1
ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA HÓA ------- -------
Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa
học trong hạt tiêu đen (Piper nigrum L.) ở huyện
Đăk Đoa, tỉnh Gia Lai
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Ngành cử nhân hóa dược
SVTH: Nguyễn Thị Triên Ly
Lớp: 08CHD
GVHD: ThS. Đỗ Thị Thúy Vân.
2
MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Ngày nay việc nghiên cứu, sàng lọc các hợp chất thiên nhiên có tác dụng dược
lý đang là hướng đi được nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm. Từ đó
có định hướng cho việc chiết xuất để tìm ra các loại thuốc mới trong việc điều trị
bệnh. Chính vì vậy việc nghiên cứu thành phần hóa học từ những cây cỏ thiên nhiên
có một ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao.
Hồ tiêu là cây thương mại được trồng ở nhiều nước nhiệt đới. Ở Việt Nam,
cây được trồng nhiều ở các tỉnh miền Trung, Tây Nguyên và Nam Bộ. Trong đó hạt
tiêu đen là loại gia vị phổ biến, đóng vai trò quan trọng trong lịch sử và được đánh
giá cao. Từ lâu nhân dân ta đã sử dụng hạt tiêu đen để chữa một số bệnh như lợi
tiểu, giảm đầy hơi trong đường ruột, cải thiện tiêu hóa, … Trong y học cổ đại của
Ấn Độ, hạt tiêu đen được tất cả các trường phái y học từ Ayurveda, Siddha đến
Unani sử dụng làm thuốc chữa nhiều bệnh như hen suyễn, đau nhức, đau họng, trĩ,
rối loạn đường tiết niệu, tả, sốt định kỳ, khó tiêu, … Và hiện nay, theo nhiều công
trình nghiên cứu cho thấy, hạt tiêu đen có thể làm giảm đau, giảm viêm, chữa viêm
khớp, chống bệnh cao huyết áp, tiểu đường, bệnh tim mạch và đặc biệt điều trị bệnh
bạch biến và ung thư vú.
Thành phần hóa học của hạt tiêu đen có chứa một số alkaloid như piperine (5-
9%), piperidine, piperettine và piperanine, chavixin, tinh dầu dễ bay hơi (1-2,5%),
chất hăng nhựa (6,0%), và tinh bột (khoảng 30%). Năm 1821, vị cay của hạt tiêu
đen đã được tìm thấy là do piperine.
Nước ta có diện tích gieo trồng hồ tiêu lớn, ước tính đạt khoảng 52.000 ha vào
năm 2003, sản lượng xuất khuẩu hạt tiêu đen hàng năm khoảng 85.000 tấn, rất
thuận lợi trong việc đảm bảo nguồn nguyên liệu. Nhưng do còn nhiều hạn chế về
trình độ khoa học nên cho đến nay nước ta chưa có nhiều công trình nghiên cứu về
thành phần, tính chất, khả năng ứng dụng, công nghệ khai thác các hợp chất hoá học
có trong hạt tiêu đen. Vì vậy, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu chiết tách và xác
định thành phần hóa học trong hạt tiêu đen (Piper nigrum L.) ở huyện Đăk Đoa,
tỉnh Gia Lai” nhằm xây dựng qui trình chiết tách, từ đó xác định thành phần các
3
hợp chất trong hạt tiêu đen để đóng góp một phần nhỏ trong việc đánh giá tài
nguyên thiên nhiên và sử dụng chúng một cách có hiệu quả, khoa học hơn.
2. Mục tiêu của đề tài
- Nghiên cứu quy trình chiết tách các hợp chất hóa học có trong hạt tiêu đen.
- Xác định thành phần hóa học, công thức cấu tạo của các hợp chất có trong hạt
tiêu đen.
3. Đ i t ng, phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng: Hạt tiêu đen ở huyện Đăk Đoa, tỉnh Gia Lai
- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu quy trình chiết tách, xác định thành phần và
cấu trúc một số hợp chất trong hạt tiêu đen.
4. Ph ng pháp nghiên cứu
4.1. Nghiên cứu lý thuyết: Tổng quan tài liệu, các tư liệu, sách báo trong và ngoài
nước kết hợp tìm hiểu thực tế về đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hoá học,
công dụng của hạt tiêu đen.
4.2. Nghiên cứu thực nghiệm
- Phương pháp lấy mẫu, thu gom và xử lý mẫu
- Phương pháp phân tích trọng lượng: xác định độ ẩm, hàm lượng tro
- Phương pháp phân hủy mẫu phân tích: tro hóa mẫu
- Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS: xác định hàm lượng kim loại
nặng
- Phương pháp chiết Soxhlet
- Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS: khảo sát các điều kiện chiết
tối ưu
- Phương pháp định tính alkaloid
- Phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ GC-MS: xác định thành phần hóa học
của hạt tiêu đen
- Phương pháp thử hoạt tính sinh học.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
- Ý nghĩa khoa học: Cung cấp các thông tin khoa học về các chỉ tiêu hóa lý, thành
phần hóa học và cấu tạo của một số hợp chất có trong hạt tiêu đen.
4
- Ý nghĩa thực tiễn: Giải thích một cách khoa học các kinh nghiệm dân gian, thuận
tiện cho việc nghiên cứu, ứng dụng vào ngành công nghiệp dược phẩm
6. B cục của khóa luận
Khóa luận gồm 44 trang trong đó có 10 bảng và 27 hình. Phần mở đầu (3
trang), kết luận và kiến nghị (1 trang), tài liệu tham khảo (2 trang). Nội dung của đề
tài chia làm 3 chương:
Chương 1- Tổng quan tài liệu (15 trang)
Chương 2- Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (12 trang)
Chương 3- Kết quả và bàn luận (11 trang)
5
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. S l c về họ Hồ tiêu [17], [18]
Họ Hồ tiêu (Piperaceae) là một họ thực vật có hoa chứa trên 3610 loài được
nhóm thành 9 chi: Macropiper, Peperomia, Piper, Sarcohachis, Trianaeopiper,
Zippelia, Lepianthes, Potomorphe, Ottonia. Họ này gồm các loại cây thân gỗ nhỏ,
cây bụi hay dây leo được phân bố rộng khắp ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Đặc
điểm chung của họ là lá có vị cay nồng, hoa nhiều nhưng không có lá đài và cánh
hoa.
Chi Hồ tiêu (Piper) là một chi quan trọng về kinh tế cũng như sinh thái học
của họ Hồ tiêu, gồm có 1000-2000 loài. Sự đa dạng của chi này thích hợp cho sự
nghiên cứu lịch sử tự nhiên, hóa học các sản phẩm tự nhiên, sinh học tiến hóa, sinh
thái cộng đồng. Có thể kể đến một số loài như: Piper lolot C. DC. (Lá lốt), Piper
nigrum L. (Hồ tiêu), Piper longum (Hồ tiêu dài), Piper belte (Trầu không), … (Hình
1.1)
Piper lolot C. DC. Piper longum Piper belte
Hình 1.1. Một số loài trong chi Hồ Tiêu
1.2. Giới thiệu về cây hồ tiêu [3], [5], [7], [16], [17], [19], [20]
1.2.1. Tên gọi
Tên thường gọi : Hồ tiêu (Hình 1.2)
Tên khác : Cổ nguyệt, Hắc cổ nguyệt, Hắc xuyên, Mạy lòi (Tày)
Tên nước ngoài : Black pepper (Anh), Poivrier commun (Pháp)
Tên khoa học : Piper Nigrum L.
6
1.2.2. Phân loại khoa học
Giới : Plantae
Ngành : Magnoliophyta
Lớp : Magnoliopsida
Phân lớp : Magnoliidae
Bộ : Piperales
Họ : Piperaceae
Chi : Piper
Loài : Piper Nigrum L.
Hình 1.2. Cây hồ tiêu 1.2.3. Đặc tính sinh thái
1.2.3.1. Nguồn gốc
Hồ tiêu có nguồn gốc ở vùng Tây Ghats, Kerala, Ấn Độ, nơi có nhiều giống
tiêu hoang dại, mọc rất lâu đời. Hồ tiêu đã được tìm thấy cách đây hơn 4000 năm và
được trồng từ 1000 năm trước Công nguyên. Sau đó, tiêu được người Hindu mang
tới Java (Indonesia) vào khoảng 600 năm sau công nguyên. Cuối thế kỷ 12, tiêu có
mặt ở Malaysia. Đến thế kỷ 18, tiêu được canh tác ở Srilanka và Campuchia. Vào
đầu thế kỷ 20, tiêu được trồng nhiều ở các nước nhiệt đới như Châu Phi với
Mandagasca, Nigieria, Congo và Châu Mỹ với Brazil, Mexico, …
Tiêu du nhập vào Đông Dương từ thế kỷ 17 nhưng mãi đến thế kỷ 18 mới bắt
đầu phát triển mạnh khi một số người Trung Hoa di dân vào Campuchia ở vùng dọc
bờ biển vịnh Thái Lan như Konpong, Trach, Kep, Kampot. Tiêu vào Đồng bằng
Sông Cửu Long qua ngõ Hà Tiên của tỉnh Kiên Giang, rồi sau đó lan dần đến các
tỉnh khác ở miền Trung như Thừa Thiên – Huế, Quảng Trị, …
1.2.3.2. Phân bố
Cây hồ tiêu được trồng ở nhiều nước nhiệt đới như Thái Lan, Malaysia,
Indonesia, Ấn Độ, Campuchia. Ở nước ta, cây được trồng từ lâu, chủ yếu ở các tỉnh
miền Đông Nam Bộ, nhiều nhất là ở Phú Quốc, Hà Tiên, Kiên Giang, Bà Rịa -
Vũng Tàu, ở các vùng đất bazan như Tây Nguyên, và còn được trồng ra tới Quảng
Trị, Nghệ An, Hà Tĩnh nhưng diện tích ít hơn. Theo Phan Hữu Trinh (1988), cây
tiêu được đưa vào canh tác tương đối quy mô ở vùng Hà Tiên vào đầu thế kỷ thứ
7
19, sau đó được trồng nhiều ở vùng Đông Nam Bộ và Bắc Trung Bộ. Vùng hồ tiêu
chủ yếu ở Quảng Trị là những vùng có độ cao dưới 100 m so với mực nước biển.
Trong những năm qua, nghề trồng hồ tiêu đã có những bước nhảy vọt, lượng
tiêu sản xuất và xuất khẩu mỗi năm tăng 20-30%. Năm 2000, Việt Nam xuất khẩu
được 55.000 tấn tiêu, năm 2002 đạt gần 70.000 tấn, đưa Việt Nam trở thành nước
đứng thứ 2 về diện tích trồng (sau Ấn Độ) và là nước đứng đầu thế giới về sản xuất
và xuất khẩu hạt tiêu đen với các chủng loại nổi tiếng trong và ngoài nước như: tiêu
Phú Quốc, tiêu Cù và tiêu Hồ Xá (Quảng Trị), tiêu Tiên Sơn (Gia Lai), tiêu Đất Đỏ
(Bà Rịa), tiêu Di Linh (Lâm Đồng), … Các loại tiêu này được xuất khẩu sang nhiều
nước và được đánh giá cao vì có độ thơm và vị cay nồng đặc trưng.
