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : PGS.TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG Sinh viên thực hiện : BÙI NHỰT TRƯỜNG MSSV: 107111193 Lớp: 07DSH4 TP. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2011
Ngày nay, ngành công nghiệp đồ uống đang có những bước phát triển lớn với nhiều dạng sản phẩm đa dạng hơn cho ra thị trường, nhằm đáp ứng nhu cầu của con người. Thị hiếu hiện nay đặt ra là sản phẩm thức uống không những giúp thỏa mãn nhu cầu giải khát đơn thuần, mà còn đáp ứng nhu cầu về dinh dưỡng, giá trị của thực phẩm chức năng như nâng cao sức đề kháng, chống oxi hóa, hỗ trợ tiêu hóa … Sự lên men của vi khuẩn lactic trong thực phẩm góp phần làm tăng giá trị dinh dưỡng của thực phẩm, hầu hết các dạng sản phẩm này đều không chứa cồn, có vị chua ngọt nhẹ giàu dinh dưỡng và năng lượng. Một trong những thành tựu lớn nhất của công nghệ sinh học hiện nay có thể kể đến probiotic là chế phẩm chứa những “vi sinh vật thân thiện” có lợi cho sức khỏe của con người được sử dụng như một dạng thực phẩm từ rất lâu ví dụ như sữa chua men sống, Amazake truyền thống của người Nhật, Kunumzaki, hoặc sử dụng dưới dạng thương phẩm cốm vi sinh, viên nén … Những “ vi sinh vật thân thiện này” sau khi thâm nhập vào cơ thể người, chúng cư ngụ trong hệ tiêu hóa và một số niêm mạc, chúng có vai trò làm hạn chế sự xâm nhập của các vi khuẩn có hại vào ruột, cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột đồng thời nâng cao khả năng chuyển hóa dinh dưỡng và đào thải bã tốt hơn, điều này giúp nâng cao khả năng đề kháng của cơ thể trước sự tấn công của những vi sinh vật cơ hội gây các bệnh tiêu chảy, nhiễm trùng tiết niệu, viêm ruột hay hội chứng ruột kích thích… Ngoài ra chế phẩm probiotic an toàn và tự nhiên phần lớn không có hại gì cho sức khỏe [17]. Các sản phẩm có chứa probiotic đã được sử dụng tại rất nhiều nước trên toàn thế giới như Mỹ, Nhật, Châu Âu… Probiotic được bổ sung vào rất nhiều sản phẩm như thực phẩm thông thường: sữa chua để ăn, sữa chua lỏng để uống, nước trái cây…đến các thực phẩm bổ sung dành cho người bệnh và dưới dạng thuốc không cần kê toa như viên nén, hay dạng bột… Đã có nhiều nghiên cứu của các nhà khoa học về sản phẩm thức uống Probiotic lên men từ cà chua, nước ép bắp cải, gạo lức, malt, chanh dây … gặt hái được những thành công bước đầu, góp phần làm đa dạng hóa các dạng thực phẩm lên men cho con người [8,9,10,11,12]. Cam là loại cây ăn quả được trồng phổ biến ở nước ta, cam cho quả quanh năm và được sử dụng làm thức uống từ rất lâu. Nghiên cứu cho thấy nước cam có nhiều 1
chất dinh dưỡng hơn các loại nước hoa quả khác như táo, dứa, nho và mận … Nước cam chứa nhiều vitamin C, nhóm B6, kali, folate, thiamin… giúp cơ thể điều hòa thân nhiệt, nâng cao đề kháng, tái sản xuất tế bào, chống oxi - hóa… Trên thị trường hiện nay cũng có nhiều mặt hàng sản phẩm đồ uống được chế biến từ cam đã và đang khẳng định vị thế trên thị trường. Tuy nhiên dạng sản phẩm nước cam bổ sung probiotic vẫn còn khá xa lạ trên thị trường hiện nay [18]. Xuất phát từ những nhu cầu thực tế, việc tạo ra một dạng thức uống probiotic từ nước cam hứa hẹn sẽ mang lại một dạng thức uống có lợi cho sức khỏe, đáp ứng thị hiếu tiêu dùng và góp phần làm đa dạng hóa các sản phẩm probiotic thức uống. 1.1 Nội dung đề tài Chúng tôi tiến hành khảo sát nhằm tìm ra những điều kiện lên men tốt nhất cho Lactobacillus acidophilus trong môi trường nước ép cam có bổ sung đường và nước, tiến hành tối ưu hóa thực nghiệm tạo sản phẩm thức uống probiotic có giá trị dinh dưỡng và cảm quan thích hợp. Bước đầu xây dựng được quy trình sản xuất thức uống probiotic từ nước ép cam. 1.2 Giới hạn đề tài Đề tài chỉ thử nghiệm trong điều kiện quy mô nhỏ ở phòng thí nghiệm chưa thử nghiệm ở quy mô lớn. Do điều kiện trang thiết bị và thời gian thực hiện đề tài quá ngắn nên chưa thể tiến hành khảo sát, lập đường cong sinh trưởng của L.acidophilus trong môi trường trung gian nước cam ép pha loãng có bổ sung đường sucrose và cao nấm men. 2
