Khóa luận tốt nghiệp: Nghiên cứu thành phần triterpene glycoside từ loài Thìa canh lá to (Gymnema Latifolium)

222

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA HOÁ HỌC ====

NGUYỄN THỊ HOÀI

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN TRITERPENE GLYCOSIDE TỪ LOÀI THÌA CANH LÁ TO (GYMNEMA LATIFOLIUM)

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Hóa Hữu Cơ

HÀ NỘI, 2018

222

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA HOÁ HỌC ====

NGUYỄN THỊ HOÀI

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN TRITERPENE GLYCOSIDE TỪ LOÀI THÌA CANH LÁ TO (GYMNEMA LATIFOLIUM)

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Hóa Hữu Cơ

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học

PGS. TS. Phan Văn Kiệm

HÀ NỘI, 2018

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này, em đã nhận đƣợc sự giúp

đỡ tận tình của các quý thầy cô, anh chị và bạn bè.

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn đến thầy

giáo PGS.TS Phan Văn Kiệm, ngƣời thấy đã tận tình hƣớng dẫn em trong

suốt quá trình thực hiện khóa luận.

Cảm ơn các anh, chị trong phòng Nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa sinh

biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình giúp đỡ

truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm cho em trong suốt thời gian em thực tập.

Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển đã cho

phép và tạo điều kiện thuận lợi để em thực tập tại Viện.

Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy giáo PGS.TS. Nguyễn Văn Bằng và

các thầy cô giáo trong Khoa Hóa học – Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều

kiện giúp đỡ, dạy bảo em trong suốt 4 năm học tập tại trƣờng. Cảm ơn anh

chị, bạn bè đã luôn bên cạnh, giúp đỡ em trong suốt thời gian qua.

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến gia đình em, những ngƣời thân

luôn bên em, hết lòng ủng hộ em cả về vật chất cũng nhƣ tinh thần trong suốt

quá trình học tập.

Cuối cùng em xin kính chúc thầy cô trong Khoa Hóa học – Trƣờng

ĐHSP Hà Nội 2, các thầy cô và các anh chị Phòng Nghiên cứu cấu trúc, Viện

Hóa sinh biển- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ VIệt Nam dồi dào sức

khỏe, thành công trong công việc.

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2018

Sinh viên

Nguyễn Thị Hoài

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dƣới sự

hƣớng dẫn của PGS.TS. Phan Văn Kiệm. Các số liệu, kết quả trong khóa luận

là trung thực và là của bản thân tôi. Các kết quả nghiên cứu ra không hề sao

chép của ai. Nếu có vấn đề gì không đúng tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.

Sinh viên

Nguyễn Thị Hoài

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ..................................................................................... 3

1.1. Đại cƣơng về cây thìa canh lá to ........................................................................... 3

1.1.1. Khái quát thực vật học [47] ................................................................................ 3

1.1.2. Mô tả đặc điểm .................................................................................................... 3

1.1.3. Phân bố và sinh thái ............................................................................................. 4

1.1.4. Bộ phận dùng, tính vị, công năng và công dụng .............................................. 5

1.1.5. Thành phần hóa học ............................................................................................ 6

1.1.6. Hoạt tính sinh học .............................................................................................. 15

1.2. Giới thiệu về lớp chất saponin. ............................................................................ 17

1.2.1. Giới thiệu chung ................................................................................................ 17

1.2.2. Các nhóm saponin ............................................................................................. 17

1.2.2.1. Saponin triterpenoid ....................................................................................... 18

1.2.2.2. Saponin steroid ............................................................................................... 21

1.2.3. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của saponin .................................................. 23

1.3. Các phƣơng pháp chiết mẫu thực vật ................................................................. 25

1.3.1. Đặc điểm chung của chiết ................................................................................. 25

1.3.2. Cơ sở của quá trình chiết ................................................................................... 25

1.3.3. Quá trình chiết .................................................................................................... 25

1.3.3.1. Chọn dung môi chiết ...................................................................................... 25

1.3.3.2. Quá trình chiết ................................................................................................ 27

1.4. Các phƣơng pháp sắc ký trong phân lớp các hợp chất hữu cơ ......................... 28

1.4.1. Đặc điểm chung của phƣơng pháp sắc ký [1] ................................................. 29

1.4.2. Cơ sở của phƣơng pháp sắc ký ......................................................................... 29

1.4.3. Phân loại các phƣơng pháp sắc ký ................................................................... 29

1.4.3.1. Sắc ký cột (CC)............................................................................................... 30

1.4.3.2. Sắc ký lớp mỏng ............................................................................................. 31

1.5. Một số phƣơng pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ [1] ... 32

1.5.1. Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy, IR) ................................................... 32

1.5.2. Phổ khối lƣợng( Mass spectroscopy, MS). ...................................................... 32

1.5.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy,

NMR) ............................................................................................................................. 33 1.5.3.1. Phổ 1H- NMR: ................................................................................................ 33 1.5.3.2. Phổ 13C-NMR: ................................................................................................ 34

1.5.3.3. Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Tranfer): ........ 34

1.5.3.4. Phổ 2D-NMR: ................................................................................................ 34

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 36

2.1. Mẫu thực vật.......................................................................................................... 36

2.2. Phƣơng pháp phân lập các hợp chất ................................................................... 36

2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ..................................................................................... 36

2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế ................................................................................. 36

2.2.3. Sắc ký cột (CC) .................................................................................................. 36

2.3. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất ...................................... 37

2.3.1. Điểm nóng chảy (Mp) ....................................................................................... 37

2.3.2. Phổ khối lƣợng (ESI-MS) ................................................................................. 37

2.3.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều ( 1D-NMR) ..................................... 37

2.3.4. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân hai chiều ( 2D-NMR) ....................................... 37

2.4. Dụng cụ và thiết bị ................................................................................................ 37

2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết ........................................................................... 37

2.4.2. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc .............................................................. 38

2.5. Hóa chất ................................................................................................................. 38

CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM .............................................................................. 39

3.1. Phân lập các hợp chất .......................................................................................... 39

3.2. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập đƣợc ..................... 41

3.2.1. Hợp chất GL5A1 ............................................................................................... 41

3.2.2. Hợp chất GL8B1 ............................................................................................... 41

CHƢƠNG 4: THẢO LUẬN KẾT QUẢ ............................................................... 42

4.1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất GL5A1 ............................................... 42

4.2. Xác định cấu trúc của hợp chất GL8B1.............................................................. 49

KẾT LUẬN ................................................................................................................. 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 58

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Độ quay cực [α]D

Specific Optical Rotation

13C-NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân Cacbon 13

Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

1H-NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton

Proton Magnetic Resonance Spectroscopy

2D-NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân hai chiều

Two-Dimensional NMR Spectroscoppy

CC Sắc ký cột

Column Chromatography

DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

ESI-MS Phổ khối lƣợng va chạm electron

Electron Impact Mass Spectroscopy

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivity

HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence

Mp Điểm nóng chảy

Melting point

TLC Sắc ký lớp mỏng

Thin Layer Chromatography

Me Nhóm metyl

DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH VẼ

Hình 1.1. Hình ảnh dây thìa canh lá to [48] ................................................................. 3

Hình 1.2. Cấu trúc của saponin ................................................................................... 17

Hình 1.3. Khung cấu trúc nhóm olean và β-amyrin ................................................ 18

Hình 1.4. Khung cấu trúc nhóm Ursan và α-amyrin ................................................ 18

Hình 1.5. Khung cấu trúc nhóm lupna ....................................................................... 19

Hình 1.6. Khung cấu trúc nhóm Hopan ..................................................................... 19

Hình 1.7. Hai genin Protopanaxadiol, Protopanaxatriol khung Dammaran. .......... 20

Hình 1.8. Holothurin A khung Lanostan ................................................................... 20

Hình 1.9. Momorcharaside B khung Cucurbitan ...................................................... 21

Hình 1.10. Ba chất sapogenin ..................................................................................... 22

Hình 1.11. Thủy phân Sarsaparillosid ........................................................................ 22

Hình 1.12. Thủy phân Avenacosid A ......................................................................... 23

Hình 1.13. Solanin........................................................................................................ 23

Hình 3.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn MeOH của loài G. latifolium ......... 40 Hình 4.1.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất GL5A1 ....................................................... 42 Hình 4.1.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất GL5A1 ...................................................... 43

Hình 4.1.3. Cấu trúc hóa học của hợp chất GL5A1 .................................................. 44

Hình 4.1.4. Phổ HSQC của hợp chất GL5A1 ........................................................... 45

Hình 4.1.5. Phổ HMBC của hợp chất GL5A1 .......................................................... 45

Hình 4.1.6. Phổ HMBC dãn rộng của hợp chất GL5A1 .......................................... 46

Hình 4.1.7. Phổ HMBC dãn rộng của hợp chất GL5A1 .......................................... 46