1.2.3.3. Điều kiện sống
Cây hồ tiêu thích hợp với khí hậu vùng xích đạo và nhiệt đới. Môi trường sinh
trưởng tự nhiên là rừng xích đạo nóng ẩm quanh năm. Cây ưa lặng gió, che bóng, nhiệt độ thích hợp trung bình 22-280C. Hồ tiêu yêu cầu lượng mưa cao từ 2000-
3000mm/năm, phân bổ đều trong 7-8 tháng và cần 3-5 tháng không mưa ở cuối giai
đoạn thu hoạch để phân hóa mầm hoa tốt, ra hoa tập trung. Độ ẩm không khí thích
hợp cho sự thụ phấn của hoa tiêu là 75– 90%. Hồ tiêu có thể trồng được trên nhiều
vùng đất nhưng đất thích hợp phải là đất tơi xốp, nhiều mùn, pH 5,5-7, dốc thoải
nhiều màu, thoát nước tốt.
1.2.4. Đặc tính thực vật
Hồ tiêu là một loại dây leo sống nhiều năm.
Dây leo nhờ thân quấn chia thành nhiều đoạn và
gấp khúc ở các mấu, mấu phù to, màu nâu xám,
mang nhiều rễ móc để thân bám vào giá tựa. Thân
dài, nhẵn không mang lông, có nhiều nhánh, tròn,
phân đốt, là loại thân tăng trưởng nhanh. Cấu tạo
thân tiêu gồm nhiều bó mạch libe mộc có kích
thước lớn có khả năng vận chuyển lượng nước và
muối khoáng từ đất lên thân. Khi còn non thân Hình 1.3. Thân hồ tiêu
8
tiêu màu xanh, nhẵn, khi già thân chuyển thành màu xám, có nốt sần. Toàn cây có
mùi thơm. (Hình 1.3)
Lá đơn, mọc cách, có cuống, phiến lá hình
trái xoan nhọn, màu xanh lục, đậm ở mặt trên hơn
mặt dưới, bìa phiến nguyên, dài 11-15 cm, rộng
5-9 cm, nhìn giống như lá trầu không, nhưng dài
và thuôn hơn. Gân lá lông chim nổi rõ 2 mặt, mặt
dưới lồi nhiều hơn mặt trên, gân phụ cong hình
cung. Cuống lá màu xanh, có rãnh lòng máng, hơi
phình ở gốc nơi đính vào thân và có 2 đường dọc
màu đen nứt nẻ nhiều là vết tích của lá bắc, dài 1- Hình 1.4. Lá hồ tiêu 1,6 cm. (Hình 1.4)
Đối diện với lá là cụm hoa hình đuôi sóc
thõng xuống, mọc từng gié trên cành quả. Gié dài
7-12 cm, trung bình có từ 20-60 hoa, sắp xếp theo
hình xoắn ốc. Hoa lưỡng tính, không có bao hoa
nhưng bao bởi nhiều lá bắc. Hoa tiêu thường có
màu vàng hoặc xanh nhạt gồm 3 cánh hoa, 2-4
nhụy đực, bao phấn có 2 ngăn. Hạt phấn tròn và
rất nhỏ. Bầu nhụy gồm một bầu noãn có một
ngăn và chứa một số túi noãn nhưng quả tiêu thì Hình 1.5. Hoa hồ tiêu
chỉ có một hạt. (Hình 1.5)
Quả hình cầu nhỏ, chừng 20-30 quả trên
một chùm, lúc đầu màu xanh lục, sau có màu
vàng, khi chín có màu đỏ. Thời gian từ lúc hoa nở
đến quả chín kéo dài 7-10 tháng. Mùa hoa quả
tháng 5-8. Quả có một hạt duy nhất. (Hình 1.6)
Hạt trong cứng có mùi thơm và vị cay, cấu
Hình 1.6. Quả hồ tiêu tạo bởi 2 lớp. Bên ngoài gồm vỏ hạt, bên trong
chứa phôi nhũ và các phôi.
9
1.2.5. Thu hái và chế biến
Hồ tiêu được thu hoạch mỗi năm một lần. Thu hoạch vào cuối mùa hè. Tùy
theo cách thu hái và chế biến mà ta có các loại tiêu khác nhau.
Tiêu trắng: Hái quả chín có màu đỏ (tốt nhất trên 20% quả chín), loại bỏ lớp
vỏ ngoài rồi phơi khô, thu được hồ tiêu sọ có màu trắng ngà, xám, ít nhăn nheo, ít
thơm nhưng cay hơn. (Hình 1.7)
Tiêu đen: Hái quả còn xanh, vào lúc xuất hiện một số quả chín trên chùm (tốt nhất có trên 5% quả chín có màu vàng, đỏ) về phơi hoặc sấy khô ở 40-500C; các quả
sau khi phơi vỏ quả sẽ săn lại, ngả màu đen ta có hồ tiêu đen. (Hình 1.8)
Hình 1.7. Tiêu trắng Hình 1.8. Tiêu đen
Tiêu đỏ: Là loại hồ tiêu chín cây hoặc được thu hái khi rất già rồi ủ chín. Màu
đỏ của quả tiêu được giữ lại bằng cách ngâm vào dung dịch nước muối cùng với
chất bảo quản thực phẩm, sau đó được khử nước. (Hình 1.9)
Tiêu xanh: Các quả được hái khi còn xanh, bảo quản trong nước muối, giấm
hoặc axit citric để giữ lại màu xanh tự nhiên và hương vị của hạt tiêu tươi. (Hình
1.9)
Tiêu đỏ Tiêu xanh
Hình 1.9. Tiêu đỏ và tiêu xanh
10
Dầu tiêu: là tinh dầu được bay hơi, được chiết xuất từ quả tiêu bằng phương
pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước. Đó là một hỗn hợp lỏng tự nhiên, trong suốt, có
màu xanh vàng đến hơi xanh lá cây. (Hình 1.10)
Oleoresin tiêu: Hay còn gọi là dầu nhựa tiêu, là hỗn hợp tinh dầu, nhựa và các
hợp chất như piperine. Dầu nhựa tiêu có đầy đủ các đặc trưng về hương vị thơm cay
của hạt tiêu, được sản xuất bằng sự chiết xuất bởi các dung môi cổ truyền hoặc chiết
xuất ở nhiệt độ cao. (Hình 1.10)
Tiêu bột: Hạt tiêu khô được nghiền ở các kích cỡ khác nhau tùy theo yêu cầu
của người tiêu thụ. Gần đây sử dụng công nghệ xay tiêu bột ở nhiệt độ thấp để tránh
sự mất mát của các chất thơm có khả năng bay hơi và loại bỏ vi khuẩn, nấm mốc.
(Hình 1.10)
Dầu tiêu Oleoresin tiêu Tiêu bột
Hình 1.10. Một số sản phẩm chế biến từ hạt tiêu
Ngoài ra còn có các sản phẩm khác như trà tiêu, kẹo tiêu, dầu thơm tiêu, tiêu
dùng cho hương liệu mỹ phẩm.
1.3. Tổng quan về hạt tiêu đen [1], [2], [3], [5], [7], [11], [12], [13], [14], [15]
1.3.1. Hình dạng ngoài
Hạt tiêu đen có dạng quả hình cầu, đường kính 3,5-5 mm. Mặt ngoài màu nâu
đen có nhiều vết nhăn hình vân lưới nổi lên, gốc quả có vết sẹo của cuống quả. Vỏ
quả ngoài có thể bóc ra được, vỏ quả trong màu trắng tro hoặc màu vàng nhạt, mặt
cắt ngang màu trắng vàng. Quả có chất bột, trong có lỗ hổng nhỏ là vị trí của nội
nhũ. Mùi thơm vị cay.
11
1.3.2. Vi phẫu
Mẫu cắt ngang của hạt tiêu đen tiết diện tròn, gồm vỏ quả và nhân hạt (Hình
1.11)
Vỏ quả ngoài: biểu bì cấu tạo bởi một
lớp tế bào hình tam giác đỉnh bầu quay vào
trong, có lớp cutin dày. Vòng mô cứng xếp sát
biểu bì. Tế bào mô cứng hình đa giác, kích
thước không đều, vách dày, ống trao đổi
rõ. (Hình 1.12a)
Vỏ quả giữa: cấu tạo bởi tế bào nhỏ,
hình bầu dục hoặc đa giác, thành mỏng, nhăn
nheo, rải rác có tế bào chứa tinh bột. (Hình Hình 1.11. Vi phẫu hạt tiêu đen 1.12b)
Vỏ quả trong: gồm tế bào mô cứng thành dày ở vách ngoài, dưới là một lớp tế
bào hình chữ nhật đứng có vách cellulose bị ép dẹp, trong cùng là lớp tế bào hình
chữ nhật kích thước không đều, có vách cellulose hơi uốn ở vách bên. Tế bào chứa
tinh dầu có nhiều trong mô mềm vỏ. (Hình 1.12c)
Nhân hạt: gồm lớp tế bào vỏ hạt xếp đều đặn, thành mỏng. Vùng ngoại nhũ rất
rộng, phía trong gồm các tế bào lớn hơn, thành mỏng chứa nhiều tinh bột và tế bào
tiết tinh dầu. Đối diện với cuống quả có vùng nội nhủ rất nhỏ, cây mầm nằm trong
nội nhũ. (Hình 1.12d)
(a) (b) (c) (d)
Hình 1.12. Vi phẫu từng phần của hạt tiêu đen
(a) vỏ quả ngoài; (b) vỏ quả giữa; (c) vỏ quả trong; (d) ngoại nhũ
12
1.3.3. Một số tiêu chuẩn kỹ thuật đối với hạt tiêu đen
Theo TCVN 7036-2002 của Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đã
quy định một tiêu chuẩn kỹ thuật đối với hạt tiêu đen như sau:
Bảng 1.1 . Các chỉ tiêu hóa lý của hạt tiêu đen
Mức yêu cầu Chỉ tiêu (% khối lượng theo chất khô)
Tạp chất ≤ 0,2
Hạt lép ≤2,0
Hạt vỡ và hạt nhỏ 1,0
Khối lượng theo thể tích (g/l) 600
Độ ẩm ≤12,5
Tro tổng số ≤6,0
Tro không tan trong axit ≤1,2
1.3.4. Thành phần hóa học của hạt tiêu đen
Theo nghiên cứu của GS-TS Đỗ Tất Lợi, trong hạt tiêu đen có chứa tinh dầu
(1,5-2,2%), alkaloid (5-8%), tinh bột (36%), chất béo (8%), tro (4%) và các muối
khoáng,…
Tinh dầu tập trung ở vỏ quả giữa, có màu vàng hay lục nhạt, mùi thơm, vị dịu
gồm các hydrocacbua như phelandren, cadinen, caryophyllen, các tecpen như pinen,
limonen và một ít hợp chất có chứa oxy.
* Một số hợp chất có trong tinh dầu hạt tiêu đen:
β-Caryophyllene limonene pinene eugenol α-humulene
Có 2 alkaloid chủ yếu trong hồ tiêu là piperine và chavixin.
13
- Piperine (C17H19O3N):
+ Có trong hạt tiêu từ 5-9%, tinh thể không màu, không mùi, không tan trong
nước sôi, rất tan trong rượu nóng, tính kiềm nhẹ, đồng phân với morphin.
+ Khi đun với rượu kali, cho muối kali của axit piperic C12H10O4 và một
alkaloid khác lỏng, bay hơi là piperidine C5H11N. Axit piperic đun với MnO4K sẽ
cho piperonal dùng để chế nước hoa.
C17H19NO 3 + KOH = C12H10O4K + C5H11N.