2.1 Giới thiệu chung về Probiotic Probitotic trong tiếng Hy Lạp cổ có nghĩa là “vì sức sống”. Kể từ lúc được phát hiện ra vào đầu thế kỷ 20 bởi nhà bác học đoạt giải nobel người Nga Elie Matchnikoff đến nay probiotic đã được coi như một loại “thần dược” tự nhiên. Khái niệm về probiotic phát triển theo nhiều thời gian. Lily và Stillwell (1965) đã trước tiên mô tả probiotic như một dạng hỗn hợp được tạo thành bởi một động vật nguyên sinh có tác động thúc đẩy sự phát triển của đối tượng khác. Sau đó, Parker (1974) đã áp dụng khái niệm này cho mảng chăn nuôi gia súc là “sự ảnh hưởng tốt đối với cơ thể vật chủ bằng việc góp phần vào cân bằng hệ vi sinh vật trong ruột của nó”. Khái niệm “probiotic” được ứng dụng để mô tả “cơ quan và chất” mà góp phần vào cân bằng hệ vi sinh vật ruột. Định nghĩa chung này sau đó được làm chính xác hơn bởi Fuller (1989), ông định nghĩa probiotic như “một chất bổ trợ thức ăn chứa vi sinh vật sống có lợi đến vật chủ bằng việc cải thiện cân bằng hệ vi sinh vật ruột của nó”. Khái niệm này sau đó được phát triển xa hơn nhờ Havenaar va Huis Int Veld (1992) “ probiotic là một hoặc nhiều sự kết hợp các vi sinh vật sống, ảnh hưởng có lợi đến vật chủ bằng việc hoàn thiện hệ vi sinh vật đường ruột”. Vi khuẩn Bifidobacterium và vi khuẩn Lactobacillus có trong hệ vi sinh đường ruột tiêu biểu cho probiotic. Hai loại vi khuẩn này từ lâu đã được Nhật bản và châu Âu sử dụng trong kỹ nghệ sản xuất sữa chua lên men. Tại Hoa Kỳ, trên 60% Yogurt có chứa Bifidobacterium và Lactobacillus. Trong kỹ nghệ Yogurt, các probiotic thường được thấy sử dụng: Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Lactobacillus acidophilus và Lactobacillus casei. Qua các nghiên cứu về probiotic thì Biﬁdobacteria và Lactobacilli là 2 chi được sử dụng rộng rãi nhất nhờ khả năng lên men sinh acid mạnh trên nhiều loại cơ chất khác nhau. Bên cạnh đó nấm men S.cerevisia , một vài vi khuẩn E.coli và Bacillus spp cũng là những dạng được sử dụng. Điều đáng quan tâm nữa là muốn đạt hiệu quả khi sử dụng các chế phẩm probiotic thì lượng vi sinh vật có lợi này phải tồn tại được trong hệ tiêu hóa ở một số lượng nhất định. Trở ngại thường gặp phải là acid của dịch vị tiêu hóa có thể hủy diệt 3
tới 90% probiotic đã được ăn vào do đó cần tiêu thụ một số lượng thật lớn probiotic để bù đắp số probiotic mất mát. Tiêu chí để đánh giá một chế phẩm probiotic được sử dụng hiệu quả cho cơ thể gồm:  Có khả năng sống sót qua đường tiêu hóa nghĩa là chịu được acid và dịch tiêu hóa dạ dày.  Có khả năng kết dính trên bề mặt biểu mô ruột và tồn tại lâu dài trong đường tiêu hóa người.  Có hoạt tính đối kháng chống lại các vi sinh vật gây bệnh như Escherichia coli, Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Helicobacter pylori  Kích thích miễn dịch nhưng không gây viêm.  Kháng đột biến và kháng ung thư (Mattila et al, 2002). 2.2 Cơ chế hoạt động của probiotic 2.2.1 Bám kết trên biểu mô ruột Trước hết muốn đến được biểu mô ruột chúng phải vượt qua được dạ dày, tức là phải có khả năng chịu được pH thấp và các men tiêu hóa, sau đó là gắn vào các vị trí của biểu mô, vi khuẩn probiotic sẽ tạo thành một lớp “đệm” vi khuẩn nằm trên các biểu mô ruột, cạnh tranh thức ăn và vị trí dính bám đối với những vi sinh vật. 2.2.2 Sinh các chất kháng vi sinh vật Khả năng tổng hợp các chất kháng vi sinh vật như bacterioxin, acid lactic, H2O2… Quan trọng hơn cả là khả năng sinh bacteriocin của probiotic, bacteriocin là nhóm peptide hoặc protein được tổng hợp nhờ Ribosome và có hoạt tính kháng vi sinh vật rất cao (Cotter et al., 2005). Các loài vi sinh vật có hoạt tính Probiotic được trình bày ở bảng 2.1 4
Bảng 2.1 Các loài vi sinh vật có hoạt tính Probiotic Lactobacillus Bifidobacteri vi khuẩn lactic Không phải vi khuẩn lactic um khác L. acidophilus B.adolescenti Enterococcus Bacillus cereus var. Toyoi L. amylovorus s faecalis Escherichia coli Nissle 1917 L. casei B. animalis Enterococcus Propionibacterium L. cripatus B. bifidum faecium freudenreichii L. delbrueckii B. breve Lactococcus Saccharomyces cerevisiae subsp.Bulgaric B. infantis lactis Saccheromyces boulardii us B. lactis Leuconostoc L. gallinarum B. Longum mesenteroides L. gasseri Pediococcus L. johnsonii acidolactici L. paracasei Streptococcus L. plantarum thermophilus L. reuteri Sporolactobacil L. rhamnosus lus inulinus [20]. 2.2.3 Hoạt tính kích thích điều hòamiễn dịch và các hoạt tính khác Vi khuẩn probiotic có khả năng huy động tế bào miễn dịch, hoạt hóa các đáp ứng miễn dịch thích hợp nhờ một cơ chế phức tạp bắt đầu bằng sự tương tác giữa các tề bào probiotic và tế bào của hệ miễn dịch. Nhiều nghiên cứu gần đây còn cho rằng probiotic có tác dụng kháng đột biến và kháng ung thư nhờ sự tương tác của các tế bào này với các tác nhân gây đột biến và ung thư [20]. 