Giáo trình thực tập vi sinh vật

Chia sẻ: 986753421 986753421 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:100

Thêm vào BST

Báo xấu

257
lượt xem 89
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tham khảo sách 'giáo trình thực tập vi sinh vật', khoa học tự nhiên, công nghệ sinh học phục vụ nhu cầu học tập, nghiên cứu và làm việc hiệu quả

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Giáo trình thực tập vi sinh vật

B GIÁO D C VÀ ðÀO T O TRƯ NG ð I H C NÔNG NGHI P HÀ N I *** NGUY N XUÂN THÀNH (Ch biên) VŨ TH HOÀN NGUY N TH BÌNH - ðINH H NG DUYÊN Ch biên & hi u ñính PGS.TS NGUY N XUÂN THÀNH TH C T P VI SINH V T Chuyªn ngµnh Chuyªn Hà N i - 2007 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………1
M CL C N i dung Trang Bài s 1: Trang thi t b c n thi t trong nghiên c u vi sinh v t 1 Bài s 2: Phương pháp c ñ nh tiêu b n và nhu m t bào vi sinh v t 12 Bài s 3: Chu n b d ng c và môi trư ng nuôi c y vi sinh v t 16 Bài s 4: Nuôi c y vi sinh v t 26 Bài s 5: Phương pháp l y m u ñ phân tích vi sinh v t 31 Bài s 6: Phương pháp phân tích vi sinh v t 33 Bài s 7: ðánh giá ñ c tính sinh h c c a vi sinh v t 37 Bài s 8: Phân l p tuy n ch n Azotobacter t ñ t 40 Bài s 9: Phương pháp l y m u và phân l p tuy n ch n vi khu n 42 Rhizobium Bài s 10: Phương pháp xác ñ nh nhanh trao ñ i ch t vi sinh v t 46 Bài s 11: Vi sinh v t trong môi trư ng 50 Bài s 12: Phương pháp xác ñ nh n m men, n m m c, t o và 53 nguyên sinh ñ ng v t Bài s 13: Quá trình chuy n hoá nitơ dư i tác d ng c a vi sinh v t 60 Bài s 14: Chuy n hoá lưu huỳnh dư i tác d ng c a vi sinh v t 63 Bài s 15: Vi sinh v t phân gi i lân (phospho) 65 Bài s 16: Enzym trong quá trình trao ñ i nitơ, phospho, lưu huỳnh 67 Bài s 17: Xác ñ nh sinh kh i vi sinh v t ñ t 75 Bài s 18: Sinh trư ng c a vi sinh v t 83 Bài s 19: Thăm quan ki n t p v vi sinh v t 86 Ph l c 88 Tài li u tham kh o 91 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………2
Bài s 1 TRANG THI T B C N THI T TRONG NGHIÊN C U VI SINH V T M c ñích yêu c u: + N m ñư c nh ng máy móc, trang thi t b c n thi t trong nghiên c u v vi sinh v t. + Bi t s d ng thành th o m t s máy móc thông d ng c a phòng nghiên c u. + Hi u ñư c t m quan tr ng c a công tác tiêu ñ c, kh trùng. + S d ng thành th o kính hi n vi + Phân bi t các d ng hình thái c a vi sinh v t N i dung : + Gi i thi u nh ng trang thi t b c n thi t trong phòng nghiên c u vi sinh v t. + Gi i thi u các d ng c và nguyên li u c n thi t ñ nghiên c u vi sinh v t: d ng c l c, kh trùng, d ng c quang h c, d ng c ño lư ng, môi trư ng nuôi c y. + Thao tác v n hành và s d ng các trang thi t b trong phòng nghiên c u vi sinh v t + C u t o và s d ng, b o qu n kính hi n vi + Quan sát hình thái vi sinh v t I. MÁY MÓC 1. T nuôi c y vi sinh v t (Incubator) T nuôi c y hay còn g i là t ñ nh ôn là thi t b quan tr ng dùng trong công tác nghiên c u vi sinh v t, vì nhi t ñ trong t có th thay ñ i t 00 – 900 C tuỳ theo ý mu n c a ngư i nghiên c u và nhi t ñ trong t sau khi ñã ñư c xác ñ nh thì luôn luôn tr ng thái n ñ nh trong su t th i gian nuôi c y. 1.1. C u t o C u t o v t nuôi c y có 2 l p: l p trong là kim lo i d n nhi t ñ gi nhi t ñ bên trong c a t , l p ngoài là kim lo i dày hơn và ñư c b c phía trong b i m t ch t cách nhi t (amiant). Gi a l p trong và l p ngoài là kho ng tr ng ñ gi cho nhi t ñ trong t ít b bi n ñ i. Trong t có b ph n c m nhi t ñ báo nhi t ñ lên xu ng cho rơ-le ho t ñ ng và qu t gió ñư c l p ph n gi a thân ñ ñi u hoà nhi t ñ bên trong. Ph n ngoài t nuôi có h th ng b ng ñi n t ñ ñi u ch nh nhi t ñ theo yêu c u c a nghiên c u. Phía trên t ñư c l p van an toàn, n u nhi t ñ trong t vư t quá dao ñ ng biên ñ , van an toàn s t ng t. 1.2. Cách s d ng ðóng m ch ñi n, b m nút m công t c t (có th gi vài giây ñ n khi xu t hi n ñèn báo trên b ng ñi n t ). Sau ñó b m nút ñ t nhi t ñ và th i gian (set up) theo yêu c u nuôi c y, ñi u ch nh nhi t ñ và th i gian b ng n nút tương Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………1