+ Piperine được chuyển hóa thành các hợp chất khác:
- Chavixin (C17H19O3N):
Chiếm khoảng 2,2-4,6%, tập trung phía ngoài vỏ, chất lỏng sền sệt, có vị cay hắc làm cho hồ tiêu có vị cay nóng, tan trong rượu, ete, chất béo, đặc ở 00C.
Chavixin là đồng phân quang học của piperine, thủy phân cho piperidine và axit
chavinic C12H10O4.
14
Các nhà khoa học tại trường Đại học DDU Gorakhpur Ấn Độ và Đại học
Tucuman Nacinal Organic Argentina năm 2009 đã nghiên cứu về tinh dầu và nhựa
dầu của hạt tiêu đen. Tinh dầu hạt tiêu đen được trích xuất với bộ dụng cụ
Clevenger, được phân tích GC-MS cho thấy sự hiện diện của 54 thành phần đại diện
cho khoảng 96,6% của tổng trọng lượng. Caryophyllene (29,9%) đã được tìm thấy
như là thành phần chủ yếu cùng với limonene (13,2%), β-pinen (7-9%), sabinene
(5,9%) và một số nhỏ các thành phần khác. Nhựa dầu được chiết Soxhlet với 2 loại
dung môi etanol và ethyl acetate. Thành phần chính của cả nhựa chiết trong ethanol
và ethyl acetate là piperine (63,9 và 39,0%), với nhiều thành phần khác có hàm
lượng ít hơn.
Và theo như một công bố trên trang web của trung tâm khoa học và công nghệ
cao Italy (International Centre for Science and High Technology - AREA Science
Park -Padriciano 99 - 34012 Trieste - Italy) cho thấy thành phần hóa học của hạt
tiêu đen qua các nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới như sau:
- Piperine, sabinene, limonene, caryophyllene, β-pinene, α-pinene,δ3-carene;
3,4-dihydroxy phenyl ethanol glycosides, l-phyllandrene, pipertipine, pipercitine; β-
sitosterol, (2E,4E,8Z)-N-isobutyleicosatrienamide, pellitorine, guineensine,
piperettine, pipericine, (3,4-methylenedioxyphenyl) cinnamaldehyde, dipiperamides
A (I), B and C, pipnoohine, pipyahyine (Siddiqui et al., 2004; Gruenwald et al.,
2000; Duke and Ayensu, 1985; Thomas Li, 2000; Siddiqui et al., 2002; Tsukamoto
et al., 2002).
- Terpinen–4-ol, caryophyllene oxide, β-caryophyllene, α-phellandrene,
eugenol, α-humulene (Musenga et al, 2007).
- Retrofractamide A, pipercide, piperchabamide D, dehydroretrofractamide C,
dehydropipernonaline (Rho et al, 2007).
- (2E,4Z,8E)-N-[9-(3,4-methylenedioxyphenyl)-2,4,8-nonatrienoyl]piperidine,
Retrofractamide C, pipernonaline, piperrolein B, dehydropipernonaline (Lee, 2006).
- Tricyclo[6.2.1.0(4,11)]undec-5-ene,1,5,9,9-tetramethyl-(isocaryophyllene-II),
β-emelene, 4,11,11-trimethyl-8-methylene-,[1R-(1R*,4E,9S*)]-bicyclo [7.2.0]
undec-4-ene, decahydro-4a-methyl-1-methylene-7-(1-methylethenyl)-,[4aR-(4a α,7
15
α,8a β)]-naphthalene,1,2,3,5,6,7,8,8a-octahydro-1,8a-dimethyl-7-(1-methylethenyl)-
,[1S-(1 α,7 α,8a β)]-naphthalene, nonacosane, methyl hexadecanoate, ethyl
hexadecanoate, methyl 14-methyl heptadecanoate, methyl-trans-8-octadecanote,
ethyl-cis-9-octadecanaote, hexadecanoic acid, octadecanoic acid (Rasheed, 2005).
1.3.5. Tác dụng dược lý
* Theo Y học cổ truyền:
Hạt tiêu đen tác động vào 12 kinh lạc của cơ thể làm thông kinh hoạt lạc, giúp
lưu thông máu huyết ở phần bên ngoài cơ thể; có tác dụng ôn trung chỉ thống, hạ
khí, tiêu đờm, kích thích tiêu hoá:
- Tẩy trừ hàn khí: trừ lạnh, chống hàn.
- Tăng cảm giác ngon miệng: tỉnh tì, khai vị, tăng cảm giác thèm ăn, có tác
dụng trị liệu chứng chán ăn, ăn không ngon và tiêu hóa không tốt.
Hồ tiêu đen vị cay tính nóng: tính nhiệt rất lớn, thậm chí còn nhiệt hơn cả ớt
cay.
* Theo nghiên cứu dược lý hiện đại:
- Dùng liều nhỏ tăng dịch vị, dịch tụy, kích thích tiêu hóa ăn ngon, nhưng liều
lớn kích thích niêm mạc dạ dày, gây sung huyết và viêm cục bộ, gây sốt viêm
đường tiểu, đái ra máu.
- Piperine và piperidine gây độc ở liều cao, piperidine làm tăng huyết áp, làm
tê liệt hô hấp và một số dây thần kinh (50mg/kg cân nặng).
- Hồ tiêu có tác dụng sát trùng, diệt ký sinh trùng, gây hắt hơi.
- Alkaloid trong hồ tiêu có tác dụng an thần đối với chuột nhắt rõ rệt.
1.3.6. Công dụng của hạt tiêu đen
Hạt tiêu đen là nguồn nguyên liệu quý của nước ta. Nó không những được
dùng làm gia vị, là nguồn hàng xuất khẩu mà còn dùng làm thuốc trị bệnh.
Chất gia vị: Hạt tiêu có vị nóng, cay, có mùi thơm hấp dẫn nên rất thích hợp
cho việc chế biến các món ăn. Hạt tiêu giàu vi khoáng chất và lượng chất xơ, tốt
cho hệ tiêu hóa, lại không có cholesterol. Chính vì thế, hạt tiêu là loại gia vị được
dùng phổ biến nhất trên thế giới.
16
Chất dinh dưỡng: Hạt tiêu đen có chứa một số khoáng chất rất quan trọng đối
với cơ thể con người, một trong số đó là crom. Hạt tiêu đen cũng chứa canxi, đồng,
sắt, magie, mangan, photpho và kẽm. Hạt tiêu đen thì không được coi là một thực
phẩm có chứa vitamin, nhưng nó chứa nhiều vitamin và dinh dưỡng thực vật hơn
chúng ta nghĩ. Hạt tiêu đen có hàm lượng vitamin K cao, chứa beta-carotene, beta-
cryptoxanthin, choline, axit folic, lycopene, niacin, pyridoxine, riboflavin, thiamin,
các vitamin A, C, E. Phần lớn các vitamin này có đặc tính chống oxy hóa, giúp
giảm tác hại của các gốc hóa học tự do trên cơ thể và giúp ngăn chặn ung thư làm
thay đổi các tế bào. Theo phân tích của Quỹ Thực phẩm lành mạnh thế giới (Mỹ) đã
chứng minh: Cứ 2 muỗng cà phê hạt tiêu (khoảng 4,28g) sẽ cung cấp khoảng 10,88
calorie, 0,24mg mangan, 6,88mg vitamin K, 1,24mg sắt, 1,12g chất xơ, 0,88mg
vitamin C, ...
Chất bảo quản: Hạt tiêu được dùng như là một chất bảo quản tự nhiên cho thịt
và các loại thực phẩm dễ bị hư hỏng khác. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng điều này là
do các tính chất chống oxy hóa và chống vi khuẩn hiện diện trong hạt tiêu.
Trong y dược: Do có sự hiện diện của chất piperine, tinh dầu và nhựa có mùi
thơm, vị cay, tính nóng, nên có tác dụng kích thích tiêu hóa. Hạt tiêu kích thích sự
tiết ra một số men tiêu hóa của tuyến tụy như amylase, trypsin, chymotrypsin và
lipase, làm thúc đẩy quá trình tiêu hóa tốt hơn, giúp ăn ngon miệng, tăng cường
chức năng hoạt động của tuyến tụy, giúp ấm bụng, giảm đau, chống nôn; được dùng
chữa cảm hàn, chữa chứng tiêu chảy, giảm tỉ lệ mắc chứng đầy hơi khó tiêu, … Hạt
tiêu cũng có thể làm giảm kích ứng với vết côn trùng cắn, giúp chống lại tình trạng
viêm đường hô hấp như hen suyễn. Bên cạnh đó piperine còn làm tăng sinh khả
dụng của một số chất dinh dưỡng và thuốc.
Trong công nghiệp hương liệu: Chất piperine trong hạt tiêu được thủy phân
thành piperidin và acid piperic. Oxy hóa acid piperic bằng permanganate kali ta thu
được piperonal (heliotropin nhân tạo) có mùi hương tương tự như heliotropin và
coumarin, dùng để thay thế các hương liệu này trong kỹ nghệ làm nước hoa. Tinh
dầu tiêu với mùi thơm đặc biệt được sử dụng trong công nghiệp hương liệu và hóa
dược.
17
* Trên thế giới:
Ở Trung Quốc, hạt tiêu đen được chế thành cao dán để chữa hen. Người Ấn
Độ dùng tiêu đen để chữa dịch tả, tăng cường sức khỏe cho cơ thể yếu mệt sau khi
sốt và phòng tái phát bệnh sốt rét. Người Indonesia dùng tiêu đen làm thành phần
của một số loại thuốc bổ, thuốc giảm đau cho phụ nữ sau sinh. Còn ở Nepan, tiêu
đen được phối hợp với nhiều vị khác để làm thuốc chữa cảm lạnh, cảm cúm, khó
tiêu, viêm khớp.
Bên cạnh đó còn có nhiều nghiên cứu của các nhà khoa học về tác dụng của
hạt tiêu đen ít người còn chưa biết đến:
- Các chuyên gia vật lý trị liệu ở Nga qua một thời gian nghiên cứu đã đi đến
kết luận: tinh dầu chiết xuất từ hạt tiêu sẽ mang lại cảm giác minh mẫn, tỉnh táo
hơn, làm tăng ham muốn tình dục.
- Nhóm nghiên cứu của trường King’s College London - Anh, đã phát hiện
ra rằng hạt tiêu đen có thể kích thích sự hình thành hắc tố ở da của những người bị
bệnh bạch tạng (căn bệnh phá hủy melanin, một chất khiến cho da có màu sẫm và
giúp bảo vệ da dưới tia cực tím, tránh được nguy cơ ung thư da). Chất piperine
trong hạt tiêu đen sẽ rất hữu ích khi kết hợp với phương pháp trị liệu bằng ánh sáng
để điều trị bệnh. Các nhà khoa học Anh cho biết hạt tiêu đen có thể giúp làm giảm
những rối loạn trên da, căn bệnh đang làm ảnh hưởng đến 1% dân số thế giới.
- Trung tâm ung bướu Đại học Michigan (Mỹ) phát hiện các chất curcumin
(có trong nghệ) và piperine (trong tiêu đen) có thể làm giảm số lượng các tế bào gốc
của những tế bào vú được nuôi cấy. Hai hợp chất vừa kể cản trở quá trình tự làm
mới, một đặc tính tiêu biểu ở các tế bào gốc ung thư nhưng không ảnh hưởng đến
quá trình biệt hóa tế bào nên không độc hại với những mô vú bình thường. Các nhà
nghiên cứu dự định thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 1 để xác định liều lượng
curcumin và piperine có thể dung nạp ở người.