Hình 4.1.8. Các tƣơng tác HMBC chính của hợp chất GL5A1 ............................. 47 Hình 4.2.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất GL8B1 ....................................................... 49 Hình 4.2.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất GL8B1 ...................................................... 50

Hình 4.2.3. Cấu trúc hóa học của hợp chất GL8B1 .................................................. 51

Hình 4.2.4. Phổ HSQC của hợp chất GL8B1 ............................................................ 51

Hình 4.2.5. Phổ HMBC của hợp chất GL8B1 .......................................................... 52

Hình 4.2.6. Phổ HMBC dãn rộng của hợp chất GL8B1 .......................................... 52

Hình 4.2.7. Phổ HMBC dãn rộng của hợp chất GL8B1 .......................................... 53

Hình 4.2.8. Tƣơng tác HMBC chính của hợp chất GL8B1 ..................................... 53

Bảng 4.1. Bảng số liệu phổ của hợp chất GL5A1 và hợp chất tham khảo ............. 47

Bảng 4.2. Bảng số liệu phổ của hợp chất GL8B1 và hợp chất tham khảo ..... 54

MỞ ĐẦU

Ngày nay, các dƣợc phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên ngày càng đƣợc

sử dụng rộng rãi và phổ biến trong đời sống với nhiều ƣu điểm nhƣ dễ hấp

thu, ít gây độc, ít tác dụng phụ, có sẵn trong tự nhiên, có giá trị kinh tế cao…

Các hợp chất thiên thể hiện hoạt tính sinh học rát phong phú và là một trong

những định hƣớng để con ngƣời có thể tống hợp ra nhiều loại thuốc mới với

những ƣu điểm vƣợt trội đƣợc dùng để chữa bệnh mà ít gây các tác dụng phụ

cũng nhƣ không ảnh hƣởng đến môi sinh. Vì vậy, việc nghiên cứu nguồn

dƣợc liệu trong thiên nhiên để ứng dụng vào sản xuất thuốc phòng và chữa

bệnh đang là xu hƣớng hiện nay của y học Việt Nam và y học thế giới.

Việt Nam là quốc gia thuộc khu vực Đông Nam Á, nằm trong vùng khí

hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm nên có nguồn tài nguyên sinh vật vô cùng

phong phú. Đặc biệt là nguồn tài nguyên rừng ở nƣớc ta, không chỉ đa dạng

về số lƣợng loài mà còn chứa đựng giá trị đa dạng sinh học cao chƣa đƣợc

khám phá. Rừng Việt Nam có thảm thực vật phong phú với khoảng 12.000

loài trong đó có 4000 loài đƣợc nhân dân sử dụng làm thảo dƣợc cùng các

mục đích khác phục vụ đời sống con ngƣời. Đây chính là nguồn dƣợc liệu

quý phục vụ cho việc sản xuất thuốc chữa bệnh phục vụ cho đời sống. Cùng

với sự đa dạng do thiên nhiên mang lại, Việt Nam là một trong những quốc

gia có nhiều kinh nghiệm trong việc sử dụng các thực vật và sinh vật trong

các bài thuốc y học cổ truyền.

Từ ngày xa xƣa, ngƣời ta đã biết sử dụng các loại cây phối hợp với nhau

để tạo đƣợc thành các bài thuốc dân gian có nhiều tác dụng tốt nhƣ chữa đƣợc

nhiều bệnh mà không để lại tác dụng phụ hoặc ít để lại tác dụng phụ.

Tuy nhiên, phần lớn các cây thuốc và các bài thuốc mới chỉ đƣợc sử

dụng theo kinh nghiệm dân gian mà chƣa đƣợc nghiên cứu, đánh giá một cách

khoa học, cũng nhƣ các thành phần hóa học, các chất có hoạt tính sinh học

cao trong cây có thể sử dụng để làm thuốc chữa đƣợc nhiều bệnh khác mà

chƣa đƣợc phân tích và tách chiết ra.

Xuất phát từ các cơ sở trên, việc nghiên cứu và khai thác các chất có

hoạt tính sinh học cao từ các nguồn dƣợc liệu ở Việt Nam là rất cần thiết và

đặc biệt có ý nghĩa to lớn về mặt khoa học cũng nhƣ thực tiễn.

Hiện nay bệnh đái tháo đƣờng là một trong các căn bệnh mãn tính, gây

tử vong cao, đứng hàng thứ ba trên thế giới sau bệnh tim mạch và ung thƣ. Ở

Việt Nam, tỉ lệ mắc bệnh ngày một gia tăng, đòi hỏi cấp thiết phải tìm ra các

loại thuốc hiệu quả đặc trị.

Trong y học cổ truyền, loài thìa canh lá to và loài thìa canh có tác dụng

tính kích thích dạ dày, đồng thời làm se da, lợi tiểu, lại rất bổ dƣỡng và nhất là

làm giảm thiều đƣợc lƣợng đƣờng trong máu. Cây còn có tác dụng chống béo

phì, giảm mỡ máu, đặc biệt cây thìa canh lá to còn hỗ trợ điều trị bệnh tiêu

đƣờng hiệu quả tự nhiên mà không tốn kém mà lại an toàn, ngoài ra nó còn hỗ

trợ điều trị cao huyết áp… các nghiên cứu về dƣợc học từ loài thìa canh lá to

trên thế giới cho thấy nhiều tác dụng tuyệt vời đặc biệt là đối với bệnh đái

tháo đƣờng đang ngày một gia tăng và phổ biến nhƣ hiện nay.

Vì vậy em lựa chọn đề tài: với mục đích khảo sát thành phần hóa học

nhằm tạo cơ sở cho các nghiên cứu tiếp trong việc nghiên cứu phát triển thuốc

mới và giải thích tác dụng chữa bệnh của cây thuốc quý này.

Nhiệm vụ của đề tài:

1. Xử lí mẫu và tạo dịch chiết

2. Nghiên cứu phân phân lập và xác định cấu trúc hóa học của một số

hợp chất từ phân đoạn

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Đại cƣơng về cây thìa canh lá to

1.1.1. Khái quát thực vật học [47]

Tên khoa học: Gymnema latifolium

Tên thƣờng gọi: Dây thìa canh lá to

Tên khác: Lõa ti lá rộng

Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta)

Lớp: Ngọc Lan (Magnoliopsida)

Phân lớp: Bạc hà

Bộ: Long đởm (Gentianales)

Họ: Trúc đào (Aposynaceae)

Phân họ: Thiên lý (Asclepiadoideae)

Chi: Gymnema R.Br

Loài: Gymnema latifolium Wall. ex Wight

1.1.2. Mô tả đặc điểm

Hình 1.1: Hình ảnh dây thìa canh lá to [48]

Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium), còn gọi là Lõa ti lá rộng, là

dạng cây thân gỗ, dây leo, thân leo tới 6m. Thân có lỗ vỏ, các nhánh có nhiều

lông tơ. Cuống lá 1,5 - 4 cm, có lông tơ dày đặc, phiến lá 8-13 × 5-8 cm, lông

dày đặc, càng xa trục càng dày đặc, gốc tròn, ngọn nhọn, gân bên 6-7 cặp.

Cụm hoa xim dạng đầu thành từng đôi ở mấu, có lông dày. Một cụm mang rất

nhiều hoa, mùi thơm. Cuống cụm hoa 1-1,5 cm, cuống hoa 3-8 mm. Đài hình

trứng, phủ lông măng.Tràng hoa vàng, hình chuông, nhẵn ở mặt ngoài. Ống

hoa có 5 cặp gờ mang lông ở họng tràng, các thùy hình trứng, khoảng 1,2 ×

1,2 mm, phủ lông dày đặc hƣớng trục, ngắn hơn so với ống tràng. Khối nhị

nhụy dạng hình trụ, phần phụ nhị dạng màng ngắn hơn so với đầu núm nhụy.

Khối phấn hình thuôn. Đầu núm nhụy hình nón, đỉnh phân đôi [8].

Quả đại hình mác nhọn, 4,5-5,5 × 1,5-2 cm. Hạt hình trứng thuôn, dài

khoảng 1,1 cm × 5 mm, mép dạng màng, mào lông dài 3 cm [8].

1.1.3. Phân bố và sinh thái

Phân bố: Đảo Andaman và Nicobar, Bangladesh, Trung Quốc (Quảng

Đông, Quảng Tây, Vân Nam), Ấn Độ (Arunachal Pradesh, Assam, Kerala,

Maharashtra, Tamil Nadu), Myanmar, Thailand, Indonesia [45]. Ở Việt Nam

đƣợc trồng ở nhiều nơi nhƣ Cúc Phƣơng( Ninh Bình), Hòa Bình, Thái

Nguyên, Thanh Hóa, Nam Định.[8]

Sinh thái: Dây thìa canh lá to nói riêng là loài không ƣa trũng, ngập úng

nên khi trồng đây thìa canh phải chọn vùng đất cao nhƣng phải thoát nƣớc tốt,

đất càng mùn và tơi xốp càng tốt cho cây. Nếu muốn trồng cây ở nhà thì cũng

có thể trồng trên sân thƣợng nhƣng nguồn đất phải giàu dinh dƣỡng, đắp ụ đất

cao. Đối với dây thìa canh, từ khi trồng đến khi thu hoạch mất khoảng 6-8

tháng, trồng 1 lần có thể thu hoạch 10 năm. Một năm có thể thu hoạch từ 4-5

lần, từ tháng 4-12, cứ 2 tháng thì thu 1 lần.

