Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của một số loại cao chiết và bước đầu định tính thành phần hóa học hoa Sứ vàng (Plumeria rubra F. Tricilor)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA MỘT SỐ LOẠI CAO CHIẾT VÀ BƯỚC ĐẦU ĐỊNH TÍNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC HOA SỨ VÀNG (PLUMERIA RUBRA F. TRICILOR)

Ngành:

Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Giảng viên hướng dẫn : ThS. Phạm Minh Nhựt

Sinh viên thực hiện

: Đinh Vũ Nghị

MSSV: 1311100485 Lớp: 13DSH04

TP. Hồ Chí Minh, 2017

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng

dẫn của ThS. Phạm Minh Nhựt, giảng viên khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm –

Môi trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh.

Những kết quả có được trong đồ án này hoàn toàn không sao chép từ đồ án tốt

nghiệp của người khác dưới bất kỳ hình thức nào. Các số liệu trích dẫn trong đồ án tốt

nghiệp này là hoàn toàn trung thực. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đồ án của

mình.

TP. HCM, ngày 27 tháng 07 năm 2017

Sinh viên thực hiện

ĐINH VŨ NGHỊ

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN

Để có kiến thức và bài báo cáo tốt nghiệp ngày hôm nay, em xin chân thành

cảm ơn quý Thầy Cô Bộ môn công nghệ sinh học trường HUTECH đã giảng dạy

những kiến thức cơ bản và bổ ích cho em.

Em cũng xin được gửi lời cảm ơn đặc biệt đến thầy ThS. Phạm Minh Nhựt đã

tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này.

Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy phụ trách phòng thí

nghiệm đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp chúng em hoàn thành tốt quá

trình thực hành.

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình đã chăm sóc, dạy dỗ và làm chỗ

dựa tinh thần động viên, hỗ trợ kinh tế cho em trong suốt những năm qua và trong quá

trình thực hiện đồ án này.

Em cũng xin cảm ơn đến các bạn cùng thực hiện đề tài trong phòng thí

nghiệm đã quan tâm, hỗ trợ em làm đồ án tốt nghiệp này.

Và em cũng xin cảm ơn các Thầy Cô trong Hội đồng phản biện đã dành thời

gian đọc và nhận xét đồ án này.

Lời cuối cùng em xin gửi lời chúc sức khỏe đến quý Thầy Cô.

Tp Hồ Chí Minh, 27 tháng 07 năm 2016

Sinh viên thực hiện

ĐINH VŨ NGHỊ

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

MỤC LỤC ........................................................................................................................ i

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................................... v

DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................... vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH ............................................................................................vii

MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1

1. Tính cấp thiết của đề tài ......................................................................................... 1

2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................... 2

3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .......................................................................................... 3

1.1. Đại cương về Hoa Sứ vàng .................................................................................. 3

1.1.1. Nguồn gốc và tên gọi ....................................................................................... 3

1.1.2 Phân loại .......................................................................................................... 3

1.1.3. Đặc điểm hình thái .......................................................................................... 4

1.1.4. Phân bố ............................................................................................................ 5

1.1.5. Tác dụng dược lý ............................................................................................. 5

1.1.6. Công dụng ....................................................................................................... 5

1.1.7. Thành phần hóa học và dược chất .................................................................. 6

1.2. Đại cương về một số hợp chất kháng khuẩn từ thực vật ................................. 7

1.2.1 Khái niệm và phân loại .................................................................................... 7

1.2.2. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật ......................................... 7

1.2.3. Một số hợp chất kháng khuẩn trong Hoa Sứ vàng .......................................... 8

1.2.3.1. Alkaloid ..................................................................................................... 8

1.2.3.2. Flavonoid ................................................................................................ 10

1.2.3.3. Tinh dầu .................................................................................................. 11

1.2.3.4. Saponin.................................................................................................... 12

1.2.3.5. Tannin ..................................................................................................... 13

i

Đồ án tốt nghiệp

1.2.4. Tình hình nghiên cứu về Hoa Sứ trên thế giới và tại Việt Nam .................... 14

1.3 Giới thiệu một số nhóm vi sinh vật gây bệnh ................................................... 15

1.3.1 Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy .............................................................. 15

1.3.1.1 Nhóm vi khuẩn Escherichia coli .............................................................. 15

1.3.1.2 Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Salmonella ................................................... 16

1.3.1.3 Nhóm vi khuẩn Vibrio spp. ...................................................................... 17

1.4.1.4 Nhóm vi khuẩn Shigella spp. ................................................................... 18

1.3.2. Nhóm vi sinh vật gây bệnh cơ hội trên da ..................................................... 20

1.3.2.1 Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa ......................................................... 20

1.3.2.2 Nhóm vi khuẩn Enterococcus faecalis .................................................... 21

1.3.2.3 Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Staphylococcus ............................................ 22

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ....................................................... 25

2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ..................................................................... 25

2.1.1. Địa điểm ........................................................................................................ 25

2.1.2. Thời gian ....................................................................................................... 25

2.2. Vật liệu ................................................................................................................ 25

2.2.1. Vật liệu .......................................................................................................... 25

2.2.2. Chủng vi sinh vật ........................................................................................... 25

2.2.3. Môi trường nuôi cấy và hóa chất .................................................................. 25

2.2.4. Thiết bị và dụng cụ ........................................................................................ 26

2.2.4.1. Thiết bị .................................................................................................... 26

2.2.5.2. Dụng cụ ................................................................................................... 26

2.3. Các phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 27

2.3.1. Phương pháp tách chiết các hợp chất từ thực vật ......................................... 27

2.3.2. Phương pháp tăng sinh ................................................................................. 27

2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật .......................................... 27

2.3.3.1. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật ........................................................ 27

ii

Đồ án tốt nghiệp

2.3.3.2. Phương pháp bảo quản lạnh sâu ............................................................. 28

2.3.4. Phương pháp xác định mật độ tế bào ............................................................ 28

2.3.5. Phương pháp pha loãng mẫu ........................................................................ 28

2.3.6. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ....................... 29

2.3.7. Phương pháp xác định thành phần hóa học .................................................. 29

2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................. 32

2.4. Bố trí thí nghiệm ................................................................................................ 32

2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Hoa Sứ vàng. ............................................................... 36

2.4.3. Thí nghiệm 3: Định tính một số thành phần hóa học của các loại cao chiết từ Hoa Sứ vàng. ........................................................................................................... 38

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 40

3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hàm lượng thu hồi cao từ Hoa Sứ vàng ................................................................................................... 40

3.2. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Hoa Sứ vàng với các loại dung môi tách chiết khác nhau trên các chủng vi khuẩn chỉ thị. .................... 41

3.2.1. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli ....................................................................................................... 41

3.2.2. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Listeria spp. ............................................................................................................. 44

3.3.3. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Salmonella spp. ....................................................................................................... 46

3.3.4. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Shigella spp. ............................................................................................................ 48

3.3.5. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Vibrio spp. ............................................................................................................... 50

3.3.6. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn còn lại. ..................................................................................................................... 53

3.3.7. Tổng hợp kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với 20 vi khuẩn gây bệnh gây bệnh ........................................................................................ 55

iii

Đồ án tốt nghiệp

3.3. Kết quả định tính một số thành phần hóa học cơ bản của cao chiết Hoa Sứ vàng từ ethanol 70%. ................................................................................................ 59

Kết luận và kiến nghị ................................................................................................... 62

1. Kết luận .................................................................................................................. 62

2. Kiến nghị ................................................................................................................ 62

Tài liệu tham khảo ....................................................................................................... 63

Phụ lục ............................................................................................................................. 1

iv

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

TSB: Trypton Soya Broth

TSA: Trypticase Soya Agar

DMSO: Dimethyl Sulfoxide

NA: Non activity

DNA: Deoxyribonucleic acid

RNA: Ribonucleic acid

v

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Kết quả đường kính vòng ức chế (mm) các loại cao chiết khác nhau từ Hoa Sứ vàng đối với 20 chủng vi sinh vật chỉ thị. ................................................................. 55 Bảng 3.2. Kết quả định tính một số thành phần hóa học của cao chiêt Hoa Sứ vàng từ ethanol 70%. ................................................................................................................... 59

vi

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Hoa Sứ vàng ..................................................................................................... 3 Hình 1.2. Cây Hoa Sứ vàng ............................................................................................. 4 Hình 1.3. Công thức hóa học của fulvoplumierin và plumierid ...................................... 6 Hình 1.4. Hình thái E.coli trên kính hiển vi điện tử ....................................................... 16 Hình 1.5. Hình thái Salmonella trên kính hiển vi điện tử. ............................................. 17 Hình 1.6. Hình thái Vibrio trên kính hiển vi điện tử ...................................................... 18 Hình 1.7. Hình thái Shigella trên kính hiển vi điện tử. .................................................. 19 Hình 1.8. Hình thái Pseudomonas aeruginosa trên kính hiển vi điện tử. ...................... 20 Hình 1.9. Hình thái Enterococcus faecalis trên kính hiển vi điện tử. ............................ 22 Hình 1.10. Hình thái Staphylococcus trên kính hiển vi điện tử ..................................... 23 Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát ................................................................... 33 Hình 2.2. Quy trình tách chiết và thu cao Hoa Sứ vàng từ các loại dung môi khác nhau. ........................................................................................................................................ 34 Hình 2.3. Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết Hoa Sứ vàng với các chủng vi khuẩn chỉ thị. ...................................................................................... 36 Hình 2.4. Quy trình định tính thành phần hóa học của cao chiết Hoa Sứ vàng. ............ 38 Hình 3.1. Hàm lượng thu hồi cao chiết từ Hoa Sứ vàng với các loại dung môi ............ 40 Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết và đối chứng đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli. .................................................................................................. 42 Hình 3.3. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết và đối chứng đối với nhóm vi khuẩn Listeria spp. ......................................................................................................... 44 Hình 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết và đối chứng đối với nhóm vi khuẩn Salmonella spp. ................................................................................................... 46 Hình 3.5. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết và đối chứng đối với nhóm vi khuẩn Shigella spp. ........................................................................................................ 49 Hình 3.6. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết và đối chứng đối với nhóm vi khuẩn Vibrio spp. ........................................................................................................... 51 Hình 3.7. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết và đối chứng đối với nhóm vi khuẩn còn lại. ................................................................................................................. 53

vii

Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Việt Nam là nước có hệ thực vật rất phong phú và đa dạng. Tổng số loài thực

vật đã ghi nhận ở Việt Nam khoảng 10.500 loài trong tổng số 12.000 loài theo ước

tính. Trong số đó, nguồn tài nguyên cây làm thuốc chiếm khoảng 30%. Kết quả điều tra

nguồn tài nguyên cây thuốc của Viện Dược liệu (2006) cho biết ở Việt Nam có 3.948

loài thực vật bậc cao, bậc thấp và nấm lớn được dùng làm thuốc. Trong thời gian qua,

nước ta đã có hơn 3.000 loại thuốc có nguồn gốc từ thảo dược được cấp số đăng ký,

chiếm gần 1/3 trong tổng số thuốc mới được cấp số đăng ký lưu hành hàng năm. Như

vậy nhu cầu sử dụng cây dược liệu chế xuất thuốc trong nước là rất lớn. Không những

vậy, việc sử dụng dược phẩm có nguồn gốc thiên nhiên cũng đang được các nước trên

thế giới hết sức quan tâm.

Cây thuốc được coi là di sản quý báu của dân tộc ta.Từ xa xưa, cây thuốc gắn

liền với cuộc sống của các gia đình người Việt và có giá trị lớn trong điều trị bệnh. Tuy

chỉ là những cỏ cây gần gũi, thân quen xung quanh con người nhưng chúng được sử

dụng tạo ra các bài thuốc rất hữu hiệu. Các loài thuốc thảo mộc ít gây tác dụng phụ,

độc hại cho người sử dụng và có khả năng dung nạp tốt với cơ thể sống.Hiện nay, hoạt

tính kháng khuẩn của cây thuốc ngày càng được nghiên cứu và phát triển nhiều hơn bởi

các nhà khoa học đã nhận ra các giá trị to lớn từ cây thuốc mang lại cho việc điều trị

bệnh. Trong thời đại mà việc sử dụng thuốc kháng sinh không còn hiệu quả thì thảo

dược tự nhiên là câu trả lời đáng tin cậy và dài hạn cho việc ức chế vi sinh vật có hại và

nâng cao đề kháng, hỗ trợ tốt cho quá trình điều trị bệnh. Theo một số nghiên cứu, các

loại thảo dược điển hình như Trầu Không (Piper betle L.), Sống Đời (Kalanchoe

pinnata (Lam). Pers.), Lô hội (Aloe barbadensis), Dâu Tằm (Morus acidosa Griff), Khổ

Qua (Momordica charantia L.)… đã được xác định là có hoạt tính kháng khuẩn rất

mạnh đối với nhiều loại vi khuẩn như Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella spp.

… Chính vì thế mà ngày nay, không chỉ riêng ở Việt Nam mà cả trên thế giới, các nhà

1

Đồ án tốt nghiệp

khoa học không ngừng nghiên cứu và tìm hiểu sâu hơn về hoạt tính sinh học và thành

phần hóa học của các loài thực vật.Điều này giúp họ sử dụng hiệu quả hơn các nguồn

dược liệu sẵn có, đồng thời phát hiện thêm các loại thảo dược mới, quý hiếm, có khả

năng kháng được nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh.

Plumeria là một loài thực vật khá phổ biến ở Việt Nam. Trong đó, ngoài giá trị

làm cảnh trang trí thì nó còn được sử dụng trong y học dân gian để chữa các bệnh như

viêm ruột, lỵ, khó tiêu, nhiễm khuẩn, viêm gan… Thành phần hóa học cũng như các

hoạt tính sinh học của Plumeria đã được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm

nghiên cứu, nhiều hợp chất có hoạt tính tốt đã được công bố. Tuy nhiên, ở Việt Nam

việc nghiên cứu về cây này vẫn chưa có tài liệu nào được công bố rộng rãi.

Từ những vấn đề trên tôi quyết định chọn đề tài: “Nghiên cứu hoạt tính

kháng khuẩn của một số cao chiết và bước đầu định tính thành phần hóa học của

Hoa Sứ vàng (Plumeria rubra F. Tricilor)” để thực hiện đồ án tốt nghiệp.

2. Mục tiêu nghiên cứu

- Đánh giá ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của

cao chiết từ Hoa Sứ vàng.

- Xác định sơ bộ thành phần hóa học trong cao chiết.

3. Nội dung nghiên cứu

- Xác định hoạt tính kháng khuẩn của 4 loại cao chiết Hoa Sứ vàng từ 4 dung

môi EtOH 50%, EtOH 70%, EtOH 96% và nước.

- Xác định thành phần hóa học của cao chiết.

2

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Đại cương về Hoa Sứ vàng

1.1.1. Nguồn gốc và tên gọi

Xuất xứ của hoa sứ từ Trung mỹ và Caribe. Ngày nay hoa sứ được tìm thấy

nhiều ở các hải đảo Thái Bình Dương, các quốc gia Nam Á, Ɖông Nam Á, Trung và

Nam Mỹ. Hoa sứ là quốc hoa của Lào và của Nicaragua, nơi hoa sứ được gọi

là Sacuanjoche. Quốc hiệu Champa mà ta gọi là Chiêm Thành có gốc tiếng Ấn Ɖộ

(Hindi) có nghĩa là cây hoa sứ.

Tên khoa học của cây hoa sứ là Plumeria rubra thuộc họ Apocynaceae của

trúc đào. Chữ Plumeria là tên của nhà thực vật học Pháp Charles Plumier vào thế kỷ

XVII. Người Anh gọi hoa sứ là temple tree vì ở Ấn Ɖộ và Sri Lanka cây hoa sứ được

trồng quanh các đền Ấn Giáo và chùa Phật Giáo. Nó cũng được trồng trong các nghĩa

địa. Ở Sri Lanka nó được xem là sinh mộc. Hoa sứ cũng còn được gọi là frangipani do

tên của hầu tước Ý Muzio Frangipani mà ra. Người Ấn Ɖộ gọi hoa sứ là Champa;

Lào:Champa; Sri Lanka tức đảo Ceylon: Champey; Indonesia: Kampoja; Trung

Hoa: Dai Ji Hua (Ɖại Cát Hoa); Khmer: Champei krahom (hoa sứ đỏ); tiếng Tagalog

(Phi Luật Tân): Kalasusi, v.v.

1.1.2 Phân loại

Lớp: Dicotyledons

Bộ: Gentianales

Họ: Apocynaceae (Trúc Đào)

Chi: Plumeria

Loài: P.rubra

Tên khoa học: Plumeria rubra L. tricilor

Tên thường gọi: Sứ cùi, cây Đại,…

Hình 1.1. Hoa Sứ vàng

3

Đồ án tốt nghiệp

1.1.3. Đặc điểm hình thái

Cây cao khoảng 2-3m, có khi cao đến 7m. Thân tròn mập, phân cành nhiều

nhánh, dài, khẳng khiu, cong, xù xì. Vỏ cây có màu trắng xám với những sẹo lá để lại.

Cây có nhựa mủ.

Hình 1.2. Cây Hoa Sứ vàng

Lá cây Sứ thuôn dài có hình bầu dục, rộng ở giữ và hẹp ở cả 2 đầu. Lá có màu

xanh bóng, nhẵn ở mặt trên, lớp lông mịn cùng với gân chính màu trắng và các gân

viền ở mép nổi rõ ở mặt dưới lá. Lá xếp sát nhau thành vòng ở ngọn cành, khi rụng để

lại sẹo lớn ở cành.

Cây Sứ ra những cụm hoa trên cuống chung dài khoảng 30-50cm, phân nhánh

ở vòng đỉnh, có nhiều sẹo do hoa rụng. Các hoa có cánh dày, mập, khi còn nụ thì xếp

vặn, nở bung thì có màu trắng ở viền của cánh hoa, tâm màu vàng cùng nhị đính trên

ống tràng và phía sau cánh hoa có những đường sọc màu hồng. Hoa nở quanh năm và

mang mùi thơm thoang thoảng. Cây Sứ có quả mọc choãi thẳng hàng, dài từ 10 –

15cm. Quả chứa các hạt có cánh nhưng ít gặp vì Sứ Đại khó đậu trái.

Cây Sứ có tốc độ sinh trưởng nhanh. Đây là cây ưa sáng, phát triển tốt trên đất

giàu dinh dưỡng, thoát nước tốt. Cây còn có thể trồng trên đất cát, đất sỏi vì Sứ có khả

năng chịu hạn cao.

4

Đồ án tốt nghiệp

1.1.4. Phân bố

Cây được trồng nhiều tại công viên, dọc đường phố, khu đô thị, khu công

nghiệp, trồng dọc lối đi, dải phân cách, cảnh quan nhà máy, bệnh viện hay trồng sân

vườn… Những đình, chùa, lăng miếu hay nghĩa trang cũng sử dụng loại cây này rất

nhiều.

1.1.5. Tác dụng dược lý

Hoa Sứ có vị ngọt, tính bình, thơm, có tác dụng thanh nhiệt, lợi tiểu, hòa vị,

nhuận tràng, bổ phổi. Có tác dụng hạ huyết áp rất rõ, ở hoa khô có tác dụng mạnh hơn

ở hoa tươi. Vỏ cây có vị đắng, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, tả hạ, tiêu thủng, sát

trùng. Lá có tác dụng hành huyết, tiêu viêm. Nhựa có tác dụng tiêu viêm và làm mềm

những tổ chức rắn chai chân. (Võ Văn Chi, 2012).

1.1.6. Công dụng

Công dụng làm cảnh: Sứ có nhiều loại và màu sắc khác nhau, từ nhứng cây

nhỏ được trồng trong chậu đặt ở những vị trí nhỏ hẹp như sân thượng, ban công

nhà,…cho tới những cây lớn được trồng trong sân vườn, công viên, đình chùa,….đem

lại vẻ đẹp hương thơm từ hoa nở quanh năm và bóng mát từ tàn cây rộng.