1.3.7. Một số bài thuốc y học cổ truyền sử dụng hạt tiêu đen
Từ lâu dân gian đã sử dụng hạt tiêu đen để chữa nhiều bệnh như trộn hạt tiêu
đen với bơ tươi đã diệt khuẩn làm từ sữa bò có thể chữa eczema và ghẻ. Trường hợp
bứu giáp có thể dùng hạt tiêu đen xay cùng với gỗ cây thông làm thành một thứ bột
18
và bôi lên. Hạt tiêu đen xay thật mịn và trộn với dầu vừng rồi đem đun trên lửa thật
nhỏ để làm thành chất kem bôi lên những chỗ bị tác động bởi bệnh liệt. Bôi hạt tiêu
đen vào lợi sẽ làm giảm cơn đau răng. Hạt tiêu đen rang và xay thành bột trộn với
mật ong sẽ làm giảm chứng chảy nước mũi, ho và hen. Hạt tiêu đen còn có thể kiểm
soát cả bệnh lỵ mạn tính. Hạt tiêu đen có thể kích thích đường tiết niệu, và do đó rất
công dụng đối với thận, đồng thời là chất kích thích tình dục và điều hòa kinh
nguyệt.
- Phong thấp: Tiêu, Hồi, Phèn chua, đều bằng nhau. Tán nhỏ xoa bóp vào chỗ
đau.
- Ỉa chảy, thổ tả: Tiêu tán nhỏ, uống với nước cơm.
- Nấc và ợ hơi: Tiêu sao, tán nhỏ, viên với hồ, uống với giấm.
- Ho lâu không khỏi: Tiêu 6 hạt tán nhỏ, quả thận lợn 1 đôi, cắt miếng. Nấu lấy
nước uống.
- Âm hộ sưng ngứa: Tiêu 9 hạt, cho vào nước nấu sôi, để ấm mà rửa.
- Chữa đi lỏng, ăn uống không tiêu: Tiêu, Bán hạ chế, hai vị lượng bằng nhau, tán
nhỏ, làm viên to bằng hạt đậu. Ngày dùng 15-20 viên, dùng nước Gừng chiêu thuốc.
- Trị chứng tê thấp: Hạt tiêu đen, phèn chua, hồi, ngâm với rượu xoa bóp chữa tê
thấp.
- Trị đau răng, sâu răng: Hạt tiêu đen nghiền thành bột mịn xát vào chân răng.
- Trị chứng sốt rét: Hạt tiêu nghiền bột, thuyền thoái (xác ve sầu) nghiền bột, mỗi
thứ để vào một lọ, bảo quản tốt để dùng dần. Lấy mỗi thứ 2-3g trộn đều rồi gói vào
tờ giấy kín, sau khoảng 2-4 giờ thì bóc ra uống với nước đun sôi để ấm.
- Trị viêm thận: 7 hạt tiêu đen, 1 quả trứng gà. Chọc một lỗ nhỏ ở quả trứng rồi
nhét hạt tiêu vào. Dùng bột mì bịt kín lỗ thủng. Bọc quả trứng vào trong một tờ giấy
ướt rồi đem cách thủy. Cứ 3 ngày ăn một lần. Ăn liên tục 10 ngày. Người lớn ăn
một ngày 2 quả, trẻ em ăn ngày 1 quả.
- Trị chứng lạnh bụng, nôn ói: 12g hạt tiêu, 1lít rượu 40 độ; ngâm hạt tiêu trong
rượu, uống 2 lần/ngày trước bữa ăn, mỗi lần một chén nhỏ.
- Ăn vào thổ ra: Hồ tiêu ngâm giấm, phải tẩm 7 lần. Tán thành bột luyện hồ và
rượu, vo viên bằng hạt ngô. Mỗi lần dùng 8 - 10 viên với nước, ngày 2 lần.
19
- Đau bụng do lạnh, mùa hè hoắc loạn: Tiêu 4g, sao vàng, tán mịn, uống với
nước, ngày 2 lần. Hoặc Hồ tiêu tán bột, nhào với cơm nhão, vo viên bằng hạt ngô,
mỗi lần uống 8 - 10 viên với nước cơm, ngày 2 lần.
- Thổ tả vì hàn lạnh: Tiêu chảy mửa dữ dội, chân tay giá lạnh, ngực tức, rêu lưỡi
trắng nhờn. Hồ tiêu giã nhỏ 40g, Chè hương cũ 40g, Riềng tươi giã nhỏ 40g. Ngâm
vào 1 lít rượu tốt trong 5 - 10 ngày. Người lớn mỗi lần uống 1 thìa cà phê, trẻ em
giảm liều lượng. Cách 1 giờ uống 1 lần.
- Phong độc phát ra ở bàn tay, bàn chân lở ngứa: Hồ tiêu, muối ăn lượng bằng
nhau, tán mịn, trộn giấm, bôi vào chỗ lở ngứa sau khi đã rửa sạch.
- Đau một bên đầu: Trộn hạt tiêu đen xay mịn với đất cháy lấy từ một đám cháy,
cả hai thứ với lượng đều nhau, rồi hít ngửi sẽ giảm đau đầu.
- Đau họng, có đờm rãi, ho hoặc đắng mồm: Mật ong vào trộn với nước hạt tiêu
đen sắc và dùng trong 1 tuần.
- Bệnh trĩ và sa trực tràng: Nước sắc hạt tiêu đen với 1,5 lần bột hạt carum (hạt
dùng làm gia vị tăng mùi vị cho bánh mì, bánh ngọt) và 7,5 lần mật ong hòa rồi
uống.
- Tàn nhang hoặc mụn cóc, mụn hạt cơm: Bôi một lớp mỏng hạt tiêu đen sẽ khỏi.
20
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, dụng cụ, hoá chất [4], [7], [10]
2.1.1. Thu gom nguyên liệu
Nguyên liệu để nghiên cứu là hạt tiêu được thu hái tại xã Nam Yang, huyện
Đăk Đoa, tỉnh Gia Lai. Thời điểm thu hoạch tốt nhất khi chùm tiêu có trên 5% quả
chín có màu vàng hoặc đỏ thu hoạch từ tháng 2-4. Loại bỏ tạp, rác sau đó đem phơi
khô. (Hình 2.1)
Hình 2.1. Thu hái nguyên liệu hồ tiêu
2.1.2. Xử lí nguyên liệu
Hạt tiêu đen khô loại bỏ hạt lép, tạp bẩn, xay nhỏ thành bột. (Hình 2.2)
Hình 2.2. Hạt tiêu đen và bột xay nhỏ
21
2.1.3. Thiết bị - dụng cụ và hóa chất
2.1.3.1. Thiết bị - dụng cụ
- Bộ chiết soxhlet, máy đo quang UV-VIS, thiết bị cô quay chân không (phòng thí
nghiệm khoa Hoá, trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng).
- Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS (Đài Khí tượng Thủy văn khu vực
Trung Trung Bộ, 660 - Trưng Nữ Vương - Đà Nẵng).
- Máy sắc kí khí ghép khối phổ GC-MS (Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo
lường Chất lượng 2, số 2 Ngô Quyền – Đà Nẵng).
- Tủ sấy, lò nung, cân phân tích, cốc thuỷ tinh, bình tam giác, ống nghiệm, bếp
điện, bếp cách thuỷ, cốc sứ, các loại pipet, bình định mức, bình hút ẩm, giấy
lọc…(phòng thí nghiệm khoa Hoá, trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng).
2.1.3.2. Hóa chất - Dung môi hữu cơ: etanol 960
- Hóa chất vô cơ: H2SO4, HNO3
- Thuốc thử ankaloid: Mayer (K2HgI4), Bouchardat (KI3).
2.2. S đồ nghiên cứu [8], [10], [11], [12], [13], [14]
Nguyên liệu
Xử lý Xác định hàm lượng kim loại nặng Xác định hàm độ ẩm, hàm lượng tro Bột nguyên liệu
Chiết Soxhlet Khảo sát thời gian chiết Khảo sát tỉ lệ rắn-lỏng
Định tính dịch chiết Dịch chiết Thử hoạt tính sinh học
Xác định thành phần hóa học ( Đo GC-MS)
22
2.3. Ph ng pháp xác định một s chỉ tiêu hóa lý [6], [7], [9]
Dùng phương pháp trọng lượng để xác định các chỉ số hóa lý. Phương pháp
trọng lượng là một phương pháp phân tích định lượng dựa trên sự đo chính xác khối
lượng của một chất tinh khiết hay ở dạng hợp chất có trong mẫu cần phân tích. Do
chất phân tích chiếm một tỉ lệ xác định trong sản phẩm đem cân nên dựa vào khối
lượng của sản phẩm đem cân dễ dàng suy ra lượng chất phân tích trong đối tượng
phân tích.
Quá trình phân tích một chất theo phương pháp trọng lượng gồm: chọn mẫu và
gia công mẫu, tách chất cần xác định hoặc các thành phần của nó khỏi mẫu phân
tích, xử lý mẫu rồi cân để xác định khối lượng.
* Một số chú ý khi dùng phương pháp trọng lượng:
- Phương pháp này thường gặp những sai số do phép cân gây ra, vì thế phải dùng
cân phân tích có độ chính xác cao.
- Nếu giá trị Δm quá nhỏ thì phép đo thường dễ gặp sai số lớn. Trong trường hợp
đó cần phải làm thí nghiệm nhiều lần để lấy giá trị trung bình.
- Độ lớn của lượng cân chất lấy để nghiên cứu ảnh hưởng đến độ chính xác của sự
phân tích. Lượng cân của chất phân tích càng lớn, độ chính xác tương đối của các
kết quả phân tích càng cao. Trong phân tích trọng lượng, sai số cho phép khi cân
không được vượt quá 0,1%.
- Để thu được dạng cân, mẫu cần được sấy trong tủ sấy hoặc được nung đến khi
khối lượng không đổi.
- Chén được rửa cẩn thận, sấy khô và được nung trong điều kiện nung mẫu.
* Ưu nhược điểm của phương pháp trọng lượng:
- Xác định được hàm lượng chất cần phân tích với độ chính xác cao.
- Nhược điểm chủ yếu là thời gian thực hiện kéo dài.
2.3.1. Xác định độ ẩm
Chuẩn bị 5 cốc sứ có kí hiệu, rửa sạch, sấy ở nhiệt độ 1000C đến trọng lượng
không đổi, sấy xong cho vào bình hút ẩm cho đến khi đạt nhiệt độ phòng thì cân xác
định trọng lượng cốc (m1).
23
Lấy chính xác 5 mẫu bột hạt tiêu, mỗi mẫu 5g cho vào cốc. Cân ghi nhận khối
lượng mỗi mẫu (m2).
Tiến hành sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 1000C. Sấy khoảng 3h thì lấy cốc ra để
nguội 15 phút trong bình hút ẩm rồi đem cân. Sau đó đem cho vào sấy, cứ 30 phút
lại đem cân 1 lần. Cứ như vậy đến khi trọng lượng cốc giữa các lần sấy liên tiếp là
không đổi hoặc có sai số khoảng 0,005g thì dừng quá trình sấy. Cân ghi nhận khối
lượng (m3).
Độ ẩm của mỗi cốc là hiệu số khối lượng giữa khối lượng mẫu trước và sau
khi sấy. Suy ra độ ẩm trung bình của 5 mẫu.