1.1.4. Bộ phận dùng, tính vị, công năng và công dụng

Bộ phận dùng: Thân leo. Thƣờng thu hái dây lá và ngọn non, sơ chế, rửa

sạch sau đó đem phơi hay sấy khô.

Tính vị, công năng: Dây thìa canh có vị đắng, cay. Lá của cây khi nhai

có tác dụng làm tê trong vài giờ, vị giác đối với các chất ngọt và đắng. Có tác

dụng mát, bổ, làm dễ tiêu và lợi tiểu.

Công dụng: Dây thìa canh đƣợc dùng làm trị đái tháo đƣờng với liều

uống hàng ngày là 4g lá khô (Võ Văn Chi, 1997; 396 - 397). Dây thìa canh

 Ở các nƣớc Đông Nam Á, ngoài công dụng trị đái tháo đƣờng, rễ và lá

đƣợc dùng điều trị đái tháo đƣờng ở nhiều nƣớc khác nhau trên thế giới.

đƣợc dùng trị viêm khớp dạng thấp, bệnh gút, viêm mạch máu, phù, sốt, ho,

trĩ, nhọt, mụn, lở, rắn cắn, thuốc làm dễ tiêu và lợi tiểu. Lá có khi đƣợc dùng

 Ở Trung Quốc, tất cả các bộ phận của cây, đặc biệt là rễ, đƣợc dùng trị

làm rau ăn.

viêm khớp dạng thấp, bệnh gút, viêm mạch máu, phù, sốt, trĩ và rắn cắn

 Ở Ấn Độ, lá của dây thìa canh đƣợc dùng trị đái tháo đƣờng và một số

(Lemnens R.M.H.J. et al., 2003: 228 - 236).

chứng bệnh khác nhƣ khó tiêu, trĩ, táo bón, sốt rét, ho, viêm phế quản, hen.

Dây thìa canh đƣợc dùng làm thuốc trợ tim, lợi tiểu, làm dễ tiêu, nhuận trành,

gây tăng trƣơng lực cơ tử cung, trị các bệnh đa tiết mật, giác mạc và thể kính

 Lá đắp trị vết thƣơng và trộn với dầu thầu dầu đắp trị sƣng hạch, gan to

ở bệnh nhân đái tháo đƣờng.

 Rễ tán bột chữa rắn cắn.

 Quả đắng và có tác dụng làm giảm trƣớng bụng, và đƣợc dùng trị bệnh

và lách to.

 Toàn cây dùng trị lỵ.

 Trong thú y, dây thìa canh đƣợc dùng cho gia súc ăn để lợi sữa.

phong, đái tháo đƣờng, viêm phế quản, chữa loét, trị ngộ độc và diệt giun.

 Ở Đông Phi, rễ tán bột và sắc lấy nƣớc uống để điều trị động kinh, rắn

cắn và dùng ngoài trị nhọt (Kirtikar K.R. et al., 1998: 1625 - 1627;

Williamson E.M. et al., 2003: 228 - 236)

1.1.5. Thành phần hóa học

Dây thìa canh lá nhỏ (Gymnema sylvestre) từ lâu đã đƣợc biết đến rộng

rãi với tác dụng hạ đƣờng huyết và kiểm soát béo phì. Giai đoạn gần đây, một

loài dây thìa canh khác là dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex

Wight) đã đƣợc khẳng định có kết quả tốt hơn hẳn so với dây thìa canh lá nhỏ.

Cho đến nay, loài Gymnema latifolium chỉ mới đƣợc nghiên cứu rất sơ

lƣợc về thành phần hóa học. Các nhóm chất chứa trong cây này chỉ mới đƣợc

đề cập đến trong rất ít các tài liệu, bao gồm: HCN-glucosid [36], saponin,

flavonoid, tanin, sterol, chất béo acid amin, đƣờng khử và coumarin trong loài

Gymnema latifolium Wall. Ex Wight thu hái tại Hòa Bình [2].

Các nghiên cứu về thành phần hóa học vẫn đang tập trung vào loài

Gymnema sylvestre. Theo đó các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt

tính sinh học của các loài thuộc chi Gymnema đƣợc bắt đầu vào những năm

1950, chủ yếu bởi các nhà khoa học Ấn Độ. Nghiên cứu về thành phần hóa

học thực sự bắt đầu khi có các thiết bị xác định cấu trúc Hoạt tính sinh học

đặc trƣng của loài G. sylvestre là khả năng hạ đƣờng huyết [9]. Tuy nhiên nhƣ

phổ cộng hƣởng từ nhân NMR, phổ khối lƣợng MS. Các nghiên cứu cho thấy

G. sylvestre có thành phần hóa học rất đa dạng, trong đó thành phần chính là

các conduritol, gymnemasin.

Vào khoảng những năm 1980-1990, các nhà khoa học Nhật Bản tập trung

mạnh vào nghiên cứu thành phần hóa học loài này. Cụ thể từ lá loài G.

sylvestre đƣợc các nhà khoa học Nhật Bản đã phân lập và xác định cấu trúc của

một hợp chất mới conduritol A (1) [10]. Hợp chất này đã đƣợc phát hiện có khả

năng ức chế enzyme aldose mạnh trên chuột và không gây độc [11]. Tiếp đó,

Yoshikawa và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc thành công của 7 hợp

chất mới gymnemic acid I-VII (2-8) [12, 13]. Trong quá trình tìm kiếm các hợp

chất có tác dụng diệt cỏ, Yoshikawa và cộng sự đã phân lập và xác định đƣợc 5

hợp chất mới từ lá loài G. sylvestre là gymnemic acid VIII-XII (9-13) [14].

Từ lá loài G. sylvestre, Sahu và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc

của 4 hợp chất mới, đƣợc đặt tên là gymnemasin A-D (14-17) [15]. Tiếp đó

vào năm 1996, Murakami và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc của 2

hợp chất mới, đặt tên là gymnemoside a và b (18-19) cùng với 10 hợp chất đã

biết. Cũng tiếp tục nghiên cứu này, Yosikawa và cộng sự đã tiến hành nghiên

cứu thành phần hóa học và đã xác định đƣợc 4 hợp chất mới và đƣợc đặt tên

là gymnemoside c-f (20-23) [16]. Các nhà khoa học Trung Quốc, đã phân lập

và xác định cấu trúc của 6 hợp chất mới (24-29) và 2 hợp chất đã biết [17].

Vào năm 2001, Ye và cộng sự cũng đã tiến hành nghiên cứu và phát hiện

ra 4 hợp chất mới có tác dụng diệt cỏ từ loài G. sylvestre, 4 hợp chất này đƣợc

đặt tên là: 21α-O-benzoylsitakisogenin 3-O-α-D-glucopyranosyl(1→3)-α-D-

glucuronopyranoside (30), longispinogenin 3-O-α-D-glucopyranosyl(1→3)-α-

D-glucuronopyranoside potassium (31), 29-hydroxylongispinogenin 3-O-α-D-

glucopyranosyl(1→3)-α-D-glucuronopyranoside potassium (32), alternoside

II sodium (33) [18].

Liu và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc của 1 hợp chất mới (34) và

4 hợp chất đã biết từ loài G. sylvestre [19]. Tiếp nối các nghiên cứu, Zhu và cộng

sự đã phân lập đƣợc 2 hợp chất mới, 16β-hydroxyl olean-12-en-3-O-[β-D-

glucopyranosyl (1→6)-β-D-glucopyranosyl]-28-O-β-D-glucopyranoside (35) và

16β,21β,28-trihydroxy-olean-12-ene-3-O-glucoronopyranoside (36) [20].

Zhang và cộng sự đã thông báo phân lập đƣợc 1 hợp chất mới, 3β,16 β,22α-

trihydroxy-olean-12-ene3-O-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-

(1→6)-β-D-glucopyranoside (37) và 4 hợp chất đã biết từ loài G. sylvestre [21].

Zarrelli và cộng sự thông báo đƣợc 7 hợp chất mới, bao gồm 6 oleanane (38-43):

3β,16β,21β,23-tetrahydroxyolean-12-ene, 3β,16β,21α,23,28-pentahydroxyolean-

12-ene, 3β,16β,23,28-tetrahydroxyolean-13(18)-ene, 16β,23,28-trihydroxyolean-

12-en-3-one, 16β,21β,23,28-tetrahydroxyolean-12-en-3-one, 16β,21β,22α,23,28-

pentahydroxyolean-12-en-3-one và 1 lupane 3β,16β,23,28-tetrahydroxylup-

20(29)-ene (44) cùng với 6 hợp chất đã biết từ phần trên mặt đất loài G.

sylvestre [22].