2.3 Những ứng dụng và lợi ích của probiotic 2.3.1 Có khả năng kháng ung thư và chống các yếu tố đột biến Nhiều nghiên cứu đã cho thấy vi khuẩn probiotic có thể làm giảm nguy cơ ung thư ruột kết và ung thư bàng quang. Ngoài ra có tác dụng khử chất độc gây ung thư có trong cơ thể và làm chậm sự phát triển của các khối u bướu. Cơ chế này đã được nghiên cứu và kết luận rằng nhờ khả năng gắn kết và phân hủy được các chất gây ung thư. Sản xuất các hợp chất kháng ung thư : sinh ra những acid yếu có lợi cho đường ruột như acid butyric có vai trò giảm tạo ra những chất gây ung thư trong đường ruột và kích thích các tế bào niêm mạc ruột bị tổn thương mau lành và hồi phục chức năng. Điều hòa những enzyme gây tiền chất ung thư ruột như các enzyme phân 5
(nitroreductase, β-glucuronidase) có khả năng chuyển các chất tiền sinh ung thư thành chất gây ung thư trong trực tràng. Ức chế khối u bằng một cơ chế đáp ứng miễn dịch. Tuy nhiên, những vấn đề vẫn còn giới hạn trong mô hình in vitro, việc mở rộng ra trên người để dự phòng ung thư còn là vấn đề đang tranh cãi. Hình 2.1 Những tác động của probiotic [16 ]. 2.3.2 Kiềm hãm vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa Probiotic kìm hãm sự phát triển của mầm bệnh và cải thiện hệ thống miễn dịch của dạ dày và giảm nguy cơ nhiễm một số mầm bệnh phổ biến như Salmonella và Shigella. Để có thể tác động lên hệ sinh thái vi khuẩn đường ruột thì điều khá quan trọng đó là probiotic phải có khả năng chống lại các vi khuẩn gây bệnh bằng cách tiết ra các kháng khuẩn hay là những chất cạnh tranh. Tác động của probiotic đến hệ vi sinh vật đường ruột được mô tả như sau :  Cạnh tranh dinh dưỡng cần thiết cho sự sống sót của mầm bệnh.  Cạnh tranh với các nguồn bệnh để ngăn chặn sự bám dính của chúng vào đường ruột. Vị trí nào được các vi khuẩn probiotics gắn kết thì các độc tố đường ruột bị ngăn chặn.  Vi khuẩn probiotic tạo ra các chất đa dạng ức chế cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương. Những hợp chất này có thể làm giảm không chỉ những vi 6
sinh vật mang mầm bệnh có thể sống được mà còn ảnh hưởng đến sự trao đổi chất của vi khuẩn và sự tạo ra các độc tố.  Qua nghiên cứu cho thấy các kháng sinh và chất cạnh tranh thường thấy ở các chủng probiotic là: bacteriocin, hydrogen peroxide, acid hữu cơ (acid lactic, acid acetic), diacetyl. Điều này được thực hiện bằng cách giảm pH khoang ruột thông qua sự tạo ra các acid béo chuỗi ngắn dễ bay hơi, chủ yếu là acetate, propionate, và butyrate, nhất là acid lactic. 2.3.3 Cải thiện việc sử dụng lactose ở những người không dung nạp được lactose: Sự không dung nạp đường lactose (có nhiều trong sữa) xảy ra khá phổ biến ở nhiều người, gây ra sự đầy hơi, khó tiêu khi hấp thu thực phẩm có chứa đường lactose. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy một số chủng vi khuẩn lên men acid lactic trong sản phẩm sữa lên men có thể cải thiện các triệu chứng kháng đường lactose của cơ thể bằng cách cung cấp men lactase cho đường ruột và dạ dày. Sử dụng các thực phẩm có chứa các chủng vi khuẩn này giúp cải thiện rõ rệt khả năng tiêu hóa đường lactose. 2.3.4 Làm giảm cholesterol trong huyết thanh : Probiotic có tác dụng làm giảm nồng độ cholesterol trong huyết thanh, làm giảm huyết áp cao. Ngoài ra, giúp nhanh chóng bình phục sau khi mắc các bệnh tiêu chảy và sử dụng nhiều kháng sinh. 2.3.5 Kích thích hệ thống miễn dịch : Thực phẩm chức năng probiotic có thể góp phần cải thiện hệ thống miễn dịch của cơ thể, làm tăng hàm lượng globulin. Sự hấp thụ thực phẩm probiotic đối với người ốm và trẻ nhỏ cải thiện rõ rệt sức đề kháng của cơ thể. Tăng cường hiệu quả của một số vaccin như vaccin thương hàn. Những cải thiện hệ miễn dịch bởi probiotic gồm tăng cường hoạt động của đại thực bào, nâng cao khả năng thực bào của sinh vật hay nguồn carbon. Tăng khả năng sản xuất kháng thể thường là loại IgG và IgM và interferon (nhân tố kháng virus không đặc hiệu). Tăng cường khả năng định vị kháng thể trên bề mặt ruột thường là IgA. 7