Công thức:
* Độ ẩm của mỗi mẫu
W(%) = ( 2.1)
* Độ ẩm trung bình
(2.2) WTB (%) =
Trong đó:
: Khối lượng chén sứ (g) m1
: Khối lượng bột hạt tiêu đen trước khi sấy(g) m2
: Khối lượng chén sứ và mẫu sau khi sấy (g) m3
n : Số mẫu xác định độ ẩm
W : Độ ẩm của mỗi mẫu (%)
WTB : Độ ẩm trung bình (%)
2.3.2. Xác định hàm lượng tro
Để xác định hàm lượng tro và các nguyên tố vô cơ trong động thực vật người
ta dùng các phương pháp tro hóa mẫu hay còn gọi là vô cơ hóa mẫu. Có 3 phương
pháp tro hóa mẫu là: phương pháp khô, ướt và khô – ướt kết hợp. Trong đó phương
pháp khô - ướt kết hợp là tối ưu hơn cả vì hạn chế mất chất phân tích, tro hóa triệt
để, thời gian xử lí nhanh hơn. Do vậy, trong đề tài này tôi sử dụng phương pháp tro
24
hóa mẫu bằng phương pháp khô – ướt kết hợp.
Ban đầu mẫu được phân hủy sơ bộ bằng các chất có tính oxi hóa cao như
H2SO4 đặc, hỗn hợp H2SO4 + HNO3, HClO4, H2O2, KMnO4 ... để tăng nhanh quá
trình phân hủy. Sau đó đốt mẫu trên bếp điện để tránh cháy trong lò nung, rồi tiến
nung đến tro trắng. Trong quá trình nung có các quá trình vật lý và hóa học xảy ra,
tùy theo bản chất mẫu mà có các quá trình sau: bay hơi nước và các chất dễ bay hơi,
kết tinh, đốt cháy các chất mùn, chất hữu cơ, ... tro còn lại là các chất vô cơ khó bay
hơi. Cân xác định khối lượng tro.
* Cách tiến hành:
Chuẩn bị 5 cốc nung rửa sạch, sấy ở 1000C trong 30 phút, nung trong lò nung
ở 6000C trong 30 phút. Làm nguội trong bình hút ẩm và cân ta được m4
Cho 5 mẫu đã xác định độ ẩm vào cốc nung. Tiếp theo nhỏ dung dịch H2SO4
đặc vào và đốt cẩn thận trên bếp điện đến than hoá hoàn toàn. Sau đó cho vào lò nung, nung ở nhiệt độ 6000C cho đến khi thu được tro màu trắng ngà. Làm nguội
trong bình hút ẩm, rồi cân để xác định khối lượng. Nung được lặp lại cho đến khi
cốc nung có khối lượng không đổi m5.
Công thức:
* Hàm lượng tro của mỗi mẫu
X (%) = ( 2.3)
* Hàm lượng tro trung bình
( 2.4) XTB (%) =
Trong đó:
: Khối lượng chén sứ nung (g) m4
: Khối lượng bột hạt tiêu đen (g) m2
: Khối lượng chén sứ và mẫu sau khi tro hoá (g) m5
n : Số mẫu xác định hàm lượng tro
X : Hàm lượng tro của mỗi mẫu (%)
25
XTB : Hàm lượng tro trung bình (%)
2.3.3. Xác định hàm lượng kim loại nặng
Tro thu được sau khi nung đem hòa tan trong dung dịch HNO3 loãng, định
mức bằng nước cất và xác định hàm lượng kim loại nặng bằng phương pháp đo phổ
hấp thụ nguyên tử AAS.
Cơ sở lý thuyết của phép đo AAS là sự hấp thụ năng lượng ánh sáng của
nguyên tử tự do ở trạng thái hơi khi chiếu chùm tia bức xạ qua đám hơi của nguyên
tố ấy trong môi trường hấp thụ theo định luật hấp thụ ánh sáng Lambert – Beer.
(Hình 2.3)
Như chúng ta đã biết trong điều kiện bình thường, nguyên tử ở trạng thái cơ
bản bền vững, không thu cũng không phát ra năng lượng. Nhưng khi ở trạng thái
hơi tự do, nếu chiếu một chùm tia sáng có bước sóng xác định vào đám hơi nguyên
tử đó thì các nguyên tử tự do sẽ hấp thụ các bức xạ có bước sóng nhất định ứng
đúng với những tia bức xạ mà nó có thể phát ra được trong quá trình phát xạ. Lúc
này nguyên tử nhận năng lượng của các tia bức xạ chiếu vào và chuyển lên trạng
thái kích thích có năng lượng cao hơn. Quá trình này gọi là quá trình hấp thụ năng
lượng của nguyên tử tự do ở trạng thái hơi và tạo ra phổ của nguyên tử đó, phổ sinh
ra trong quá trình này gọi là phổ hấp thụ nguyên tử. Nhưng nguyên tử không hấp
thụ tất cả các bức xạ mà nó có thể phát ra trong quá trình phát xạ, quá trình hấp thụ
chỉ xảy ra đối với các vạch phổ nhạy, đặc trưng của các nguyên tố. Như vậy mỗi
loại nguyên tử sẽ hấp thu tối đa và chọn lọc ở một năng lượng bức xạ đặc trưng tùy
theo cấu tạo hóa học của nguyên tử đó.
Tóm lại, để thu được phổ hấp thụ nguyên tử của một nguyên tố nào đó cần
phải thực hiện các quá trình sau:
- Xử lí mẫu để đưa nguyên tố cần xác định có trong mẫu về trạng thái dung
dịch của các cation theo một quy trình phù hợp để chuyển hoàn toàn nguyên tố cần
xác định vào dung dịch đo phổ.
- Thực hiện quá trình hóa hơi và nguyên tử hóa mẫu để tạo ra các đám hơi
nguyên tử - là môi trường hấp thụ và sinh ra phổ hấp thụ nguyên tử. Điều này được
thực hiện ở nhiệt độ cao nhờ nguồn nhiệt là ngọn lửa đèn khí: phun dung dịch chứa
26
chất phân tích ở trạng thái aerosol vào ngọn lửa đèn khí hoặc bằng phương pháp
không ngọn lửa nhờ tác dụng nhiệt của lò graphite.
- Chiếu chùm bức xạ đặc trưng của nguyên tố cần phân tích qua đám hơi
nguyên tử trên. Chùm bức xạ này được phát ra từ đèn catot rỗng đèn (HCL) hay đèn
phóng điện không cực (EDL) làm từ chính nguyên tố cần xác định.
Hình 2.3. Sơ đồ máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS
Khi đó nguyên tử tự do sẽ hấp thu năng lượng của chùm bức xạ và tạo ra phổ
hấp thụ nguyên tử, làm cường độ chùm bức xạ đi qua mẫu giảm. Dựa vào cường độ
vạch phổ hấp thụ nguyên tử đó để phân tích định lượng.
Ứng dụng của phương pháp này là phân tích các vết kim loại trong các loại
mẫu khác nhau của chất vô cơ và hữu cơ như quặng, đất, đá, xi măng, nước, không
khí, các sản phẩm nông nghiệp, thực phẩm, nước uống, phân bón, vật liệu, các mẫu
sinh học, y học như máu nước tiểu, thực vật, ...
2.4. Ph ng pháp chiết và khảo sát các điều kiện chiết t i u [4], [8], [9], [10]
2.4.1. Phương pháp chiết
Phương pháp chiết là phương pháp tách một hay một số chất ra khỏi nguyên
liệu dựa vào đặc tính của chất cần chiết và dung môi, là sự phân bố giữa hai pha
không trộn lẫn vào nhau: một pha lỏng và một pha rắn tạo cân bằng lỏng- rắn. Dung
môi phân cực sẽ tách được chất phân cực còn dung môi không phân cực sẽ tách chất
không phân cực.
Khi nguyên liệu và dung môi tiếp xúc với nhau, lúc đầu dung môi thấm vào
nguyên liệu, sau đó hòa tan những chất tan có trong tế bào nguyên liệu rồi được
khuếch tán ra ngoài tế bào. Trong chiết xuất sẽ xảy ra một số quá trình như khuếch
27
tán, thẩm thấu, thẩm tích, hòa tan, ... và chịu sự ảnh hưởng của nhiều yếu tố như
nhiệt độ chiết, thời gian chiết, tỉ lệ rắn-lỏng, độ mịn của nguyên liệu, ...
Có nhiều phương pháp chiết xuất nguyên liệu, có thể kể đến là phương pháp
ngâm dầm, phương pháp ngấm kiệt, phương pháp đun hoàn lưu, phương pháp chiết
soxhlet, ... Trong đó phương pháp chiết soxhlet là tối ưu hơn cả khi dùng ở điều
kiện phòng thí nghiệm vì chiết kiệt được hoạt chất, tiết kiệm dung môi do chiết
nóng hồi lưu.
Phương pháp chiết soxhlet: là một quá trình chiết liên tục, được lặp đi lặp lại
nhiều lần một cách tự động nhằm chiết kiệt được hoạt chất. Bộ dụng cụ soxhlet bao
gồm một bình cầu, một thiết bị chiết và một ống sinh hàn hồi lưu. Dung môi ở trong
bình cầu được làm bốc hơi từng phần, rồi ngưng tụ nhỏ vào nguyên liệu chiết đựng
trong một cái túi bằng giấy lọc và sau đó chảy lại vào bình cầu. Trong quá trình đó,
cấu tử cần tách được làm giàu thêm trong dung môi. Đặc biệt, dụng cụ chiết soxhlet
có một ống xi-phông đặt ở bên cạnh, chỉ để dung dịch chiết chảy vào bình khi nào
mức chất lỏng trong ống chiết đạt được khuỷu trên của ống xi-phông. (Hình 2.4)
Hình 2.4. Bộ dụng cụ Soxhlet
2.4.2. Khảo sát các điều kiện chiết tối ưu
Để khảo sát các điều kiện chiết tối ưu ta dùng phương pháp hấp thụ phân tử
UV-VIS.
28
Phổ hấp thụ phân tử UV-VIS là phổ sinh ra do các điện tử hóa trị trong phân
tử hay nhóm phân tử sẽ hấp thu năng lượng của chùm sáng kích thích (chùm bức xạ
trong vùng UV-VIS) và chuyển lên trạng thái kích thích có mức năng lượng cao hơn (ζ ζ*, π π*, n ζ*, n π*). Phổ này chủ yếu nằm trong vùng sóng từ
190 – 900nm.
Khi chiếu một chùm sáng vào dung dịch màu thì một phần ánh sáng bị hấp thụ
bởi dung dịch, một phần bị phản xạ lại, phần còn lại ló ra cho ta màu của dung dịch.
Bảng 2.1. Sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch màu
Bước sóng (nm) Màu của tia đơn sắc Màu của dung dịch
400-450 Vùng tím Lục ánh vàng
450-480 Vùng chàm Vàng
480-490 Vùng chàm lục Da cam
490-500 Vùng lục chàm Đỏ
Như vậy nguyên tắc chung của phương pháp đo quang là để xác định một chất X
nào đó, ta chuyển nó thành dung dịch màu có khả năng hấp thụ ánh sáng rồi đo sự
hấp thụ ánh sáng của nó, từ đó suy ra hàm lượng chất cần xác định theo định luật
Lambert – Beer: D =A= ε. l. C. Mật độ quang đo được ngoài tính chất tuyến tính
với nồng độ dung dịch còn có đặc tính quan trọng là tính cộng tính, tức là giá trị đó
chính là tổng giá trị các mật độ quang của các chất có trong dung dịch.