ng mũi tên lên ho c xu ng. Nhi t ñ trong t m tăng d n và ñ t t i nhi t ñ ñã xác ñ nh. Nhi t ñ s ñư c duy trì trong su t th i gian nuôi c y ñã ñ nh s n. Trên b ng ñi n t luôn xu t hi n ch s báo nhi t ñ th c t trong t . Khi ñ th i gian nuôi c y, t s phát ra ti ng báo hi u và rơ le t ng t ñ t ñ ng t t ch ñ làm vi c. N u mu n nuôi c y liên t c lâu dài có th không c n ñ t ch ñ th i gian, ch ñ t nhi t ñ . Khi nào mu n k t thúc thì b m nút t t công t c ngu n. 1.3. Khi s d ng máy c n chú ý nh ng ñi m sau ñây + Hi u ch nh thi t b trư c khi s d ng. + Ph i n i t v i dây ñ t và ki m tra ñi n th c a máy v i ñi n th nơi ñ t máy xem có gi ng nhau không, trư ng h p không gi ng nhau ph i dùng bi n th . + Khi s d ng t m l n ñ u, ph i ki m tra b ph n ñi u ch nh nhi t ñ xem có chính xác không, nhi t ñ trong t có ñ u không. + C a t luôn luôn ph i ñóng kín, tr khi l y ho c cho nguyên li u vào nuôi c y nhưng cũng không ñư c m c a t r ng và lâu. + Luôn luôn ph i ñ m b o cho t m ñư c khô ráo, s ch s , ph i cho t ho t ñ ng thư ng xuyên nh t là nh ng hôm tr i m. Khi làm ñ các ch t d ch nuôi c y ho c làm b n trong t , ph i lau chùi và sát trùng ngay. + Nên ñ t trong t 1 c c nư c vô trùng trong quá trình nuôi c y ñ giúp cho qu t gió ho t ñ ng t t. + Khi không dùng, t t công t c ñi n và rút phích c m ñi n ra. 2. T s y khô (Drying oven) 2.1. Tác d ng Dùng t s y khô ñ kh trùng các d ng c th y tinh, ñ s như ng nghi m, xi lanh, h p l ng, c c, ph u, c i ch y s ..., các ñ kim khí như dao, kéo, panh và các d ng c khác không có nư c khác như bông, băng, v i... Tr v t li u làm t cao su và môi trư ng nuôi c y không ñư c kh trùng b ng t s y khô. Nguyên lý c u t o c a t s y khô cũng g n gi ng như t m, ch khác là có th ti t trùng nhi t ñ 175 - 200o C. 2.2. Cách s d ng t s y khô Các d ng c ph i r a s ch, ñ khô, bao gói c n th n trư c khi cho vào t , sau khi s p x p các th vào trong t r i ñóng kín c a và ñóng các l thông khí. B t công t c ñi n, ñ t ch ñ làm vi c cho t (ñi u ch nh nhi t ñ và th i gian gi ng như v i t ñ nh ôn). Thông thư ng d ng c nuôi c y và phân tích vi sinh v t ñư c kh trùng 160-180oC trong 2 gi . V i các d ng c , như: pipét, xi lanh,… không ñư c s y quá 60oC vì nhi t ñ cao làm giãn n thu tinh d n ñ n m t ñ chính xác c a d ng c . Lưu ý khi s y không nên ñ t d ng c sát thành t vì ñ y nhi t ñ thư ng cao Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………2
hơn nhi u d làm cháy gi y gói ho c nút bông, cũng không nên x p d ng c quá khít nhau ñ không khí có th lưu thông ñư c và làm nóng ñ u các v t c n kh trùng. Sau khi ng t m ch ñi n, ch nhi t ñ h d n xu ng b ng nhi t ñ phòng thì m i ñu c m c a t ñ l y d ng c s y ra. D ng c l y ra ph i ñ trên giá g , trên gi y ho c v i, không ñư c ñ trên g ch men, trên sàn g ch ho c sàn xi măng vì d ng c ñang nóng g p l nh s d v và làm nh hư ng ñ n tính vô trùng c a d ng c . 3. N i h p hơi nư c cao áp (Autoclave) 3.1. Nguyên lý N i h p hơi nư c cao áp (hình 1) làm b ng kim lo i ch u ñư c nhi t ñ cao (ít nh t là 135o C) có th dùng ñi n, dùng c i ho c dùng than ñun cho nư c sôi, hơi nư c s nén d n l i trong n i và n u ti p t c ñ cho nư c sôi thì áp l c trong n i s tăng d n, áp l c càng tăng thì nhi t ñ c a hơi nư c trong n i càng cao, như v y gi a nhi t ñ t0 c a hơi nư c và áp l c P c a nó có liên quan v i nhau, nhưng không ph i theo m t t l ñư ng th ng (xem ñ th ). Khi áp l c k ch s 0 có nghĩa là: áp l c P trong n i h p = áp l c P không khí. Cho nên khi áp l c k ch 1kg/cm2 thì chính là ch hi u s gi a áp l c bên trong v i áp l c không khí t n t i trong n i. 1kg/cm2 = P (trong n i) - P (không khí trong n i) Do ñó áp l c P trong n i không phù h p v i P áp l c k hay nói m t cách khác, nhi t ñ trong n i không tương ng v i nhi t ñ c a áp l c k . Vì v y mu n cho nhi t ñ trong n i phù h p v i áp l c k thì ph i lo i b h t không khí trong n i ra (1kg/cm2 = 1atm = 1 phoud). B ng 1. So sánh m i liên quan gi a áp su t ghi trên áp k c a n i h p bi u th b ng atmosphere và nhi t ñ trong n i ñã lo i h t không khí Áp Nhi t Áp Nhi t Áp Nhi t Áp Nhi t ñ (oC) ñ (oC) ñ (oC) ñ (oC) su t su t su t su t (atm) (atm) (atm) (atm) 0,0 100,0 0,5 112,5 1,0 121,0 1,5 127,0 0,1 102,5 0,6 114,5 1,1 129,9 1,6 128,0 0,2 105,0 0,7 116, 1,2 124,0 1,7 129,0 0,3 107,5 0,8 117,0 1,3 125,0 1,8 130,0 0,4 110,0 0,9 119,0 1,4 126,0 1,9 131,0 2,0 132,0 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………3