Công dụng làm thuốc: Theo y học cổ truyền, các bộ phận sau của cây hoa sứ

có thể dùng làm thuốc như vỏ thân, vỏ rễ, hoa, nụ hoa, lá tươi và nhựa cây, nhưng sử

dụng nhiều nhất là hoa. Toàn cây có chứ một loại kháng sinh thực vật là fulvo

plumierin, có tác dụng ức chế sự tăng sinh và phát tiển của một số vi khuẩn

Mycobacterium tuberculosis. Từng bộ phận khác nhau của cây có những công dụng

khác nhau:

Hoa dùng trong các trường hợp như say nắng; viêm ruột, lỵ; khó tiêu, kém hấp

và kém dinh dưỡng ở trẻ em; nhiễm khuẩn, viêm gan; viêm phế khí quản, ho. Người ta

còn dùng hoa Sứ làm thuốc chữa bênh ưa chảy máu có kết quả tốt. Ngày dùng 10-15g

dạng thuốc sắc. Không dùng cho người suy nhược toàn thân, ỉa chảy và phụ nữ có thai.

5

Đồ án tốt nghiệp

Hoa sứ khô là nguyên liệu để làm gối rất tốt, có nhiều tác dụng trị bệnh mất ngủ, ngủ

không ngon giấc.

Vỏ dùng chữa thủy thủng, tiểu tiện ít hoặc táo bón lâu ngày, viêm chân răng.

Ngày dùng 4-8g để nhuận tràng, 8-20g để tẩy, 12-20g ngâm rượu ngậm chữa viêm

chân răng. Ở Ấn Độ, người ta còn dùng vỏ trị ỉa chảy và dùng vỏ rễ để trị bệnh lậu và

loét đường sinh dục.

Nhựa cũng dùng được như vỏ, còn dùng chữa chai chân, sưng tấy, mụn nhọt

dưới dạng nhũ dịch, thường dùng bôi. Ở Ấn Độ, người ta còn dùng như chất gây sung

huyết để trị thấp khớp và còn dùng sổ.

Lá chữa bong gân, sai khớp, mụn nhọt, thường dùng giã đắp ngoài, không kể

liều lượng. Ở Papua Niu Ghinê dịch lá đùng đắp vết thương rắn cắn hoặc dùng nhựa

cây đắp vào chỗ đau.

Hình 1.3. Công thức hóa học của fulvoplumierin và plumierid

1.1.7. Thành phần hóa học và dược chất

Tinh dầu hoa có hàm lượng 0,04-0,07%; trong tinh dầu có geraniol,

citroneellal, farnesol, linalol và aldehyd, fulvoplumierin, chất nhựa quercetin, vết

kaempferol và cyanidin, diglycosid. Vỏ ngoài chứa fulvoplumierin và plumierid,

agoniadin, acid plumieric, acid cerotinic, lupeol. Lá chứa 0,83% plumierid, acid

resinic. Nhựa chứ acid plumieric.

6

Đồ án tốt nghiệp

Fulvoplumierin có tác dụng ức chế các chủng khác nhau của Mycobacterium

tuberculosis ở nồng độ 1 - 5mg/1ml. Plumierid là iridoid glycosid có tác dụng lên vi

khuẩn gram âm và gram dương.

Nghiên cứu tại Trường Dược Illinois (Chicago), ghi nhận hoạt chất loại

iridoid: fulvoplumierin trích từ Sứ có khả năng ức chế men reverse transcriptase của

siêu vi HIV-1 nơi người (Journal of Natural Products Số 54 (Jan-Feb)-1991).

1.2. Đại cương về một số hợp chất kháng khuẩn từ thực vật

1.2.1 Khái niệm và phân loại

Các hợp chất kháng khuẩn từ thực vật là những hợp chất hữu cơ có nguồn gốc

thực vật, có tác dụng tiêu diệt hay kìm hãm sự phát triển của các vi khuẩn, virus. Các

hợp chất kháng khuẩn thường có tác dụng khá đặc hiệu lên các loài vi khuẩn khác nhau

ở một nồng độ thường là rất nhỏ. Những chất này có thể thuộc nhiều cấu trúc hóa học

khác nhau như alkaloid, các hợp chất quinone, flavonoid, tinh dầu v.v…

Ngày nay người ta chia các hợp chất kháng khuẩn từ thực vật ra làm 2 nhóm

sau:

Nhóm bay hơi: gồm những chất do thực vật tiết ra có khả năng khuếch tán vào

không khí và có tác dụng ức chế sự sinh trưởng, phát triển của virus, vi khuẩn.

Nhóm không bay hơi: gồm những chất ở sâu trong các tế bào thực vật, không

có khả năng khuếch tán vào không khí. Muốn sử dụng nó, phải dựa vào đặc điểm, tính

chất của từng loại kháng sinh thực vật. Thường người ta hay sử dụng chúng dưới các

dạng: Giã nát lấy nước cốt, ngâm, sắc hoặc chiết bằng các dung môi thích hợp.

1.2.2. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật

Cơ chế chung của các hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc thực vật bao gồm

việc phá vỡ màng chức năng và cấu trúc tế bào, gây ra sự gián đoạn quá trình tổng hợp

cùng chức năng của DNA và RNA, gây cản trở các chuyển hóa trung gian tế bào, gây

đông tụ các thành phần tế bào chất và làm gián đoạn quá trình truyền thông tin của tế

bào. Ngoài ra quá trình hoạt động kháng khuẩn còn bao gồm cả PSMs (Plant secondary

7

Đồ án tốt nghiệp

metabolites) tác động tới màng tế bào, khuếch tán qua màng tế bào rồi tác động tương

tác với các thành phần nội bào từ đó ảnh hưởng tác động tới hoạt động tế bào

(Radulovíc và ctv, 2013).

1.2.3. Một số hợp chất kháng khuẩn trong Hoa Sứ vàng

1.2.3.1. Alkaloid

a) Khái niệm về alkaloid

Năm 1819, Wilhelm Meissner đề nghị xếp các chất có tính kiềm lấy từ thực vật

ra thành một nhóm riêng và gọi tên là alkaloid. Ông là người đầu tiên đưa ra khái niệm

về alkaloid: Alkaloid là những hợp chất hữu cơ, có chứa nitơ, có phản ứng kiềm và lấy

từ thực vật.

Theo Polonopski: Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có

nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khi có trong động

vật, thường có dược lực tính mạnh và cho những phản ứng hóa học với một số thuốc

thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid.

b) Tính chất chung của alkaloid

Đặc điểm lý học:

Thể chất: Phần lớn alkaloid trong thiên nhiên công thức cấu tạo có oxy nghĩa

là trong công thức có C, H, N, O, những alkaloid này thường ở thể rắn ở nhiệt độ

thường. Ví dụ: Morphine (C17H19NO3), codein (C18H21NO3), strychnin (C21H22N2O2),

quinin (C20H24N2O2), reserpin (C33H40O9N2)… Những alkaloid thành phần cấu tạo

không có oxy thường ở thể lỏng. Ví dụ như: Coniin (C8H17N), nicotin (C10H14N2),

spartein (C15H26N2 ). Các alkaloid ở thể rắn thường kết tinh được và có điểm chảy rõ

ràng, nhưng cũng có một số alkaloid không có điểm chảy vì bị phân hủy ở nhiệt độ

trước khi chảy. Những alkaloid ở thể lỏng bay hơi được và thường vững bền, không bị

phân hủy ở nhiệt độ sôi nên cất kéo được bằng hơi nước để lấy ra khỏi dược liệu.

Mùi vị: Đa số alkaloid không có mùi, có vị đắng và một số ít có vị cay như

capsaixin, piperin…

8

Đồ án tốt nghiệp

Màu sắc: Hầu hết các alkaloid đều không màu trừ một số ít alkaloid có màu

vàng như berberin, palmatin, chelidonin,

Độ tan: Nói chung các alkaloid base không tan trong nước, dễ tan trong các

dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, ether, chloroform, benzen.. trái lại các muối

alkaloid thì dễ tan trong nước, hầu như không tan trong các dung môi hữu cơ ít phân

cực.

Đặc điểm hóa học: Hầu như alkaloid đều có tính base yếu, song cũng có chất

có tác dụng như base mạnh có khả năng làm xanh giấy quỳ đỏ như nicotin, cũng có

chất tính base rất yếu như cafein, piperin… vài trường hợp ngoại lệ có những alkaloid

không có phản ứng kiềm như colchicin, ricinin, theobromin và cá biệt cũng có chất có

phản ứng acid yếu như arecaidin, guvacin.

Do có tính base yếu nên có thể giải phóng alkaloid ra khỏi muối của nó bằng

những kiềm trung bình và mạnh như NH4OH, MgO, cacbonat kiềm, NaOH… khi định

lượng alkaloid bằng phương pháp đo acid người ta phải căn cứ vào độ kiềm để lựa

chọn chỉ thị màu cho thích hợp.

Tác dụng với acid, alkaloid cho các muối tương ứng.

Alkaloid kết hợp với kim loại nặng (Hg, Bi, Pt…) tạo ra muối phức.

Các alkaloid cho phản ứng với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của

alkaloid.

c. Vai trò của alkaloid

Alkaloid nói chung là những chất có hoạt tính sinh học, có nhiều chất rất độc.

Tác dụng của alkaloid thường khác nhau. Nhiều alkaloid có tác dụng lên hệ thần kinh

trung ương gây ức chế như morphin, codein, scopolamin, reserpin hoặc gây kích thích

như strychnin, cafein, lobelin. Nhiều chất tác dụng lên hệ thần kinh giao cảm gây kích

thích: Ephedrin, hordenin, làm liệt giao cảm, ergotamin, yohimbin hoặc kích thích phó

giao cảm: pilocarpin, eserin; có chất gây liệt phó giao cảm: hyoscyamin, atropin; có

chất phong bế hạch giao cảm: nicotin, spartein, coniin.

9

Đồ án tốt nghiệp

Trong số alkaloid có chất gây tê tại chỗ, có chất làm giãn cơ trơn, chống co

thắt. Có alkaloid làm tăng huyết áp (ephedrin, hydrastin), có chất làm hạ huyết áp trên

tim như ajmalin, quinidin và α-fagarin được dùng làm thuốc chữa loạn nhịp tim. Có

alkaloid diệt ký sinh trùng: Quinin độc đối với ký sinh trùng sốt rét; emetin và conexin

độc đối với amip dùng để chữa lỵ. Isopelletierin, arecolin dùng để trị sán.

1.2.3.2. Flavonoid

a. Khái niệm chung về flavonoid

Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn thường gặp trong thực vật. Hơn một nửa

rau quả thường dùng có chứa flavonoid. Flavonoid cũng là thành phần hay gặp trong

dược liệu nguồn gốc thực vật. Cho đến nay có khoảng 4.000 chất đã được xác định cấu

trúc. Phần lớn các chất flavonoid có màu vàng (Flavonoid do từ flavus có nghĩa là màu

vàng). Tuy nhiên một số có màu xanh, tím đỏ, một số khác lại không có màu cũng

thuộc nhóm flavonoid. Trong thực vật cũng có một số nhóm hợp chất khác không

thuộc flavonoid nhưng lại có màu vàng như carotenoid, anthranoid, xanthon, cần chú ý

để khỏi nhầm lẫn.

b. Tính chất chung của flavonoid

Các dẫn chất flavon có màu vàng rất nhạt có khi không màu (trường hợp các

nhóm OH đã methyl hoá), flavonol vàng nhạt đến vàng, chalcon và auron vàng đậm

đến đỏ cam. Các chất thuôc nhóm isoflavon, flavanon, isoflavanon, flavanonol, leuco-

anthocyanidin, flavan-3-ol do không có nối đôi liên hiệp giữa vòng B với nhóm

carbonyl nên không màu.

Các dẫn chất anthocyanidin thì màu thay đổi tuỳ theo pH của môi trường. Tuy

nhiên khi các flavonoid ở trong các bộ phận của cây thì còn phụ thuộc vào hỗn hợp với

các sắc tố khác.

Độ tan không giống nhau, thường flavonoid glycoside và flavonoid sulfat là

những hợp chất phân cực nên không tan hoặc ít tan trong dung môi hữu cơ, tan được

trong nước tốt nhất là cồn nước. Các aglycon flavonoid thì tan được trong dung môi

10

Đồ án tốt nghiệp

hữu cơ, không tan trong nước. Các dẫn chất flavonoid có nhóm 7hydroxy thường dễ

tan trong dung dịch kiềm loãng.

c. Vai trò của flavonoid

Các dẫn chất flavonoid có khả năng dập tắt các gốc tự do như HO., ROO.. Các

gốc này sinh ra trong tế bào bởi nhiều nguyên nhân và khi sinh ra cạnh DNA thì sẽ gây

ra những ảnh hưởng nguy hại như gây biến dị, hủy hoại tế bào, gây ung thư, tăng

nhanh sự lão hoá.

Flavonoid cùng với acid ascorbic tham gia trong quá trình hoạt động của

enzyme oxy hoá - khử. Flavonoid được dùng trong các trường hợp rối loạn chức năng

tĩnh mạch, tĩnh mạch bị suy yếu, giãn tĩnh mạch, các bệnh trong nhãn khoa. Các dẫn

chất anthocyanosid có tác dụng tái tạo tế bào võng mạc.

Tác dụng chống độc của flavonoid thể hiện làm giảm thương tổn gan, bảo vệ

được chức năng gan. Flavonoid thể hiện tác dụng chống co thắt những tổ chức cơ nhẵn

(túi mật, ống dẫn mật, phế quản và một số tổ chức khác). Flavonoid còn có tác dụng

thông tiểu, chống loét chữa đau dạ dày, chống viêm điều trị ban đỏ, viêm da, tổn

thương da và màng nhầy trong trường hợp xạ trị, điều hòa nhịp tim.

Một số tài liệu gần đây có nói đến tác dụng chống ung thư của một số chất như

leucocyanidin, leucopelargonidin, leucodelphinidin và tác dụng kháng HIV của một số

dẫn chất thuộc nhóm flavon như chrysin, acacetin 7-O-b-Dgalactopyranosid.

1.2.3.3. Tinh dầu

a. Khái niệm về tinh dầu

Tinh dầu là một hỗn hợp của nhiều thành phần, thường có mùi thơm, không

tan trong nước, tan trong các dung môi hữu cơ, bay hơi được ở nhiệt độ thường và có

thể điều chế từ thảo mộc bằng phương pháp cất kéo hơi nước.

b. Tính chất chung của tinh dầu

Thể chất: Đa số là chất lỏng ở nhiệt độ thường, một số thành phần ở thể rắn:

Menthol, borneol, camphor, vanilin, heliotropin.

11

Đồ án tốt nghiệp

Màu sắc: Không màu hoặc vàng nhạt. Do hiện tượng oxy hóa màu có thể sẫm

lại. Một số có màu đặc biệt: Các hợp chất azulen có màu xanh mực

Mùi: Đặc biệt, đa số có mùi thơm dễ chịu, một só có mùi hắc, khó chịu (tinh

dầu giun).

Vị: cay, một số có vị ngọt: Tinh dầu quế, hồi.

Bay hơi được ở nhiệt độ thường.

Tỷ trọng: Đa số nhỏ hơn 1. Một số lớn hơn 1: Quế, đinh hương, hương nhu.

c. Vai trò của tinh dầu

Tinh dầu đóng vai trò quyến rũ côn trùng giúp cho sự thụ phấn của hoa. Một số

nghiên cứu khác cho rằng tinh dầu bài tiết ra có nhiệm vụ bảo vệ cây, chống lại sự xâm

nhập của nấm và các vi sinh vật khác.

Tinh dầu và các dược liệu chứa tinh dầu có một phạm vi sử dụng rất rộng lớn

trong đời sống hàng ngày của con người, trong nhiều ngành khác nhau thể hiện qua

những tác dụng:

Tác dụng trên đường tiêu hoá: Kích thích tiêu hoá, lợi mật, thông mật.

Tác dụng kháng khuẩn và diệt khuẩn: Tác dụng trên đường hô hấp như tinh

dầu bạch đàn, bạc hà. Tác dụng trên đường tiết niệu như tinh dầu hoa cây Barosma

betulina.

Một số có tác dụng kích thích thần kinh trung ương: Dược liệu chứa tinh dầu

giàu anethol: Đại hồi...

Một số có tác dụng diệt ký sinh trùng.

Rất nhiều tinh dầu có tác dụng chống viêm, làm lành vết thương, sinh cơ v.v..

khi sử dụng ngoài da.

1.2.3.4. Saponin

a. Khái niệm saponin

12

Đồ án tốt nghiệp

Saponin còn gọi là saponosid do chữ latin sapo là xà phòng (vì tạo bọt như xà

phòng), là một nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi trong thực vật. Người ta cũng phân lập

được saponin trong động vật như hải sâm, cá sao.

b. Tính chất chung của saponin

Saponin có một số tính chất đặc biệt: làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều

khi lắc với nước, có tác dụng nhũ hoá và tẩy sạch; làm vỡ hồng cầu ngay ở những

nồng độ rất loãng; có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3-b -

hydroxysteroid khác.

Saponin gây độc với cá vì saponin làm tăng tính thấm của biểu mô đường hô

hấp nên làm mất các chất điện giải cần thiết, ngoài ra có tác dụng diệt các loài thân

mềm như giun, sán, ốc sên.

Saponin đa số có vị đắng, tan trong nước, alcol, rất ít tan trong aceton, ether,

hexan do đó người ta dùng 3 dung môi này để tủa saponin. Saponin khó bị thẩm tích,

người ta dựa vào tính chất này để tinh chế saponin trong quá trình chiết xuất.

c. Vai trò của saponin

Saponin có tác dụng long đờm, chữa ho. Một số dược liệu chứa saponin có tác

dụng thông tiểu như rau má, tỳ giải, thiên môn, mạch môn,... Saponin làm tăng sự thấm

của tế bào; sự có mặt của saponin sẽ làm cho các hoạt chất khác dễ hoà tan và hấp thu

Một số saponin có tác dụng chống viêm. Một số có tác dụng kháng khuẩn,

kháng nấm, ức chế virus. Một số có tác dụng chống ung thư trên thực nghiệm. Nhiều

saponin có tác dụng diệt các loài thân mềm (nhuyễn thể). Sapogenin steroid dùng làm

nguyên liệu để bán tổng hợp các thuốc steroid.

1.2.3.5. Tannin

a. Khái niệm chung về tannin

Từ "Tanin" được dùng đầu tiên vào năm 1796 để chỉ những chất có mặt trong

dịch chiết từ thực vật có khả năng kết hợp với protein của da sống động vật làm cho da

biến thành da thuộc không thối và bền. Do đó, tanin được định nghĩa là những hợp chất

13

Đồ án tốt nghiệp

polyphenol có trong thực vật có vị chát được phát hiện dương tính với "thí nghiệm

thuộc da" và được định lượng dựa vào mức độ hấp phụ trên bột da sống chuẩn.

b. Tính chất chung của tannin

Tanin có vị chát, làm săn da, tan được trong nước, kiềm loãng, cồn, glycerin và

aceton, hầu như không tan trong các dung môi hữu cơ.

Kết tủa với gelatin. Dung dịch tanin (0,5-1%) khi thêm vào dung dịch gelatin

1% có chứa 10% natrichlorid thì sẽ có tủa. Acid gallic và các pseudotanin khác cũng

làm kết tủa gelatin nhưng với dung dịch tương đối đậm đặc.

Kết tủa với các alkaloid. Tanin tạo tủa với các alcaloid hoặc một số dẫn chất

hữu cơ có chứa nitơ khác như hexamethylen tetramin, dibazol...

Kết tủa với muối kim loại. Tanin cho tủa với các các muối kim loại nặng như

chì, thuỷ ngân, kẽm, sắt.

Phát hiện acid chlorogenic. Dịch chiết có acid chlorogenic khi thêm dung dịch

ammoniac rồi để tiếp xúc không khí dần dần sẽ có màu xanh lục.

c. Vai trò của tannin

Ở trong cây, tanin tham gia vào quá trình trao đổi chất, các quá trình oxy hoá

khử. Là những chất đa phenol, tanin có tính kháng khuẩn nên có vai trò bảo vệ cho cây.