Cũng các nghiên cứu thuộc nhóm tác giả này tiếp tục công bố 6 hợp chất

mới khác, đó là (3β,16β)-olean-12-ene-3,16,23,28-tetrayl tetraacetate,

(3β,16β,21β,22α)-3,16,22,23,28-pentahydroxyolean-12-en-21-yl(2S)-2-

methylbutanoate, (3β,16β,21β,22α)-28-(acetyloxy)-3,16,22,23-tetrahydroxyolean-

12-en-21-yl (2S)-2-methylbutanoate, (3β,16β,21β,22α)-3,16,22,23,28-pentakis

(acetyloxy)olean-12-en-21-yl (2S)-2-methylbutanoate, (3β,16β,21β,22α)-

3,16,22,23,28-pentahydroxyolean-12-en-21-yl (2E)-2-methylbut-2-enoate, và

(3β,16β)-lupane-3,16,20,23,28-pentol (45-50) [23].

Từ loài G. inodorum, Wang và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc

của 2 hợp chấtmới: 2α,3β-dihydroxy-olean-12-ene-23,28-dioicacid-3-O-β-D-

glucopyranoside và 2α,3β,15β-trihydroxy-olean-12-ene-23,28-dioic acid-3-O-

β-D-glucopyranoside [24]. Cũng từ loài này, Atsuchi và cộng sự đã phân lập

đƣợc 1 hợp chất mới (3β,16β)-16,28-dihydroxyolean-12-en-3-yl-2-O-β-D-

glucopyranosyl-β-D-glucopyranosiduronic acid [25].

Từ loài G. alternifolium, Yoshikawa và cộng sự đã phân lập và xác định

cấu trúc của 6 hợp chất mới và đƣợc đặt tên là gymnepregoside A-F [26].

Cũng từ loài này, nhóm tác giả tiếp tục công bố phân lập và xác định cấu trúc

của 11 hợp chất mới khác và đặt tên là gymnepregoside G-Q [27].

6 hợp chất mới đặt tên là gymnetinoside A-F cùng với 6 hợp chất cũ,

sequinoside K, khaephuoside B, and albibrissinoside A (60-69) đƣợc Tian và

cộng sự phân lập từ loài G. tingens. Các hợp chất này đƣợc phát hiện có khả

năng bảo vệ tế bào gan mạnh [28].

8 hợp chất mới thuộc khung pregnane steroidal glycoside đã đƣợc phân

lập từ vỏ quả loài G. griffithii và đƣợc đặt tên là gymnemogriffithoside A-H.

Các hợp chất này đã đƣợc đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên 5 dòng tế bào

ung thƣ (BT 474, Chago, Hep-G2, KATO-III và SW620) và hoạt tính ức chế

enzyme α-glucosidase và thể hiện hoạt tính ở mức độ trung bình [29].

1.1.6. Hoạt tính sinh học

Bên cạnh việc sử dụng phổ biến để điều trị bênh tiểu đƣờng, các loài

thuộc chi Gymnema còn đƣợc sử dụng để điều trị một số bệnh nhƣ béo phì,

viêm khớp, bệnh Parkinson và bệnh sơ vữa động mạch. Các hoạt chất từ các

loài thuộc chi Gymnema đã đƣợc nghiên cứu về tác dụng kháng viêm, kháng

khuẩn, và kháng ung thƣ, và kháng cỏ dại. Dƣợc tính của các loài này đã đƣợc

nghiên cứu rộng dãi. Hơn 70 hợp chất mới đã đƣợc phân lập. Dịch chiết đã

đƣợc nghiên cứu lâm sàng và trên động vật. Các hoạt tính đƣợc thử nghiệm

bao gồm:

Hoạt tính trị bệnh tiểu đường

Tác dụng hạ đƣờng huyết của dịch chiết saponin cùng với 5 triterpene

saponin gymnemic acid I-IV và gymnemasaponin V từ loài G. sylvestre đã

đƣợc thông báo. Hợp chất gymnemic acid IV (3.4/13.4 mg/kg) đƣợc phát hiện

có tác dụng hạ đƣờng huyết từ 14,0-60% trong vòng 6h khi so sánh với

glibenclamide. Thêm vào đó, hợp chất này cũng làm tăng lƣợng insulin khi

cho chuột bị tiểu đƣờng uống ở nồng độ 13.4 mg/kg [30]. Nghiên cứu khác về

tác dụng hạ đƣờng huyết của lá loài G. sylvestre thông qua kiểm soát hàm

lƣợng glyucose trong máu và lipid trên chuột Wistar ở nồng độ 200mg/kgP.

Kết quả cho thấy dịch chiết loài này làm giảm đáng kể đƣờng trong huyết

tƣơng và mỡ máu (thông qua các thông số cholesterol VLDL, LDL) [31]. Với

liều triacetate dihydroxy gymnemic (20 mg/kgP) bằng đƣờng uống trong 45

ngày trên chuột bị tiểu đƣờng. Các thông số đánh giá bao gồm đƣờng huyết,

insulin, hemoglobin glycated (HbA1c), mô glycogen, các thông số lipid nhƣ

triglycerid, cholesterol tổng, LDL-cholesterol, HDL-cholesterol và họat tính

của các enzym gan đánh dấu, nhƣ aspartate aminotransferase (AST), alanine

aminotransferase (ALT), alkaline phosphatase (ALP) và phosphatase acid

(ACP). Kết quả cho thấy hợp chất dihydroxy triacetate gymnemic tại liều 20

mg đã tác động đáng kể trên tất cả các thông số sinh hóa học so với nhóm

chuột mang bệnh tiểu đƣờng [32]. Gymnemic acid từ lá loài G. sylvestre đã

làm tăng đáng kể sự tiết ra insulin từ tế bào β- tuyến tụy của chuột mang bệnh

tiểu đƣờng [33].

Một nghiên cứu ở cấp độ lâm sàng về tác dụng tiết insulin của dịch chiết

ethanol loài G. sylvestre thông qua đƣờng uống (500 mg/ngày) trong 60 ngày

cho thấy nồng độ glucose trong máu lúc đói giảm từ 162 mg/L xuống còn 119

mg/L, nồng độ glucose trong máu sau ăn giảm từ 291 mg/L xuống 236 mb/L;

tăng nồng độ insulin huyết thanh từ 24 đến 32 μU/mL, tăng nồng độ C-peptide

huyết thanh từ 298 đến 447 pmol/L, nhƣng không ảnh hƣởng đến cân nặng [34].

Một số nghiên cứu về tác dụng hạ đƣờng huyết loài G. inodorum đã chỉ

dịch chiết cũng nhƣ các hợp chất từ loài này đã thể hiện tác dụng hạ đƣờng

huyết mạnh [35, 36].

Hoạt tính chống béo phì

Saponin từ dịch chiết nƣớc của lá loài G. sylvestre đã đƣợc phát hiện có

tác dụng chống béo phì tƣơng đƣơng với orlistat, một loại thuốc tổng hợp

dùng để điều trị bệnh béo phì [37]. Dịch chiết nƣớc loài G. sylvestre đã phát

hiện có khả năng chống béo phì trên chuột thông qua giảm nồng độ serum

lipid, leptin, insulin, glucose, apolipoprotein B và LDH trong khi tăng nồng

độ HDL-cholesterol, apolipoprotein A1 [38].

Hoạt tính kháng viêm khớp

Dịch chiết nƣớc và ether dầu hỏa từ lá loài G. sylvestre đã đƣợc phát

hiện có tác dụng rõ rệt trong việc kiểm soát hiệu quả bệnh nhân viêm khớp

[34]. Thêm vào đó, các dịch chiết khác nhau từ loài này cũng đã đƣợc phân bố

đều trong 1% Tween 8 và diclofenac sodium cho chuột viêm đa khớp uống 1

lần/ngày trong 21 ngày. Kết quả cho thấy dịch chiết ether dầu hỏa làm giảm

rõ các yếu tố viêm nhƣ IL-1b, TNF-α, GM-CSF, PGDF [39].

Ngoài ra, còn có một số nghiên cứu về hoạt tính diệt tế bào ung thƣ [40],

kháng viêm [41], kháng khuẩn [42] từ các hợp chất cũng nhƣ cặn chiết của

loài thuộc chi Gymnema. 1.2. Giới thiệu về lớp chất saponin. 1.2.1. Giới thiệu chung

Saponin hay saponoid là một nhóm glycosid lớn, Sapo trong tiếng la tinh

có nghĩa là xà phòng. Saponin có mặt trong các lòa thực vật nhƣ một số cây

họ đậu: đậu tƣơng, đậu Hà Lan và một số loài động vật nhƣ: hải sâm, cá

sao…Cấu trúc saponin gồm 2 phần: Aglycone và Glycone.

SAPONIN

Sapogen

Sugar

Glycone Aglycone

1. Glucose

Acid Neutral 2.Arabinos e 3. Xylose

4. Glucuronic Steroids

Triterpenoi d Hình 1.2. Cấu trúc của saponin

Dựa theo cấu trúc hóa học có thể chia ra: saponin triterpenoid và saponin

steroid.