2.3.6 Các tác dụng khác : Probiotic còn có một số tác dụng khác như giảm tác dụng phụ của kháng sinh, giảm nhiễm trùng đường niệu ở người. Đối với việc sử dụng probiotic trong chăn nuôi còn mang lại hiệu quả cao nhờ có khả năng tăng trọng ở gia cầm, giảm tỉ lệ mắc các bệnh do nhiễm trùng và tiêu chảy ở động vật non. Bảng 2.2 : Tác dụng lâm sàng của một số chủng probiotic Chủng Tác dụng lâm sàn trên người Lactobacillus rhamrosus GG Giảm hoạt tính enzyme phân, giảm tiêu chảy do (ATCC 53103) kháng sinh ở trẻ em, điều trị và dự phòng rotavirus và tiêu chảy cấp ở trẻ em, điều trị tiêu chảy tái phát do Clostridium difficile, kích thích miễn dịch, giảm nhẹ triệu chứng viêm da không điển hình ở trẻ em. Lactobacillus johnsonii Cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, tăng cường (acidophilus) LJ-1 (La1) miễn dịch, hỗ trợ điều trị Helicobacter pylori. Bifidobacterium lactis Bb-12 Dự phòng tiêu chảy , điều trị tiêu chảy do virus, kể cả rotavirus, cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, cải thiện tình trạng táo bón, kích thích hệ miễn dịch, giảm nhẹ triệu chứng viêm da không điển hình ở trẻ em. Lactobacillus reuteri Rút ngắn thời gian bị tiêu chảy do rotavirus ở trẻ (BioGaia Biologics) em, điều trị tiêu chảy cấp ở trẻ em, an toàn và dung nạp tốt ở bệnh nhân trưởng thành HIV dương tính. Lactobacillus casei Shirota Cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, giảm hoạt tính enzyme phân, có tác động tích cực đối với ung thư mặt bàng quang và ung thư cổ tử cung, không ảnh hưởng tới hệ miễn dịch của người khỏe mạnh. Lactobacillus plantarum Cân bằng hệ vi sinh đường ruột, tăng hàm lượng DSM9843 (299v) acid béo mạch ngắn trong phân. Saccharomyces bourlardii Dự phòng tiêu chảy do kháng sinh, điều trị viêm ruột kết do Clostridium difficile, dự phòng tiêu chảy cho bệnh nhân sử dụng dinh dưỡng qua ống. 8
Chủng trong sữa chua Không có tác dụng trên tiêu chảy do rotavirus, (Streptococcus thermophilus hay không có hiệu ứng tăng cường miễn dịch khi bị L. Delbrueckii subsp bulgaricus) tiêu chảy do rotavirus, không có tác dụng lên hoạt tính enzyme phân. [19]. 2.4 Tổng quan về quá trình lên men lactic 2.4.1 Tổng quan về các vi khuẩn lên men lactic phổ biến Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn lên men lactic thuộc họ Lactobacterium, là vi khuẩn Gram (+). Đây là những trực khuẩn hoặc cầu khuẩn, đa số không sinh bào tử, thường không chuyển động và kị khí tùy tiện, vi hiếu khí, chúng không chứa cytochrom và enzyme catalase, chúng có khả năng sinh tổng hợp enzyme peroxydase rất mạnh, phân giải H2O2 để phát triển. Đa số chúng lên men được mono và disaccharide, một số không lên men được saccharose, đường maltose. Các vi khuẩn lactic không có khả năng lên men tinh bột và các polysaccharide khác (chỉ có loài L. delbruckii là đồng hóa được tinh bột). Vi khuẩn lactic thường có dạng hình cầu, hình oval và hình que, đường kính của dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5-1,5 μm, các tế bào hình cầu xếp thành từng cặp hoặc chuỗi có chiều dài khác nhau. Kích thước tế bào trực khuẩn lactic từ 1-8 μm, trực khuẩn thường đứng riêng lẻ hoặc kết thành chuỗi. Các loài vi khuẩn lactic có khả năng rất khác nhau tạo thành acid trong môi trường và sức chịu đựng acid cũng khác nhau. Đa số các trực khuẩn lactic đồng hình tạo thành acid cao hơn (khoảng 2- 3,5 %), liên cầu khuẩn (khoảng 1%). Các trực khuẩn này có thể phát triển được ở pH = 3- 4, còn cầu khuẩn không thể phát triển được ở môi trường này. Hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn lactic ở vùng pH = 5,5 - 6. Đa số vi khuẩn lactic (đặc biệt là trực khuẩn đồng hình) rất kén chọn thành phần dinh dưỡng, chúng chỉ phát triển khi trên môi trường có tương đối đầy đủ các yếu tố dinh dưỡng cần thiết như acid amin, peptide, protein, vitamin (B1, B2, B6, PP) các acid pantotenic và acid folic Phân loại vi khuẩn lactic hiện nay chưa hoàn thiện và còn nhiều tranh cãi, chủ yếu phân loại dựa theo hình dáng tế bào. Thí dụ: cầu khuẩn xếp các giống 9