* Ứng dụng:
Dịch chiết hạt tiêu đen có màu lục hơi vàng nên sẽ hấp thụ chùm tia bức xạ
nằm trong khoảng 400-450nm. Tiến hành quét bước sóng trong khoảng đó tìm giá
trị λmax để tại đó giá trị mật độ quang là lớn nhất, tạo điều kiện chính xác cho phép
đo.
Mật độ quang thu được là tổng giá trị các mật độ quang của các chất có trong
dịch chiết hạt tiêu đen. Giá trị mật độ quang càng lớn thì hàm lượng các chất càng
29
cao, quá trình chiết càng triệt để. Dựa vào đó xác định các điều kiện tối ưu của dịch
chiết.
* Cách tiến hành: Trong đề tài này tiến hành khảo sát 2 điều kiện chiết là thời gian
chiết và tỉ lệ rắn – lỏng.
- Thời gian chiết: Tiến hành chiết soxhlet 20g bột hạt tiêu đen với cùng thể tích etanol 960 ở nhiệt độ 800C trong các khoảng thời gian khác nhau: 4 giờ, 6 giờ, 8
giờ, 10 giờ, 12 giờ. Dịch chiết thu được đem đo UV- VIS để xác định thời gian tối
ưu. (Hình 2.5)
- Tỷ lệ R/L: Tiến hành chiết soxhlet 20g bột hạt tiêu đen ở nhiệt độ 800C trong cùng một thời gian với thể tích etanol 960 lần lượt là 160ml, 180ml, 200ml,
220ml, 240ml. Dịch chiết thu được đem đo UV- VIS để xác định tỉ lệ R/L tối ưu.
(Hình 2.6)
Hình 2.5. Khảo sát tỉ lệ R/L Hình 2.6. Khảo sát thời gian
2.5. Định tính alkaloid trong dịch chiết [1], [2], [3]
Alkaloid cho phản ứng với một số thuốc thử gọi chung là thuốc thử alkaloid
và chia làm 2 loại: phản ứng gây tủa và phản ứng màu đặc hiệu. Do điều kiện thí
nghiệm nên đề tài này chỉ sử dụng 2 thuốc thử tạo tủa là Mayer và Bouchardat.
Chuẩn bị 3 ống nghiệm đựng dịch chiết hạt tiêu đen. Một ống làm ống chuẩn,
2 ống còn lại lần lượt cho thuốc thử Mayer và Bouchardat vào mỗi ống. Để yên,
quan sát hiện tượng và nhận xét.
30
2.6. Xác định thành phần hóa học của hạt tiêu đen bằng ph ng pháp GC-MS
[6], [8], [9]
Cân 20g bột tiêu đen cho vào bộ chiết soxhlet, chiết với 200ml etanol 960 ở nhiệt độ 800C trong thời gian 8 giờ. Dịch chiết thu được đem cô đuổi dung môi thu
được cắn. Cắn được phân tích trên máy sắc kí ghép khối phổ để định danh một số
thành phần hóa học có trong hạt tiêu đen.
Sắc ký khí ghép khối phổ là một trong những phương pháp sắc ký hiện đại
nhất hiện nay với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Hệ thống được ghép nối giữa một
thiết bị sắc ký và một thiết bị phổ khối lượng, điều khiển tự động bằng máy tính.
Sắc ký khí được dùng để chia tách hỗn hợp các chất ra các phần riêng lẻ. Pha
động là một khí trơ (giống như helium) sẽ mang hỗn hợp mẫu đi qua pha tĩnh. Mỗi
chất trong hỗn hợp pha động tương tác khác nhau với pha tĩnh, hợp chất tương tác
nhanh ra khỏi cột trước, hợp chất tương tác chậm ra khỏi cột sau. Mỗi chất chia
tách, rửa giải đi ra khỏi cột và đi vào đầu dò sẽ tạo thành một peak trong sắc đồ với
thời gian lưu đặc trưng cho từng chất trong cùng điều kiện sắc kí.
Khối phổ được dùng để xác định các chất hóa học dựa trên cấu trúc của nó.
Khi giải hấp các hợp chất riêng lẻ từ cột sắc ký, chúng đi vào đầu dò có dòng điện
ion hóa và bị bắn phá thành các mảnh ion có khối lượng và điện tích. Các mảnh ion
này sẽ được tách biệt khỏi nhau trong một từ trường theo tương quan giữa m và e.
Phổ khối đồ thu được với trục hoành là giá trị m/e (số khối z) và trục tung là cường
độ tín hiệu tương đối. Cấu trúc này được so sánh với một thư viện cấu trúc các chất
đã biết trong thư viện phổ để định danh các hợp chất trong mẫu.
Sắc ký khí ghép khối phổ dùng để phân tích các hỗn hợp hóa chất phức tạp
như xác định thành phần các chất hóa học, độc chất, kháng sinh, đánh giá độ tồn lưu
của hóa chất diệt côn trùng khác nhau trong các vật liệu hoặc hợp chất khác nhau.
2.7. Thử hoạt tính sinh học [3], [16], [18]
2.7.1. Hoạt tính kháng sinh
Thử hoạt tính vi sinh vật được kiểm định theo phương pháp khuyếch tán trên
thạch, hoặc phương pháp đo độ đục trong môi trường lỏng tại phòng Thử hoạt tính
sinh học – Viện Hóa học.
31
Các chủng vi sinh vật thử gồm:
- Vi khuẩn Gram (+): Staphylococccus aureus, Bacillus subtilis, Lactobacillus
fermentum.
- Vi khuẩn Gram (-): Salmonella enterica, Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa.
- Nấm: Candida albican.
2.7.2. Hoạt tính độc tế bào
Phương pháp thử độ độc tế bào là một phép thử nhằm phát hiện các chất có khả
năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư ở điều kiện invitro. Trong phạm vi khóa
luận này, cặn chiết hạt tiêu đen được thử khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô KB
theo phương pháp Scudiero và cộng sự tại phòng Thử hoạt tính sinh học – Viện Hóa học.
Phương pháp thử: tế bào ung thư được duy trì liên tục ở các điều kiện chuẩn và tiến
hành thử nghiệm với cặn chiết hạt tiêu đen được pha ở 5 thang nồng độ khác nhau (128,
32, 8, 2 và 0.5 μg/ml) trên 96 đĩa giếng. Các đĩa thử nghiệm này được ủ trong tủ ấm CO2 ở 370C để tế bào tiếp tục phát triển. Sau 3 – 5 ngày, các tế bào này được xử lý và xác
định giá trị ức chế sinh trưởng từ đó tính được giá trị IC50.
32
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết quả xác định một s chỉ tiêu hóa lý của hạt tiêu đen
3.1.1. Độ ẩm
Tiến hành xác định độ ẩm với số lượng mẫu được lấy là 5 mẫu. Độ ẩm chung
là độ ẩm trung bình của 5 mẫu. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát độ ẩm trong hạt tiêu đen
STT W (%) m1 (g) m2 (g) WTB (%) m3 (g)
1 81.109 5.004 85.383 14.588
2 83.012 5.006 87.269 14.962
3 86.384 5.003 90.656 14.611 14.702
4 98.294 5.006 102.559 14.802
5 101.010 5.005 105.287 14.545
Từ bảng 3.1 cho thấy độ ẩm trung bình trong hạt tiêu đen tương đối cao:
14.702%. Với độ ẩm này cần phải cẩn trọng trong việc bảo quản nguyên liệu trong
suốt quá trình nghiên cứu, tránh bị nấm mốc.
3.1.2. Hàm lượng tro
Lấy 5 mẫu hạt tiêu đen đã xác định độ ẩm ở trên, nung trong lò nung ở nhiệt độ 6000C. Hàm lượng tro được lấy trung bình từ 5 mẫu. Kết quả được trình bày ở
bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát hàm lượng tro trong hạt tiêu đen
STT X (%) m4 (g) m2 (g) XTB (%) m5 (g)
1 32.282 5.004 32.490 4.157
2 32.098 5.006 32.316 4.355
3 30.252 5.003 30.449 3.938 4.184
4 31.567 5.006 31.788 4.415
5 28.294 5.005 28.497 4.056
Vậy hàm lượng tro trung bình trong hạt tiêu đen là: 4.184%. Tro này có thể là
một số muối kim loại và các chất vô cơ.
33
3.1.3. Hàm lượng kim loại nặng
Mẫu hạt tiêu đen sau khi tro hoá hoàn toàn (như mục 2.3.2.), được hoà tan
trong dung dịch axit HNO3 loãng và định mức bằng nước cất trong bình định mức
50ml. Sau đó xác định hàm lượng các kim loại nặng bằng máy quang phổ hấp thụ
nguyên tử AAS tại Đài Khí tượng Thủy văn khu vực Trung Trung Bộ, 660 - Trưng
Nữ Vương - Đà Nẵng. Kết quả phân tích được trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát hàm lượng kim loại nặng trong hạt tiêu đen
Kim loại Hàm l ng (mg/l) QCVN (mg/l)
Cu 0,8472 20,0
Pb 0,3942 2,0
Kết quả khảo sát trên cho thấy hàm lượng một số các kim loại nặng (Cu, Pb)
trong hạt tiêu đen nằm dưới mức giới hạn tối đa cho phép của QCVN 8-
2:2011/BYT về giới hạn ô nhiễm kim loại nặng trong gia vị. Vì thế, việc sử dụng
hạt tiêu đen trong các lĩnh vực liên quan như dược phẩm, thực phẩm, … sẽ không
gây hại cho sức khỏe con người.
3.2. Kết quả khảo sát các điều kiện chiết
3.2.1. Thời gian chiết
Cân 20g bột hạt tiêu đen cho vào bộ soxhlet, chiết với 250 ml etanol 960. Tiến hành chiết soxhlet ở nhiệt độ 800C trong các khoảng thời gian khác nhau: 4 giờ, 6
giờ, 8 giờ, 10 giờ, 12 giờ. Dịch chiết thu được đem đo UV- VIS tại bước sóng
417nm (hình 3.1). Giá trị mật độ quang của các mẫu được thể hiện ở bảng 3.4.
Hình 3.1. Dịch chiết tại các thời gian khác nhau
34
Kết quả khảo sát thời gian chiết được trình bày trong bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả mật độ quang của các dịch chiết theo thời gian
Mẫu Thời gian (h) Mật độ quang (D)
1 4 1.8810
2.2627 2 6
2.3864 3 8
2.1279 4 10
12 2.1293 5
D
Và được biểu diễn qua đồ thị như trong hình 3.2.
Thời gian (h)
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào thời gian
Qua kết quả thu được ở bảng 3.4 và hình 3.2 ta thấy thời gian chiết tăng, làm
tăng số lần chiết, tăng diện tích tiếp xúc và độ khuếch tán của dung môi vào nguyên
liệu, nên có thể chiết được nhiều hoạt chất dẫn đến mật độ quang tăng. Giá trị mật
độ quang lớn nhất tại thời gian 8 giờ. Nếu tiếp tục tăng thời gian chiết, giá trị D
giảm, do chiết nóng trong thời gian dài sẽ làm caryophyllene (một thành phần của
tinh dầu) bay hơi. Hơn nữa nguyên liệu ngâm trong dung môi thời gian dài sẽ
trương nở làm bít lổ thông của màng tế bào, cản trở khả năng thấm của dung môi,
giảm hiệu suất chiết.
35
Như vậy thời gian chiết tối ưu là 8 giờ.