Dung dịch tanin kết hợp với protein, tạo thành màng trên niêm mạc nên ứng

dụng làm thuốc săn da. Tanin còn có tác dụng kháng khuẩn nên dùng làm thuốc súc

miệng khi niêm mạc miệng, họng bị viêm loét, hoặc chỗ loét khi nằm lâu. Tanin có thể

dùng trong để chữa viêm ruột, chữa tiêu chảy.

Tanin kết tủa với kim loại nặng và với alcaloid nên dùng chữa ngộ độc đường

tiêu hoá. Tanin có tác dụng làm đông máu nên dùng đắp lên vết thương để cầm máu,

chữa trĩ, rò hậu môn.

1.2.4. Tình hình nghiên cứu về Hoa Sứ trên thế giới và tại Việt Nam

Tình hình nghiên cứu về Hoa Sứ trên thế giới

14

Đồ án tốt nghiệp

 Năm 2010, Ajay Singh Baghel và cộng sự đã nghiên cứu về khả năng kháng

khuẩn của chiết xuất từ hoa Plumeria rubra L. bằng các loại dung môi nước,

ethanol, etyl acetate, chloroform.

 Năm 2015, Lawal và cộng sự đã khảo sát thành phần hóa học của chiết xuất

tinh dầu từ lá Plumeria rubra L. trồng ở Nigeria.

 Năm 2012, Ramproshad và cộng sự đã nghiên cứu chiết xuất etanol thô của

Plumeria rubra cho thấy có hoạt tính chống oxy hoá mạnh và có hoạt tính

kháng khuẩn trung bình. Hoạt động giảm đau của Plumeria rubra đã được

thử nghiệm bằng mô hình xoắn gây axit axetic ở chuột. Chiết xuất này gây

ra sự ức chế đáng kể ở liều 500mg/kg-thể trọng. Chiết xuất thô của

Plumeria rubra trong thí nghiệm cho thấy nó có hoạt tính giảm đau mạnh.

 Năm 2014, Muruganantham và cộng sự đã nghiên cứu khả năng kháng

khuẩn và kháng nấm của chiết xuất ethanol từ Plumeria rubra.

 Năm 2008, Laila Jarin đã nghiên cứu hoạt động kháng nấm và kháng khuẩn

từ chiết xuất tinh dầu của Plumeria rubra.

Tình hình nghiên cứu về cây Sứ tại Việt Nam đặc biệt là Hoa Sứ vàng hiện còn

chưa có tài liệu và nghiên cứu được công bố rộng rãi.

1.3 Giới thiệu một số nhóm vi sinh vật gây bệnh

1.3.1 Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy

1.3.1.1 Nhóm vi khuẩn Escherichia coli

a) Đặc điểm

Escherichia là trực khuẩn Gram âm hình que, kị khí tùy nghi, không sinh bào

tử. Nhiệt độ thích hợp 37oC, pH 7,2 – 7,4. Sống chủ yếu hội sinh trong đường ruột của

người và động vật. Chúng được biết đến như là nguyên nhân chủ yếu gây nhiễm trùng

đường tiết niệu và các bệnh đường tiêu hóa (Trần Văn Cường, 2009).

Đặc điểm sinh hóa của Escherichia: do chúng có phản ứng lên men đường nên

dòng Escherichia cụ thể là E. coli lên men sinh hơi các loại đường lactose, fructose,

15

Đồ án tốt nghiệp

glucose, levulose, galactose, xylose, manitol; lên men không chắc chắn các loại đường

dulcitol, saccharose và salicin. Ngoài ra chúng còn có một số phản ứng sinh hoá khác

như phản ứng Indol và MR dương tính, phản ứng H2S, VP, Urea âm tính (Trần Văn

Cường, 2009).

Hình 1.4. Hình thái E.coli trên kính hiển vi điện tử

b) Khả năng gây bệnh

Escherichia sản sinh nhiều loại độc tố: enterotoxin, vertoxin, neurotoxin. Mỗi

loại độc tố gắn với một thể bệnh mà chúng gây ra (Trần Văn Cường, 2009).

1.3.1.2 Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Salmonella

a) Đặc điểm

Salmonella là trực khuẩn Gram âm kị khí tùy nghi, hình que, có khả năng di

động, kích thước 0.4 – 0.6 x 1 – 3 μm thích hợp phát triển tốt ở nhiệt độ 37oC, pH 7,2-

7,6 (Trần Văn Cường, 2009).

16

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.5. Hình thái Salmonella trên kính hiển vi điện tử.

b) Khả năng gây bệnh

Salmonella cũng có khả năng sản sinh ra độc tố enterotoxin, ngoài việc phá

hủy lớp niêm mạc ruột, độc tố này cũng có tác động gây tiêu chảy, độc tố thẩm xuất

chậm (DPF - Delayed Permeability Factor – độc tố không chịu nhiệt) và độc tố thẩm

xuất nhanh (RPF - Rapid Permeability Factor - độc tố chịu nhiệt) (Trần Văn Cường,

2009).

1.3.1.3 Nhóm vi khuẩn Vibrio spp.

a) Đặc điểm

Vibrio là phẩy khuẩn Gram âm, hình cong, kích thước 0,3-0,5 x 1,4-2,6 μm.

Chúng không hình thành bào tử và chuyển động nhờ một tiên mao hoặc nhiều tiên mao

mảnh, kỵ khí tùy nghi. Chúng phát triển tốt trong môi trường dinh dưỡng thường và

môi trường kiềm (pH >7) Vibrio có thể sống được vài ngày đến 2-3 tuần. Dễ bị diệt bởi

nhiệt độ (80°C/5 phút), bởi hoá chất thông thường và môi trường axit. nhiệt độ thích

hợp là 37oC, có thể phát triển tốt trong môi trường kiềm (pH 8,5- 9,5), có nồng độ

NaCl cao (3%) (Triệu Anh Tuấn, 2013).

17

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.6. Hình thái Vibrio trên kính hiển vi điện tử

Nhóm Vibrio còn có các đặc điểm đó là di động, cho phản ứng oxidase và

catalase dương tính (Triệu Anh Tuấn, 2013).

b) Khả năng gây bệnh

Vibrio cholearae gây bệnh bằng độc tố ruột (choleragen). Đây là nội độc tố có

cấu trúc gồm đơn nguyên A (trọng lượng phân tử là 27 000 dalton, mang độc tính cao)

và đơn nguyên B có tính kháng nguyên đặc hiệu và một cầu nối A2 có tác dụng kích

thích tăng cAMP (Adenosin 3,5-cyclic mono phosphat). Độc tố ruột gắn vào niêm mạc

ruột non, hoạt hoá enzyme adenylcyclase dẫn đến tăng cAMP, làm giảm hấp thu Na+,

tăng tiết Cl- và nước gây tiêu chảy cấp tính theo (Triệu Anh Tuấn, 2013).

1.4.1.4 Nhóm vi khuẩn Shigella spp.

a) Đặc điểm

Shigella là trực khuẩn Gram âm mảnh dài 1-3 µm, rộng 0,5-0,6 µm, không có

tiên mao, vì vậy không có khả năng di động, không có vỏ không sinh bào tử, Shigella

là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi nhưng phát triển tốt trong điều kiện hiếu khí, phát triển

được trên các môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ thích hợp là 37oC (Chang

Tran, 2014).

18

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.7. Hình thái Shigella trên kính hiển vi điện tử.

Trong môi trường lỏng làm đục đều. Trên môi trường đặc SS (Salmonella-

Shigella) sau 24h khuẩn lạc có đường kính khoảng 2 mm, tròn lồi mặt nhẵn bờ đều.

Shigella lên men glucose không sinh hơi, lên men manitol (trừ Shigella dysenteriae

không lên men manitol), hầu hết Shigella không lên men lactose, chỉ có Shigella sonnei

lên men lactose nhưng chậm, không sinh H2S, Urease âm tính, phản ứng Indol thay

đổi, phản ứng đỏ metyl dương tính, phản ứng VP âm tính, phản ứng citrate âm tính

(Chang Tran, 2014).

b) Khả năng gây bệnh

Các chủng Shigella đều có độc tố ruột (enterotoxin) là ShET-1 và ShET-2

chúng làm thay đổi sự vận chuyển điện giải ở các tế bào niêm mạc đại tràng, gây tăng

tiết dịch. Nội độc tố Shigella cấu tạo như kháng nguyên thân, có độc tính mạnh nhưng

tính kháng nguyên yếu. Tác dụng chính của nội độc tố là gây phản ứng tại ruột. Ngoại

độc tố của trực khuẩn Shiga không giống như độc tố ruột của Vibrio cholerae và

ETEC, hoạt tính sinh học chủ yếu của ngoại độc tố trực khuẩn Shiga là tác dụng độc

đối với tế bào. Shigella gây bệnh lỵ trực khuẩn ở người, đây là một bệnh truyền nhiễm

có thể gây thành các vụ dịch địa phương. Thương tổn đặc hiệu khu trú ở ruột già, trên

lâm sàng biểu hiện bằng hội chứng lỵ với các triệu chứng: đau bụng quặn, đi ngoài

nhiều lần, phân có nhiều mũi nhầy và thường có máu. Shigella gây bệnh bằng cơ chế

19

Đồ án tốt nghiệp

xâm nhập vào tế bào biểu mô của niêm mạc ruột và nhân lên với số lượng lớn trong tổ

chức ruột. Các Shigella đều có nội độc tố. Riêng trực khuẩn Shiga còn có thêm ngoại

độc tố bản chất là protein. Nội độc tố Shigella cấu tạo như kháng nguyên thân, có độc

tính mạnh nhưng tính kháng nguyên yếu. Tác dụng chính của nội độc tố là gây phản

ứng tại ruột. Ngoại độc tố của trực khuẩn Shiga không giống như độc tố ruột của

Vibrio cholerae và ETEC, hoạt tính sinh học chủ yếu của ngoại độc tố trực khuẩn

Shiga là tác dụng độc đối với tế bào (Chang Tran, 2014).

1.3.2. Nhóm vi sinh vật gây bệnh cơ hội trên da

1.3.2.1 Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa

a) Đặc điểm

Pseudomonas là một chi vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi trường. Sự

biến dưỡng dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiều môi

trường khác nhau như nước, đất, trên cây và trong các động vật. Đặc điểm hình thái

học chung của Pseudomonas là vi khuẩn Gram âm, tế bào hình que, di động nhờ roi ở

đầu và không có bào tử.Các đặc điểm sinh lí là dị dưỡng, không lên men, linh hoạt về

dinh dưỡng, không quang hợp hoặc cố định nitrogen.

Hình 1.8. Hình thái Pseudomonas aeruginosa trên kính hiển vi điện tử.

Pseudomonas aeruginosa mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông

thường, hiếu khí. Nhiệt độ thích hợp 370C nhưng phát triển được ở nhiệt độ 5 – 42oC,

pH thích hợp 7,2 – 7,5 nhưng phát triển được ở pH 4,5 - 9,0. Trên môi trường đặc:

20

Đồ án tốt nghiệp

khuẩn lạc thường to giống như quả trứng ốp (fried eggs), nhẵn, dẹt, trung tâm lồi, có

màu xanh ánh kim và có xu hướng mọc lan. Khi nuôi cấy vi khuẩn này trên

môi trường thạch máu, khuẩn lạc mọc gây tan máu hoàn toàn (β).

Một số đặc điểm sinh hóa chính của Pseudomonas aeruginosa: không lên men

glucose, có khả năng thủy giải gelatin, khử nitrate (+) oxidase (+), sản xuất

hydrogensulphide từ thiosulphate, sản xuất 2-keto-D-gluconateacid từ D-gluconate, sử

dụng glycerol, succinate, L-arabinose, formate, acetate, lactose, xylose, mannitol,

rhamnose, P-arabinose, trehalose, cellobiose, inositol, sucrose (Nguyễn Thị Như Yến

và ctv, 2011).

b) Khả năng gây bệnh

Độc tính của Pseudomonas aeruginosa chủ yếu là exotoxin của vi sinh vật bao

gồm loài Pseudomonas aeruginosa đuợc biết là gây độc trên ấu trùng của loài muỗi

cũng như lòai sâu bọ cánh phấn. Pseudomonas aeruginosa gây chết loài muỗi ở giai

đọan ấu trùng, nhộng, và theo nghiên cứu loài này cũng gây độc tố đối với họ nhà bay.

Mặc dù phuơng thức hoạt động của độc tố này chưa đuợc hiểu rõ, những loại độc tố

như của P. aeruginosa đuợc hấp thụ hấp thụ qua biểu bì của loài côn trùng và họat

động trên protein tan huyết. Dịch formulation (VCRC B426) từ sự trao đổi chất của P.

aeruginosa tiết ra như là phuơng pháp đuợc sử dụng để chống lại loài muỗi (Nguyễn

Thị Như Yến và ctv, 2011).

1.3.2.2 Nhóm vi khuẩn Enterococcus faecalis

a) Đặc điểm

Enterococcus faecalis là vi khuẩn Gram dương kỵ khí tùy nghi, vi khuẩn phát

triển tốt hơn ở điều kiện khí trường có thêm 5-10% CO2 và thường đòi hỏi môi trường

nuôi cấy có nhiều chất dinh dưỡng như máu, huyết thanh, đường. Nhiệt độ nuôi cấy

thích hợp là 37oC, một số phát triển được ở 10 tới 40oC (Dương Văn Sĩ, 2010).

21

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.9. Hình thái Enterococcus faecalis trên kính hiển vi điện tử.

Khuẩn lạc có màu hồng tới đỏ đậm khi nuôi cấy trong môi trường azide

tetrazolium chứa triphenyl tetrazolium chloride (TTC), trên môi trường thạch máu thì

khuẩn lạc tròn, lồi, bóng khô, có màu hơi xám trong. Có phản ứng catalase và oxidase

âm tính, có khả năng lên men đường glucose, sinh acid làm giảm pH môi trường

(Dương Văn Sĩ, 2010).

b) Khả năng gây bệnh

Viêm họng, viêm hạch có mủ, viêm khớp, viêm thận cấp tính, viêm các van

tim. Gây đau dạ dày và mùi hôi ở cổ họng.

1.3.2.3 Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Staphylococcus

Staphylococcus là các cầu khuẩn Gram dương không tạo nha bào có đường

kính khoảng 1 μm, không di động và sắp xếp theo mọi hướng và thường tạo thành cụm

(tụ) trông giống như chùm nho. Staphylococcus chủ yếu phân thành 2 nhóm:

Staphylococcus có enzyme coagulase: Staphylococcus aureus, Staphylococcus

intermedius

Staphylococcus không có enzyme coagulase: Staphylococcus epidermidis,

Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus capitis,

Staphylococcus simulans, Staphylococcus hominis, Staphylococcus warneri.

a) Đặc điểm

22

Đồ án tốt nghiệp

Staphylococcus thuộc loại vi khuẩn kỵ khí tuỳ nghi, phát triển dễ dàng trên các

môi trường nuôi cấy thông thường. Staphylococcus có khả năng phát triển được ở

khoảng nhiệt độ dao động từ 10 tới 45oC và môi trường có nồng độ muối cao tới 10%.

Hình 1.10. Hình thái Staphylococcus trên kính hiển vi điện tử

Trên môi trường thạch thường khuẩn lạc dạng S, đường kính 1 - 2mm, sau 24

giờ khuẩn lạc có màu vàng rơm (đối với Staphylococcus aureus) hoặc có màu trắng

(đối với các loại Staphylococcus khác).

Trên môi trường thạch máu Staphylococcus phát triển nhanh: Khuẩn lạc

Staphylococcus aureus dạng S, kích thước khoảng 1 – 2mm, tan máu hoàn toàn, có

màu vàng. Khuẩn lạc tụ cầu khác: dạng S, kích thước khoảng 1 – 2mm, có màu trắng

và thường không gây tan máu, khuẩn lạc S. aureus có đường kính khoảng 1 – 1,5mm,

có màu đen bóng,lồi, có vòng trắng đục hẹp và vòng sáng rộng khoảng 2 – 4mm quanh

khuẩn lạc. Khuẩn lạc một số dòng S.aureus có thể không tạo các vòng sáng quanh

khuẩn lạc (Trần Quang Cảnh, 2012).

b) Khả năng gây bệnh

Một số chủng tụ cầu vàng có thể tạo vỏ polysaccharide. Vỏ này cùng với

protein A có chức năng bảo vệ vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào. Ngoài ra phần

lớn các chủng tụ cầu đều có khả năng sản xuất một chất kết dính gian bào. Nhờ chất

23

Đồ án tốt nghiệp

này, vi khuẩn tạo được một lớp màng sinh học bao phủ chính nó và vi khuẩn có thể

phát triển trong lớp màng nhầy niêm mạc.

Tụ cầu còn sản xuất một số enzyme có khả năng phá hủy mô liên kết của tổ

chức, giúp vi khuẩn có thể phát tán trong cơ thể, phá hủy hồng cầu (tan máu) và gây

chết các tế bào bạch cầu hạt cũng như đại thực bào, phá hủy lớp thượng bì. Enzyme

này gây tổn thương da tạo các bọng nước. Ví dụ điển hình là hội chứng Lyell do tụ cầu.

Sáu độc tố ruột (Enterotoxine A, B, C, D, E, F) bền với nhiệt. Các độc tố ruột này đóng

vai trò quan trọng trong ngộ độc thực phẩm. Hầu hết các chủng tụ cầu đều sản xuất

được men penicillinase (beta- lactamase). Enzyme này phá hủy vòng betalactam, cấu

trúc cơ bản của các kháng sinh như penicilline G, Ampicilline và Ureidopenicilline,

làm cho các kháng sinh này mất tác dụng.

24

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1. Địa điểm

Đề tài được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm vi sinh của Khoa Công nghệ Sinh

học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.

2.1.2. Thời gian

Thời gian nghiên cứu từ tháng 02/2017 đến tháng 07/2017.

2.2. Vật liệu

2.2.1. Vật liệu

Hoa Sứ vàng (Plumeria rubra) được thu tại công viên dọc đường Hoàng Sa.

2.2.2. Chủng vi sinh vật

Các chủng vi sinh vật sử dụng trong quá trình nghiên cứu được cung cấp bởi

ThS. Phạm Minh Nhựt giảng viên trường Đại học Công Nghệ TP.HCM, bao gồm:

Nhóm vi khuẩn Escherichia coli gồm: E.coli 0208, E.coli O157:H7 và

Enterotoxigenic E.coli - ETEC.

Nhóm vi khuẩn Shigella spp. gồm: S. boydii, S. flexneri và S. sonnei.

Nhóm vi khuẩn Vibrio spp. gồm: V. cholerae, V. harveyi, V. alginolyticus và V.

parahaemolyticus.

Nhóm vi khuẩn Salmonella spp. gồm: S. dublin, S. enteritidis, S. typhi và S.

typhimurium.

Nhóm vi khuẩn Listeria spp. gồm Lis. innocua và Lis. monocytogenes.

Nhóm vi sinh vật gây bệnh khác bao gồm : Pseudomonas aeruginosa,

Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis.

2.2.3. Môi trường nuôi cấy và hóa chất

Môi trường TSB (Trypton Soya Broth) (HiMedia - Ấn Độ).

Môi trường TSA (Trypticase Soya Agar) (HiMedia - Ấn Độ).

Ethanol (Việt Nam)

25

Đồ án tốt nghiệp

DMSO (Dimethy lsulfoxide) (Trung Quốc)

Các loại thuốc thử : Molisch, Fehling A, Fehling B, Barfoed, Mayer,

Dragendorff, Hager, Wagner, Ninhidrin, NaOH, NaCl, chì acetate, acetic anhydride,

gelatin, chloroform, ferric chlodride, H2SO4 đậm đặc.