Streptococcus và Leuconostoc, còn trực khuẩn xếp thành một giống Lactobacillus 2.4.1.1 Lactobacillus Lactobacillus là vi khuẩn có tự nhiên trong miệng , đường ruột, và cả trong âm đạo của con người, đây là loại vi khuẩn có khả năng lên men tạo axit lactic rất mạnh và khả năng phát triển trong môi trường axit rất tốt. Vi khuẩn này có khả năng sản xuất các enzyme phá vỡ các thành phần trong các sản phẩm sữa rất tốt do sinh enzyme có hoạt lực protease cao. Lactobacillus là tên một giống vi khuẩn, giống này có nhiều loài như Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus sporogenes, Lactobacillus kefir... Các vi khuẩn này có nhiệm vụ biến đổi chất xơ thực phẩm, thức ăn chưa tiêu hóa hết ở ruột non thành acid lactic, acetic, butyric, hàng loạt vitamin, acid amin, men, hormon và các chất dinh dưỡng quan trọng khác. Nó cũng sinh ra các khí như NH 3, CO2, H2S… Quá trình biến đổi đó gọi chung là quá trình lên men, mà nhờ nó thức ăn được tiêu hóa hoàn toàn. Lactobacillus bulgaricus: lên men đồng hình, là trực khuẩn tròn đôi khi ở dạng hạt, thường kết thành chuỗi dài, Gram (+), không có khả năng di động. Chúng có khả năng lên men được các loại đường glucose, lactose, galactose, không lên men được sacaroza, xylose, arabinose, sorbose, dulcitol, mannitol, dextrin, inulin. Chúng không có khả năng tạo ra nitrit từ nitrate. Đây là giống ưa nhiệt, nhiệt độ tối thích cho phát triển là 40 – 450C, tối thiểu là 15 – 200C, tạo thành acid mạnh. Hình 2.1 Vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus [22]. Lactobacillus casei: lên men lactic đồng hình, trực khuẩn nhỏ, Gram (+), thường gặp ở dạng chuỗi dài hoặc ngắn, tích tụ tới 1,5% acid. Chúng không có khả năng 10
chuyển động. Có khả năng lên men được các loại đường glucose, fructose, galactose, maltose, lactose, salicin. Trong quá trình lên men chúng tạo ra D – acid lactic. Nhiệt độ tối thích cho phát triển là 38 – 400C, nhờ có hoạt tính protease nên có thể phân huỷ protein trong sữa thành acid amin. Lactobacillus lycopersici: lên men lactic dị hình, là trực khuẩn Gram (+), sinh hơi, trong thiên nhiên chúng tồn tại thành từng đôi một, có khả năng tạo bào tử. Trong quá trình lên men đường, chúng tạo ra cồn, acid lactic, acid acetic và CO2. Ngày nay chúng được coi như các biến chủng của Lactobacillus brevis [3]. Hình 2.2 Vi khuẩn Lactobacillus casei [22]. Lactobacillus pasteurianus: là trực khuẩn Gram (+), có kích thước rộng: 0.5 – 1,0µm, dài: 7,0 – 35µm. Trong thiên nhiên chúng tồn tại riêng lẻ, không di động. Chúng có khả năng lên men được arabinose, glucose, fructose, galactose, maltose, saccharose, rafinose, trehalose, manitol, dextrin. Trong quá trình lên men chúng tạo ra một loạt sản phẩm như: CO2, alcohol, acid lactic, acid acetic, acid formic. Nhiệt độ thích hợp từ 29 – 330C. Lactobacillus bifidus: trực khuẩn rất nhỏ, thuộc loại Gram (+). Chúng không có khả năng di dộng, có khả năng lên men được các loại đường glucose, fructose, galactose, saccharose, inulin, dextrin. Nhiệt độ phát triển tốt nhất của vi khuẩn này là 370C. Lactobacillus causaciccus: trực khuẩn Gram (+) ngắn, không có khả năng chuyển động, có khả năng lên men các loại đường glucose, fructose, mannose, galactose, maltose, lactose, mannitol. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 48 – 500C. 11
Lactobacillus delbruckii: trực khuẩn dài Gram (+), có kích thước rộng: 0,5µm – 0,8µm, dài: 2,0 – 9,0µm, không di động. Chúng có khả năng lên men các loại đường glucose, maltose, fructose, galactose và dextrin, chúng không có khả năng lên men xylose, arabinose, rhamnose, lactose, raffinose, trehalose, inulin. Lactobacillus brevis: lên men lactic dị hình, là loại trực khuẩn Gram (+), không có khả năng di động, có kích thước rộng: 0,7 – 1,0µm, dài: 2,0 – 4,0µm, tìm thấy chủ yếu trong muối chua bắp cải, rau cải, dưa chuột, vì vậy nó còn được gọi là trực khuẩn bắp cải. Trong thiên nhiên chúng thường liên kết với nhau thành chuỗi. Trong quá trình phát triển chúng có thể sử dụng lactate canxi như nguồn cung cấp carbon. Chúng có khả năng lên men các loại đường arbinose, xylose, gluxose, fructose, galactose, maltose. Trong lên men ngoài acid lactic (1,2%), nó còn tạo thành acid acetic, rượu etylic (2,4%), CO2, nó còn tạo hương làm cho sản phẩm có hương vị dễ chịu. Nhiệt độ phát triển tối đa là 300C, vi khuẩn này có nhiều trong sữa, kefir, dưa chua… Hình 2.3 Vi khuẩn Lactobacillus brevis [23]. Lactobacillus leichmannii: trực khuẩn Gram (+). Trong tự nhiên chúng có khả năng tạo thành chuỗi ngắn, kích thước tế bào từ 0,6 – 2,0µm. Chúng có khả năng lên men glucose, fructose, maltose, saccharose, trehalose và không có khả năng lên men lactose, galactose, raffinose, arabinose, rhamnose, dextrin, inulin. Trong quá trình lên men, chúng tạo ra L – acid lactic, không có khả năng tạo nitrit từ nitrat. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 360C. Lactobacillus helveticcus: trực khuẩn, có kích thước rộng: 0,7 – 0,9µm, dài: 2,0 – 6,0µm. Trong thiên nhiên chúng có thể tồn tại riêng lẻ từng tế bào, cũng có thể tạo 12