3.2.2. Tỷ lệ rắn lỏng
Cân 20g bột hạt tiêu đen cho vào giấy lọc, gói lại thật kỹ, cuộn lại bằng chỉ, rồi cho vào bộ chiết soxhlet. Tiến hành chiết ở nhiệt độ 800C trong thời gian 8 giờ với thể tích dung môi etanol 960 lần lượt là: 160ml, 180ml, 200ml, 220ml, 240ml.
Dịch chiết thu được có màu vàng lục, đem đo UV- VIS tại bước sóng 417nm (hình
3.3). Giá trị mật độ quang của các mẫu được thể hiện ở bảng 3.5.
Hình 3.3. Dịch chiết với các tỉ lệ R/L khác nhau
Kết quả khỏa sát tỷ lệ rắn lỏng được trình bày trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả mật độ quang của các dịch chiết theo tỉ lệ rắn-lỏng
Mẫu Tỉ lệ R/L Mật độ quang (D)
1 2.0654 1/8
2 2.2561 1/9
3 2.4012 1/10
4 2.3852 1/11
5 2.3859 1/12
36
Và được biểu diễn qua đồ thị như trong hình 3.4
D
Vdm (ml)
Hình 3.4. Đồ thị biễu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào tỉ lệ R/L
Qua kết quả và đồ thị ở bảng 3.5 và hình 3.4 ta nhận thấy cùng khối lượng
nguyên liệu nhưng khi tăng thể tích dung môi thì giá trị mật độ quang ngày càng
tăng. Nguyên nhân là do khi thể tích nhỏ, dung môi nhanh bão hòa; còn khi thể tích
lớn sẽ làm tăng độ thẩm thấu, độ hòa tan của dung môi, tăng khả năng tiếp xúc với
nguyên liệu dẫn đến tăng hiệu suất chiết. Đến một thể tích nhất định, lượng hoạt
chất được tách ra gần như hoàn toàn và không thể chiết thêm được nữa khi tăng thể
tích dung môi. Giá trị mật độ quang cực đại đạt được ở mẫu 3. Sau điểm cực đại,
mật độ quang giảm không đáng kể và ổn định. Chứng tỏ tại điều kiện này, dịch
chiết của hạt tiêu đen chứa lượng chất chiết là lớn nhất.
Như vậy tỷ lệ R/L tối ưu là 1/10.
3.3. Kết quả định tính alkaloid trong dịch chiết hạt têu đen
Dịch chiết hạt tiêu đen với etanol 960 đem thử định tính alkaloid với các thuốc
thử Mayer và Bouchardat, ta có kết quả thử định tính alkaloid như sau:
* Thuốc thử Mayer:
Ống 1: Ống chuẩn chứa dịch chiết.
Ống 2: Ống thử chứa dịch chiết rồi nhỏ từ từ thuốc thử Mayer vào, nhận thấy
kết tủa màu vàng trắng, không tan trong dung dịch axit H2SO4 loãng. (Hình 3.5)
37
* Thuốc thử Bouchardat:
Ống 3: Ống chuẩn chứa dịch chiết.
Ống 4: Ống thử chứa dịch chiết rồi nhỏ từ từ thuốc thử Bouchardat vào, nhận
2
1
3
4
thấy có kết tủa màu nâu đậm. (Hình 3.6)
Hình 3.5. Dịch chiết với thuốc thử Mayer Hình 3.6. Dịch chiết với thuốc thử Bouchardat
=> Kết luận: Dịch chiết hạt tiêu đen có chứa alkaloid.
3.4. Kết quả xác định thành phần hóa học của dịch chiết hạt tiêu đen bằng
ph ng pháp GC-MS
Cân 20g bột hạt tiêu đen cho vào giấy lọc, gói lại thật kỹ, cuộn lại bằng chỉ, rồi cho vào bộ chiết soxhlet. Tiến hành chiết ở nhiệt độ 800C trong thời gian 8 giờ với 200 ml dung môi etanol 960. Dịch chiết thu được có màu vàng lục. Cô đuổi dung
môi bằng máy cô quay chân không thu được cắn. Gửi cắn đi phân tích trên máy sắc
kí khí ghép khối phổ (GC-MS) tại Trung tâm Kỹ Thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất
lượng 2, số 2 Ngô Quyền –Sơn Trà –Đà Nẵng.
Kết quả định danh các cấu tử trong cắn hạt tiêu đen bằng GC-MS được thể
hiện ở sắc kí đồ hình 3.7 và phổ khối hình 3.8, 3.9:
38
Hình 3.7. Sắc kí đồ biểu thị thành phần hóa học trong cắn hạt tiêu đen
39
Hình 3.8. Phổ khối của piperine.
Hình 3.9. Phổ khối của Caryophyllene
Từ sắc kí đồ - khối phổ thu được cho thấy thành phần chính của cắn chiết từ
hạt tiêu đen là những hợp chất alkaloid và secquiterpen, đây là những hợp chất gây
nên vị cay cho hạt tiêu đen và có hoạt tính sinh học. Qua phân tích phổ GC-MS và
đối chiếu dữ liệu trong thư viện phổ chuẩn, bước đầu thống kê được một số cấu tử
với hàm lượng đáng kể, có thời gian lưu và tỉ lệ phần trăm được trình bày trong
bảng 3.6:
40
Bảng 3.6. Thành phần hóa học của cắn chiết hạt tiêu đen
Hàm
STT l ng Định danh Công thức cấu tạo TR
(%)
1 12,436 13,11 Caryophyllene
Naphthalene, decahydro-4a-
methyl-1methylene-7-(1- 2 13,736 2,02 methylethenyl)-, [ 4aR-(4aα,
7α, 8aβ)]
3 30,645 1,97 Chavixin
2,3-Dihydro-7- 4 31,872 2,49 methoxyfuro(2,3-b)quinoline
5 32,368 80,41 Piperine
Bảng 3.6 cho thấy trong thành phần cắn chiết hạt tiêu đen, cấu tử piperine
chiếm tỉ lệ lớn nhất (80,41%). Chất này có tác dụng ức chế tế bào ung thư, kích
thích hình thành sắc tố trong da, làm tăng sinh khả dụng của một số chất dinh dưỡng
và thuốc. Đồng phân quang học của piperine là chavixin chiếm 1,97%, chất gây nên
vị cay hắc của hạt tiêu đen. Bên cạnh đó còn có caryophyllene (13,11%) là hoạt chất
chống viêm và một số cấu tử khác có hàm lượng phần trăm thấp.
41
3.5. Kết quả thử hoạt tính sinh học của dịch chiết hạt tiêu đen
Bột hạt tiêu đen tiến hành chiết soxhlet với dung môi etanol 960 trong thời gian
8 giờ, dịch chiết thu được có màu lục hơi vàng. Cô đuổi dung môi thu được cắn
chiết. Gửi mẫu cắn chiết này tới Phòng thử hoạt tính sinh học – Viện Hóa học, 18 -
Hoàng Quốc Việt - Cầu Giấy - Hà Nội.
3.5.1. Thử hoạt tính kháng sinh
Kết quả thử hoạt tính kháng sinh được trình bày ở bảng 3.7.
Bảng 3.7. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh
Theo kết quả trên cho thấy dịch chiết hạt tiêu đen không có hoạt tính kháng
các chủng vi sinh vật Gram (-): Salmonella enterica, Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa và nấm Candida albican. Chỉ có tác dụng lên một chủng
vi sinh vật Gram (+) Bacillus subtilis với giá trị IC50 là 82,53μg/ml. Bacillus subtilis
hay còn gọi là trực khuẩn, là tác nhân làm hỏng và gây vị chua nặng ở thức ăn. Điều
này lý giải vì sao hạt tiêu thường được dùng như chất bảo quản thịt và các loại thức
ăn khỏi bị ôi thiu.
42
3.5.2. Thử hoạt tính độc tế bào
Kết quả thử hoạt tính kháng sinh được trình bày ở bảng 3.8.
Bảng 3.8. Kết quả thử hoạt tính độc tế bào
Dịch chiết được kiểm tra hoạt tính ức chế sự phát triển của tế bào ung thư
thông qua phép thử gây độc tế bào với dòng tế bào ung thư biểu mô KB. Trong khi
chất đối chứng ellipticin cho giá trị IC50 là 0,51μg/ml thì dịch chiết hạt tiêu đen theo
kết quả trên cho thấy không có khả năng ức chế dòng tế bào này.
43
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
I. Kết luận
Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã thu được các kết quả sau đây:
- Đã xác định được một số chỉ tiêu hóa lý: Độ ẩm: 14.702%; hàm lượng tro:
4.184%; hàm lượng kim loại nặng phù hợp với tiêu chuẩn của Bộ Y tế đối với gia
vị.
- Đã khảo sát và tìm được các điều kiện chiết tối ưu: thời gian chiết là 8h, tỷ lệ
rắn – lỏng là 1/10.
- Bằng phương pháp GC-MS đã định danh được thành phần hóa học một số
hợp chất trong cắn chiết hạt tiêu đen: Piperine (80,41%); Caryophyllene (13,11%);
2,3-Dihydro-7-methoxyfuro(2,3-b)quinoline (2,49%); Naphthalene, decahydro-4a-
methyl-1methylene-7-(1-methylethenyl)-, [ 4aR-(4aα, 7α, 8aβ)] (2,02%); Chavixin
(1,97%).
- Dịch chiết hạt tiêu đen có hoạt tính kháng chủng vi sinh vật gram (+)
Bacillus subtilis với giá trị IC50 là 82,53μg/ml, không có hoạt tính với các chủng
Gram (-) cũng như không có khả năng ức chế với dòng tế bào ung thư biểu mô KB.
II. Kiến nghị
Thông qua kết quả của đề tài, tôi mong muốn đề tài được phát triển rộng hơn về một
số vần đề như:
- Tách và phân lập các cấu tử tinh khiết từ dịch chiết hạt tiêu đen. Trên cơ sở
đó xác định cấu trúc và thử hoạt tính sinh học để đi đến những nghiên cứu ứng dụng
vào dược học.
- So sánh khả năng chiết tách hạt tiêu đen trong các loại dung môi khác nhau,
trên các vùng nguyên liệu khác nhau để có cơ sở khoa học đánh giá sự ảnh hưởng
của khí hậu, thổ nhưỡng đến thành phần và tính chất của dịch chiết.
44
TÀI LIỆU THAM KHẢO
* Tiếng Việt
[1]. Đái Duy Ban (2008), Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học phòng
chống một số bệnh cho người và vật nuôi, Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên & công
nghệ, Hà Nội.
[2]. Nguyễn Văn Đàn và Ngô Ngọc Khuyến (1999), Hợp chất thiên nhiên dùng làm
thuốc, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
[3]. Phạm Thanh Kỳ (2007), Dược liệu học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
[4]. Từ Minh Koóng (2007), Kĩ thuật sản xuất dược phẩm, Tập 1, Nhà xuất bản Y
học, Hà Nội.
[5]. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học,
Hà Nội.
[6]. Lê Thị Mùi (2008), Bài giảng phân tích công cụ, Trường Đại học Sư phạm –
Đại học Đà Nẵng.
[7]. Tôn Nữ Tuấn Nam (2008), Báo cáo đánh giá chất lượng và thị trường Hồ tiêu
tại Việt Nam, Dự án quản lý bền vững nguồn tài nguyên thiên nhiên miền Trung.
[8]. Hồ Viết Quý (2006), Chiết tách phân chia các chất bằng dung môi hữu cơ (Lý
thuyết – Thực hành - Ứng dụng), Tập 2, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.
[9]. TS. Nguyễn Đăng Đức (2008), Giáo trình học phân tích, Trường Đại học Thái
Nguyên.