2.2.4. Thiết bị và dụng cụ

2.2.4.1. Thiết bị

Tủ sấy Bếp từ

Máy lọc chân không Tủ hấp autoclave

Tủ ủ Máy lắc

Bể đều nhiệt Máy chưng nước cất

Tủ lạnh

2.2.5.2. Dụng cụ

Pipette pasteur Cốc thủy tinh 1000ml

Ống nghiệm Cốc thủy tinh 100ml

Phễu lọc Đĩa nhựa

Giấy lọc Efpendoff

Cân phân tích Que trang

Kẹp ống nghiệm Dao cấy

Micropipette loại 10 – 100 µl Cây đục lỗ

Micropipette loại 100 – 1000 µl Đèn cồn

Đầu tipe Bông không thấm

Bình môi trường 500 ml Bông thấm

Chai môi trường 100 ml Parafim

26

Đồ án tốt nghiệp

2.3. Các phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp tách chiết các hợp chất từ thực vật

Nguyên tắc: Sử dụng các loại dung môi để tách chiết các hợp chất có trong cây

thuốc nhờ lực liên kết hóa học từ đó ta có thể lôi kéo các chất cần thiết ra khỏi mẫu cây

thuốc.

Mẫu tươi được rửa sạch loại bỏ bụi bẩn rồi đem đi phơi khô, sau đó xay thành

dạng bột. Bột Hoa Sứ sẽ được ngâm để trích ly hợp chất với dung môi trong 24 giờ và

lặp lại 3 lần. Dịch chiết sẽ được loại bỏ dung môi để giữ lại phần cao chiết bằng cách

cô cách thủy ở nhiệt độ 70oC. Cao chiết thu được sẽ được chia vào trong chai và bảo

quản ở nhiệt độ 4oC.

2.3.2. Phương pháp tăng sinh

Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường dinh

dưỡng thích hợp. Môi trường dinh dưỡng không những chứa đầy đủ các chất dinh

dưỡng (đa lượng và vi lượng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh vật

mà còn phải đảm bảo có đủ các điều kiện hóa lý thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa

vi sinh vật và môi trường.

Cách tiến hành: Môi trường TSB được sử dụng để làm môi trường tăng sinh.

Môi trường này được hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút ở 1 atm. Thực hiện thao tác

trong điều kiện vô trùng, lấy 100µl sinh khối của chủng vi khuẩn thử nghiệm bằng

micropipet cho vào chai môi trường có 20ml TSB, lắc ở 150 vòng/ phút trong 24 giờ

trước khi đưa vào thí nghiệm chính.

2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật

2.3.3.1. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật

Nguyên tắc: Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật

được cấy trên môi trường thạch nghiêng và ủ trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật

phát triển. Sau đó các chủng này được chuyển vào tủ mát (3 – 5oC) để bảo quản. Quá

trình này được lặp đi lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm bảo vi sinh vật luôn

27

Đồ án tốt nghiệp

được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết. Tùy từng nhóm vi sinh vật

khác nhau mà thời gian định kỳ cấy chuyển khác nhau, tuy nhiên giới hạn tối đa là 3

tháng cấy chuyển một lần.

Đối với các giống vi sinh vật chỉ thị: Cấy chuyển định kỳ 1 tháng/lần trong ống

thạch nghiêng chứa môi trường TSA và bảo quản trong tủ mát ở nhiệt độ 4oC (Nguyễn

Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007).

2.3.3.2. Phương pháp bảo quản lạnh sâu

Nguyên tắc: Ngoài phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng, có

thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu. Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong

quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích

lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào.

Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh

sâu và làm tan nhanh như glycerol.

Vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường dinh dưỡng thích hợp rồi hút 1 ml

dịch tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch và thu cặn có chứa sinh

khối vi khuẩn. Hút glycerol 40% cho vào và tiến hành giữ giống ở nhiệt độ lạnh -15oC

(Nguyễn Lân Dũng và Dương Evaluation of Cameroonian plants towards experimental

bone regeneration Văn Hợp, 2007).

2.3.4. Phương pháp xác định mật độ tế bào

Công thức tính toán xác định mật độ tế bào (công thức MacFahrland):

Mật độ = OD600nm x 1,02 x 109 (CFU/ml)

2.3.5. Phương pháp pha loãng mẫu

Nguyên tắc: Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhưng có vai

trò rất quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh vật. Việc pha loãng mẫu ở các nồng

độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều cho quá trình định lượng cũng như phân tích vi sinh

vật. Phương pháp pha loãng mẫu chỉ được sử dụng trong trường hợp vi sinh vật phân

bố trong mẫu nhiều và để định lượng vi sinh vật trong mẫu.

28

Đồ án tốt nghiệp

Đối với mẫu lỏng: Dùng micropipette hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa

9 ml dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ được nồng độ pha loãng là 10-1. Tiếp tục từ ống

nghiệm 10-1 hút tiếp 1 ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta

được nồng độ pha loãng 10-2. Tiếp tục tiến hành như vậy cho đến khi được nồng độ cần

thiết (Phạm Minh Nhựt, 2013).

2.3.6. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết

Nguyên tắc: Các hợp chất kháng khuẩn có trong cao chiết sẽ khuếch tán vào

trong môi trường thạch và tác động lên các vi sinh vật chỉ thị. Nếu cao chiết có khà

năng tiêu diệt vi khuẩn thì sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch.

Từ đó, xác định được hoạt tính kháng khuẩn của cao thuốc bằng đường kính

vòng kháng khuẩn (mm).

Cách thực hiện: Hút 0.1 ml dịch vi khuẩn đã được hoạt hóa ở mật độ thích hợp

cho vào môi trường TSA và tiến hành trang đều cho tới khô. Sau đó, dùng một ống trụ

kim loại có đường kính 6 mm tạo các giếng trên đĩa thạch và nhỏ 100µl dịch cao chiết

ở nồng độ khảo sát vào, giữ yên trong vòng 1 giờ để dịch cao chiết có thể khuếch tán

vào môi trường thạch. Ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ và tiến hành đọc kết quả thông

qua việc đo đường kính vòng ức chế (mm) ( Ramakrishnan, 2011).

2.3.7. Phương pháp xác định thành phần hóa học

Nguyên tắc: Định tính các nhóm chất hữu cơ trong thành phần cao chiết từ Hoa

Sứ vàng bằng các phản ứng với thuốc thử đặc trưng dựa trên tính chất hóa học của

chúng theo các phương pháp thông dụng trong phòng thí nghiệm đã được chuẩn hoá để

sơ bộ hóa thành phần hoạt chất. (Lâm Văn Tiến và cộng sự, 2015).

Cách tiến hành: Cao chiết được đem ngâm trong dung môi thích hợp, tiến

hành lọc và thu dịch lọc. Sau đó dùng dịch cao chiết này tiến hành định tính các thành

phần hóa học với các loại hóa chất, thuốc thử đặc trưng.

a) Định tính carbohydrate

29

Đồ án tốt nghiệp

Thử nghiệm Molisch: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó cho

5 - 6 giọt thuốc thử Molisch vào, tiếp tục nhỏ từ từ 2 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc vào

và đọc kết quả. Kết quả được xem là dương tính khi có hình thành phức hợp màu đỏ -

tím.

Thử nghiệm Fehling: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, cho lần lượt

1 ml thuốc thử Fehling A và 1 ml Fehling B vào. Đun cách thủy 5 phút và đọc kết quả.

Kết quả dương tính khi có xuất hiện tủa màu đỏ của CuO.

Thử nghiệm Barfoed: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml

thuốc thử Barfoed. Đun cách thủy hỗn hợp trong 5 phút, sau đó làm lạnh ngay và đọc

kết quả. Kết quả dương tính khi hình thành kết tủa màu đỏ gạch.

b) Định tính alkaloid

Thử nghiệm Mayer: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và nhỏ vài

giọt thuốc thử Mayer và đọc kết quả. Kết quả dương tính là khi quan sát được kết tủa

màu trắng đục tạo thành.

Thử nghiệm Dragendorff: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và nhỏ

vài giọt thuốc thử Dragendorff và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi hình thành kết

tủa màu vàng cam.

Thử nghiệm Hager: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml

thuốc thử Hager và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi hình thành kết tủa màu vàng.

Thử nghiệm Wagner: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và bổ sung

2 ml thuốc thử Wagner vào và đọc kết quả. Kết quả dương tính là khi hình thành kết

tủa màu nâu đỏ

c) Định tính saponin

Thử nghiệm tạo bọt: Hút 5 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó lắc

mạnh và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi ống nghiệm có xuất hiện bọt và ổn định

d) Định tính cardiac glycoside

30

Đồ án tốt nghiệp

Thử nghiệm Legal: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml

pyridine và 1 ml Na nitro prusside, sau đó bổ sung 5 - 6 giọt NaOH 10% vào và đọc kết

quả. Kết quả dương tính khi xuất hiện màu đỏ đậm.

Thử nghiệm Keller Killiani: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm

2 ml acid acetic glacial và 1 ml dung dịch FeCl3, cho từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc vào và

đọc kết quả. Kết quả dương tính khi xuất hiện màu xanh trong lớp acid acetic.

e) Định tính flavonoid

Thử nghiệm Alkaline reagent: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm rồi

cho vào vài giọt NaOH 10% thấy xuất hiện màu vàng, thêm vài giọt HCl loãng vào

thấy ống nghiệm về màu cao ban đầu chứng tỏ có sự hiện diện của Flavonoid (mẫu đối

chứng làm tương tự, thay NaOH 10% thành nước cất). Kết quả dương tính nếu xuất

hiện màu vàng đậm khi bổ sung NaOH và trở về màu cao ban đầu khi bổ sung HCl. Có

thực hiện ống đối chứng dương thay NaOH thành nước cất.

Thử nghiệm Ferric chloride: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau

đó thêm vài giọt thuốc thử Ferric chloride 10% và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi

ống nghiệm xuất hiện màu xanh hoặc tím.

f) Định tính các hợp chất phenol

Thử nghiệm lead acetate: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, rồi cho

vào 1,5 ml lead acetate 10% sau đó đọc kết quả. Kết quả dương tính khi xuất hiện kết

tủa trắng trong ống nghiệm.

Thử nghiệm Gelatin: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm vài

giọt galatin 1% vào và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi xuất hiện kết tủa trắng.

g) Định tính tannin

Thử nghiệm ferric chloride: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và

thêm 2 ml NaCl 10%, cho 4 giọt thuốc thử ferric chloride 10% và đọc kết quả. Kết quả

dương tính khi ống nghiệm xuất hiện tủa màu xanh, xanh – đen.

31

Đồ án tốt nghiệp

Thử nghiệm lead acetate: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và thêm

2 ml NaCl 10%, cho 4 giọt thuốc thử chì acetate vàovà đọc kết quả. Kết quả dương tính

khi ống nghiệm xuất hiện màu vàng.

h) Định tính steroid

Thử nghiệm Salkowski: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm vào

2 ml chloroform và nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc, lắc mạnh rồi để yên cho tách thành

2 lớp và đọc kết quả ở mặt phân cách. Kết quả xác định được chia thành 2 trường hợp:

ở lớp dưới xuất hiện màu đỏ là sterol, xuất hiện màu vàng là triterpenoid.

Thử nghiệm Libermann Burchard: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm

thêm 2 ml acid anhydride, đun sôi và làm nguội nhanh. Sau đó nhỏ từ từ H2SO4 đậm

đặc dọc theo thành ống nghiệm rồi đọc kết quả. Kết quả xác định được chia thành 2

trường hợp: nếu xuất hiện vòng màu đỏ ở mặt phân cách là steroid. Nếu hình thành

màu nâu đỏ đậm là triterpenoid.

j) Định tính amino acid

Thử nghiệm Ninhidrin: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó cho vào

một vài giọt thuốc thử ninhidrin, đun sôi cách thủy trong 5 phút và đọc kết quả. Kết

quả dương tính khi thấy xuất hiện màu tím.

2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu ghi nhận ở các thí nghiệm được thống kê và xử lý bằng phần mềm

Microsoft Excel 2010 và phần mềm Statistical Analysis System 9.4 (SAS). Kết quả

được thể hiện bằng giá trị trung bình ± SD (độ lệch chuẩn) với sự khác biệt có ý nghĩa

ở mức P = 0,01.

2.4. Bố trí thí nghiệm

32

Đồ án tốt nghiệp

Mẫu Hoa Sứ vàng

Xử lý mẫu

Tách chiết và thu hồi cao

Cao chiết Hoa Sứ vàng của các loại cao khác nhau

Đánh giá hiệu suất thu hồi của các loại cao chiết

Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết

Xác định thành phần hóa học của cao chiết

Định lượng alkaloid và flavonoid của cao chiết

Tổng hợp kết quả thí nghiệm

Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

33

Đồ án tốt nghiệp

2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hiệu suất thu

hồi cao từ Hoa Sứ vàng.

Mẫu Hoa Sứ vàng

Xử lý mẫu

Ngâm dung môi (1:20) (w/v)

Nước Ethanol

50% 70% 96%

Lọc tinh Bã

Cô cách thủy 70oC

Cao chiết

Hiệu suất thu hồi

Hình 2.2. Quy trình tách chiết và thu cao Hoa Sứ vàng từ các loại dung môi

khác nhau.

34

Đồ án tốt nghiệp

Thuyết minh quy trình:

Mẫu hoa sứ tươi sau khi thu được rửa sạch và đem đi sấy khô ở 40oC. Sau khi

sấy khô mẫu được cắt nhỏ. Tiến hành cân 40 g và ngâm trong 800 ml với các loại dung

môi khảo sát tỉ lệ 1 : 20 (w/v) ở nhiệt độ phòng.

- Đối với dung môi nước: mẫu được ngâm với lượng lớn nước cất chứa trong

erlen thủy tinh. Cách 3 giờ, tiến hành lọc chân không thu nhận dịch chiết, phần bã tiếp

tục được ngâm và lọc với lượng nước cất như lần đầu cho đến khi dịch chiết nhạt màu.

Thu tất cả dịch lọc, sau đó tiến hành loại bỏ dung môi bằng phương pháp cô cách thủy

ở 70oC để thu nhận cao chiết.

- Đối với dung môi ethanol: ngâm mẫu với lượng lớn ethanol (50%, 70%, 96%)

trong erlen thủy tinh đậy kín để tránh hiện tượng bay hơi khoảng 48 giờ. Sau đó, tiến

hành lọc chân không mẫu thu nhận dịch chiết, phần bã tiếp tục được ngâm, lọc với

lượng dung môi như lần đầu cho đến khi dịch chiết có màu nhạt dần. Thu tất cả dịch

lọc, sau đó tiến hành loại bỏ dung môi bằng phương pháp cô cách thủy ở 70oC để thu

nhận cao chiết.

Tiến hành đánh giá hàm lượng thu hồi cao ở mỗi nghiệm thức bằng công thức:

H (%) =(m1 – m2)/m x 100

Trong đó: H: hàm lượng cao thu được (%)

m1: khối lượng cốc sau khi cô mẫu (g)

m2: khối lượng cốc ban đầu (g)

m: khối lượng mẫu ban đầu dùng để ngâm với dung môi (g)

Sau khi xác định hàm lượng thu hồi, các loại cao thu hồi được bảo quản ở nhiệt

độ 4oC trong tủ lạnh để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo. Mỗi nghiệm thức trong

thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần.

35

Đồ án tốt nghiệp

2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính

kháng khuẩn của cao chiết Hoa Sứ vàng.

Vi sinh vật chỉ thị

Tăng sinh trong môi trường TSB

Môi trường TSA

Lắc nhiệt độ phòng (18 – 24 giờ) Hấp tiệt trùng 121oC – 1 atm trong 15 phút

Đo OD600nm Đổ đĩa Cao chiết

Hút 100 µl

Pha loãng về 106 cfu/ml Cấy trang Hòa tan với DMSO 1%

Đục lỗ (d = 6 mm)

Hút 100µl Nồng độ thích hợp

Ủ 37oC/24 giờ

Đo đường kính vòng kháng khuẩn

Hình 2.3. Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết Hoa

Sứ vàng với các chủng vi khuẩn chỉ thị.

36

Đồ án tốt nghiệp

Thuyết minh quy trình:

Trong thí nghiệm này, tiến hành đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại

cao chiết Hoa Sứ vàng bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch.

Tiến hành tăng sinh vi sinh vật chỉ thị trong chai thủy tinh chứa 20 ml môi

trường TSB (riêng đối với các chủng Vibrio spp. thì bổ sung thêm 1.5% NaCl). Sau đó,

chai được lắc ở 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 18 - 24 giờ. Tiến hành đo quang

phổ dịch tăng sinh ở bước sóng 600 nm để xác định mật độ tế bào, sau đó dịch vi

khuẩn được pha loãng bằng nước muối sinh lí vô trùng để đạt mật độ tế bào vi khuẩn

106 cfu/ml.

Hút 100 µl dịch vi khuẩn đã được pha loãng ở mật độ 106 cho vào đĩa thạch

TSA đã chuẩn bị sẵn. Sau đó dùng que trang, trang đều dịch vi khuẩn khắp bề mặt đĩa

thạch cho đến khi khô trong điều kiện vô trùng.

Dùng que đục đã khử trùng có đường kính d = 6 mm, đục 6 giếng trên bề mặt

đĩa thạch sau khi trang, mỗi giếng cách nhau 2 cm và cách mép đĩa 1cm. Sau đó dùng

dao cấy vô trùng lấy phần thạch đã đục ra khỏi đĩa.

Cao chiết Hoa Sứ vàng được hòa tan trong DMSO 1% ở nồng độ 200 mg/ml.

Hút 100 μl dịch cao chiết và nhỏ vào các giếng trong đĩa môi trường TSA đã được đục

lỗ trước đó. Các đĩa thạch được để yên trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng để dịch cao chiết

từ các giếng khuếch tán vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn, sau đó đem ủ ở 37oC trong

vòng 24 giờ và đọc kết quả. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.

37

Đồ án tốt nghiệp

2.4.3. Thí nghiệm 3: Định tính một số thành phần hóa học của các loại cao chiết từ

Hoa Sứ vàng.

Cao chiết từ Hoa Sứ vàng

Ngâm trong DMSO 1% Ngâm trong H2SO4 10%

Lọc Lọc

Thử nghiệm

Carbohydrate Alkaloid Flavonoid

Tannin Saponin Amino acid

Steroid

Phenolic compound Cardiac glycoside

Hình 2.4. Quy trình định tính thành phần hóa học của cao chiết Hoa Sứ vàng.

Thuyết minh quy trình:

Cao chiết Hoa Sứ vàng được chia làm 2 phần

Phần thứ nhất: Cao chiết Hoa Sứ vàng được hòa tan trong dung dịch H2SO4

10% trong khoảng 30 phút đến 60 phút. Sau đó tiến hành lọc qua giấy lọc và thu phần

dịch trong để tiến hành định tính alkaloid.

Phần thứ hai: Cao Hoa Sứ vàng được hòa tan trong dung dịch DMSO 1% cho

tan hoàn toàn, sau đó tiến hành pha loãng và lọc dung dịch qua giấy lọc để thu dịch

trong. Dịch này đem phân tích, định tính một số thành phần hóa học như carbohydrate,

saponin, flavonoid, amino acid, steroids, phenolic, tannin, cardiac glycoside.

a) Định tính thành phần carbohydrate

38

Đồ án tốt nghiệp

- Thử nghiệm Molisch

- Thử nghiệm Fehling

- Thử nghiệm Barfoed

b) Định tính thành phần saponin

- Thử nghiệm Foam (xà phòng)

c) Định tính thành phần alkaloid

- Thử nghiệm Mayer

- Thử nghiệm Dragendorff

- Thử nghiệm Hager

- Thử nghiệm Wagner

d) Định tính thành phần cardiac glycoside

- Thử nghiệm Legal

- Thử nghiệm Keller Killiani

e) Định tính thành phần flavonoid

- Thử nghiệm Alkaline

- Thử nghiệm Ferric chloride

f) Định tính hợp chất phenolic

- Thử nghiệm Lead acetate

- Thử nghiệm Gelatin

g) Định tính thành phần tannin

- Thử nghiệm Ferric chloride

- Thử nghiệm Lead acetate

h) Định tính thành phần steroid

- Thử nghiệm Salkowski

- Thử nghiệm Libermann Burchard

i) Định tính thành phần amino acid

- Thử nghiệm Ninhidrin

39

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hàm lượng thu hồi

cao từ Hoa Sứ vàng

Bột cây Hoa Sứ vàng sau khi ngâm trong các loại dung môi khảo sát (nước,

ethanol 50%, ethanol 70%, ethanol 96%) được lọc, thu dịch và cô dịch lọc ở 70oC. Kết

thúc quá trình này thu được cao chiết từ các loại dung môi khác nhau và kết quả khảo

sát hàm lượng thu hồi cao chiết được trình bày trong hình 3.1.