1.2.2. Các nhóm saponin

Các hợp chất saponin đƣợc phân loại thành 2 nhóm khác nhau dựa vào

khung cấu trúc hóa học của các hợp chất:

1.2.2.1. Saponin triterpenoid

Saponin triterpenoid có bản chất là các hợp chất triterpenoid gốm 6

nhóm hemitrerpen, tạo nên 2 loại: - Saponin triterrpenoid pentacyclic: Bao

gồm các nhóm nhỏ: Olean, Ursan, Lupan, Hopan.

+ Nhóm Olean: Phần lớn các saponin triterpenoid trong tự nhiên đều

thuộc nhóm này.

olean β-amyrin R1=R2=R3=R4=R5= CH3

Hình 1.3. Khung cấu trúc nhóm olean và β-amyrin

Cấu trúc hóa học: Phần aglycon thƣờng có 5 vòng và thƣờng là dẫn chất

của 3-hydroxy olean 12-ene, tức là -amyrin.

+ Nhóm Ursan: Nhóm ursan có cấu trúc tƣơng tự olean chỉ khác nhau ở

nhóm methyl ở C-30 không đỉnh vào vị trí C-20 mà đỉnh vào C-19.

Ursan α-amyrin

Hình 1.4. Khung cấu trúc nhóm Ursan và α-amyrin

Các sapogenin nhóm ursan thƣờng là những dẫn chất của 3-hydroxy

ursan 12-ene, tức là -amyrin.

+ Nhóm Lupan:

Lupan

Hình 1.5. Khung cấu trúc nhóm lupna

Cấu trúc của nhóm lupan có các vòng A,B,C,D giống các nhóm trên chỉ

khác vòng E là vòng 5 cạnh, C-20 ở ngoài vòng và thƣờng có nối đôi ở vị trí

C20-C29.

+ Nhóm Hopan: cấu trúc của nhóm hopan có các vòng A, B, C, D giống

nhƣ các nhóm trên, vòng E là vòng 5 cạnh giống nhóm lupan. Tuy nhiên,

nhóm C-22 ở ngoài vòng và nhóm methyl gốc đỉnh C-18 thay vì ở C-17.

Hopan

Hình 1.6. Khung cấu trúc nhóm Hopan

- Saponin triterpenoid: Nhóm này đƣợc chia làm 3 nhóm nhỏ:

Dammaran, Lanostan, Cucurbitan.

+ NHóm Dammaran: Phần Aglycon gồm 4 vòng và một mạch nhánh,

Khi tác dụng bởi acid thì mạch nhánh đóng vòng tạo thành vòng

tetrahydropyran.

Bằng các phƣơng pháp đặc biệt để cắt phần đƣờng, ngƣời ta đã thu

đƣợc các genin thật. Hai genin chính là protopanaxadiol và protopanaxatripol.

Phần đƣờng nối vào OH ở C-3 hoặc có khi thêm một mạch nữa nối vào OH ở

mạch nhánh.

Protopanaxadiol Protopanaxatriol

Hình 1.7. Hai genin Protopanaxadiol, Protopanaxatriol khung Dammaran.

+ Nhóm Lanostan: Holothurin A, một trong những saponin có trong các

loài hải sâm - Holothuria spp là một ví dụ của nhóm này.

Hình 1.8. Holothurin A khung Lanostan

+ Nhóm Cucurbitan: Phần lớn các saponin nhóm cucurbitan gặp trong

họ cucurbitaceae. Ở đây nhóm CH3 gốc thay vì ở vị trí C-10 lại đính ở C-9.

Hình 1.9. Momorcharaside B khung Cucurbitan

1.2.2.2. Saponin steroid

- Nhóm spirostan: Ta xét 3 chất sapogenin làm ví dụ: sarsasapogenin,

smilagenin, tigogenin. Những chất này có 27 carbon nhƣ cholesterol, nhƣng

mạch nhánh từ C20-27 tạo thành 2 vòng có oxy (16,22 và 22,26 diepoxy),

một vòng là hydrofuran (vòng E) và một vòng là hydropyran (vòng F). Hai

vòng này nối với nhau bởi một carbon chung ở C-22. Mạch nhánh này đƣợc

gọi là mạch nhánh spiroacetal.

Sarsasapogenin Smilagenin

Tigogenin

Hình 1.10. Ba chất sapogenin

Các sapogenin nhóm này có nối vòng C Và D trans. Còn vòng A và B có

thể là cis nhƣ ở chất sarsasapogeninvà smilagenin hoặc có thể là trans nhƣ ở

chất tigogenin.

- Nhóm furostan: Nhóm này có cấu trúc tƣơng tự nhƣ nhóm spirostan chỉ

khác là vòng F bị biến đổi.

Trƣờng hợp thứ nhất: vòng F mở và nhóm ancol bậc 1 ở C-26 đƣợc nối

với đƣờng glucose. Nếu glucose ở C-26 bị cắt (bởi enzim hoặc acid) thì xảy ra

sự đóng vòng F thành vòng hydropyran và chuyển thành dẫn chất nhóm

spirostan. Ví dụ sarsaparillosid dƣới tác dụng của enzym thủy phân cắt mạch

glucose ở C-26 sẽ chuyển thành parillin.

enzym

Sarsaparillosid Parillin

Hình 1.11. Thủy phân Sarsaparillosid

Trƣờng hợp thứ hai: vòng F là vòng 5 cạnh do sự đóng vòng 22-25

epoxy, ví dụ avenacosid có trong yến mạch (Avena L. Họ lúa - Poaceae).

Avenacosid A cũng có 2 mạch đƣờng. Khi thủy phân cắt đƣờng glucose ở C-

26 thì cũng chuyển thành dẫn chất nhóm spirostan.

H+

Avenacosid Ionuatigenin

Hình 1.12. Thủy phân Avenacosid A

- Nhóm aminifurostan: Ở đây vòng F mở nhƣ trƣờng hợp sarsaparillosid

nói ở trên nhƣng ở vị trí C-3 đính nhóm NH2.

- Nhóm Spirosolan: Nhóm này chỉ khác nhóm spirostan ở nguyên tử oxy

của vòng F đƣợc thay bằng NH. Một điểm cần chú ý là ở đây có isomer ở C-

22 (khác với nhóm spirostan)

- Nhóm Solanidan: Solanin có trong mầm khoai tây thuộc nhóm này. Ở

đây 2 vòng E và F cùng chung 1C và 1N

Solanin

Hình 1.13. Solanin

1.2.3. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của saponin

Saponin có tác dụng long đờm, chữa ho. Saponin là hoạt chất chính

trong các dƣợc liệu chữa ho nhƣ viễn chí, cát cánh, cam thảo, thiên môn, sạch

môn,… Một số dƣợc liệu chứa saponin có tác dụng thông tiểu nhƣ rau má, tỳ

giải, thiên môn, mạch môn… Saponin có mặt trong một số vị thuốc bổ tăng

cƣờng sinh lực nhƣ nhân sâm, tam thất, ngũ gia bì, đinh lăng và một số cây

thuốc họ nhân sâm khác. Saponin làm tăng sự thấm của tế bào, sự có mặt của

saponin sẽ làm cho các hoạt chất khác dễ hòa tan và hấp thu. Một số có tác

dụng chống viêm nhƣ saponin cam thảo, ngƣu tất, cỏ xƣớc. Một số có tác

dụng kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế hoạt động của virut nhƣ saponin cam

thảo, lá cà chua, mầm khoai tây. Một số có tác dụng chống ung thƣ trên thực

nghiệm. Nhiều saponin có tác dụng diệt các loài thân mền (nhuyễn thể).

Sapogenin steroid dùng làm nguyên liệu để bán tống hợp các thuốc

steroid. Digitonin dùng để định lƣợng cholesterol. Saponin trong đậu nành

cũng giống nhƣ phytate, hành xử nhƣ chất anti-oxidants để bảo vệ tế bào cơ

thể chúng ta khỏi bị hƣ hại do tác dụng các gốc tự do. Nó cũng còn có khả

năng trực tiếp ngăn cản sự phát triển ung thƣ kết tràng và đồng thời làm giảm

lƣợng cholesterol trong máu. Saponin trong nhân sâm làm tăng chuyển hóa

lipid, theo các thí nghiệm, nhân sâm có thể ngăn ngừa sự phát sinh cholesterol

cao ở thỏ, vì vậy mà ngăn ngừa đƣợc sự hình thành xơ vữa động mạch. Ngƣời

ta đã khám phá ra những tác dụng của nhân sâm và các thành phần hóa học

đơn lẻ của nó, dặc biệt là saponin (còn gọi là ginsenoside). Trong đó có một

hoạt chất mang tên gọi là Ginsenoside Rh2- đây là một trong hơn 30 loại

saponin có trong thành phần của Nhân sâm.