[10]. Viện Dược liệu (2008), Kỹ thuật chiết xuất dược liệu, Nhà xuất bản Khoa học
và Kỹ thuật, Hà Nội.
* Tiếng Anh
[11]. Dr. J. Pion, G. Rodriguez-Feo, P. Borges, A. Rosado, 1990, “Chemistry and
sensory properties of black pepper oil (Piper nigrum L.)”, J. Food/Nahrung, 34 (6),
pp 555–560.
[12]. Girija Raman and Vilas G. Gaikar, 2002, “Extraction of Piperine from Piper
nigrum (Black Pepper) by Hydrotropic Solubilization”, Ind. Eng. Chem. Res., 41
(12), pp 2966–2976.
45
[13]. I.P.S. Kapoor, Bandana Singh, Gurdip Singh, Carola S. De Heluani, M.P. De
Lampasona and Cesar A.N. Catalan, 2009, “Chemistry and in Vitro Antioxidant
Activity of Volatile Oil and Oleorereisins of Black Pepper (Piper nigrum)”, J.
Agric. Food Chem, 57(12), pp 5358-5364.
[14]. Leopold Jirovetz, Gerhard Buchbauer, Martin Benoit Ngassoum, Margit
Geissler, 2002, “Aroma compound analysis of Piper nigrum and Piper guineense
essential oils from Cameron using solid-phase microextraction-gas chromatography,
solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry and
olfactometry”, Journal of Chromatography A, 976 (1-2), pp265-275.
[15]. William W. Epstein , David F. Netz and Jimmy L. Seidel, 1993, “Isolation of
piperine from black pepper”, J. Chem. Educ., 70 (7), pp 598.
* Trang web
[16]. Tra cứu cây thuốc
[17]. Wikipedia
[18]. Cây thuốc quý
[19]. Dược liệu
[20]. Hiệp hội Hồ tiêu Việt Nam
46
PHỤ LỤC
KẾT QUẢ ĐO AAS
KẾT QUẢ ĐỊNH DANH CÁC HỢP CHẤT TRONG HẠT TIÊU ĐEN
47
ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐHSP KHOA HÓA Độc lập – Tự do – Hạnh phúc ----------
---------
NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Họ và tên sinh viên: Nguyễn Thị Triên Ly
Lớp: 08CHD
1. Tên đề tài: “Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa học trong hạt
tiêu đen (Piper nigrum L.) ở huyện Đăk Đoa, tỉnh Gia Lai” 2. Nguyên liệu, dụng cụ và thiết bị - Nguyên liệu: Hạt tiêu đen - Dụng cụ: Bộ chiết soxhlet, tủ sấy, lò nung, cân phân tích, cốc thuỷ tinh, bình tam giác, bếp điện, bếp cách thuỷ, cốc sứ, bình hút ẩm, … - Thiết bị: thiết bị cô quay chân không, máy đo quang UV-VIS, máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS, máy sắc kí khí ghép khối phổ GC-MS.
3. Nội dung nghiên cứu - Xác định một số chỉ tiêu hóa lý: độ ẩm, hàm lượng tro, hàm lượng kim loại nặng - Khảo sát các điều kiện chiết: thời gian, tỉ lệ rắn- lỏng - Xác định thành phần hóa học có trong hạt tiêu đen - Thử hoạt tính sinh học của dịch chiết hạt tiêu đen 4. Giáo viên hướng dẫn: ThS. Đỗ Thị Thúy Vân
5. Ngày giao đề tài: 10/2011
6. Ngày hoàn thành: 5/2012.
Chủ nhiệm khoa Giáo viên hướng dẫn
PGS.TS Lê Tự Hải ThS. Đỗ Thị Thúy Vân
Kết quả điểm đánh giá:
Sinh viên đã hoàn thành và nộp báo cáo cho khoa ngày … tháng … năm 2012. Ngày … tháng … năm 2012 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
48
LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn cô Đỗ Thị Thúy
Vân đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo động viên em trong suốt thời gian học tập,
nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này.
Xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa, thầy cô công tác tại phòng thí
nghiệm khoa Hóa, Ban giám hiệu Trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng đã tận tình
giảng dạy, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học
tập và làm khóa luận.
Em cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ công tác tại Đài Khí tượng Thủy
văn khu vực Trung Trung Bộ, Trung tâm Kỹ Thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất
lượng 2, Phòng Thử hoạt tính sinh học –Viện Hóa học đã tạo điều kiện giúp đỡ em
hoàn thành khóa luận này.
Bước đầu làm quen với nghiên cứu khoa học, mặc dù có nhiều cố gắng xong
khó có thể tránh khỏi những hạn chế và thiếu sót. Vì vậy em rất mong nhận được sự
đóng góp ý kiến của thầy cô và các bạn.
Đà Nẵng, ngày 14 tháng 5 năm 2010
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Triên Ly
49
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
STT Chữ viết tắt Tên
1 AAS Quang phổ hấp thụ nguyên tử
2 UV-VIS Quang phổ hấp thụ phẩn tử
3 GC-MS Sắc kí khí ghép khối phổ
4 R/L Rắn – lỏng
50
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
STT Bảng Danh mục bảng Trang
Các chỉ tiêu hóa lý của hạt tiêu đen 1 1.1 11
Sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch màu 2 2.1 27
Kết quả khảo sát độ ẩm trong hạt tiêu đen 3 3.1 31
Kết quả khảo sát hàm lượng tro trong hạt tiêu đen 4 3.2 31
Kết quả khảo sát hàm lượng kim loại nặng trong hạt tiêu đen 5 3.3 32
Kết quả mật độ quang của các dịch chiết theo thời gian 6 3.4 33
7 3.5 34 Kết quả mật độ quang của các dịch chiết theo tỉ lệ rắn-lỏng
Thành phần hóa học của cắn chiết hạt tiêu đen 8 3.6 39
9 3.7 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh 40
3.8 10 Kết quả thử hoạt tính độc tế bào 41
51
DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ
STT Hình Danh mục hình Trang
1.1 Một số loài trong chi Hồ Tiêu 1 4
1.2 2 Cây hồ tiêu 5
1.3 3 Thân hồ tiêu 6
1.4 4 Lá hồ tiêu 7
1.5 5 Hoa hồ tiêu 7
1.6 6 Quả hồ tiêu 7
1.7 7 Tiêu trắng 8
1.8 8 Tiêu đen 8
1.9 9 Tiêu đỏ và tiêu xanh 8
10 1.10 Một số sản phẩm chế biến từ hạt tiêu 9
11 10
12 1.11 Vi phẫu hạt tiêu đen 1.12 Vi phẫu từng phần của hạt tiêu đen 10
2.1 13 Thu hái nguyên liệu hồ tiêu 19
2.2 14 Hạt tiêu đen và bột xay nhỏ 19
2.3 15 25
2.4 16 Sơ đồ máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS Bộ dụng cụ Soxhlet 26
2.5 17 Khảo sát tỉ lệ R/L 28
2.6 18 Khảo sát thời gian 28
3.1 19 Dịch chiết tại các thời gian khác nhau 32
3.2 20 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào thời gian 33
3.3 21 Dịch chiết với các tỉ lệ R/L khác nhau 34
3.4 22 Đồ thị biễu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào tỉ lệ R/L 35
3.5 23 Dịch chiết với thuốc thử Mayer 36
3.6 24 Dịch chiết với thuốc thử Bouchardat 36
3.7 25 Sắc kí đồ biểu thị thành phần hóa học trong cắn hạt tiêu đen 37
3.8 26 Phổ khối của piperine 38
3.9 27 Phổ khối của Caryophyllene 38
52
MỤC LỤC
TRANG PHỤ BÌA
NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
LỜI CÁM ƠN
MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1
1. Lí do chọn đề tài ................................................................................................ 2 2. Mục tiêu của đề tài ............................................................................................. 3
3. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu .......................................................................... 3
4. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................... 3 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ............................................................ 3
6. Bố cục của khóa luận ......................................................................................... 4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 5
1.1. Sơ lược về họ Hồ tiêu ........................................................................................ 5
1.2. Giới thiệu về cây hồ tiêu .................................................................................... 5
1.2.1. Tên gọi ............................................................................................................ 5
1.2.2. Phân loại khoa học .......................................................................................... 6
1.2.3. Đặc tính sinh thái ............................................................................................ 6
1.2.4. Đặc tính thực vật ............................................................................................. 7
1.2.5. Thu hái và chế biến ......................................................................................... 9
1.3. Tổng quan về hạt tiêu đen ................................................................................ 10
1.3.1. Hình dạng ngoài ............................................................................................ 10
1.3.2. Vi phẫu ......................................................................................................... 11
1.3.3. Một số tiêu chuẩn kỹ thuật đối với hạt tiêu đen ............................................. 12
1.3.4. Thành phần hóa học của hạt tiêu đen ............................................................. 12
1.3.5. Tác dụng dược lý .......................................................................................... 15 1.3.6. Công dụng của hạt tiêu đen ........................................................................... 15 1.3.7. Một số bài thuốc y học cổ truyền sử dụng hạt tiêu đen .................................. 17 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............... 20 2.1. Nguyên liệu, dụng cụ, hoá chất ........................................................................ 20 2.1.1. Thu gom nguyên liệu .................................................................................... 20
53
2.1.2. Xử lí nguyên liệu .......................................................................................... 20 2.1.3. Thiết bị - dụng cụ và hóa chất ....................................................................... 21
2.2. Sơ đồ nghiên cứu ............................................................................................. 21
2.3. Phương pháp xác định một số chỉ tiêu hóa lý ................................................... 22
2.3.1. Xác định độ ẩm ............................................................................................. 22 2.3.2. Xác định hàm lượng tro................................................................................. 23
2.3.3. Xác định hàm lượng kim loại nặng................................................................ 25
2.4. Phương pháp chiết và khảo sát các điều kiện chiết tối ưu ................................. 26
2.4.1. Phương pháp chiết ........................................................................................ 26
2.4.2. Khảo sát các điều kiện chiết tối ưu ................................................................ 27 2.5. Định tính alkaloid trong dịch chiết ................................................................... 29
2.6. Xác định thành phần hóa học của hạt tiêu đen bằng phương pháp GC-MS ....... 30
2.7. Thử hoạt tính sinh học .................................................................................... 30 2.7.1. Hoạt tính kháng sinh ....................................................................................... 30
2.7.2. Hoạt tính độc tế bào ........................................................................................ 31
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ........................................................... 32
3.1. Kết quả xác định một số chỉ tiêu hóa lý của hạt tiêu đen .................................. 32
3.1.1. Độ ẩm ........................................................................................................... 32
3.1.2. Hàm lượng tro ............................................................................................... 32
3.1.3. Hàm lượng kim loại nặng .............................................................................. 33
3.2. Kết quả khảo sát các điều kiện chiết................................................................. 33
3.2.1. Thời gian chiết .............................................................................................. 33
3.2.2. Tỷ lệ rắn lỏng ................................................................................................ 35
3.3. Kết quả định tính alkaloid trong dịch chiết hạt têu đen ..................................... 36
3.4. Kết quả xác định thành phần hóa học của dịch chiết hạt tiêu đen bằng
phương pháp GC-MS.............................................................................................. 37
3.5. Kết quả thử hoạt tính sinh học của dịch chiết hạt tiêu đen ................................ 41
3.5.1. Thử hoạt tính kháng sinh ............................................................................... 41
3.5.2. Thử hoạt tính độc tế bào ................................................................................ 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................. 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 44
PHỤ LỤC