Hình 3.1. Hàm lượng thu hồi cao chiết từ Hoa Sứ vàng với các loại dung môi

Kết quả trên hình 3.1, cho thấy rằng các dung môi tách chiết khác nhau có ảnh

hưởng rất lớn đến hàm lượng thu hồi cao chiết từ Hoa Sứ Vàng. Tuy cùng quy trình

tách chiết nhưng hàm lượng thu hồi cao của các loại dung môi từ Hoa Sứ Vàng không

giống nhau và có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,01).

Kết quả tách chiết cao từ Hoa Sứ Vàng cho thấy rằng sử dụng dung môi nước

cho hàm lượng thu hồi cao cao nhất trong số 4 loại dung môi khảo sát với hàm lượng

trung bình là 32,27%. Kế đến là dung môi ethanol 50% và ethanol 70% với hiệu suất

trung bình lần lượt là 31,4%, 18,83%. Cuối cùng với hàm lượng thu hồi thấp nhất là

17,13% ứng với dung môi ethanol 96%. Qua kết quả trên có thể thấy rằng để thu được

lượng cao cao nhất thì dung môi nước là tối ưu nhất.

40

Đồ án tốt nghiệp

Việc lựa chọn các dung môi tách chiết đều là dung môi phân cực vì các dung

môi phân cực có thể lôi kéo tốt các hợp chất kháng khuẩn có trong thực vật như

flavonoid, alkaloid, glycosides, saponins, tannin,... (Ngô Văn Thu, 2011). Sở dĩ chọn

dung môi phân cực để tách chiết vì các loại dung môi này phù hợp với điều kiện phòng

thí nghiệm, giúp tiết kiệm cũng như sẽ an toàn hơn so với các dung môi không phân

cực.

Với mục tiêu chọn ra dung môi tốt nhất từ 4 loại dung môi khảo sát để tách

chiết cao có hoạt tính sinh học tốt nhất, chưa thể khẳng định rằng nước là dung môi

tách chiết cao tốt nhất. Để đánh giá dung môi nào phù hợp tách chiết, cần đánh giá

thêm về hoạt tính kháng khuẩn của chúng. Do đó, việc tiến hành thí nghiệm đánh giá

hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết để tối ưu hóa lựa chọn dung môi tốt nhất

đối với mẫu Hoa Sứ vàng.

3.2. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Hoa Sứ vàng với các loại

dung môi tách chiết khác nhau trên các chủng vi khuẩn chỉ thị.

Sau khi đánh giá hàm lượng thu hồi cao chiết của các loại dung môi thu được

từ Hoa Sứ vàng, thử nghiệm đánh giá hoạt tính kháng khuẩn được tiến hành và kết quả

được thể hiện thông qua đường kính vòng ức chế (mm) đối với các nhóm vi sinh vật

chỉ thị bằng phướng pháp khuếch tán giếng thạch được trình bày ở các Hình 3.2, Hình

3.3, Hình 3.4, Hình 3.5, Hình 3.6, Hình 3.7 và Bảng 3.1.

3.2.1. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn

Escherichia coli

41

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết và đối chứng đối với nhóm vi

khuẩn Escherichia coli.

Tiến hành xác định hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm

Escherichia coli với 4 chủng: E.Coli, ETEC, E.Coli 0208, E.Coli O157:H7. Kết quả thí

nghiệm được thể hiện trong Hình 3.2.

Kết quả trên Hình 3.2 cho thấy rằng cao chiết Hoa Sứ vàng từ các loại dung

môi ethanol ở nồng độ 200 mg/ml đều thể hiện hoạt tính kháng khuẩn với 4/4 chủng

thuộc nhóm Escherichia coli được khảo sát. Đường kính trung bình vòng kháng của

các loại cao EtOH 50%, EtOH 70% và EtOH 96% là từ 8,67 mm đến 12 mm. Trong đó

ở từng loại cao cho khả năng kháng khuẩn khác nhau, cao EtOH 50% cho khả năng

kháng khuẩn đối với chủng E.coli 0208 mạnh nhất với đường kính trung bình 9,8 mm

tương đương với kháng sinh ciprofloxacin (0,5 mg/ml) về phương diện thống kê (p >

0,01), thấp nhất là chủng E.coli (8,83 mm). Ở cao EtOH 70% hoạt tính kháng khuẩn

cao nhất đối với chủng ETEC với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình 12 mm

nhưng thấp hơn so với ciprofloxacin (0,5 mg/ml) về mặt thống kê (P < 0,01), ở chủng

E.coli O157:H7 hoạt tính kháng khuẩn của cao thể hiện thấp nhất với đường kính trung

42

Đồ án tốt nghiệp

bình 8,67 mm và thấp hơn so với đối chứng ciprofloxacin (0,5 mg/ml) ở mức khác biệt

có ý nghĩa (P < 0,01). Ở cao EtOH 96% chỉ biểu hiện khả năng kháng khuẩn ở nồng độ

200 mg/ml, khả năng kháng mạnh nhất ở chủng E.coli O157:H7 vời đường kính vòng

ức chế trung bình là 10,17 mm thấp hơn so với đối chứng ciprofloxacin (0,5 mg/ml),

thấp nhất đối với chủng E.coli 0208 với đường kính trung bình vòng kháng khuẩn 8,67

mm thấp hơn so với đối chứng ở mức khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,01). Còn ở

nồng độ 100 mg/ml thì chỉ thể hiện hoạt tính kháng khuẩn ở 3/4 chủng với đường kính

trung bình từ 8,5 mm đến 9,5 mm. Trong đó, ở cao chiết EtOH 50% cho khả năng

kháng 2/4 chủng là E.coli 0208 và E.coli O157:H7 với đường kính vòng kháng khuẩn

như nhau (8,5 mm), tuy nhiên ở chủng E.coli 0208 khả năng kháng của cao chiết tương

đương với đối chứng (P > 0,01) còn ở chủng E.coli O157:H7 thì thấp hơn so với đối

chứng ở mức có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,01). Ở cao chiết EtOH 70% cho khả

năng kháng khuẩn duy nhất đối với chủng ETEC với đường kính trung bình vòng

kháng khuẩn là 9,5 mm thấp hơn so với đối chứng ciprofloxacin (0,5 mg/ml) về mặt

thống kê (P < 0,01). Ở cao nước và nồng độ 50 mg/ml không có khả năng ức chế.

Như vậy, cao chiết ethanol 50%, 70%, 96% từ Hoa Sứ vàng ở nồng độ 200

mg/ml thể hiện khả năng ức chế khá tốt đối với cả 4 chủng của nhóm vi khuẩn E.coli.

Kết quả này cho thấy rằng nhóm vi khuẩn E. coli khảo sát khá nhạy cảm với cao chiết

ethanol từ Hoa Sứ vàng đặc biệt là EtOH 70% hơn so với các loại cao chiết từ dung

môi khác.

Trong nghiên cứu của Vijayakumar và ctv (2015) cho thấy khả năng kháng

khuẩn của cao chiết ethanol 95% ở nồng độ 150 mg/ml từ Carica papaya L. đối với

chủng E.coli cho đường kháng khuẩn là 11 mm. Ở cao chiết ethanol 96% nồng độ 200

mg/ml của Hoa Sứ vàng cho khảng năng kháng chủng E.coli với đường kính trung bình

10 mm.

Nghiêm cứu của Al-Manhel và Niamah (2015) cho thấy cao chiết ethanol ở

nồng độ 100 mg/ml của Ziziphus cho khả năng kháng khuẩn đối với chủng E.coli là 12

43

Đồ án tốt nghiệp

mm. Còn đối với cao chiết Hoa Sứ vàng với cao ethanol 96% ở nồng độ 200 mg/ml

cho kết quả kháng khuẩn đối với chủng trên là 10 mm.

Qua hai so sánh trên có thể thấy cao Hoa Sứ vàng có khả năng kháng khuẩn

khá tương đồng với các mẫu ở những báo cáo trên. Điều có thể do ở mỗi loài thực vật

có các thành phần hóa học khác nhau và điều kiện tự nhiên ở từng vùng cũng ảnh

hưởng đến khả năng tổng hợp các chất trong cây.

3.2.2. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn

Listeria spp.

Thí nghiệm kháng khuẩn đối với nhóm vi khuẩn Listeria spp. gồm 2 chủng: L.

innocua và L.monocytogenes. Kết quả thí nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn của

các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Listeria spp. được trình bày trong Hình 3.3.

Hình 3.3. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết và đối chứng đối với nhóm vi

khuẩn Listeria spp.

Kết quả nghiên cứu ở Hình 3.3 cho thấy cả 3 loại cao chiết Hoa Sứ vàng từ các

dung môi ethanol khác nhau ở nồng độ 200 mg/ml đều có khả năng ức chế nhóm vi

khuẩn Listeria spp., đường kính vòng kháng khuẩn trung bình từ 8,17 đến 12 mm. Xét

ở cao EtOH 50% cho khả năng kháng khuẩn với 2 chủng L.innocua và

L.monocytogenes tương đương nhau với đường kính trung bình 10 mm nhưng chủng

L.innocua tương đương với đối chứng ciprofloxacin (0,05 mg/ml) về phương diện

thống kê (P > 0,01) còn chủng L.monocytogenes khác biệt so với đối chứng ở mức có ý

nghĩa (P < 0,01). Đối với cao EtOH 70% cho khả năng kháng khuẩn cao nhất đối với

các loại cao thử nghiệm và chỉ có khả năng kháng khuẩn ở nồng độ 200 mg/ml, kháng

44

Đồ án tốt nghiệp

mạnh nhất đối với chủng L.innocua với đường kính vòng kháng trung bình 12 mm

tương đương với đối chứng ciprofloxacin (0,5 mg/ml) về phương diện thống kê (P >

0,01). Cũng giống như cao EtOH 70%, cao EtOH 96% chỉ thể hiện khả năng kháng

khuẩn ở nồng độ 200 mg/ml, chủng L.innocua bị kháng mạnh nhất với đường kính

vòng kháng khuẩn trung bình là 9,5 mm thấp hơn so với đối chứng ciprofloxacin (0,5

mg/ml) ở mức khác biệt có ý nghĩa (P < 0,01). Ở nồng độ 100 mg/ml chỉ có cao EtOH

50% cho khả năng kháng chủng L.innocua với vòng kháng trung bình là 8,67 mm thấp

hơn so với đối chứng về mặt thống kê (P < 0,01). Đối với cao chiết Hoa Sứ vàng 50

mg/ml và cao nước không thể hiện khả năng kháng khuẩn có nghĩa là hoạt lực rất thấp

không đủ khả năng kháng lại các chủng vi khuẩn thử nghiệm.

Ở cao EtOH 70%, có thể thấy rằng các chủng thuộc nhóm Listeria spp. cho khả

năng kháng khuẩn cao nhất trong các loại cao chiết với đường kính trung bình là 12

mm và 10,83 mm. Đối với cao EtOH 96% cho kết quả kháng khuẩn thấp nhất so với

các loại cao khác và thấp hơn so với đối chứng. Với các nồng độ thử nghiệm thì nồng

độ 200 mg/ml cho khả năng kháng tốt nhất còn nồng độ 50 mg/ml không thể hiện tính

kháng khuẩn.

Theo kết quả nghiên cứu của Bayoub (2010) và Emanuel (2011), 2 chủng vi

khuẩn L.monocytogenes và L.innocua đều bị ức chế bởi cao chiết ethanol từ Matricaria

chamomilla và A-ti- sô (Cynara scolymus) với đường kính vòng ức chế là 15 mm. Đặc

biệt trong kết quả thí nghiệm này, cả ba loại cao chiết từ ethanol của Hoa Sứ vàng đều

có khả năng ức chế được sự phát triển của L.innocua và L.monocytogenes, đặc biệt là

cao EtOH 70% cho đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là 12 mm.

So với nghiên cứu của Rozman (2009) ở cây Rosmarinus offcinalis L. với nồng

độ 160 mg/ml có thể hiện tính kháng khuẩn trên chủng L.monocytogenes với đường

kính vòng kháng là 8 mm. Trong khi đó cao chiết EtOH 70% từ Hoa Sứ vàng ở nồng

độ 200 mg/ml lại có đường kính vòng kháng trung bình trên chủng L.monocytogenes là

10,83 mm.

45

Đồ án tốt nghiệp

3.3.3. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn

Salmonella spp.

Tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn của 4 loại cao chiết từ Hoa Sứ vàng

ở nồng độ 200 mg/ml, 100 mg/ml và 50 mg/ml trên nhóm vi khuẩn gây bệnh

Salmonella spp. gồm các chủng: S.enteritidis, S.typhii, S.typhimurium, và S.dublin. Kết

quả của thí nghiệm được trình bày ở Hình 3.4.

Hình 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết và đối chứng đối với nhóm vi

khuẩn Salmonella spp.

Dựa vào Hình 3.4, nhận thấy rằng cao chiết Hoa Sứ vàng ở nồng độ 200 mg/ml

từ các dung môi EtOH 50%, EtOH 70% và EtOH 96% đều ức chế với 4 chủng vi

khuẩn nhóm Salmonella spp. với đường kính vòng ức chế trung bình từ 8,7 mm đến 11

mm. Đối với cao EtOH 50% cho hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất thể hiện ở chủng

S.enteritidis với đường kính trung bình vòng kháng khuẩn là 10,33 mm tương đương

cới đối chứng ciprofloxacin (0,5 mg/ml) về phương diện thống kê (P > 0,01), thấp nhất

là chủng S.typhimurium với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình 8,83 mm khác

biệt ở mức có ý nghĩa so với đối chứng (P < 0,01). Đối với cao EtOH 70% cho khả

46

Đồ án tốt nghiệp

năng kháng khuẩn tốt nhất đối với chủng S.typhimurium với đường kính trung bình 12

mm tương đương với đối chứng ciprofloxacin (0,5 mg/ml) về mặt thống kê (P > 0,01),

thấp nhất là chủng S.typhii với đường kính trung bình 10,83 mm thấp hơn so với đối

chứng ở mức khác biệt có ý nghãi về phương diện thống kê (P < 0,01). Đối với cao

chiết EtOH 96%, chủng S.enteritidis bị kháng mạnh nhất với đường kính vòng kháng

trung bình 10,50 mm tương đương với đối chứng ciprofloxacin (0,5 mg/ml) về mặt

thống kê (P > 0,01), còn đối với chủng S.typhimurium cao chiết thể hiện khả năng

kháng khuẩn yếu nhất trong các vi khuẩn thử nghiệm với đường kính trung bình 8,33

mm khác biệt so với đối chứng ở mức có ý nghĩa thống kê (P < 0,01). Ở nồng độ 100

mg/ml, các loại cao chiết thể hiện hoạt tính kháng khuẩn với 3/4 chủng vi khuẩn trong

thí nghiệm với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình từ 7,33 mm đến 8,5 mm. Xét

ở cao EtOH 50%, trừ chủng S.enteritidis ở các chủng còn lại cao chiết đều thể hiện

hoạt tính kháng khuẩn với đường kính trung bình ở cả ba chủng đều là 8,5 mm và thấp

hơn so với đối chứng ở mức có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,01). Đối với cao EtOH

70% chỉ cho thấy khả năng kháng khuẩn đối với chủng S.typhii với đường kính trung

bình 7,33 mm thấp hơn so với đối chứng ở mức khác biệt có ý nghĩa (P < 0,01). Đối

với cao chiết EtOH 96%, chỉ cho khả năng kháng khuẩn với chủng S.typhii với đường

kính vòng kháng khuẩn trung bình là 8,5 mm thấp hơn so với đối chứng ở mức có ý

nghĩa về mặt thống kê (P < 0,01). Riêng với cao chiết nước và các loại cao ở nồng độ

50 mg/ml không có dấu hiệu của sự ức chế đối với nhóm Salmonella spp.

Từ kết quả này có thể thấy các loại cao chiết ethanol 50%, 70%, 96% với nồng

độ 200 mg/ml có khả năng kháng khuẩn tốt đối với các chủng vi khuẩn đặc biệt là cao

ethanol ở nồng độ 70%. Qua kết quả trên cũng cho thấy nồng độ 50 mg/ml ở các loại

cao chiết cũng không cho khả năng kháng khuẩn có nghĩa là hoạt lực của cao chiết ở

50 mg/ml không đủ mạnh để kháng các chủng vi khuẩn thử nghiệm.

So với nghiên cứu của Muruganantham và ctv (2014) ở cây Plumeria rubra với

cao EtOH 96% ở nồng độ 30 mg/ml có thể kháng chủng S.typhii với đường kính vòng

47

Đồ án tốt nghiệp

kháng là 10 mm. Còn đối với cao chiết EtOH 70% từ Hoa sứ vàng ở nồng độ 200

mg/ml có đường kính vòng kháng trung bình trên chủng S.typhii là 11,7 mm.

Trong nghiên cứu của Doughari và Okafor (2008) cho thấy khả năng kháng

khuẩn của cao chiết ethanol ở nồng độ 30 mg/ml từ Senna siamae đối với chủng

S.typhii cho thấy vòng kháng khuẩn là 8 mm. Mặt khác, cao chiết ethanol 70% ở nồng

độ 200 mg/ml của Hoa Sứ vàng cho khả năng kháng khuẩn với vòng kháng trung bình

là 10,83 mm.

Qua sự so sánh có thể thấy khả năng kháng khuẩn là khác nhau giữa các loại

mẫu điều đó có thể do các chất trong cây khác nhau và điều kiện tự nhiên ở mỗi vùng

lãnh thổ cũng một phần do điều kiện và phương pháp nhiên cứu ảnh hưởng đến kết

quả.

3.3.4. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn

Shigella spp.

Tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn của 4 loại cao chiết từ Hoa Sứ vàng

ở nồng độ 200 mg/ml, 100 mg/ml, 50 mg/ml trên nhóm vi khuẩn gây bệnh Shigella

spp. gồm các chủng: Shi.sonnei, Shi.boydii và Shi.flexneri. Kết quả của thí nghiệm

được trình bày ở Hình 3.5.

48

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.5. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết và đối chứng đối với nhóm vi

khuẩn Shigella spp.

Kết quả Hình 3.5 cho thấy rằng cao chiết Hoa Sứ vàng từ các loại dung môi

đều ức chế được 3 chủng của nhóm vi khuẩn Shigella spp. ở nồng độ 200 mg/ml với

đường kính vòng kháng khuẩn trung bình từ 8,33 mm đến 12 mm ngoại trừ cao nước

không có khả năng kháng. Có thể thấy cao chiết EtOH 50% cho khả năng kháng mạnh

nhất đối với chủng Shi.boydii với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là 9,67 mm

nhưng kháng sinh ciprofloxacin lại không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với

chủng này sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,01), ở hai chủng còn lại cho khả

năng kháng của cao là thấp với đường kính trung bình vòng kháng khuẩn ở cả 2 chủng

đều là 8,83 mm thấp hơn so với đối chứng ciprofloxacin (0,5 mg/ml) ở mức có ý nghĩa

(P < 0,01). Đối với cao chiết EtOH 70% cho khả năng kháng khuẩn mạnh nhất đối với

chủng Shi.flexneri có đường kính vòng kháng trung bình 12 mm tương đương với đối

chứng ciprofloxacin (0,5 mg/ml) về mặt thống kê (P > 0,01), khả năng kháng thấp nhất

đối với chủng Shi.boydii với đường kính trung bình 10,50 mm mặt khác ở chủng này

kháng sinh không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn. Đối với cao EtOH 96% cho khả

năng kháng tốt nhất đối với chủng Shi.boydii với đường kính trung bình vòng ức chế là

8,67 mm còn kháng sinh ciprofloxacin không cho khả năng kháng khuẩn (P < 0,01). Ở

49

Đồ án tốt nghiệp

nồng độ 100 mg/ml thì chỉ kháng được 2/3 chủng với vòng kháng khuẩn trung bình từ

7,50 mm đến 11 mm. Đối với cao EtOH 70% chỉ thể hiện khả năng kháng khuẩn với

chủng Shi.flexneri với đường kính trung bình vòng kháng khuẩn là 11 mm thấp hơn so

với đối chứng ciprofloxacin (0,5 mg/ml) ở mức có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,01).