Hình 1. Sơ ñ n i h p áp l c ð lo i b h t không khí trong n i ra có 2 cách: a) ðóng khóa thoát hơi ñ tăng áp l c trong n i lên ñ n kho ng 0,3 atm r i xì cho thoát h t hơi ra, sau ñó khóa l i và cho tăng áp l c. b) M khóa thoát hơi và ñun cho ñ n khi hơi nư c b t ñ u thoát ra thành m t lu ng hơi tr ng khá m nh, khá ñ u thì ñóng l i và cho tăng áp l c. 3.2. Cách s d ng n i h p cao áp - ð nư c vào n i h p v i lư ng v a ñ (xem v ch ngang ghi trên ng th y tinh ho c bình ch a l p bên ngoài n i h p). Chú ý nư c ph i ng p dây may so trong n i n u là n i h p xách tay. - Các d ng c ñem h p ph i ñư c bao gói k , ñ i v i các bình và ng môi trư ng có nút bông ph i b c b ng gi y d u ho c gi y nhôm ñ tránh hơi nư c ñ ng làm ư t nút. - Khi s p x p d ng c vào n i h p không nên ñ sát nhau quá, ñ v t n ng xu ng dư i v t nh lên trên. - ð y n p, khóa ch t các c theo t ng ñôi ñ i x ng nhau ñ kh i vênh, kh i h , khi tháo khóa cũng ph i làm như v y. ðóng van ñi u áp và van x hơi. - M m ch ñi n ho c ñ t nhiên li u ñ cung c p nhi t cho n i, n nút m công t c n i (nút on), ñ t ch ñ làm vi c (nhi t ñ và th i gian h p) cho n i Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………4
b ng cách ñi u ch nh mũi tên lên xu ng. Ch ñ làm vi c luôn th hi n trên b ng ghi ñi n t . Sau khi h p ñ theo nhi t ñ và th i gian ñ nh s n, rơ le s t ng t, n i phát ra ti ng kêu báo hi u quá trình h p ñã k t thúc. V i n i h p xách tay ph i luôn luôn có m t ñ theo dõi kim ch áp l c trên ñ ng h áp l c k trong khi h p, lo i h t không khí trong n i theo 2 phương pháp ñã nêu trên. Khi ñ t t i m c c n thi t thì ñi u ch nh ngu n nhi t ñ duy trì áp l c không ñ i trong m t kho ng th i gian c n thi t. Nhi t ñ và th i gian h p kh trùng ph thu c vào v t ñem kh trùng và m c ñích nghiên c u. Ngư i ta thư ng h p nhi t ñ 121oC trong kho ng 20 phút thì nha bào c a m t s lo i vi khu n cũng s b tiêu di t. - Khi ñ t t i th i gian c n thi t thì ng t ñi n ( n nút off) ho c rút h t nhiên li u ra và ñ i cho áp l c h d n xu ng 0o C, nhi t ñ trong n i gi m h n r i m i ñư c m n p l y d ng c ñã kh trùng ra. Chú ý tránh h áp l c ñ t ng t b ng cách m van xì hơi ra quá m nh s làm r n n t ho c v d ng c . Cũng không nên ñ n i h p ngu i l nh m i l y d ng c ra, vì lúc này n p n i s mút ch t vào mi ng ñ m cao su r t khó m . - Các d ng c l y ra không ñư c ñ n n g ch men, n n ñá, n n xi măng (vì d ng c ñang nóng g p l nh s v , n t) và ñ m bào tính vô trùng cho d ng c . 4. T l nh (Freezer) T l nh là m t thi t b quan tr ng dùng ñ gi và b o qu n gi ng vi khu n, virus và b o qu n các lo i huy t thanh, các lo i vacxin, các môi trư ng dùng ñ nuôi c y... T l nh 0o- 4o C dùng ñ gi gi ng vi khu n. T l nh -15o C ñ n -30o C dùng ñ gi gi ng virus. 5. Máy ly tâm (Centrifugal machine) 5.1. Công d ng - T p trung ñáy ng các ph n t c n nghiên c u ch a trong m t b nh ph m hay ch t mang. - T p trung vi khu n nuôi c y trong môi trư ng l ng ñ tách riêng vi khu n. - Làm trong m t ch t l ng ch a nhi u ph n t ñ c v n ñ c. - Tách h ng c u riêng v i huy t tương…. 5.2. Cách s d ng Máy ly tâm thông thư ng có m t tr c quay tròn, v phía trên c a tr c có m t hình sao ñ nh n các ng ch a ch t l ng c n ly tâm. Các ng này ñư c móc vào sao b ng m t cái quai. Khi quay các ng s giãn ra th ng góc v i tr c quay ñ ng và các h t l ng xu ng theo ñư ng tr c c a ng và d n v phía ñáy. V i ki u máy này, t c ñ t i ña là 4500 - 6000 vòng trong m t phút. Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………5