thành chuỗi tế bào. Chúng có khả năng lên men các loại đường glucose, fructose, galactose, mannose, maltose, lactose. Nhiệt độ phát triển từ 40 – 420C. Vi khuẩn này được sử dụng nhiều trong sản xuất sữa chua và pho mai cứng. Lactobacillus thermophilus: là trực khuẩn gram (+), kích thước tế bào 0,5 – 3,0µm, không có khả năng di động. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 300C, có thể chịu được nhiệt độ 65 – 750C. Vi khuẩn này được sử dụng nhiều trong sản xuất sữa chua và pho mai. Lactobacillus plantarum: trực khuẩn gram (+), kích thước tế bào rộng: 0,7 – 1µm, dài: 3 – 8µm. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 300C, có khả năng chịu được nồng độ NaCl 5,5%. Vi khuẩn này được dùng nhiều trong chế biến sữa. 2.4.1.2 Leuconostoc Leuconostoc gồm những liên cầu khuẩn lên men lactic đồng dạng, lên men đường sinh acid lactic và 1 lượng lớn acid acetic, cồn etylic và khí CO2. Khả năng của 2 loài Leuconostoc dextranicium và Leuconostoc citrovorum lên men acid citric của sữa với sự sản sinh chất có mùi thơm diacetyl và khả năng kích thích liên cầu khuẩn lactic làm cho chúng được đem dùng vào giai đoạn đầu của chế biến bơ và phomai. Một số đặc trưng của giống Leuconostoc cho nó vị trí quan trọng trong thực phẩm như: Sản sinh diacetyl, sự chịu đựng của những nồng độ muối cao làm cho Leuconostoc mesenteriodes được đem dùng ở giai đoạn đầu của sự lên men lactic. Sự chịu đựng được ở những nồng độ đường cao đến 55 – 60% (đối với Leuconostoc mesenteriodes) làm cho vi khuẩn có thể phát triển trong xiro bán lỏng và kem đá… sản sinh ra nhiều thán khí từ đường làm hư hỏng 1 số loại phomai, xiro. 13
Hình 2.4: Vi sinh vật thuộc nhóm Leuconostoc [24]. 2.4.1.3 Streptococcus Streptococcus cremoris: là tế bào hình cầu và kết thành chuỗi dài, ưa ấm và tạo ít acid trong môi trường. Nhiệt độ thích hợp cho phát triển là 250C, tối thiểu là 100C, tối đa là 36 – 380C. Streptococcus thermophilus: có dạng hình cầu, kết thành chuỗi dài, phát triển tốt ở nhiệt độ 40 – 450C, tích tụ khoảng 1% acid. Streptococcus falcalis: là tế bào Gram (+), chúng thường tạo thành chuỗi tế bào hình cầu, có khả năng chịu được nồng độ NaCl 5%, có khả năng lên men đường glucose, maltose, lactose, trehalose, silicin, sorbitol [4]. Streptococcus diacetylactis còn được gọi là Pneumococci, là cầu khuẩn Gram (+), xếp từng đôi hay thành chuỗi, có vỏ bằng polysaccharide. Pneumococci dễ bị ly giải bởi những chất hoạt động bề mặt như muối mật. 2.4.1.4 Bifidobacterium Bifidobacteria là vi khuẩn gram dương, không di động, kị khí bắt buộc . Bifidobacterium không di động, không sinh bào tử, hình que với nhiều dạng khác nhau như dạng cong, dạng móc câu, hình gậy đánh gôn, dạng phân nhánh và cũng thường có dạng chữ Y. Các tế bào vi khuẩn Bifidobacteria thường đứng riêng lẻ, xếp thành cặp hoặc xếp thành chữ V. Kích thước tế bào khoảng 0,5 – 1,3mm. Bifidobacterium có dạng hình que chẻ đôi hoặc que phân nhiều nhánh và dưới điều kiện tăng trưởng khác nhau thì các tế bào sẽ có hình dạng khác nhau ( Tisser, 1990). Khi sử dụng N- Acetyl D – Glucosaminde, alamine, acid aspartic, acid 14
glutamic, serin, ca2+ trong môi trường nuôi cấy sẽ ảnh hưởng đến hình dạng của tế bào vi khuẩn Bifidobacteria. Tế bào Bifidobacteria không có vỏ bao và không có hệ thống tiêm mao bao quanh . Vách tế bào cấu tạo bởi 3 phần chính  Peptidoglycan  Polysaccharide  Acid lipotechoic Peptidoglycan của vi khuẩn Bifidobacteria được cấu tạo từ acid N- acetylmuramic và N- acetylglucosamine. Các phân tử này kết hợp với nhau tạo thành chuỗi oligopeptide. Ngoài ra , vách tế bào vi khuẩn Bifidobacteria còn chứa nhiều polysaccharide gồm các phân tử đường glucose, galactose, rhamnose… liên kết với nhau (Lauer và Kandler,1983). Bifidobacterium cư trú trong ruột của cơ thể người và động vật. chúng đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh pH ở ruột và kết tràng . Chúng được phát hiện trong phân của trẻ sơ sinh còn bú sữa mẹ. Tính ổn định của loài vi khuẩn này tỷ lệ nghịch