Đối cới cao EtOH 96% chỉ thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng Shi.boydii với

đường kính trung bình là 7,5 mm. Ở đối chứng chỉ có thể kháng 2/3 chủng vi khuẩn

thuộc nhóm Shigella spp. Ngoài ra cao nước và các loại cao ở nồng độ 50 mg/ml

không thể hiện khả năng kháng khuẩn.

Qua kết quả thực nghiệm trên cho thấy rằng cao chiết EtOH 70% có hoạt tính

kháng khuẩn tốt đối với các chủng vi khuẩn trong nhóm Shigella spp. hơn là cao chiết

từ các loại dung môi khác trong thí nghiệm. Đối với chủng Shi.boydii các loại cao chiết

ethanol đều thể hiện khả năng kháng khuẩn ở nồng độ 200 mg/ml còn với nồng độ 100

mg/ml ở cao EtOH 96%, trong khi đó kháng sinh ciprofloxacin ở nồng độ 0,5 mg/ml

lại không có khả năng kháng đối với chủng Shi.boydii có sự khác biệt có ý nghĩa về

mặt thống kê (P < 0,01).

So sánh với nghiên cứu của Kumari và ctv (2013) về khả năng kháng khuẩn

của cây Plumeria alba LINN. cho kết quả kháng khuẩn với chủng Shi.boydii 8 và

S.sonnei NK 29 với đường kính vòng kháng khuẩn lần lượt là 12,5 mm và 11 mm ở

nồng độ 1 mg/ml còn đối với chủng Shi.boydii và Shi.sonnei trong thí nghiệm với cao

chiết Hoa Sứ vàng cho khả năng kháng khuẩn với vòng kháng trung bình lần lượt là

10,5 mm và 11,17 mm.

3.3.5. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn

Vibrio spp.

Tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn của 4 loại cao chiết từ Hoa Sứ vàng

ở nồng độ 200 mg/ml, 100 mg/ml và 50 mg/ml trên nhóm vi khuẩn Vibrio spp. gồm các chủng: V.cholerae, V.harveyi, V.alginoliticus và V.parahaemolyticus. Kết quả của thí nghiệm được trình bày ở Hình 3.6.

50

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.6. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết và đối chứng đối với nhóm vi

khuẩn Vibrio spp.

Kết quả Hình 3.6 cho thấy rằng cao chiết Hoa Sứ vàng ở nồng độ 200 mg/ml

từ các loại dung môi đều ức chế được 4 chủng của nhóm vi khuẩn Vibrio spp. với

đường kính vòng kháng khuẩn trung bình từ 9,3 mm đến 13 mm. Trong đó, cao chiết

EtOH 50% cho khả năng kháng khuẩn mạnh nhất đối với chủng V.alginolyticus với

đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là 10 mm thấp hơn với đối chứng

ciprofloxacin (0,08 mg/ml) về mặt thống kê (P < 0,01), khả năng kháng khuẩn thấp

nhất đối với 2 chủng V.harveyi và V.parahaemolyticus có đường kính vòng kháng

khuẩn trung bình 9,33 mm ở cả hai chủng, thấp hơn so với đối chứng ở mức có ý nghĩa

(P < 0,01). Đối cới cao chiết EtOH 70% kháng mạnh nhất ở chủng V.paraheamolitycus

với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình 13 mm tương đương với đối chứng

ciprofloxacin (0,08 µg/ml) về phương diện thống kê (P > 0,01), kháng thấp nhất ở

chủng V.harveyi với đường kính trung bình 10,17 mm thấp hơn so với đối chứng ở

mức có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,01). Đối với cao EtOH 96% cho khả năng

kháng tốt nhất chủng V.harveyi với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình 9,67 mm

51

Đồ án tốt nghiệp

thấp hơn so với đối chứng ở mức có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,01), với hai chủng

V.alginolyticus và V.paraheamolitycus cao EtOH 96% cho khả năng kháng khuẩn thấp

nhất với đường kính vòng kháng khuẩn của 2 chủng đều bằng 9 mm thấp hơn so với

đối chứng (P < 0,01). Ở nồng độ 100 mg/ml chỉ thể hiện khả năng kháng khuẩn ở 3/4

chủng thuộc nhóm Vibrio spp. với đường kính trung bình từ 8,17 mm dến 10,5 mm.

Trong đó, cao EtOH 50% không thể hiên hoạt tính kháng khuẩn. Cao EtOH 70% chỉ

thể hiện hoạt tính kháng khuẩn ở chủng V.parahaemolyticus với đường kính vòng

kháng khuẩn trung bình là 10,5 mm tương đương với đối chứng trên phương diện

thống kê (P > 0,01). Đối với cao EtOH 96% thể hiện khả năng kháng 2/3 chủng vi

khuẩn thử nghiệm là V.alginolyticus và V.cholerae với đường kính vòng kháng khuẩn

trung bình đều bằng 8,17 mm thấp hơn s với đối chứng ciprofloxacin (0,08 mg/ml) ở

mức có ý nghĩa trên phương diện thống kê (P < 0,01). Mặt khác cao nước và các loại

cao khác ở nồng độ 50 mg/ml không có hoạt tính kháng khuẩn.

Như vậy có thể nhận thấy rằng cao chiết EtOH 50%, EtOH 70% và EtOH 96%

đều có khả năng ức chế được nhóm vi khuẩn Vibrio spp. ở nồng độ 200 mg/ml, trong

khi đó cao chiết EtOH 70% có khả năng ức chế nhóm Vibrio spp. cao hơn so với cao

chiết EtOH 50% và EtOH 96% với đường kính vòng ức chế dao động từ 10,2 mm đến

13 mm. Riêng cao chiết nước không có khả năng ức chế được nhóm vi khuẩn Vibrio

spp. và ở nồng độ 50 mg/ml cũng không cho thấy khả năng kháng khuẩn ở các loại cao

thử nghiệm.

So sánh với nghiên cứu của Kurima và ctv (2013) về khả năng kháng khuẩn

của cây Plumeria alba LINN. cho kết quả kháng khuẩn với chủng V.cholerae 756 với

đường kính vòng kháng khuẩn là 10 mm ở nồng độ 1 mg/ml còn đối với chủng

V.cholerae trong thí nghiệm với cao chiết Hoa Sứ vàng cho khả năng kháng khuẩn với

vòng kháng trung bình là 10,67 mm.

Qua nghiên cứu của Maneemegalai và Naveen (2010), cho thấy khả nắng

kháng chủng V.cholerae của hoa Cassia auriculata từ cao chiết ethanol ở nồng độ 100

52

Đồ án tốt nghiệp

mg/ml với đường kính vòng kháng khuẩn là 17 mm. Đối với cao chiết Hoa Sứ vàng thì

cho vòng kháng 10,67 mm ở EtOH 70% nồng độ 200 mg/ml.

3.3.6. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn

còn lại.

Tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn của 3 loại cao chiết từ Hoa Sứ vàng

ở nồng độ 200 mg/ml trên nhóm vi khuẩn còn lại trong thí nghiệm gồm các chủng:

P.aeruginosa, S.aureus và E.faecalis. Kết quả của thí nghiệm được trình bày ở Hình

3.7.

Hình 3.7. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết và đối chứng đối với nhóm vi

khuẩn còn lại.

Kết quả ở Hình 3.7 cho thấy rằng cao chiết Hoa Sứ vàng từ các loại dung môi ở

nồng độ 200 mg/ml đều ức chế 3 chủng vi khuẩn thử nghiệm với đường kính trung

bình từ 8,3 mm đến 11 mm. Trong đó, cao EtOH 50% thể hiện hoạt tính kháng khuẩn

tốt nhất trên chủng E.faecalis với đường kính trung bình vòng kháng khuẩn là 9,5 mm

thấp hơn so với đối chứng ciprofloxacin (0,5 mg/ml) ở mức có ý nghĩa thống kê (P <

0,01), khả năng kháng thấp nhất là ở chủng S.aureus với đường kính vòng kháng khuẩn

trung bình là 8,33 mm. Đối với cao EtOH 70% cho khả năng kháng khuẩn mạnh nhất ở

53

Đồ án tốt nghiệp

2 chủng S.aureus và E.faecalis với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình ở cả 2

chủng là 11 mm tương đương với đối chứng ciprofloxacin (0,5 mg/ml) về mặt thống kê

(P > 0,01). Đối với cao EtOH 96% chỉ thể hiện hoạt tính ở 2/3 chủng vi khuẩn thử

nghiệm là P.aeruginosa và E.faecalis. Trong đó, ở nồng độ 200 mg/ml cho khả năng

kháng khuẩn tốt nhất đối với chủng P.aeruginosa với đường kính trung bình 9,83 mm

thấp hơn so với đối chứng ciprofloxacin (0,5 mg/ml) ở mức có ý nghĩa (P < 0,01). Ở

nồng độ 100 mg/ml cao EtOH 50% không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn. Đối với cao

EtOH 70% chỉ thể hiện khả năng kháng khuẩn đối với chửng E.faecalis với đường kính

trung bình là 8,5 mm thấp hơn so với đối chứng ở mức có ý nghĩa thống kê (P < 0,01).

Còn cao EtOH 96% thể hiện hoạt tính ở 2/3 chủng trừ chủng S.aureus trong đó cho khả

năng kháng tốt nhất đối với chủng E.faecalis với đường kính trung bình vòng kháng

khuẩn là 8,83 mm thấp hơn so với đối chứng ở mức có ý nghĩa thống kê (P < 0,01).

Mặt khác cao nước và các loại cao ở nồng độ 50 mg/ml không cho thấy khả năng

kháng khuẩn.

Có thể nhận thấy rằng cao chiết Hoa Sứ vàng EtOH 70% ở nồng độ 200 mg/ml

thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất cho cả 3 chủng khảo sát với đường kính vòng

ức chế trung bình từ 10,7 mm - 11 mm so với các loại cao chiết khác trong thí nghiệm.

Ở cao chiết EtOH 50% cho thấy khả năng kháng đối với cả ba chủng vi khuẩn nhưng

đường kính vòng ức chế thấp từ 8,3 mm đến 9,5 mm. Ở cao EtOH 96% chỉ kháng được

hai chủng là P.aeruginosa và E.faecalis còn đối với chủng S.aureus thì không thể hiện

hoạt tính kháng khuẩn. Đối với nồng độ 50 mg/ml do hoạt lực yếu nên không thể hiện

hoạt tính kháng khuẩn.

Trong kết quả thi nghiệm của Vijayakumar và ctv (2015) cho thấy hoạt tính

kháng khuẩn ở cao chiết ethanol 95% ở nồng độ 150 mg/ml từ Carica papaya L. với

chủng S.aureus là 7 mm. Còn trong cao chiết EtOH 96% ở nồng độ 200 mg/ml của

Hoa Sứ vàng không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn, nhưng trong cao EtOH 70% ở

nồng độ 200 mg/ml thì lại cho khả năng kháng khuẩn là 11 mm.

54

Đồ án tốt nghiệp

So sánh với cao chiết ethanol 96% ở nồng độ 30 mg/ml hoa của Plumeria

rubra trong nghiên cứu của Muruganantham và ctv (2015) cho thấy khả năng kháng

khuẩn đối với chủng E.faecalis với đường kính vòng kháng là 12 mm. Trong đó đối

với chủng này cao chiết EtOH 70% của Hoa Sứ vàng ở nồng độ 200 mg/ml cho vòng

kháng khuẩn trung bình 11 mm.

Qua đó cho thấy hoạt tính khấng khuẩn của cao chiết Hoa Sứ vàng thấp hơn so

với hai loại cao chiết đã so sánh ở trên. Với kết quả này có thể do các loại cây ở những

điều kiện thí nghiệm và điều kiện tự nhiên ở mỗi nơi khác nhau nên ảnh hưởng đến kết

quả nghiên cứu.

3.3.7. Tổng hợp kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với 20 vi

khuẩn gây bệnh gây bệnh

Sau khi tiến hành khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Hoa Sứ vàng từ

các loại dung môi khác nhau ở nồng độ 200 mg/ml trên 20 nhóm vi khuẩn gây bệnh,

kết quả tổng hợp đo đường kính vòng ức chế của 4 loại cao chiết được trình bày ở

Bảng 3.1.

Bảng 3.1. Kết quả đường kính vòng ức chế (mm) các loại cao chiết khác nhau từ Hoa

Sứ vàng đối với 20 chủng vi sinh vật chỉ thị.

55

Đồ án tốt nghiệp

Vi sinh vật chỉ thị

Ciprofloxacin(*)

E.coli

13,17a ± 0,29

ETEC

31,00a ± 0,50

E.coli 0208

12,33a ± 0,29

E.coli O157:H7

13,17a ± 0,29

L.innocua

12,00a ± 0,50

L.monocytogenes

12,17a ± 0,29

S.dublin

12,17a ± 0,76

S.enteritidis

13,00a ± 0,50

S.typhii

12,50a ± 0,50

S.typhimu

13,17a ± 0,29

Shi.sonneii

33,00a ± 0,50

Shi.boydii

NA

Shi.flexneri

13,17a ± 0,29

V.cholerae

13,33a ± 0,58

V.harveyi

18,00a ± 0,50

V.alginolyticus

16,17a ± 0,29

V.parahaemolyticus

11,33a ± 0,29

P.aeruginosa

12,17a ± 0,58

S.aureus

12,17a ± 0,29

E.faecalis

12,00a ± 0,50

Nồng độ (mg/ml) 200 100 200 100 200 100 200 100 200 100 200 100 200 100 200 100 200 100 200 100 200 100 200 100 200 100 200 100 200 100 200 100 200 100 200 100 200 100 200 100

Cao chiết nước NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA

Cao chiết ethanol 50% 8,83b ± 1,04 NA 9,00c ± 0,50 NA 9,83ab ± 0,29 8,50b ± 0,5 9,67b ± 0,58 8,50b ± 0,50 10,00ab ± 0,50 8,67b ± 0,58 10,00b ± 0,50 NA 9,67bc ± 0,58 8,5b ± 0,5 10,33a ± 0,58 8,5b ± 0,5 9,33b ± 0,76 8,50b ± 0,5 8.83b ± 0,29 NA 8,83c ± 0,29 NA 9,67ab ± 0,58 NA 8,83b ± 0,29 NA 9,50b ± 0,5 NA 9,33b ± 0,58 NA 10,00bc ± 0,50 NA 9,33b ± 0,58 NA 8,67b ± 0,58 NA 8,33b ± 0,29 NA 9,50b ± 0.87 NA

Cao chiết ethanol 70% 9,50b ± 1,50 NA 12,00b ± 1,00 9,50c ± 0,50 11,33ab ± 1,53 NA 8,67b ± 0,58 NA 12,00a ± 1,00 NA 10,83ab ± 0,76 NA 11,00ab ± 1,00 NA 11,67a ± 1,53 NA 10,83ab ± 1,26 7,33b ± 0,29 12,00a ± 1,00 NA 11,17b ± 0,16 NA 10,50a ± 0,5 NA 12,00a ± 1,00 11,00b ± 1,00 10,67b ± 1,15 NA 10,17b ± 0,76 NA 11,00b ± 1,00 NA 13,00a ± 0,5 10,50a ± 0,50 10,67ab ± 1,53 NA 11,00a ± 1,00 NA 11,00ab ± 1,00 8,50b ± 0,50

Cao chiết ethanol 96% 10,00a ± 1,00 NA 8,83c ± 0,76 NA 8,67b ± 0,58 NA 10,17b ± 0,76 NA 9,50b ± 0,50 NA 8,17c ± 0,29 NA 8,67c ± 0,29 NA 10,50a ± 0,50 NA 10,33ab ± 0,58 8,50b ± 0,50 8,33b ± 0,58 7,5 ± 0,5 8,33c ± 0,58 NA 8,67b ± 0,58 NA 8,33b ± 0,58 NA 9,50b ± 0,50 8,17b ± 0,76 9,67b ± 0,58 NA 9,00c ± 0,50 8,17b ± 0,29 9,00b ± 1,00 NA 9,83b ± 0,29 8,67b ± 0,58 NA NA 9,67ab ± 0,58 8,83b ± 0,76

(*): Nồng độ ciprofloxacin tương ứng với nhóm Vibrio spp. là 8 µg/ml và đối với các vi sinh vật chỉ thị còn lại là 500 µg/ml. NA: Non activity

56

Đồ án tốt nghiệp

Dựa vào Bảng 3.1 có thể kết luận rằng cao chiết Hoa Sứ vàng sứ vàng từ 4 loại

dung môi ở nồng độ 200 mg/ml có phổ hoạt động rộng và hoạt tính kháng khuẩn khác

nhau trên 20 chủng vi khuẩn chỉ thị với đường kính vòng úc chế trung bình từ 8,17 mm

đến 13 mm. Mặt khác, các loại cao chiết ethanol có khả năng ức chế tốt đối với cả 20

chủng vi khuẩn khảo sát, trong đó ở cao chiết EtOH 96% không có khả năng kháng

chủng S.aureus; còn đối với cao nước không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn trên 20

chủng vi khuẩn chỉ thị. Đặc biệt cao EtOH 70% thể hiện khả năng kháng khuẩn ở

19/20 chủng vi khuẩn thuộc các nhóm Escherichia coli, Listeria spp., Salmonella spp.,

Shigella spp., Vibrio spp. và nhóm gây bệnh cơ hội trên da so với các cao chiết còn lại

luôn ở mức cao nhất với đường kính vòng kháng trung bình từ 8,67 mm đến 13 mm. Ở

cao chiết EtOH 70% riêng đối với các nhóm vi khuẩn Listeria spp., Salmonella spp. và

nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da còn đối với nhóm Vibrio spp. thì có chủng

V.parahaemolyticus khi so sánh với kháng sinh thì ở nồng độ 200 mg/ml có hoạt tính

tương đương với ciprofloxacin (0,5 mg/ml) riêng chủng Vibrio spp. là ciprofloxacin

(0,08 mg/ml) không có sự khác biệt về phương diện thống kê với (P > 0,01). Đối với

nồng độ 100 mg/ml cao chiết Hoa Sứ vàng cho khả năng kháng khuẩn không đồng dều

với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình từ 7,33 mm đến 11 mm. Cụ thể, ở cao

chiết EtOH 50% chỉ kháng được 6/20 chủng vi khuẩn thử nghiệm. Ở cao chiết EtOH

70% thể hiện hoạt tính kháng khuẩn với 5/20 chủng vi khuẩn chỉ thị, đặc biệt kháng

mạnh nhất đối với chủng Shi.flexneri với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là

11 mm tuy nhiên thấp hơn so với đối chứng ciprofloxacin (0,5 mg/ml) ở mức có ý

nghĩa về mặt thống kê (P < 0,01). Còn ở cao chiết EtOH 96% cũng chỉ cho khả năng

kháng 6/20 chủng vi khuẩn.

Xét khả năng kháng khuẩn của cao EtOH 50% và cao EtOH 96% có thể thấy

phổ kháng khuẩn rộng lần lượt là 20/20 và 19/20 chủng vi khuẩn chỉ thị với đường

kính trung bình của vòng kháng khuẩn lần lượt từ 8,3 mm đến 10,3 mm và từ 8,3 mm

đến 10,5 mm. Ở hai loại cao này khả năng kháng khuẩn của cao EtOH 50% cao hơn

57

Đồ án tốt nghiệp

cao EtOH 96% nhưng không nhiều. Ở chủng Listeria spp. cao EtOH 70% cho khả

năng kháng cao hơn cao EtOH 96% và ngược lại ở chủng vi khuẩn gây bệnh cơ hội

trên da cao EtOH 96% cho kết quả tốt hơn. Mặt khác ở cao nước không có khả năng

kháng khuẩn.