Các máy ly tâm g n ñây có b ph n thăng b ng t ñ ng, có máy ñ th i gian t ñ ng, có ñ ng h ch t c ñ v.v..., khi ly tâm ch c n v n các nút theo ý mu n. 6. Nh ng thi t b c n thi t khác - Máy hút chân không (vacuum gauge) - Máy ñ m khu n l c (colony counting) - Máy ño pH (pH meter) hay thang ño pH (pH paper set) - Máy c t nư c (Deionizers) - Máy ñánh m u (Mixers) - Máy ñ m t bào (cell counting) - Máy l c (shaker) - Phòng ho c bu ng vô trùng (clean bench, laminars) II. CÁC D NG C VÀ THI T B PHÒNG THÍ NGHI M 1. Thi t b quang h c - Kính hi n vi quang h c (Microscopy) - Kính hi n vi ch p nh - ðèn soi kính hi n vi - T quang n n ñen - Thư c ño v t kính và thư c ño th kính - Kính lúp hai m t ñeo trán - Máy projector - Máy Over head - Máy nh - ðèn t ngo i (UV lamp) 2. Thi t b ño lư ng - Cân k thu t (technical balance) - Cân ti u ly có l ng kính - Cân ti u ly xách tay - Cân bàn - Cân phân tích ñi n - Nhi t k treo tư ng và các lo i nhi t k ño nhi t ñ khác - ð ng h ñi n t ñ m phút, giây 3. Các lo i d ng c khác - Các lo i d ng c th y tinh: Phi n kính, h p l ng, ng nghi m, l , bình, ph u, c c ng ñong, xi lanh, pipet, que g t, ñèn c n... Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………6
- Các lo i d ng c kim lo i: Dao m các lo i, kéo th ng, kéo cong, panh, que c y, ñèn xì, h p tiêu ñ c, cưa xương... - Các lo i d ng c ñ men, s : Khay men, c i chày s , xoong n i ñ pha ch môi trư ng. - Các lo i d ng c cao su, v i, bông, băng: Găng tay ñ m và ñ r a d ng c , ng, bông th m nư c, bông không th m nư c, v i g c, v i l c, v i màn. - Các lo i hóa ch t ñ ch môi trư ng, r a d ng c th y tinh và sát trùng tiêu ñ c. - Các lo i thu c nhu m và thu c th ph n ng sinh hóa. - Các lo i gi ng vi khu n và virus, các lo i kháng huy t thanh ñ ch n ñoán, các lo i khu n t ñ ch n ñoán. III. KÍNH HI N VI Kính hi n vi là m t d ng c quang h c r t c n thi t ñ nghiên c u hình thái vi sinh v t và nghiên c u nh ng v t h t s c nh mà m t thư ng không th nhìn th y ñư c, có nhi u lo i kính hi n vi khác nhau. * C u t o kính hi n vi quang h c Kính hi n vi quang h c g m có 2 b ph n: 1. B ph n cơ h c 1.1 Chân kính hay ñ kính Dùng ñ ñ kính hi n vi tr ng thái cân b ng, c u t o t kim khí ñ c bi t. 1.2 Thân kính N i li n v i chân kính, ñư c t o t lo i kim khí ñ c bi t. Thân kính ñ g n toàn b các b ph n c a kính hi n vi. 1.3 ng kính Là m t ng kim khí r ng hình tr l p trên tr kính, ñ u trên c a ng kính l p th kính, phía dư i c a ng kính là bàn xoay dùng ñ l p các v t kính. Tác d ng c a ng kính là khi v t nh ñư c phóng ñ i l n th nh t b i v t kính, thì ñưa v t nh qua ng kính t i th kính ñ phóng v t nh l n th 2. Như v y v t nh ta quan sát th y chính là nh o. 1.4 Khay kính hay ñĩa kính Có th hình vuông hay hình tròn là nơi ñ t tiêu b n ñ quan sát, gi a có l th u quang ñ ñưa ánh sáng t b t quang kính lên tiêu b n. Trên khay kính có b ph n k p tiêu b n cho v ng và b ph n g i là xa ñ di chuy n tiêu b n theo hai chi u khác nhau, t trái sang ph i, t trư c ra sau và ngư c l i ñ tìm v t nh. Ngoài ra, khay kính còn có th di chuy n theo các chi u b ng cách v n hai c hai bên khay kính. 1.5 c ñi u ch nh Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………7
G m có c ñi u ch nh l n ( c sơ c p) và c ñi u ch nh nh ( c vi c p). c sơ c p dùng ñ ñi u ch nh tiêu ñi m, c vi c p dùng ñ ñi u ch nh cho nh v t rõ nét. 2. B ph n quang h c: 2.1. Gương ph n chi u ð t phía dư i khay kính g m có hai m t, m t m t ph ng và m t m t lõm, dùng ñ l y ánh sáng. 2.2. T quang kính ðư c l p vào phía dư i khay kính b i m t c c ñ nh, dùng ñ t p trung ánh sáng vào tiêu b n. 2.3. B ph n ch n sáng Có hình gi ng như con ngươi ñ t phía dư i t quang kính có th m r ng hay h p dùng ñ ñi u hòa ánh sáng vào tiêu b n. 2.4. V t kính Là m t h th ng quang h c r t quan tr ng và ph c t p, g m m t s th u kính, nó tr c ti p phóng ñ i nh th t c a