với độ tuổi, tuổi càng lớn thì lượng vi khuẩn càng giảm. Lượng vi khuẩn Bifidobacteria trong cơ thể bị tác động bởi nhiều yếu tố như thức ăn, nước uống, tình trạng sức khỏe và việc sử dụng kháng sinh. Nhiệt độ tối ưu cho Bifidobacterium phát triển là 37 – 41oC. Tế bào không tăng trưởng ở nhiệt độ dưới 20oC và trên 46oC. Tuy nhiên Bifidobacterium Themacidophilum có khả năng phát triển ở nhiệt độ 49,5oC. Phần lớn các chủng có nguồn gốc từ động vật đều có khả năng phát triển ở 45 oC. Riêng các chủng có nguồn gốc từ người thì không có khả năng phát triển ở nhiệt độ này. pH tối ưu cho sự phát triển nằm khoảng 6,5 – 7. Tế bào vi khuẩn Bifidobacteria không tăng trưởng ở pH thấp hơn 4,5 và pH trên 8,5. Ngoại trừ Bifidobacterium thermacidophilum có thể tăng trưởng ở pH 4. Bifidobacterium là loài chịu được acid nhưng không phải là loài ưa acid. 2.4.1.5 Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Lactobacillus acidophilus là trực khuẩn dài hình que, Gr+, không sinh bào tử, lên men lactic đồng hình. Trực khuẩn này được phân lập từ ruột trẻ em và bê mới đẻ. Một số chủng có khả năng tạo thành màng nhầy. Trong thiên nhiên chúng tồn tại 15
riêng lẻ, đôi khi chúng tạo thành những chuỗi ngắn, có khả năng chuyển động, có khả năng lên men 1 số loại đường glucose, fructose, galactose, mannose, maltose, lactose, saccharose để tạo ra acid lactic và hoàn toàn không có khả năng lên men xylose, arabinose, rahamnose, glycerol, sorbitol, dulcitol, inositol. Trong quá trình lên men chúng tạo ra cả 2 dạng đồng phân quang học của acid lactic. Trong sữa nó có thể tích tụ tới 2,2% acid [4]. Lactobacillus acidophilus thuộc:  Giới: Bacteria  Ngành: Fermicutes  Lớp: Bacilli  Bộ: Lactobacillilales  Họ: Lactobacillaceae  Giống: Lactobacillus [4]. Lactobacillus acidophilus có thể phát triển ở nhiệt độ cao như 450C nhưng tối ưu là 35-400C. với pH tối ưu từ 5,5-6. Chúng có những yêu cầu phát triển phức tạp như yêu cầu áp lực oxygen thấp, có thể lên men carbohydrate, protein và các phần tử bị phá vỡ từ các chất này, một số vitamin và khoáng như B-complex, acid nucleic, Mg, Mn, Fe cần cho sự phát triển. Lactobacillus acidophilus phát triển ở pH < 3,5 và lên men trong điều kiện yếm khí. Lactobacillus acidophilus thiếu cytochrome, prophyrin, những enzyme hô hấp nó sẽ không thể thực hiện quá trình phosphoryl hóa hoặc hô hấp. Vì vậy, nó sử dụng đường như một cơ chất cho sự lên men và sống được ở môi trường phong phú đường. Mỗi phân tử glucose trải qua sự lên men của Lactobacillus acidophilus tạo ra năng lượng là 2ATP. Ngoài glucose, Lactobacillus acidophilus còn sử dụng aesculin, cellobiose, galactose, lactose, maltose, salicin, sucrose và trehalose cho sự lên men [4]. 16
Hình 2.5 Hình thái Lactobacillus acidophilus [24]. 2.4.2. Cơ sở sinh hóa của quá trình lên men lactic. Đầu tiên, đường sẽ được vi khuẩn lactic đưa vào bên trong tế bào nhờ cơ chế vận chuyển đặc trưng của màng tế bào. Nếu phân tử đường là đường đơn như glucose thì sẽ vào thẳng chu trình chuyển hóa, còn nếu phân tử đường là đường đôi hay các dạng đường khác thì sẽ bị thủy phân thành các monosaccharide sau đó mới vào chu trình chuyển hóa. Sau đó, phân tử đường này sẽ đi vào chu trình chuyển hóa khác nhau và cuối cùng cho sản phẩm là acid lactic, acid acetic, CO2,… Dựa vào sản phẩm tạo thành của quá trình lên men, mà người ta chia chúng ra hai nhóm là vi khuẩn lactic lên men đồng hình hay vi khuẩn lactic lên men dị hình. Trường hợp lên men lactic đồng hình: quá trình lên men tạo acid lactic theo chu trình Embden-Meyerhorf (con đường EMP). Trong tế bào vi khuẩn lên men lactic đồng hình có đủ enzyme carboxylase, do vậy pyruvate không bị phân giải sâu hơn, mà thay vào đó nó nhận hydro được tách ra và chuyển tới pyruvate để tạo thành acid lactic. Lượng acid lactic tạo thành chiếm hơn 90% sản phẩm, chỉ một phần nhỏ pyruvate còn lại bị khử cacbon chuyển thành acid acetic, ethanol, CO2 và acetone,… Các chủng vi sinh vật được sử dụng trong lên men đồng hình như: Lactobaterium casei, Lactobacterium cremoris, Lactobacterium bulgaricus, Lactobacterium delbruckii… C6H12O6 → CH3-CO-COOH → CH3-CHOH-COOH + Năng lượng 2ATP (glucose) (acid lactic) Trường hợp lên men lactic dị hình: xảy ra khi vi khuẩn lactic không có đủ các enzyme cơ bản của chu trình EMP là andolase và trizaphosphattizomerase. Do không theo con đường EMP nên chúng chuyển hóa theo con đường Pentose- 17