Saponin tam thất Việt Nam chứa chủ yếu saponin dammaran. Các nhà

khoa học đã phân lập đƣợc hai saponin chủ yếu của Tam thất Việt Nam và

xác định chúng là ginsenosid- Rb1 và ginsenosid- Rg1. Saponin Rg có tác

dụng hƣng phấn trung khu thần kinh, có tác dụng chống mệt mỏi, tăng khả

năng lao động trí óc và chân tay, nhƣng loại Saponin nhƣ Rb thì có tác dụng

ức chế trung khu thần kinh biểu hiện an thần gây ngủ [3,4].

1.3. Các phƣơng pháp chiết mẫu thực vật

1.3.1. Đặc điểm chung của chiết

Khái niệm: Chiết là quá trình tách và phân ly các chất dựa vào quá trình

chuyển một chất hòa tan trong một pha lỏng vào một pha lỏng khác không

hòa tan với nó

Mục đích của chiết:

+ Chuyển một lƣợng nhỏ chất nghiên cứu trong một thể tích lớn dung

môi này vào một thể tích nhỏ dung môi khác nhằm nâng cao nồng độ của chất

cần nghiên cứu và đƣợc gọi là chiết làm giàu.

+ Ngoài ra còn dùng phƣơng pháp chiết pha rắn để tách hay phân ly các

chất trong một hỗn hợp phức tạp với điều kiện thích hợp. Thƣờng dùng trong

phân tách các hợp chất tự nhiên.

1.3.2. Cơ sở của quá trình chiết

Dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất trong hai chất lỏng không

hòa tan lẫn với nhau. Sự phân bố khác nhau là do tính tan khác nhau của các

chất trong các pha lỏng.

Quá trình chiết dựa trên định luật Nerst:

KA = CA / CB

KA: hằng số phân bố

CA, CB : nồng độ các chất hòa tan trong chất lỏng A, B không hòa tan lẫn

vào nhau.

1.3.3. Quá trình chiết

1.3.3.1. Chọn dung môi chiết

Trông thƣờng các chất chuyển hóa thứ cấp trong cây có độ phân cực

khác nhau. Tuy nhiên những thành phần tan trong nƣớc ít khi đƣợc quan tâm.

Dung môi dùng trong quá trình chiết cần phải đƣợc lựa chọn rất cẩn

thận.

Điều kiện của dung môi là phải hòa tan đƣợc những chất chuyển hóa thứ

cấp đang nghiên cứu, dễ dàng đƣợc loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với

chất nghiên cứu), không độc, không dễ bốc cháy.

Những dung môi này nên đƣợc chƣng cất để thu đƣợc dạng sạch trƣớc

khi sử dụng nếu chúng có lẫn các chất khác có thể ảnh hƣởng tới hiệu quả và

chất lƣợng của quá trình chiết. Thƣờng có một số chất dẻo lẫn trong dung môi

nhƣ các diankyl phtalat, tri-n-butyl-axetyniat và tributylphotphat. Những chất

này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất dung môi hoặc khâu bảo

quản nhƣ các thùng nhựa hoặc các nút nhựa.

Methanol và chloroform thƣờng chứa đioctylphtalat [đi-(2-etylhexyl) phtalat

hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat]. Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân lập trong

các quá trình nghiên cứu hóa thực vật, thể hiện hoạt tính trong thử nghiệm

sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây. Chlorofrom, metylen clorit và

methanol là những dung môi thƣờng đƣợc lựa chọn trong quá trình chiết sơ

bộ một phần của cây nhƣ: lá, thân, rễ, củ, quả, hoa…

Những tạp chất của cloroform nhƣ CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản ững

với một vài hợp chất nhƣ các ankaloit tạo muối bậc bốn và những sản phẩm

khác. Tƣơng tự nhƣ vậy sự có mặt của lƣợng nhỏ axits clohidric (HCl) cũng

có thể gây ra sự phân hủy, sự khử nƣớc hay sự đồng phân hóa với các hợp

chất khác. Vì chloroform có thể gây tổn thƣơng cho gan và thận nên nó cần

đƣợc thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng và phải đeo mặt lạ phòng độc.

Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn chloroform.

Methanol và ethanol 80% là những dung môi phân cực hơn các

hidrocacbon thế clo. Ngƣời ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rƣợu sẽ

thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu

đƣợc lƣợng lớn các thành phần trong tế bào. Trái lại khả năng phân cực của

Chlorofrom thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol

hòa tan phân lớp các chất chuyển hóa phân cực cùng với các hợp chất phân

cực trung bình thấp. Vì vậy khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị hòa

tan đồng thời. Thông thƣờng dung môi cồn trong nƣớc có những đặc tính tốt

nhất cho quá trình chiết sơ bộ.

Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới đƣợc tạo thành khi dùng

methanol trong suốt quá trình chiết. thí dụ trechlonolide A thu đƣợc từ

Trechonaetes aciniata đƣợc chuyển thành trechonolide B bằng quá trình phân

hủy 1-hydroxytropcocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense đƣợc

chiết trong methanol nóng.

Ngƣời ta thƣờng ít sử dụng nƣớc để thu đƣợc dịch chiết thô từ cây mà

thay vào đó là dùng dung dịch nƣớc của methanol.

Đietyl ete hiếm khi đƣợc dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất

dễ bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời có xu hƣớng tạo thành peroxit dễ

nổ, peroxit của đietyl êt dễ gây phản ứng oxi hóa với những hợp chất không

có khả năng tạo Cholesterol nhƣ các carotenoid. Tiếp đến là axeton cũng có

thể tạo thành axetonit nếu 1,2 - cis - diol có mặt trong môi trƣờng axit. Quá

trình chiết dƣới điều kiện axit hoặc bazo thƣờng đƣợc dùng với quá trình phân

tách đặc trƣng, cũng có khi xử lý các dịch chiết bằng axit – bazo có thể tạo

thành những sản phẩm mong muốn.

Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hóa thứ cấp trong

cây đƣợc chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho

quá trình chiết tránh đƣợc sự phân hủy chất bởi dung môi và quá trình tạo

thành chất mong muốn.

Sau khi chiết dung môi đƣợc cất ra bằng máy cắt quay ở nhiệt độ không quá 30- 40oC, với một hóa chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn.

1.3.3.2. Quá trình chiết

Hầu hết quá trình chiết đơn giản đƣợc phân loại nhƣ sau:

- Chiết ngâm

- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet.

- Chiết sắc với dung môi nƣớc

- Chiết lôi cuốn theo hơi nƣớc

Chiết ngâm là một trong những phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng rãi nhất

trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời

gian. Thiết bị sử dụng là một bình thủy tinh với một cái khóa ở dƣới đáy để

điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách nửa dung môi. Dung môi

có thể nóng hoặc lạnh nhƣng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn. Trƣớc đây,

máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhƣng hiện nay có thể dùng

bằng thủy tinh.

Thông thƣờng quá trình chiết ngâm không đƣợc sử dụng nhƣ phƣơng

pháp chiết liên tục bởi mẫu đƣợc ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng

24 giờ rồi chất chiết đƣợc lấy ra. Thế tahông thƣờng quá trình chiết một mẫu

chỉ thực hiện qua ba lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa

những chất giá trị nữa. Sự kết thúc quá trình chiết đƣợc xác định bằng một vài

cách khác nhau. Nhƣ vậy tùy thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa

chọn dung môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lý nhằm đạt

hiệu quả cao.

Ngoài ra, có thể dựa vào mỗi quan hệ của dung môi và chất tan của các

hợp chất mà ta có ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình

chiết.

1.4. Các phƣơng pháp sắc ký trong phân lớp các hợp chất hữu cơ

Phƣơng pháp sắc ký (chromatography) là một phƣơng pháp phổ biến và

hữu hiệu nhất hiện nay, đƣợc sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp

chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng.

1.4.1. Đặc điểm chung của phƣơng pháp sắc ký [1]

Sắc ký là phƣơng pháp tách các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất

hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chũng giữa hai pha động và tĩnh.

Sắc ký gồm có pha tĩnh và pha động. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu

tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và23 pha tĩnh tƣơng ứng với tính

chất của chúng ( tính bị hấp phụ, tính tan… ). Các chất khác nhau sẽ có ái lực

khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình pha động dọc theo hệ sắc

ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp

phụ và phản hấp phụ. Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển

động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tƣơng tác yếu hơn với pha

này. Nhờ đặc điểm này mà ngƣời ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký.

1.4.2. Cơ sở của phƣơng pháp sắc ký

Phƣơng pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai

pha động và pha tĩnh. Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ

thuộc của lƣợng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch (hoặc

cới chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng

nhiệt Langmuir:

N =

n- lƣợng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng

- lƣợng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào đó

b- hằng số

C- nồng độ của chất bị hấp phụ

1.4.3. Phân loại các phƣơng pháp sắc ký

Trong các phƣơng pháp sắc ký pha động là các lƣu thể ( các chất ở trạng

thái khí hay lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn.

Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, ngƣời ta chia sắc ký thành hai nhóm

lớn: sắc ký khí và sắc ký lớp mỏng. Dựa vào cách tiến hành sắc ký, ngƣời ta

chia ra thành các phƣơng pháp sắc ký chủ yếu sau:

1.4.3.1. Sắc ký cột (CC)

Đây là phƣơng pháp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm

các loại Silica gel (có kích thƣớc hạt khác nhau) pha thƣờng và pha đảo

YMC, ODS, Dianion… Chất hấp phụ đƣợc nhồi vào cột (cột có thể bằng thủy

tinh hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thủy tinh). Độ mịn của chất hấp phụ

hết sức quan trọng, nó phản ánh số đĩa lý thuyết hoặc khả năng tách của chất

hấp phụ. Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả

năng tách càng cao và ngƣợc lại. Tuy nhiên nếu chất hấp phụ có kích thƣớc

hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm. Trong một số trƣờng hợp nếu lực

trọng trƣờng không đủ lớn thì gây ra hiện tƣợng tắc cột (dung môi không chảy

đƣợc ), khi đó ngƣời ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC), áp

suất cao (HPLC).

Trong sắc ký cột, tỷ lệ đƣờng kính cột (D) so với chiều cao cột (L) rất

quan trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột. Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu

cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể. Trong sắc ký, tỷ lệ giữa

quang đƣờng đi của chất cần tách so với quãng đƣờng đi của dung môi gọi là

quãng đƣờng đi của chất cần tách so với quãng đƣờng đi của dung môi gọi là

Rf , với mỗi một chất sẽ có Rf khác nhau. Nhờ vào sự khác nhau về Rf này mà

ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp. Tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất hấp phụ

cũng rất quan trọng và tùy thuộc vào yêu cầu tách. Nếu tách thô thì tỉ lệ này

thấp (từ 1/5 1/10), còn nếu tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tùy thuộc vào

hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau của Rf của các chất), mà hệ số này

trong khoảng 1/20 1/30. Trong sắc ký cột, việc đƣa chất lên cột hết sức

quan trọng. Tùy thuộc vào lƣợng chất và dạng chất mà ngƣời ta có thể đƣa

chất lên cột bằng các phƣơng pháp khác nhau. Nếu lƣợng chất nhiều và chạy

thô, thì phổ biến là tẩm chất vào silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đƣa lên

cột. Nếu tách tinh, thì đƣa trực tiếp chất lên cột bằng cách hòa tan chất bằng

dung môi chạy cột với dung lƣợng tối thiểu

Có hai cách đƣa chất hấp phụ lên cột:

- Cách 1: Nhồi cột khô. Theo cách này, chất hấp phụ đƣợc đƣa trực tiếp

vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất

hấp phụ sắp xếp chặt trong cột. Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột

đến khi cột trong suốt.

- Cách 2: Nhồi cột ƣớt, tức là chất hấp phụ đƣợc hòa tan trong dung môi

chạy cột trƣớc với lƣợng dung môi tối thiểu. Sau đó đƣa dần vào cột đến khi

đủ lƣợng cần thiết.

Khi chuẩn bị cột phải lƣu ý không đƣợc để bọt khí bên trong (nếu có bọt

khí gây nên hiện tƣợng chạy rối loạn trong cột và giảm hiệu quả tách), và cột

không đƣợc nứt, gãy, dò.

Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hƣởng đến hiệu quả tách. Nếu tốc

độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách. Còn nếu tốc độ dòng chảy

quá thấp thì sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hƣởng đến tiến độ công việc.

1.4.3.2. Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng (SKLM) thƣờng đƣợc sử dụng để kiểm tra và định

hƣớng cho sắc kí cột. SKLM đƣợc tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn

Silicagel trên đế nhôm hay đế thủy tinh. Ngoài ra, SKLM còn dùng để điều

chế thu chất trực tiếp. Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản đƣợc tráng

Silica gel dày hơn ), có thể đƣa lƣợng chất nhiều hơn lên bản, và sau khi chạy

sắc ký, ngƣời ta có thế cạo riêng phần silica gel có chứa chất cần tách rồi giải

hấp phụ bằng dung môi thích hợp để thu đƣợc từng chất riêng biệt. Có thể

phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc

trƣng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10%.

1.5. Một số phƣơng pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu

cơ [1]

Cấu trúc hóa học các hợp chất hữu cơ đƣợc xác định nhờ vào các

phƣơng pháp phổ kết hợp. Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học của từng chất mà

ngƣời ta sử dụng phƣơng pháp phổ cụ thể nào. Cấu trúc càng phức tạp thì yêu

cầu phổi hợp các phƣơng pháp phổ càng cao. Trong một số trƣờng hợp, để

xác định chính xác cấu trúc hóa học của các hợp chất, ngƣời ta phải dựa vào

các phƣơng pháp phổ bổ sung khác nhƣ chuyển hóa hóa học, kết hợp với các

phƣơng pháp sắc ký so sánh…

1.5.1. Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy, IR)

Phổ hồng ngoại đƣợc xác định dựa vào sự khác nhau về dao động của các

liên kết trong phân tử hợp chất dƣới sự kích thích của tia hồng ngoại. Mỗi kiểu

liên kết đƣợc đặc trƣng bởi một vùng bƣớc sóng khác nhau. Do đó dựa vào

phổ hồng ngoại, có thể xác định đƣợc các nhóm chức đặc trƣng trong hợp chất,

ví dụ nhƣ dao động hóa trị của nhóm OH tự do trong các nhóm hydroxyl là 3300 3450 cm-1, của nhóm cacbonyl C=O trong khoảng 1700 1750 cm-1 ...

1.5.2. Phổ khối lƣợng (Mass spectroscopy, MS).

Nguyên tắc của phƣơng pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion trong

phân tử chất dƣới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Phổ MS còn cho các

pic ion mảnh khác mà dựa vào đó ngƣời ta có thể xác định đƣợc cơ chế phân

mảnh và dựng lại đƣợc cấu trúc hóa học các hợp chất. Hiện nay có rất nhiều

loại phổ khối lƣợng, những phƣơng pháp chủ yếu đƣợc nêu ra dƣới đây:

- Phổ EI-MS (Electron Impact Ionizatoin mass spectroscopy) dựa vào sự

phân mảnh ion dƣới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lƣợng khác nhau,

phổ biến là 70eV.

- Phổ ESI-MS (Electron spray Ionizatoin mass spectroscopy) gọi là phổ

phun mù điện tử. Phổ này đƣợc thực hiện với năng lƣợng bắn phá thấp hơn

nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu đƣợc chủ yếu là pic ion phân tử và các

pic đặc trƣng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lƣợng thấp, dễ bị phá vỡ.

- Phổ FAB (Fast Atom Bombing mass spectroscopy) là phổ bắn phá

nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lƣợng thấp, do đó

phổ thu đƣợc cũng dễ thu đƣợc pic ion phân tử.

- Phổ khối lƣợng phân giải cao (High resolution mass spectroscopy) cho

phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao.

- Ngoài ra, hiện nay ngƣời ta còn sử dụng kết hợp các phƣơng pháp sắc

ký kết hợp với khối phổ khác nhƣ: GC-MS (sắc kí khí- khối phổ), LC-MS

(sắc ký lỏng- khổi phổ). Các phƣơng pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu hiệu

khi phân tích thành phần của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc trong

ngành dƣợc).

1.5.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance

Spectroscopy, NMR)

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân là một phƣơng pháp phổ hiện đại và hữu

hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một

chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của

hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử.

Nguyên lý chung của các phƣơng pháp phổ NMR (phổ proton và cacbon) là sự cộng hƣởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dƣới tác

dụng của từ trƣờng ngoài. Sự cộng hƣởng khác nhau này đƣợc biểu diễn bằng

độ chuyển dịch hóa học (chemical shift). Ngoài ra, đặc trƣng của phân tử còn

đƣợc xác định dựa vào tƣơng tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin

coupling). 1.5.3.1. Phổ 1H- NMR:

Trong phổ 1H-NMR, độ chuyển dịch hóa học ( ) của các proton đƣợc

xác định trong thang ppm từ 0 14 ppm, tùy thuộc vào mức độ lai hóa của

nguyên tử cũng nhƣ đặc trƣng riêng của từng phần. Dựa vào những đặc trƣng

của độ chuyển dịch hóa học và tƣơng tác spin mà ngƣời ta có thể xác định

đƣợc cấu trúc hóa học của hợp chất. 1.5.3.2. Phổ 13C-NMR:

Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng

hƣởng ở một trƣờng khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo của phổ 13C-NMR là ppm, với dải thang đo rộng 0 230 ppm.

1.5.3.3. Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Tranfer):

Phổ này cho ta tín hiệu phân loại cacbon khac nhau. Trên phổ DEPT, tín

hiệu của các cacbon bậc bốn biến mất. Tín hiệu của CH và CH3 nằm về một phía của CH2 về một phía trên phổ DEPT 135 oC. Trên phổ DEPT 90oC chỉ

xuất hiện tín hiệu phổ của các CH.