v t xem, kh năng phóng ñ i c a v t kính ph thu c vào tiêu c t c là ph thu c vào bán kính cong c a th u kính; th u kính càng cong, tiêu c càng ng n thì kh năng phóng ñ i càng l n. V t kính khi dùng ñư c l p vào bàn xoay phía dư i ng kính. Có hai lo i v t kính: + V t kính khô: là v t kính có ñ phóng ñ i th p x8; x20; x40; dùng ñ xem tươi, xem vi khu n di ñ ng, xem khu n l c, hay xem ký sinh trùng ho c xem các tiêu b n t ch c... + V t kính d u: là v t kính có ñ phóng ñ i cao x 90; x100; x 120…, nó có m t vòng khác màu ñ u v t kính ñ phân bi t v i v t kính khô. V t kính khô và v t kính d u khác nhau ch t mà ánh sáng ph i ñi qua tiêu b n (phi n kính) và v t kính. v t kính khô ch t ñi qua là không khí mà ch s khúc x (chi t xu t) c a không khí là n = 1 r t khác v i ch s khúc x c a th y tinh n = 1,52; do ñó các tia sáng khi ra kh i tiêu b n s b ph n x và ph n ngoài c a chùm ánh sáng không l t ñư c vào v t kính. v t kính có ñ phóng ñ i l n ngư i ta dùng d u b ch hương (huile de cèdre) có ch s khúc x n =1,51 x p x v i ch s khúc x c a th y tinh n = 1,52 ñ t vào gi a tiêu b n và v t kính. Lúc này th y tinh và d u b ch hương là m t môi trư ng g n như ñ ng nh t, nên ánh sáng khi ñi qua th y tinh s không b khúc x mà chi u th ng vào v t kính. Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………8
Tiêu ñi m Tia sáng T quang kính 2.5. Th kính G m có hai th u kính l p vào hai ñ u c a m t cái ng nh l p trên ñ u ng kính, m t th u kính hư ng v m t ngư i xem và m t th u kính hư ng v v t quan sát, kính trên là kính phóng ñ i nh th t do v t kính thu ñư c, kính dư i là kính th trư ng làm sáng t th trư ng do ñó mà ta nhìn th y rõ nh ñư c phóng ñ i. Th kính có ñ phóng ñ i càng cao thì kho ng cách gi a hai th u kính càng ng n (tiêu c c a th kính càng ng n) và ngư c l i. ð phóng ñ i c a th kính thư ng có 4 s : x5 ; x7 ; x10 ; x15. Mu n bi t ñ phóng ñ i c a v t quan sát (ñ phóng ñ i c a kính hi n vi), ngư i ta nhân ñ phóng ñ i c a v t kính v i ñ phóng ñ i c a th kính. Ví d dùng v t kính d u x90 và th kính x15 thì ñ phóng ñ i c a v t quan sát hay ñ phóng ñ i c a kính hi n vi s là: 90 x 15 = 1350 (l n) Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………9
8 9 7 6 10 5 11 3 1 3 4 2 12 14 1 Hình 2: C u t o kính hi n vi 1. ð kính 8. Th kính 2. ðèn chi u 9. ng kính 3. B t quang kính 10. Thân kính 4. Vòng b o hi m 11. c sơ c p 5. Khay kính 12. c vi c p 6. V t kính 13. Công t c 7. Bàn xoay 14. B ph n ñi u ch nh khay kính 3. Cách s d ng kính hi n vi 3.1. Ki m tra kính hi n vi ð t kính vào v trí làm vi c, c m ñi n ho c quay gương ph n chi u v phía ánh sáng, ñ t kính trên bàn cho ngay ng n tư th có l i nh t cho ngư i quan sát. Khi quan sát tiêu b n c n s d ng c 2 m t, m t trái dùng quan sát, m t ph i dùng ñ ghi chép ho c v , không nên nheo m t m t l i ñ xem, vì như th r t d m i m t và ñau ñ u. C n luy n t p ñ có th xem kính ñư c b ng c hai m t. 3.1. Quan sát tiêu b n tươi v i v t kính khô Không dùng t quang kính và b ph n ch n sáng, nh t là ñ i v i v t kính có ñ phóng ñ i th p (38), khi ngu n sáng h p thì dùng gương ph ng v i v t Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………10
kính có ñ phóng ñ i th p, dùng gương lõm v i v t kính có ñ phóng ñ i cao (340), khi ngu n sáng r ng thì dùng gương nào cũng ñư c. H th p t t cùng t quang kính và ít m b ph n ch n sáng. 3.2. Quan sát tiêu b n nhu m v i v t kính d u Luôn luôn s d ng t quang kính, nâng cao t quang cho sát vào tiêu b n. Khi s d ng t quang kính c n chú ý m y ñi m: ð t phi n kính lên khay kính và c ñ nh, dùng v t kính có ñ phóng ñ i th p ñ có nh trong th trư ng trư c. H th p v t kính cho sát g n tiêu b n (khi h v t kính m t nhìn ngoài ñ tránh ñè m nh làm v tiêu b n). Theo dõi trong ng kính, r i t t v n c sơ c p lên, ñ n khi trông th y nh (thư ng có hình ch p) thì ng ng v n c sơ c p và b t ñ u s d ng c vi c p, v n h t s c ch m ñ n khi th y nh rõ nét thì thôi (có th v n t i ho c v n lui). Sau