Phosphate ở giai đoạn đầu, từ glucose-6-phosphate, 6-phosphoglucose và ribuloae-5- phosphate dưới tác dụng của enzyme epimerase chuyển thành xilulose-5-phosphate. Xilulose-5-phosphate sẽ đi theo hai con đường chuyển hóa khác nhau, Chỉ có khoảng 50% lượng đường tạo thành acid lactic, ngoài ra còn có các sản phẩm phụ khác nhau như acid acetic, ethanol, CO2, các sản phẩm phụ tương tác với nhau tạo thành ester có mùi thơm  Xilulose-5-phosphate sẽ được chuyển hóa tiếp thành glyceraldehydes - 3-phosphate. Sau đó bị thủy phân tiếp theo con đường EMP để tạo thành acid lactic.  Xilulose-5-phosphate bị thủy phân tiếp theo một con đường khác để tạo acetyl phosphate. Sau đó, dưới tác dụng của acetatkinase sẽ tạo thành acetate hoặc bị khử tiếp thành acetaldehyde rồi thành ethanol, acid acetic, CO2,… C6H12O6 → CH3-CHOH-COOH + HOOC-CH2-CH2-COOH + CH3-COOH (glucose) (acid lactic) (acid sucxinic) (acid acetic) + CH3-CH2OH + CO2 +H2 (ethanol)  Lượng sản phẩm phụ của quá trình lên men dị lactic như sau: acid lactic chiếm 40% (thấp hơn nhiều so với lên men lactic đồng hình), acid sucxinic chiếm 20%, ethanol chiếm 10%, acid acetic chiếm 10% và khoảng 20% còn lại là các loại khí [3]. 2. 5 Sơ lược về tình hình nghiên cứu thực phẩm probiotic trong và ngoài nước 2.5.1 Tình hình nghiên cứu trong nước Có nhiều công trình nghiên cứu về probiotic, tuy nhiên chưa có định hướng dưới dạng phát triển sản phẩm thực phẩm .Vì vậy các nghiên cứu về các chủng vi khuẩn probiotic trong thực phẩm còn nhiều hạn chế, các nghiên cứu gần đây có thể kể gồm: Nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng Hà và cộng sự (2002) đã dử dụng 2 chủng vi khuẩn lactic là Bifidobacterium bifidum và Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế phẩm probiotic. Nhóm nghiên cứu của tác giả Trần Thanh Thủy (2003) xây dựng thành công quy 18
trình công nghiệp chế biến sắn thành đồ uống lên men lactic và có giá trị dinh dưỡng, cảm quan thích hợp. Sau khi xử lý sắn thành dịch đường tác giả bổ sung nấm men, sự tương tác giữa lượng đạm sinh khối nấm men với lượng đường trong dịch lên men ở áp suất cao tạo điều kiện cho phản ứng melanoid xảy ra nhờ đó màu sắc và hương vị của sản phẩm được cải thiện. Chủng vi sinh vật được sử dụng là pediococcus pentsaceus B và pediococcus pentosaceus KC4. Tuy nhiên sản phẩm này không bảo quản được lâu, chỉ trong 2 ngày ở nhiệt độ lạnh 4 - 6oC. Tác giả Lê Hà Vân Thư (2008), trường Đại Học Bách Khoa TP.HCM đã thực hiện đề tài “ Nghiên cứu quy trình tạo thức uống lên men lactic từ gạo lức” kết quả đạt được là tạo được sản phẩm lên men từ gạo lức với chủng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus, lượng tế bào vi khuẩn khoảng 107 - 108 cfu/ml, bảo quản tốt trong điều kiện 4- 6oC trong 4 tuần [10]. Tác giả Nguyễn Hoài Phương (2010) thực hiện đề tài “ Thử nghiệm tạo thức uống probiotic từ dịch malt” kết quả đạt được là tạo ra được dạng thức uống chua ngọt nhẹ, hàm lượng tế bào vi khuẩn Bifidobacterium bifidum khoảng 108 – 109 cfu/ml, sản phẩm bảo quản tốt trong 4 tuần ở nhiệt độ 4-6oC [8]. 2.5.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước Năm 2004 ,Yong D Hang và cộng sự đã thành công trong việc tạo ra thức uống Probiotic từ nước ép cà chua nhờ vi khuẩn lactic, nguyên liệu nước ép cà chua được lên men bởi bốn vi khuẩn lactic là Lactobacillus aciddophilus, Lactobacillus plantarum C3, Lactobacillus casei A4 và Lactobacillus D7 delbrueckii quá trình lên men ở nhiệt độ 30oC trong 24 giờ, những biến đổi về pH , lượng acid lactic sinh ra, hao hụt lượng đường luôn được kiểm soát liên tục bằng các thiết bị đo. Kết quả số tế bào đạt gần 1-9.109 cfu/ml trong thời gian lên men 72 giờ [13]. Đến 2005, Yong D. Hang và cộng sự tiếp tục thành công tạo ra sản phẩm lên men lactic từ nước ép bắp cải chủng Vi sinh vật sử dụng là Lactobacillus plantarum C3, Lactobacillus casei A4 , Lactobacillus delbrueckii D7 kết quả lên men sau 48 giờ ở 30oC đạt đến 10 x 108 cfu/ml. Sản phẩm bảo quản tốt ở 4oC trong 4 tuần [21]. Seung Hee Baek (2005) đã chọn L.acidophilus là chủng vi khuẩn thích hợp để lên men gạo lức ở 37oC trong vòng 60,4 giờ , cùng với 30,56% nước và 6,94% mật ong, chế phẩm này có tên gọi là “Fermented Brown Rice” được chứng minh là có khả 19