Theo kết quả nghiên cứu của Kareem, Akpan và Ojo (2008); nhóm tác giả đã

khả sát hoạt tính kháng khuẩn của lá và nhựa cây Calotropis procera với dung môi

ethanol ở nồng độ 10 mg/ml trên một số chủng vi khuẩn khảo sát tương tự trong thí

nghiệm. Kết quả đường kính vòng ức chế đối với các chủng E.coli, S.aureus,

P.aeruginosa lần lượt ở lá là 8,5 mm; 7 mm; 3,5 mm và ở nhựa là 14,1 mm; 12 mm; 7

mm cho thấy hoạt tính khang khuẩn của Calotropis procera cao hơn Hoa Sứ vàng.

Theo kết quả nghiên cứu của Igbinosa (2009) đã tiến hành thử nghiệm khả

năng kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ cây Jatropha curcas (cây dầu mè) trên các

chủng vi sinh vật như E.coli, Pseudomonas với đường kính vòng ức chế tương ứng là

11 mm và 12 mm (đường kính lỗ d = 6 mm). Từ kết quả nghiên cứu trên, so sánh với

hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% từ Hoa Sứ vàng ở nồng độ 200

mg/ml với chủng ETEC và E. coli có đường kính vòng ức chế là 12 mm và 9,5 mm,

với chủng Pseudomonas có đường kính vòng ức chế là 10,7 mm có thể nhận thấy được

rằng cao chiết ethanol 70% có hoạt tính kháng khuẩn tương đương cao chiết ethanol từ

cây dầu mè.

So với kết quả của Trần Phương Thùy (2017) về khảo sát hoạt tính kháng

khuẩn của cao chiết nước và ethanol Hoa Sứ trắng cho thấy phổ kháng rộng và khả

năng kháng mạnh ở cả 20 chủng vi sinh vật chỉ thị với đường kính trung bình từ 8,17

mm đến 12,5 mm như trong thí nghiệm đã sử dụng. Còn với mẫu cao chiết Hoa Sứ

vàng cho khả năng kháng khuẩn và phổ kháng khá tương đồng với nghiên cứu Hoa Sứ

trắng với đường kính kháng khuẩn trung bình từ 8,17mm đến 12 mm.

Qua kết quả phân tích, có thể kết luận rằng tách chiết mẫu cây Hoa Sứ vàng

bằng dung môi EtOH 70% sẽ thể hiện hoạt tính kháng khuẩn cao nhất so với các loại

58

Đồ án tốt nghiệp

dung môi tách chiết còn lại. Mặt khác, chúng tôi nhận thấy sử dụng dung môi EtOH

70% để tách chiết cao từ mẫu Hoa Sứ vàng là khá phù hợp vì quá trình tách chiết dễ

thực hiện, thiết bị đơn giản và an toàn. Từ thực nghiệm trên, tiến hành khảo sát thành

phần hóa học của Hoa Sứ vàng ở cao ethanol 70%.

3.3. Kết quả định tính một số thành phần hóa học cơ bản của cao chiết Hoa Sứ

vàng từ ethanol 70%.

Từ kết quả các thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cho thấy cao chiết

Hoa Sứ vàng từ EtOH 70% có khả năng ức chế các loại vi khuẩn tốt hơn các loại cao

chiết khác. Dựa vào cơ sở trên, tiến hành thực hiện các thử nghiệm để xác định sự hiện

diện một số thành phần hóa học có khả năng kháng khuẩn trong mẫu cao chiết Hoa Sứ

vàng EtOH 70%. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.2.

Bảng 3.2. Kết quả định tính một số thành phần hóa học của cao chiêt Hoa Sứ vàng từ

ethanol 70%.

Nhóm hợp chất Thử nghiệm Kết quả

Molisch +

Carbohydrate Fehling +

Barfoed +

Mayer +

Dragendorff + Alkaloid Hager +

Wagner +

Saponin Foam +

Legal - Cardiac glycosides Keller Killiani +

Alkaline reagent + Flavonoid Ferric chloride +

59

Đồ án tốt nghiệp

Lead acetate + Phenolic compound Gelatin +

Ferric chloride - Tannins Lead acetate -

Salkowski + Steroids Libermann Burchard -

- Amino acid Ninhidrin

(+) Dương tính (-) Âm tính

Dựa vào bảng 3.2, kết quả định tính thành phần hóa học của cao chiết Hoa Sứ

vàng từ ethanol 70% có khả năng tách chiết được rất nhiều hợp chất có trong hoa bao

gồm những hợp chất tự nhiên trong đó có những hợp chất có hoạt tính sinh học như:

carbohydrate, alkaloid, saponin, cardiac glycosides, flavonoid, steroids. Bên cạnh đó,

có 3 hợp chất không được phát hiện trong cao chiết Hoa Sứ vàng từ ethanol 70% là

phenolic compound, tannins, amino acid.

Hoạt tính kháng khuẩn của thực vật nói chung và của cao chiết Hoa Sứ vàng

nói riêng là do chúng có các thành phần alkaloid, flavonoid, hợp chất phenol, tannin và

triterpenoid quyết định. Với thử nghiệm định tính alkaloid, nhận thấy cao chiết từ dung

môi ethanol 70% cho phản ứng dương tính, điều này chứng tỏ loại dung môi này có

khả năng tách chiết các hợp chất thuộc nhóm alkaloid. Theo nghiên cứu của Cowan

(1999), xét cụ thể ở hợp chất alkaloid có thể thấy tồn tại dẫn chất berberine và dẫn chất

piperrine có chức năng xen vào thành tế bào hoặc DNA của vi sinh vật phá hủy và tiêu

diệt chúng. Còn đối với thử nghiệm hợp chất steroid cho kết quả dương tính với thuốc

thử salkowski, giống với kết quả nghiên cứu của Liang và ctv, 2012 công bố tìm được

các hợp chất betulinic acid thuộc nhóm triterpenoid và hợp chất stigmasterol thuộc

nhóm sterol. Thử nghiệm flavonoid với thuốc thử Ferric chloride giúp nhận biết

chalcon trong nhóm chất flavonoid (Đặng Thị Luyến và ctv, 2008) và thử nghiệm với

60

Đồ án tốt nghiệp

thuốc thử Alkaline giúp phân biệt nhóm flavon và flavonol (Manpreet Kaur, 2015).

Các hợp chất được thử nghiệm có khả năng kháng khuẩn bằng các con đường khác

nhau như phá vỡ màng tế bào, liên kết bám dính, tạo phức hợp với thành tế bào, khử

hoạt tính enzyme và bám dính protein. Sự kháng khuẩn thực vật còn có sự tham gia của

tannin và các hợp chất phenol, tuy nhiên kết quả định tính cao chiết EtOH 70% từ Hoa

Sứ vàng lại không thấy có sự suất hiện của tannin và các hợp chất phenol. Chính vì thế

nồng độ ức chế vi khuẩn chỉ thị của cao chiết tương đối cao.

Bên cạnh đó, Ramproshad và cộng sự (2012) và Subur Khan (2010) đã chỉ ra

có sự xuất hiện của các hợp chất alkaloid, steroid, flavonoid glycoside khi nghiên cứu

thành phần hóa học từ cây Plumeria. Qua đó có thể khẳng định sự xuất hiện của các

thành phần này trong Hoa Sứ vàng.

Tóm lại, với các kết quả khảo sát ban đầu về hoạt tính sinh học của Hoa Sứ

vàng, nhận thấy rằng đây là một loại thực vật có hoạt tính sinh học tương đối tốt. Tuy

dung môi nước cho hàm lượng thu hồi cao tốt nhất trong 4 dung môi khảo sát nhưng

với các thí nghiệm đã thực hiện nhận thấy rằng cao chiết từ EtOH 70% cho hoạt tính

kháng khuẩn mạnh hơn tất cả các dung môi còn lại thể hiện qua khả năng ức chế tốt

nhất ở cả 6/6 nhóm vi khuẩn chỉ thị sử dụng trong thí nghiệm, đặc biệt là đối với các

nhóm Listeria spp., Salmonella spp. và nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da. Trong

cao chiết ethanol 70% từ Hoa Sứ vàng có sự hiện diện của rất nhiều hợp chất có hoạt

tính sinh học carbohydrate, alkaloid, flavonoid, saponin, steroid, glycoside; những hợp

chất này tạo nên hoạt tính kháng khuẩn của Hoa Sứ vàng.

61

Đồ án tốt nghiệp

Kết luận và kiến nghị

- Từ mẫu Hoa Sứ vàng thực hiện tách chiết để thu hồi cao với 4 loại dung môi

1. Kết luận

khác nhau EtOH 50%, EtOH 70%, EtOH 96% và nước trong đó hàm lượng thu hồi cao

- Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của 4 loại cao chiết Hoa Sứ vàng trên

từ dung môi nước cho kết quả cao nhất là 32,27%.

20 chủng gây bệnh tiêu chảy và bệnh cơ hội trên da cho thấy cao chiết Hoa Sứ vàng có

phổ hoạt động rộng và có ức chế tất cả các chủng vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm cho

người, đặc biệt là cao chiết từ EtOH 70% luôn có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất với

- Thử nghiệm xác định thành phần hóa học của cao chiết EtOH 70% từ Hoa Sứ

đường kính vòng kháng trung bình từ 8,7mm đến 13mm.

vàng thấy sự hiện diện của các hợp chất carbohydrate, alkaloid, saponin, cardiac

glycoside, flavonoid và nhóm steroid.

- Đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ Hoa Sứ vàng với nhiều vi sinh

2. Kiến nghị

- Đánh giá khả năng trị bệnh của cao chiết từ Hoa Sứ vàng trên mô hình ở động

vật gây bệnh khác.

- Đánh giá khả năng kháng oxi hóa của Hoa Sứ vàng.

vật để làm cơ sở ứng dụng điều chế thuốc trị bệnh cho người.

62

Đồ án tốt nghiệp

Tài liệu tham khảo

Tài liệu Việt Nam

Đỗ Tất Lợi (2001)- “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, NXB Khoa học

Kỹ thuật.

GV Bùi Thi Hải Hòa và sinh viên thực hiện (2012), Chuyên Đề: Độc Tố E.coli,

Viện Đại học Mở Hà Nội.

Hoàng Sầm và Hứa Văn Thao (2012). Hoạt tính sinh học của saponin với ung

thư, TruongSinhThang. 17/08/2012, xem 17-06-2015, link:

ChiTietTinTuc.aspx?ArticleID=21>.

Ngô Văn Thu (1998), Bài giảng dược liệu, tập I, Trường đại học Dược Hà Nội

Ngô Văn Thu (2011), Bài giảng dược liệu, tập I, Trường đại học Dược Hà Nội

Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007, Phương pháp cô lập các hợp chất hữu cơ, NXB

ĐHQG TPHCM

Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp (2007). Thực tập vi sinh vật học, Nhà

xuất bản Khoa Học Kỹ Thuật, Hà Nội.

Nguyễn Phương Hà Linh Linh (2011). Cấu tạo, tính chất và vai trò của

carbohydrate.

Nguyễn Tấn Thịnh (2013), Tìm hiểu thành phần hợp chất thứ cấp trong cây

lược vàng, Trường đại học công nghệ TP.HCM.

Nguyễn Thị Hiền và ctv (2010). Chất kháng khuẩn thực vật. Tiểu luận môn

công nghệ chế biến rau trái, Kỹ thuật hóa học. Đại học bách khoa TP.HCM.

PGS. TS. Nguyễn Thanh Bảo, 2007, Vi khuẩn học, Trường Đại học Y Dược

Tp. HCM.

Phạm Minh Nhựt(2013). Thực hành vi sinh đại cương. Trường Đại học Công

Nghệ Tp. HCM.

Phùng Trung Hùng và cộng tác viên (2013), Đại cương carbohydrate.

63

Đồ án tốt nghiệp

Quỳnh Ngọc (2013), Flavonoid – Bảo vệ sức khỏe an toàn, NXB Trung tâm

thông tin KH&CN TP.HCM.

Võ Văn Chi, 2012, Từ điển cây thuốc Việt Nam (Bộ mới), tập I, NXB Y học,

Hà Nội

Vũ Thị Việt Hoa, Tô Minh Châu, Vũ Thị Lân Ân, Lâm Thanh Hiền, Nguyễn

Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thúy Hương (2000) , Vi sinh học đại cương, Trường Đại học

Nông Lâm Tp.HCM.

Vũ Xuân Tạo (2011), Nghiên cứu alkaloid & quy trình tách chiết một số chất

có bản chất là alkaloid, Luận văn tốt nghiệp, Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên

TP.HCM.

Tài liệu nước ngoài

Ahlem Rebaya, Souad Igueld Belghith, Safa Hammrouni, Abderrazak

Maaroufi, Malika Trabelsi Ayadi, Jamila Kalthoum Chérif (2016) Antibacterial and

Antifungal Activities of Ethanol Extracts of Halimium halimifolium, Cistus salviifolius

and Cistus monspeliensis. International Journal of Pharmaceutical and Clinical

Research; 8(4): 243-247.

Akerele et al, Antimicrobial activity of the ethanol extract of the aerial parts of

sida acuta burm.f. (malvaceae). Tropical Journal of Pharmaceutical Research,

December 2007; 6 (4): 809-813

Babuselvam M., Farook K.A.M., Abideen S., Mohamed M.P. and

Uthiraselvam M. (2012). Screening of antibacterial activity of mangrove plant extracts

against fish and shrimp pathogens, International Journal of Applied Microbiology

Science, 1 (3), 20-25.

Burt, S., 2004 Essential oils: their antibacterial properties and potential

applications in foods – a review. Int. J. Food Microbiol. 94, 223 – 253.

Gislene G. F. Nascimento, 2000. Antibacterial activity of plant extracts and

phytochemicals on antibiotic-resistant bacteria. Brazilian Journal of Microbiology.

64

Đồ án tốt nghiệp

H. Qiao, T.J. Sun (2014). Antibacterial activity of ethanol extract and

fractions obtained from Taraxacum mongolicum flower, Research Journal of

Pharmacognosy (RJP) 1: 35-39.

Karkare S., Adou E, Cao S., Brodie P., Miller J. S., Andrianjafy N.

M.,Razafitsalama J., Andriantsiferana R., Rasamison V. E., Kingston D. G. I. (2007),

Cytotoxic cardenolide glycosides of Roupellina (Strophanthus) boivinii, The

Madagascar rainforest, J Nat Prod, pp:70:1766 – 1770.

Khalil 2012, Antimicrobial Activity of Ethanol Leaf Extracts of Catharanthus

Roseus From Saudi Arabia. International Conference on Environment Science and

Biotechnology.

Khan et al, 2010, comparative phytochemical screening of flowers of Plumeria

alba and Plumeria rubra. Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research. ISSN

- 0974-2441.

Kumar et al 2012, Antimicrobial potential of Plumeria rubra Syn Plumeria

acutifolia bark, Der Pharma Chemica, 4(4):1591-1593.

Maneemegalai et al 2010, Evaluation of Antibacterial Activity of Flower

Extracts of Cassia auriculata L.. Ethnobotanical Leaflets 14: 182- 92.

Muruganatham et al 2015, Antimicrobial activity of Ethanolic extracts of

Plumeria rubra flowers. American journal of pharmtech reseach.

Oladipupo A. Lawal, Isiaka A. Ogunwande and Andy R. Opoku, 2014,

Chemical Composition of Essential Oils of Plumeria rubra L. Grown in Nigeria,

European Journal of Medicinal Plants 6(1): 55-61.

O. O. Igbinosa et al, 2009. Antimicrobial activity and phytochemical screening

of stem bark extracts from Jatropha curcas (Linn). African Journal of Pharmacy and

Pharmacology Vol. 3(2). pp. 058-062.

65

Đồ án tốt nghiệp

Ramproshad et al, 2012, Screening of phytochemical and pharmacological

activities of leaves of medicinal plant Plumeria rubra. International journal of research

in pharmacy and chemistry. ISSN: 22312781.

Rozman T., Jersek B. (2009), Antimicrobial activity of rosemary extracts

(Rosmarimus officinalis L.) against diferent species of Listeria, Acta agriculturae

Slovenica.

S.Kalpana, S.Moorthi* and Sushila kumari 2013, Antimicrobial activity of

different extracts of leaf of Moringa oleifera (Lam) against gram positive and gram

negative bacteria. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences.

ISSN: 2319 – 7006.

Vinoth et al, 2012, Phytochemical analysis and antibacterial activity of

Moringa oleifera lam. International journal of research in Biological Sciences. ISSN

2249 – 9687.

66

Đồ án tốt nghiệp

Phụ lục

Phụ lục A: Kết xử lý số liệu thống kê khảo sát hàm lượng thu hồi cao chiết

từ Hoa Sứ vàng với các loại dung môi khác nhau.

Bảng The ANOVA Procedure

Dependent Variable: VKK

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

3 793.5291667 264.5097222 139.22 <.0001 Model

8 15.2000000 1.9000000 Error

808.7291667 Corrected Total 11

Bảng The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for VKK

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N Cao

A 36.267 3 Nước

B 31.400 3 EtOH50%

C 18.833 3 EtOH70%

C 17.133 3 EtOH96%

Phụ lục B. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các

loại cao chiết từ Hoa Sứ vàng đối với các nhóm vi khuẩn chỉ thị.

1. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao

chiết từ Hoa Sứ vàng đối với các nhóm vi khuẩn Escherichia coli.

B.1.1. E.coli

Nồng độ 200 mg/ml

Bảng The ANOVA Procedure

Dependent Variable: VKK

1

Đồ án tốt nghiệp

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

4 291.5666667 72.8916667 82.52 <.0001 Model

10 8.8333333 0.8833333 Error

300.4000000 Corrected Total 14

Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping Mean N Cao

A 13.1667 3 Ciprolof

B A 10.0000 3 EtOH96%

B 9.5000 3 EtOH70%

B 8.8333 3 EtOH50%

C 0.0000 3 Nuoc

B.1.2. Chủng ETEC

Nồng độ 200 mg/ml

Bảng The ANOVA Procedure

Dependent Variable: VKK

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

1571.666667 392.916667 943.00 <.0001 4 Model

4.166667 0.416667 10 Error

1575.833333 Corrected Total 14

2

Đồ án tốt nghiệp

Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping Mean N Cao

31.0000 3 Ciprolof A

12.0000 3 EtOH70% B

9.0000 3 EtOH50% C

8.8333 3 EtOH96% C

0.0000 3 Nuoc D

Nồng độ 100 mg/ml

Bảng The ANOVA Procedure

Dependent Variable: VKK

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

4 2169.600000 542.400000 5424.00 <.0001 Model

10 1.000000 0.100000 Error

2170.600000 Corrected Total 14

Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping Mean N Cao

A 31.0000 3 Ciprolof

B 9.5000 3 EtOH70%

C 0.0000 3 EtOH50%

C 0.0000 3 EtOH96%

C 0.0000 3 Nuoc

3

Đồ án tốt nghiệp

B.1.3. Chủng E.coli 0208

Nồng độ 200 mg/ml

Bảng The ANOVA Procedure

Dependent Variable: VKK

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

4 290.2666667 72.5666667 128.06 <.0001 Model

10 5.6666667 0.5666667 Error

295.9333333 Corrected Total 14

Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping Mean N Cao

A 12.3333 3 Ciprolof

B A 11.3333 3 EtOH70%

B A 9.8333 3 EtOH50%

B 8.6667 3 EtOH96%

0.0000 3 Nuoc C

Nồng độ 100 mg/ml

Bảng The ANOVA Procedure

Dependent Variable: VKK

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

412.6666667 103.1666667 1547.50 <.0001 4 Model

0.6666667 0.0666667 10 Error

413.3333333 Corrected Total 14

4

Đồ án tốt nghiệp

Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping Mean N Cao

12.3333 3 Ciprolof A

8.5000 3 EtOH50% B

0.0000 3 EtOH70% C

0.0000 3 EtOH96% C

0.0000 3 Nuoc C

B.1.4. Chủng E.coli O157

Nồng độ 200 mg/ml

Bảng The ANOVA Procedure

Dependent Variable: VKK

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

4 294.1666667 73.5416667 275.78 <.0001 Model

10 2.6666667 0.2666667 Error

296.8333333 Corrected Total 14

Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping Mean N Cao

A 13.1667 3 Ciprolof

B 10.1667 3 EtOH96%

B 9.6667 3 EtOH50%

B 8.6667 3 EtOH70%

C 0.0000 3 Nuoc

5

Đồ án tốt nghiệp

Nồng độ 100 mg/ml

Bảng The ANOVA Procedure

Dependent Variable: VKK

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

4 455.1666667 113.7916667 1706.87 <.0001 Model

10 0.6666667 0.0666667 Error

455.8333333 Corrected Total 14

Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping Mean N Cao

A 13.1667 3 Ciprolof

B 8.5000 3 EtOH50%

C 0.0000 3 EtOH70%

C 0.0000 3 EtOH96%

C 0.0000 3 Nuoc

B.2. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại

cao chiết từ Hoa Sứ vàng đối với các nhóm vi khuẩn Listeria spp.