khi ñã ñi u ch nh tiêu ñi m v i v t kính ñ phóng ñ i th p thì quay v t kính ñó ra, nh m t gi t d u b ch hương vào ñi m ñ nh soi trên tiêu b n, không ñ gi t d u lan r ng ra, xoay ñ u v t kính d u vào, và v n v t kính d u sát xu ng tiêu b n ng m vào gi t d u, chú ý m t nhìn ngoài ñ ñ ng v n sát quá s ñè v phi n kính, ñ n khi th y ch p nh, t c là nh ñã trông th y nhưng chưa th y rõ, lúc này ñi u ch nh c vi c p cho ñ n khi nh v t rõ nét trong th trư ng. 4. Cách b o qu n kính hi n vi + Khi l y kính t trong h p kính hi n vi ra, dùng tay ph i n m ch c, kéo kính ra theo hư ng n m ngang, không ñ ñ ng vào thành h p, sau ñó dùng tay trái ñ chân kính ñ mang ñi (bao gi cũng ph i dùng 2 tay khi di chuy n). N u mang ñi xa ph i c ñ nh ch c ch n ñ tránh b l c. + Không ñư c s tay vào ñ u v t kính và th kính, n u b n có th dùng v i m m ho c gi y lau kính ñ lau. V t kính d u dùng xong l y v i m m m n hay gi y dai m n lau s ch d u b ch hương ñ u v t kính, sau ñó t m xylon lau cho h t d u (xylon có tác d ng làm tan d u b ch hương). Cu i cùng lau l i m t l n n a b ng v i m m, m n hay gi y m m. + Khi dùng xong ph i xoay các b ph n c a kính v ñúng v trí quy ñ nh, không ñư c ñ v t kính n m trong tr c kính như lúc quan sát mà ph i ñ t ñúng l mù ho c xoay v t kính ra hai bên và v n cho áp sát xu ng ñĩa kính, t quang h th p xu ng, gương ph n chi u xoay d c thân kính. Toàn b kính ñ u coi như tr ng thái ngh . Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………11
* Câu h i ôn t p bài s 1: 1. Trang thi t b , máy móc chuyên d ng cho nghiên c u VSV? 2. Nguyên lý v n hành và cách s d ng n i h p hơi nư c cao áp (Autoclave)? 3. C u t o và cách s d ng kính hi n vi? 4. C u t o và cách s d ng máy ñ m khu n l c? 5 Trình bày phương pháp và cách tính kích thư c t bào VSV? Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………12
Bài s 2 PHƯƠNG PHÁP C ð NH TIÊU B N VÀ NHU M T BÀO VI SINH M c ñích yêu c u: + Hư ng d n h c viên làm tiêu b n vi sinh v t t các m u v t. + N m v ng phương pháp nhu m ñơn, nhu m giemxa và phương pháp nhu m Gram. + Nh n d ng hình thái vi sinh v t và phân bi t vi khu n Gram dương, Gram âm N i dung: + Phương pháp làm tiêu b n vi sinh v t + Pha ch thu c nhu m và các phương pháp nhu m: nhu m ñơn, Gram, Giem xa, Wright. + Quan sát m t s tiêu b n hình thái vi sinh v t: c u khu n, tr c khu n, c u tr c khu n I. PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU B N VÀ NHU M T BÀO VI SINH V T 1. M c ñích c a c ñ nh tiêu b n và nhu m t bào VSV T bào vi sinh v t g n như là không m u, do ñó quan sát b ng phương pháp xem tr c ti p r t khó, vì v y c n ph i làm tiêu b n r i ñem nhu m m u. Nhu m vi sinh v t có 4 m c ñích: - ð nghiên c u hình thái, c u t o ñ c bi t c a vi sinh v t như giáp mô, nha bào, … - ð phân lo i vi sinh v t căn c vào tính ch t b t m u Gram, tính ch t kháng c n, kháng toan. - ð d phân bi t và quan sát ñư c các vi c u t o trong t bào VSV. - ð b o t n tiêu b n trong m t th i gian dài, ñ ch p nh. 2. Phương pháp làm tiêu b n vi sinh v t ñ nhu m 2.1. Chu n b phi n kính - Ch n phi n kính trong, s ch, không m , không có d u m , ñã ñư c ngâm trong c n, khi dùng lau khô b ng v i m m và hơ qua trên ng n l a ñèn c n. - Khoanh di n ph t vi sinh v t b ng cách dùng bút chì m khoanh m t vòng m t dư i phi n kính. 2.2. Ph t m u v t - N u l y m u v t là vi sinh v t t ng canh trùng d ch th thì sau khi ñã kh trùng que c y và ñ ngu i, l y m t gi t môi trư ng nh lên phi n kính ch ñã khoanh tròn b ng bút chì m , r i dàn m ng ra trong di n ñã khoanh. C n chú ý thao tác khi l y vi sinh v t ñ ph t kính: Tay ph i c m que c y, nung ñ que c y b ch kim và ñưa toàn b ph n kim khí c a que c y qua ng n Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………13
l a ñèn c n 2 - 3 l n, làm trư c khi l y vi sinh v t và sau khi ñã ph t kính xong; tay trái c m ng môi trư ng ñ vào lòng bàn tay và c m nghiêng ng b ng 5 ngón tay. Dùng ngón tay út c a bàn tay ph i m nút bông, sau khi ñã quay nút bông m t vòng trong mi ng ng cho trơn (k p nút bông vào gi a ngón tay út và bàn tay, hay gi a ngón tay út và ngón tay ñeo nh n) hơ ng môi trư ng trên ng n l a ñèn c n, và ñ u ng nghi m luôn luôn ñ sát ng n l a ñèn ñèn c n, cho que c y vào sâu trong ng môi trư ng l y ra m t gi t môi trư ng, rút que c y ra, hơ mi ng ng nghi m và ñóng nút bông l i, cho ng nghi m vào giá, sau ñó c m phi n kính ñã chu n b s n, mu n c m phi n kính cho v ng thì ngón tay cái gi m t c nh dài c a phi n kính, ba ngón ti p gi c nh ñ i di n, ngón út ñ m t dư i phi n kính, gi cho phi n kính không di chuy n trong khi ph t. - N u là vi sinh v t t canh trùng ñ c (môi trư ng th ch): thì dùng que c y b ch kim l y m t ít vi sinh v t m t khu n l c, (không nên l y nhi u vi sinh v t vì ph t dày quá s khó xem và khó phân bi t hình thái c a vi sinh v t). ð t que c y lên phi n kính ñã có s n m t gi t nư c c t hay nư c sinh lý ho c nư c th t vô trùng ñ làm huy n d ch vi sinh v t, tr n ñ u vi sinh v t trong gi t nư c r i dàn m ng ra. - N u dùng máu ñ ph t kính thì có th l y máu tĩnh m ch rìa tai (ñ i v i ñ ng v t s ng) ho c máu tim (ñ i v i ñ ng v t m khám). ð t gi t máu lên phi n kính, r i dùng ñ u m t phi n kính khác, có c nh nh n và th ng ho c c nh c a m t lá kính ñ t nghiêng m t góc 30 - 45o v i phi n kính ñ gi t máu lan kh p c nh r i ñ y nh và ñ u t i ñ u kia c a tiêu b n, máu theo phi n kính ch không ph i b phi n kính ñ y ñi, tiêu b n t t n u máu ñư c dàn ñ u trên phi n kính thành m t l p m ng. - N u dùng ph t ng lách, gan, th n, h ch, ph i... thì c t m t mi ng nh , th m b t nư c b ng bông hay gi y th m, r i ch m nh trên phi n kính ñ 3 - 4 ch , không ñè m nh trên phi n kính, ch th m nh nhàng, ho c có th kéo lư t nh mi ng ph t ng trên phi n kính thành v t dài cũng ñư c. - N u dùng ñ m m , t y xương ph t kính thì l y que c y l y ñ m ch có nhi u m nh t, r i dàn m ng ra trên phi n kính, n u m khô thì trư c khi dàn, nh m t gi t nư c sinh lý vô trùng trên phi n kính, là tương t v i t y xương. 2.3. S y khô tiêu b n : Có 2 cách - ð t khô nhi t ñ phòng thí nghi m. - Hơ cao trên ng n l a ñèn c n, không ñ sát tiêu b n vào ng n l a, nóng quá thân vi sinh v t s co qu p l i, protit trong nguyên sinh ch t ñông nhanh, nh hư ng ñ n hình thái t bào. 2.4. C ñ nh tiêu b n + C ñ nh tiêu b n có 3 m c ñích: - Gi t ch t vi sinh v t ñ vi c s d ng không gây nguy hi m. - Làm cho vi sinh v t g n ch t vào phi n kính, khi r a nư c không b trôi ñi. - Làm cho vi sinh v t b t m u t t hơn. Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………14
Có th c ñ nh b ng nh ng phương pháp sau ñây: + C ñ nh b ng nhi t ñ : Hơ phi n kính trên ng n ñèn c n b ng cách ñưa ñi, ñưa l i kho ng cách 10-15 cm ñ 3 - 4 l n, n u hơ nóng quá s làm bi n d ng hình thái vi khu n. + C ñ nh b ng ch t hóa h c: - Nh vài gi t c n nguyên ch t hay c n 96o 5 - 10 phút - Nh vài gi t c n mêtylic 2 - 3 phút - Ngâm tiêu b n vào axêton 5 phút + C ñ nh b ng hơi foocmalin 3 - 5 phút II. Phương pháp nhu m tiêu b n 2.1. Thu c nhu m ñơn và các phương pháp nhu m ñơn 2.1.1. Dung d ch fucxin (fuchsine) trong axit phênic + Chu n b thu c nhu m Fucxin ki m 1g o C n nguyên ch t hay 96 10 ml Axit phênic k t tinh 5g Nư c c t 100 ml Nghi n fucxin v i 5ml c n trong c i s ch, qu y ñ u, ñ t t 2/3 lư ng nư c vào, qu y ñ u, xong cho thêm axit phênic, tr n ñ u cho vào l kín ñ 24 gi , ñem l c qua gi y, tráng c c b ng 1/3 nư c c t và 1/2 c n còn l i, dung d ch này là dung d ch fucsin ñ c, khi dùng nhu m ñơn ho c nhu m Gram thì ñem pha loãng dung d ch này g p 10 l n v i dung d ch axit phênic 5%. Dung d ch fucxin 10 ml Dung d ch axit phênic 5% 90 ml + Phương pháp nhu m ñơn a) Nh thu c nhu m lên tiêu b n ñã c ñ nh ñ 1 - 2 phút, có khi ñ n 10 phút tùy theo lo i thu c nhu m. b) R a nư c, ñ vòi nư c t t ch y xu ng m t ñ u phi n kính c m hơi nghiêng ñ n khi nư c trong là ñư c. c) Th m khô b ng gi y th m hay b ng hơi nóng. d) Quan sát trên kính hi n vi 2.1.2. Dung d ch xanh mêtylen trong axit phênic + Chu n b thu c nhu m Xanh mêtylen 1g Axit phênic k t tinh 1g C n nguyên ch t 100o 10 ml Nư c c t 10 ml Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………15