B.2.1 Chủng L.innocua

Nồng độ 200 mg/ml

Bảng The ANOVA Procedure

Dependent Variable: VKK

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

4

299.4000000

74.8500000 213.86 <.0001

Model

10

3.5000000

0.3500000

Error

302.9000000

Corrected Total 14 Bảng The ANOVA Procedure

6

Đồ án tốt nghiệp

Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping

Mean

N Cao

A

12.0000

3 Ciprolof

A

12.0000

3 EtOH70%

B

A

10.0000

3 EtOH50%

B

9.5000

3 EtOH96%

C

0.0000

3 Nuoc

Nồng độ 100 mg/ml

Bảng The ANOVA Procedure

Dependent Variable: VKK

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

4

401.0666667 100.2666667 859.43 <.0001

Model

10

1.1666667

0.1166667

Error

402.2333333

Corrected Total 14 Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping

Mean N Cao

A

12.0000

3 Ciprolof

B

8.6667

3 EtOH50%

C

0.0000

3 EtOH70%

C

0.0000

3 EtOH96%

0.0000

3 Nuoc

C B.2.2. Chủng L.monocytogenes

Nồng độ 200 mg/ml

Bảng The ANOVA Procedure

7

Đồ án tốt nghiệp

Dependent Variable: VKK

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

4

279.4333333

69.8583333 349.29 <.0001

Model

10

2.0000000

0.2000000

Error

281.4333333

Corrected Total 14 Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping

Mean

N Cao

A

12.1667

3 Ciprolof

B

A

10.8333

3 EtOH70%

B

10.0000

3 EtOH50%

C

8.1667

3 EtOH96%

D

0.0000

3 Nuoc

B.3. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại

cao chiết từ Hoa Sứ vàng đối với các nhóm vi khuẩn Salmonella spp.

B.3.1. Chủng S.dublin

Nồng độ 200 mg/ml

Bảng The ANOVA Procedure

Dependent Variable: VKK

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

279.4000000 69.8500000 174.62 <.0001 4 Model

4.0000000 0.4000000 10 Error

283.4000000 Corrected Total 14

8

Đồ án tốt nghiệp

Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping Mean N Cao

12.1667 3 Ciprolof A

11.0000 3 EtOH70% B A

9.6667 3 EtOH50% B C

8.6667 3 EtOH96% C

0.0000 3 Nuoc D

Nồng độ 100 mg/ml

Bảng The ANOVA Procedure

Dependent Variable: VKK

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

4 404.5666667 101.1416667 606.85 <.0001 Model

10 1.6666667 0.1666667 Error

406.2333333 Corrected Total 14

Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping Mean N Cao

A 12.1667 3 Ciprolof

B 8.5000 3 EtOH50%

C 0.0000 3 EtOH70%

C 0.0000 3 EtOH96%

C 0.0000 3 Nuoc

9

Đồ án tốt nghiệp

B.3.2. Chủng S.enteritidics

Nồng độ 200 mg/ml

Bảng The ANOVA Procedure

Dependent Variable: VKK

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

4 324.2666667 81.0666667 128.00 <.0001 Model

10 6.3333333 0.6333333 Error

330.6000000 Corrected Total 14

Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping Mean N Cao

A 13.0000 3 Ciprolof

A 11.6667 3 EtOH70%

A 10.5000 3 EtOH96%

A 10.3333 3 EtOH50%

B 0.0000 3 Nuoc

Nồng độ 100 mg/ml

Bảng The ANOVA Procedure

Dependent Variable: VKK

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

4 446.4000000 111.6000000 1116.00 <.0001 Model

10 1.0000000 0.1000000 Error

447.4000000 Corrected Total 14

Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK

10

Đồ án tốt nghiệp

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping Mean N Cao

A 13.0000 3 Ciprolof

B 8.5000 3 EtOH50%

C 0.0000 3 EtOH70%

C 0.0000 3 EtOH96%

C 0.0000 3 Nuoc

B.3.3. Chủng S.typhi

Nồng độ 200 mg/ml

Bảng The ANOVA Procedure

Dependent Variable: VKK

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

4 293.1000000 73.2750000 133.23 <.0001 Model

10 5.5000000 0.5500000 Error

298.6000000 Corrected Total 14

Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping Mean N Cao

A 12.5000 3 Ciprolof

B A 10.8333 3 EtOH70%

B A 10.3333 3 EtOH96%

B 9.3333 3 EtOH50%

C 0.0000 3 Nuoc

11

Đồ án tốt nghiệp

Nồng dộ 100 mg/ml

Bảng The ANOVA Procedure

Dependent Variable: VKK

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

4 249.5666667 62.3916667 374.35 <.0001 Model

10 1.6666667 0.1666667 Error

251.2333333 Corrected Total 14

Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping Mean N Cao

A 12.5000 3 Ciprolof

B 8.5000 3 EtOH50%

B 8.5000 3 EtOH96%

B 7.3333 3 EtOH70%

C 0.0000 3 Nuoc

B.3.4. Chủng S.typhimurium

Nồng độ 200 mg/ml

Bảng The ANOVA Procedure

Dependent Variable: VKK

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

4 319.2333333 79.8083333 266.03 <.0001 Model

10 3.0000000 0.3000000 Error

322.2333333 Corrected Total 14

Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK

12

Đồ án tốt nghiệp

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping Mean N Cao

13.1667 3 Ciprolof A

12.0000 3 EtOH70% A

8.8333 3 EtOH50% B

8.3333 3 EtOH96% B

0.0000 3 Nuoc C

B.4. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại

cao chiết từ Hoa Sứ vàng đối với các nhóm vi khuẩn Shigella spp.

B.4.1. Chủng Shi.sonnei

Nồng dộ 200 mg/ml

Bảng The ANOVA Procedure

Dependent Variable: VKK

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

4

1826.433333

456.608333 1826.43 <.0001

Model

10

2.500000

0.250000

Error

1828.933333

Corrected Total 14

Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping

Mean N Cao

A

33.0000

3 Ciprolof

B

11.1667

3 EtOH70%

C

8.8333

3 EtOH50%

C

8.3333

3 EtOH96%

D

0.0000

3 Nuoc

13

Đồ án tốt nghiệp

B.4.2. Chủng Shi.boydii

Nồng độ 200 mg/ml

Bảng The ANOVA Procedure

Dependent Variable: VKK

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

4

337.6000000

84.4000000 460.36 <.0001

Model

10

1.8333333

0.1833333

Error

339.4333333

Corrected Total 14 Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping

Mean

N Cao

A

10.5000

3 EtOH70%

B

A

9.6667

3 EtOH50%

B

8.6667

3 EtOH96%

C

0.0000

3 Ciprolof

C

0.0000

3 Nuoc

Nồng độ 100 mg/ml

Bảng The ANOVA Procedure

Dependent Variable: VKK

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

4

135.0000000

33.7500000 675.00 <.0001

Model

10

0.5000000

0.0500000

Error

135.5000000

Corrected Total 14 Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK

14

Đồ án tốt nghiệp

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping

Mean N Cao

7.5000

3 EtOH96%

A

0.0000

3 Ciprolof

B

0.0000

3 EtOH70%

B

0.0000

3 EtOH50%

B

0.0000

3 Nuoc

B

B.4.3. Chủng Shi.flexneri

Nồng độ 200 mg/ml

Bảng The ANOVA Procedure

Dependent Variable: VKK

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

4

319.2333333

79.8083333 266.03 <.0001

Model

10

3.0000000

0.3000000

Error

322.2333333

Corrected Total 14 Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping

Mean N Cao

13.1667

3 Ciprolof

A

12.0000

3 EtOH70%

A

8.8333

3 EtOH50%

B

8.3333

3 EtOH96%

B

0.0000

3 Nuoc

C

Nồng độ 100 mg/ml

Bảng The ANOVA Procedure

Dependent Variable: VKK

15

Đồ án tốt nghiệp

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

4

532.6666667 133.1666667 614.62 <.0001

Model

10

2.1666667

0.2166667

Error

534.8333333

Corrected Total 14 Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping

Mean N Cao

A

13.1667

3 Ciprolof

B

11.0000

3 EtOH70%

C

0.0000

3 EtOH50%

C

0.0000

3 EtOH96%

C

0.0000

3 Nuoc

B.5. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại

cao chiết từ Hoa Sứ vàng đối với các nhóm vi khuẩn Vibrio spp.

B.5.1. Chủng V.cholerae

Nồng độ 200 mg/ml

Bảng The ANOVA Procedure

Dependent Variable: VKK

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

4

306.7666667

76.6916667 176.98 <.0001

Model

10

4.3333333

0.4333333

Error

311.1000000

Corrected Total 14 Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK

16

Đồ án tốt nghiệp

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping

Mean N Cao

13.3333

3 Ciprolof

A

10.6667

3 EtOH70%

B

9.5000

3 EtOH50%

B

9.5000

3 EtOH96%

B

0.0000

3 Nuoc

C

Nồng độ 100 mg/ml

Bảng The ANOVA Procedure

Dependent Variable: VKK

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

4

456.0666667 114.0166667 621.91 <.0001

Model

10

1.8333333

0.1833333

Error

457.9000000

Corrected Total 14 Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping

Mean N Cao

13.3333

3 Ciprolof

A

8.1667

3 EtOH96%

B

0.0000

3 EtOH70%

C

0.0000

3 EtOH50%

C

0.0000

3 Nuoc

C

B.5.2. Chủng V.harveyi

Nồng độ 200 mg/ml

Bảng The ANOVA Procedure

Dependent Variable: VKK

17

Đồ án tốt nghiệp

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

4

488.9333333 122.2333333 407.44 <.0001

Model

10

3.0000000

0.3000000

Error

491.9333333

Corrected Total 14 Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping Mean N Cao

A

18.0000 3 Ciprolof

B

10.1667 3 EtOH70%

B

9.6667 3 EtOH96%

B

9.3333 3 EtOH50%

C

0.0000 3 Nuoc

B.5.3. Chủng V.alginolyticus

Nồng độ 200 mg/ml

Bảng The ANOVA Procedure

Dependent Variable: VKK

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

411.2666667 102.8166667 324.68 <.0001

4

Model

3.1666667

0.3166667

10

Error

414.4333333

Corrected Total 14 Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK

18

Đồ án tốt nghiệp

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping

Mean

N Cao

A

16.1667

3 Ciprolof

B

11.0000

3 EtOH70%

C

B

10.0000

3 EtOH50%

C

9.0000

3 EtOH96%

D

0.0000

3 Nuoc

Nồng độ 100 mg/ml

Bảng The ANOVA Procedure

Dependent Variable: VKK

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

4

628.9000000 157.2250000 4716.75 <.0001

Model

10

0.3333333

0.0333333

Error

629.2333333

Corrected Total 14 Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping

Mean N Cao

A

16.1667

3 Ciprolof

B

8.1667

3 EtOH96%

C

0.0000

3 EtOH70%

C

0.0000

3 EtOH50%

C

0.0000

3 Nuoc

B.5.4. Chủng V.parahaemolyticus

Nồng độ 200 mg/ml

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: VKK

19

Đồ án tốt nghiệp

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

4

304.4000000

76.1000000 228.30 <.0001

Model

10

3.3333333

0.3333333

Error

307.7333333

Corrected Total 14 Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping

Mean

N Cao

A

13.0000

3 EtOH70%

B

A

11.3333

3 Ciprolof

B

C

9.3333

3 EtOH50%

C

9.0000

3 EtOH96%

D

0.0000

3 Nuoc

Nồng độ 100 mg/ml

Bảng The ANOVA Procedure

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

4

430.0666667 107.5166667 1612.75 <.0001

Model

10

0.6666667

0.0666667

Error

430.7333333

Corrected Total 14 Bảng The ANOVA Procedure

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping

Mean N Cao

A

11.3333

3 Ciprolof

A

10.5000

3 EtOH70%

B

0.0000

3 EtOH50%

B

0.0000

3 EtOH96%

B

0.0000

3 Nuoc

20

Đồ án tốt nghiệp

B.6. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại

cao chiết từ Hoa Sứ vàng đối với các nhóm vi khuẩn còn lại

B.6.1. Chủng P.aeruginosa

Nồng độ 200 mg/ml

Bảng The ANOVA Procedure

Dependent Variable: VKK

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

4

288.0666667

72.0166667 116.78 <.0001

Model

10

6.1666667

0.6166667

Error

294.2333333

Corrected Total 14

The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping

Mean

N Cao

A

12.6667

3 Ciprolof

B

A

10.6667

3 EtOH70%

B

9.8333

3 EtOH96%

B

8.6667

3 EtOH50%

C

0.0000

3 Nuoc

Nồng độ 100 mg/ml

Bảng The ANOVA Procedure

Dependent Variable: VKK

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

4

433.6000000 108.4000000 813.00 <.0001

Model

10

1.3333333

0.1333333

Error

434.9333333

Corrected Total 14

21

Đồ án tốt nghiệp

Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping

Mean N Cao

12.6667

3 Ciprolof

A

8.6667

3 EtOH96%

B

0.0000

3 EtOH70%

C

0.0000

3 EtOH50%

C

0.0000

3 Nuoc

C

B.6.2. Chủng S.aureus

Nồng độ 200 mg/ml

Bảng The ANOVA Procedure

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

4

420.0666667 105.0166667 450.07 <.0001

Model

10

2.3333333

0.2333333

Error

422.4000000

Corrected Total 14

Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD) Test for VKK

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping

Mean N Cao

12.1667

3 Ciprolof

A

11.0000

3 EtOH70%

A

8.3333

3 EtOH50%

B

0.0000

3 EtOH96%

C

0.0000

3 Nuoc

C

B.6.3. Chủng E.faecali

Nồng độ 200 mg/ml

22

Đồ án tốt nghiệp

Bảng The ANOVA Procedure

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

4

279.2666667

69.8166667 149.61 <.0001

Model

10

4.6666667

0.4666667

Error

283.9333333

Corrected Total 14 Bảng The ANOVA Procedure

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping

Mean

N Cao

A

12.0000

3 Ciprolof

B

A

11.0000

3 EtOH70%

B

A

9.6667

3 EtOH96%

B

9.5000

3 EtOH50%

C

0.0000

3 Nuoc

Nồng độ 100 mg/ml

Bảng The ANOVA Procedure

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

4

366.5666667

91.6416667 422.96 <.0001

Model

10

2.1666667

0.2166667

Error

368.7333333

Corrected Total 14

Bảng The ANOVA Procedure

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping

Mean N Cao

A

12.0000

3 Ciprolof

B

8.8333

3 EtOH96%

B

8.5000

3 EtOH70%

C

0.0000

3 EtOH50%

C

0.0000

3 Nuoc

23

Đồ án tốt nghiệp

Phụ lục C. Kết quả hình ảnh khảo sát khả năng kháng khuẩn của các loại chiết trên các chủng vi khuẩn chỉ thị.

B A

A. E. Coli - EtOH 96% B. E.coli 0157 - EtOH 50%

B A

A. S.enteritidis - EtOH 96% B. Shi.flexneri – EtOH 96%

A B

A. V.cholerae - EtOH 96% B. V.harveyi – EtOH 50% (B)

24

Đồ án tốt nghiệp

B A

A. E. faecalis - EtOH 96% B. P.aeruginosa – EtOH 96%

A B

A.. L.innocua – EtOH 96% B. L.monocytogenes – EtOH 96%

25

Đồ án tốt nghiệp

Phục lục D. Kết quả hình ảnh xác định một số thành phần hóa học của cao chiết

Hoa Sứ vàng từ Ethanol 70%.

D.1. Kết quả dương tính của các thử nghiệm định tính Carbohydrate

A B

A. Thử nghiệm Molisch B. Thử nghiệm Barfoed

D.2. Kết quả dương tính của các thử nghiệm định tính Alkaloid

A B C D

A. Thử nghiệm Mayer C. Thử nghiệm Hager

B. Thử nghiệm Dragendorff D. Thử nghiệm Wagner

26

Đồ án tốt nghiệp

D.3. Kết quả dương tính của thử nghiệm định tính Saponin

Thử nghiệm Foam test

D.4. Kết quả dương tính của các thử nghiệm định tính Cardiac Glycosides

Thử nghiệm Legal

27

Đồ án tốt nghiệp

D.5. Kết quả dương tính của thử nghiệm định tính Flavonoid

Thử nghiệm Ferric chloride test

D.6. Kết quả dương tính của thử nghiệm định tính Steroid

Thử nghiệm Salkowski

28

Đồ án tốt nghiệp

Phụ lục E. Cách pha các loại thuốc thử test thành phần hóa học

E.1. Thuốc thử Molisch

Hòa tan 5g α- napthol vào ethanol 95% và pha loãng thành 100 ml.

E.2. Thuốc thử Fehling

Thuốc thử Fehling A: 34,6 g CuSO4.5H2O được hòa tan hoàn toàn vào nước

cất, sau đó tiếp tục định mức đến 500ml .

Thuốc thử Fehling B: Hòa tan 125g KOH và 173g Kali Natri tartrate.7H2O vào

nước cất và định mức cho đến 500ml.

E.3. Thuốc thử Barfoed

Cân 66,5g Copper (II) acetate monohydrate hòa tan vào dung dịch gồm 10 ml

acid acetic glacial và 1000ml nước cất. Hỗn hợp trên được mang đi đun và khuấy đến

khi tan hoàn toàn.

E.4. Thuốc thử Mayer

Hòa tan 1,358g HgCl2 trong 60ml nước cất. Tiếp tục cân 5g KI hòa tan trong

10ml nước cất. Sau đó tiến hành trộn 2 dung dịch trên lại với nhau và định mức bằng

nước cất đến100 ml.

E.5. Thuốc thử Dragendorff: Gồm 2 dung dịch

Dung dịch A: hòa tan 0,5 g Bismuth nitrate (Bi(NO3)3.5H2O) trong 20 ml acid

acetic 20%.

Dung dịch B: dung dịch KI 40% hòa tan trong nước cất.

Khi sử dụng, trộn 20 ml dung dịch A với 5 ml dung dịch B và 70ml nước cất.

E.6. Thuốc thử Hager

Hòa tan 1 g acid picric vào 100ml nước cất, sau đó lọc dung dịch trên và thu

dịch lọc.

E.7. Thuốc thử Wagner

Hòa tan 2g I2 và 6g KI vào nước cất và định mức đến 100ml. Thuốc thử là

dung dịch tan hoàn toàn, tránh sự tiếp xúc ánh sáng.

29

Đồ án tốt nghiệp

E.8. Natri nitro prusside

Hòa tan1g Natri nitroferricyanide vào 10 ml nước cất.

E.9. Thuốc thử Resazurin

Resazurin có dạng viên nén, nghiền nhuyễn 1 viên Resazurin hòa tan với 100

ml nước cất vô trùng, bảo quản trong tủ lạnh.

30