Cách pha gi ng như fucxin trên. + Phương pháp nhu m cũng gi ng nhu m fucsin. 2.2. Phương pháp nhu m Gram( nhu m kép) 2..2.1. Chu n b thu c nhu m a) Dung d ch tím gentian trong axit phênic Tím gentian 1g o C n 96 10 g Axit phênic k t tinh 5g Nư c c t 100 ml b) Dung d ch fucxin trong axit phênic Fucxin ki m 1g o C n 96 10 g Axit phênic k t tinh 5g Nư c c t 10 g Cách pha 2 dung d ch này gi ng như dung d ch fucxin nói trên c) Pha dung d ch lugol Iôtñua kali (KI) 1g I t tinh th (I) 0,5 g Nư c c t 150 ml Nghi n iôtñuakali v i m t ít nư c c t, sau ñó cho i t ñã tán nh vào l c cho tan h t, cu i cùng cho ñ nư c c t, l c ñ u, ñ 24 gi r i ñem l c. ð ng vào chai m u. Không nên pha nhi u vì d b bi n ch t. d) Pha dung d ch t y m u c n axêtôn. C n nguyên ch t 5 ph n Axêtôn 1 ph n N u không có axêtôn thì dùng c n nguyên ch t ho c 90o cũng ñư c. 2.2.2. Phương pháp nhu m Gram 1) Nh dung d ch tím gentian lên tiêu b n 1 - 2 phút. 2) R a nư c nhanh, v y khô nư c. 3) Nh dung d ch lugol ñ 1 phút (tiêu b n có m u nâu ñen). 4) R a nư c nhanh, v y khô nư c. 5) Nh c n axêtôn t ñ u phi n kính, nghiêng phi n kính cho c n ch y qua ch ph t vi sinh v t. 6) R a nư c nhanh. 7) Nh dung d ch fucxin loãng ñ 1 phút. 8) R a nư c Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………16
9) Th m khô - hơ khô - xem kính. Vi khu n Gram dương b t màu tím, vi khu n Gram âm b t màu h ng. * C n chú ý: Bư c t y m u b ng c n axêtôn r t quan tr ng. N u t y không k thì d nh m l n vi khu n Gram âm v i vi khu n Gram dương và ngư c l i, n u t y lâu quá thì vi khu n Gram dương m t m u tím cho nên khi nhu m màu ñ fucxin thì cũng b t m u ñ . Quan sát trên kính hi n vi nh n th y: h ng c u nhu m m u nâu h ng, nhân b ch c u nhu m màu tím. * Câu h i ôn t p: Bài s 2 1. Trình bày 3 phương pháp cơ b n trong nghiên c u v VSV? 2. Th nào là Gram? ình bày s sai khác gi a nhu m ñơn và nhu n kép? 3. Các bư c ti n hành ch t o tiêu b n? Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………17
Bài s 3 CHU N B D NG C VÀ MÔI TRƯ NG NUÔI C Y VI SINH V T M c ñích, yêu c u: + Bi t ñư c và chu n b d ng c nuôi c y VSV + N m v ng cách pha ch môi trư ng nuôi c y VSV + Hi u ñư c phương pháp kh trùng các lo i d ng c và môi trư ng nuôi c y VSV N i dung ki n t p: + Chu n b và r a d ng c c n thi t ñ pha ch môi trư ng nuôi c y VSV + H c cách b c gói các d ng c thông d ng và nút bông cho ng nghi m, pipet, … + Cách pha ch môi trư ng th ch nghiêng và ñĩa th ch I. CHU N B D NG C 1. Các d ng c thư ng ñư c s d ng trong nghiên c u vi sinh v t - ðĩa petri (h p l ng) - ng nghi m, bình tam giác, bình c u, chai thu tinh - Pipét, xi lanh, que g t, que c y - Lam kính, lamen 2. Yêu c u Các d ng c ph i s ch v m t hoá h c và vi sinh v t h c (các d ng c ph i ñư c vô trùng). 3. Cách x lý d ng c trư c khi r a - ð i v i d ng c thu tinh m i chưa s d ng, c n ngâm nư c lã ho c dung d ch H2SO4 loãng 24 gi . R a l i b ng xà phòng và nư c nhi u l n cho t i khi dung d ch r a có pH trung tính. - Các d ng c ñã qua s d ng, nh t là các VSV gây b nh trư c khi r a nh t thi t ph i ñư c kh trùng b ng hơi nư c áp l c ñ gi t ch t các t bào, ñ m b o an toàn cho ngư i r a, không cho m m b nh cũ nhi m vào môi trư ng m i. - ð i v i các VSV không gây b nh cho ngư i và ñ ng th c v t, ch c n tháo nút bông, x p vào n i ho c ch u nhôm chuyên d ng, ñ nư c xà phòng, dìm d ng c ng p kín nư c, ñun sôi 15-30 phút. Gom các c n b n vào túi nilon, bu c kín r i m i ñ b . - D ch nuôi VSV trư c khi ñ b c n thêm vài gi t formalin, l c m nh ñ gi t ch t t bào. - S d ng dung d ch sunfo-cromic ñ ngâm t y các v t b n trên d ng c thu tinh. 4. Cách r a d ng c Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………18