1.5.3.4. Phổ 2D-NMR:

Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phéo xác định các tƣơng tác của

các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. Một số kỹ thuật chủ

yếu thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ sau:

- Phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence): Các tƣơng

tác trực tiếp H-C đƣợc xác định nhờ vào các tƣơng tác trên phổ này. Trên phổ một trục là phổ 1H-NMR còn trục kia là 13C-NMR. Các tƣơng tác HQMC

nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ.

- Phổ 1H-1H COSY (HOMOCOSY) (1H-1H Chemical Shift Correlation

Spectroscopy): phổ này biểu diễn các tƣơng tác xa của H-H, chủ yếu là các

proton đính với cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phần của phân tử

đƣợc ghép nối lại với nhau.

- Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phổ

biểu diễn tƣơng tác xa trong không gian phân tử. Nhờ vào các tƣơng tác trên

phổ này mà từng phần của phân tử cũng nhƣ toàn bộ phân tử đƣợc xác định

về cấu trúc.

- Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): phổ này biểu

diễn các tƣơng tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên

keetss mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian. Dựa vào kết

quả phổ này có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử.

Ngƣời ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kĩ thuật nổ NOE Differences

để xác định cấu trúc không gian của phân tử. Bằng việc đƣa vào một xung

đúng bằng từ trƣờng cộng hƣởng của một proton xác định thì các proton có

cùng phía về không gian cũng nhƣ gần nhau về không gian sẽ cộng hƣởng

mạnh hơn và cho tín hiệu với cƣờng độ mạnh hơn. Ngoài ra, còn sử dụng phổ

X-RAY (Nhiễu xạ Rowngen) để xác định cấu trúc không gian của toàn bộ phân

tử của hợp chất kết tinhowr dạng đơn tinh thể. Nhƣng phạm vi sử dụng của nó

hạn chế vì yêu cầu cần tiên quyết của phƣơng pháp này là cần phải có đơn tinh

thể. Đây là một điều kiện không phổ biến đối với các hợp chất hữu cơ.

Nhƣ trên đã đề cập ngoài việc sử dụng các loại phổ ngƣời ta còn sử dụng

kết hợp với các chuyển hóa hóa học cũng nhƣ các phƣơng pháp phân tích so

sánh kết hợp khác nhau.

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Mẫu thực vật

Thân lá loài Gymnema latifolium đƣợc thu hái tại trung tâm nghiên cứu

trồng và chế biến cây thuốc Hà Nội, Ngọc Hồi, Ngũ Hiệp, Thanh Trì, Hà Nội

vào tháng 3 năm 2017. Ngƣời giám định loài là TS. Đỗ Văn Hải. Tiêu bản

đƣợc lƣu tại Phòng nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa Sinh Biển, Viện Hàn lâm

Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam. Mẫu thực vật đƣợc phơi khô, nghiền nhỏ

trƣớc khi đem chiết.

2.2. Phƣơng pháp phân lập các hợp chất

2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng đƣợc thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien

60 F254 (Merck 1,05715), RP18F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại

ở hai bƣớc sóng 254 nm và 368 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4

10% đƣợc phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ

đến khi hiện màu.

2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế

Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silica gel

60G F254 (Merck, ký hiệu 105875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại hai

bƣớc sóng 254 nm và 368 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là

dung dịch H2SO4 10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng nhƣ

cũ để xác định vùng chất, sau đó cạo lớp Silica gel có chất, giải hấp phụ bằng

dung môi thích hợp.

2.2.3. Sắc ký cột (CC)

Sắc ký cột đƣợc tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thƣờng và

pha đảo. Silica gel pha thƣờng có cỡ hạt là 0,040- 0,063 mm (240-430 mesh).

Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 m, Fujisilisa Chemical Ltd.).

2.3. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất

2.3.1. Điểm nóng chảy (Mp)

Điểm nóng chảy đƣợc đo trên máy Kofler micro-hotstage của Viện Hóa

học các hợp chất Thiên nhiên.

2.3.2. Phổ khối lƣợng (ESI-MS)

Phổ khối lƣợng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization Mass

Spectra) đƣợc đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap của Viện Hóa học,

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.3.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều ( 1D-NMR)

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều bao gồm phổ 1H NMR (500 MHz) 13C NMR (125 MHz) và DEPT ( Distortionless Enhancement by Polarisation

Transfer) đƣợc đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrorneter, Viện Hóa

học, VIện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.3.4. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân hai chiều ( 2D-NMR)

Đây là kĩ thuật phổ hai chiều, bao gồm HMQC ( Heteronuclear Multiple-

Quantum Correlation), HSQC (Heteronuclear Single-Quantum Correlation),

HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation ) cho phép xác định các

tƣơng tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều.

2.4. Dụng cụ và thiết bị

2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết

Các dụng cụ và thiết bị dùng cho tách chiết và tinh chế chất sạch đƣợc sử

dụng bao gồm:

+ Bình chiết 30 lít

+ Phễu chiết 2 lít

+ Máy cô quay chân không

+ Đèn tử ngoại hai bƣớc sóng 254nm và 368 nm

+ Máy sấy

+ Micropipet

+ Bình sắc ký loại phân tích và điều chế

+ Cột sắc ký pha thƣờng và pha đảo với các kích cỡ khác nhau

+ Dung dịch thuốc thử H2SO4 10%

+ Capilla

2.4.2. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc

+ Phổ 1H-NMR (400 MHz) và 13C-NMR (101 MHz) đƣợc đo trên máy

Varian 400 MHz của Khoa Dƣợc, Trƣờng Đại học Yonsei, Hàn Quốc. Chất

nội chuẩn là TMS (Tetrametyl Silan).

+ Máy đánh siêu âm POWERSON IC 603 củaHãng Hwashin

Technology, Korea.

+ Độ quay cực đƣợc đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY Polarimeter

của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

+ Cân phân tích 4 số Ohaus P124 của Hãng Ohaus Corporation, USA.

+ Máy cất quay chân không.

+ Tủ hút chân không.

+ Đèn tử ngoại ở hai bƣớc sóng 254 nm và 365 nm

+ Máy phổ cộng hƣởng từ hạt nhân NMR AM500 FT-NMR spectrometer

+ Máy đo phổ khối lƣợng AGILENT 1100 LC-MSD Trap

2.5. Hóa chất

+ Silica gel pha thƣờng (0.04-0.63 mm) Merck

+ Silica gel pha đảo ODS (30-50 Fujisilisa Chemical Ltd.).

+ Bản mỏng tráng sẵn pha thƣờng DC –Alufolien 60 F254 (Merck

1.05715).

+ Bản mỏng tráng sẵn pha đảo RP18F254s (Merck).

+ Các loại dung môi hữu cơ nhƣ MeOH, EtOAc, CH2Cl2, n-hexan,

acxetone, n-butanol, clorofom, diclorofom, ethyl acetat, ethannol, vanilin,…

CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM

3.1. Phân lập các hợp chất

Thân lá G. latifolium đƣợc phơi khô, nghiền nhỏ thu đƣợc 4 kg. Ngâm 4

kg bột G.latifolium với 20 lít MeOH và siêu âm ở nhiệt độ phòng (3 lần, mỗi

lần 2 giờ) thu đƣợc dịch chiết methanol. Sau khi loại dung môi dƣới áp suất

giảm, cặn chiết MeOH (GL, 750 g) đƣợc phân bố đều trong nƣớc cất và chiết

phân lớp lần lƣợt với dung môi n-Hexane và EtOAc thu đƣợc các cặn n-

Hexan (GL1A, 130g), cặn EtOAc (GL1B, 400g) và lớp nƣớc (GL1C, 580g).

Phân lớp nƣớc (GL1C, 580g) đƣợc phân tách qua cột Diaion HP-20 rửa

giải bằng hệ dung môi MeOH:H2O (25%Me, 50%Me, 75%Me, 100%Me, v:v)

thu đƣợc bốn phân đoạn tƣơng ứng GL2A, GL2B, GL2C và GL2D. Phân

đoạn GL2C đƣợc phân tách trên cột Gradient rửa giải bằng hệ dung môi

CHCl3: MeOH (20:1, 10:1, 5:1, v:v:v) thu đƣợc ba phân đoạn tƣơng ứng

GL3A, GL3B và GL3C. Phân đoạn GL3A tiếp tục đƣợc phân tách qua cột

silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi CHCl3: MeOH: H2O (5:1:0.1, v:v:v) thu

đƣợc sáu phân đoạn GL4A, GL4B, GL4C, GL4D, GL4E và GL4F. Tiếp tục

phân tách phân đoạn GL4F qua cột silica gel pha đảo, rửa giải bằng hệ dung

môi MeOH: H2O (3:1, v:v) thu đƣợc ba phân đoạn GL5A, GL5B và GL5C.

Hợp chất 1 (11.6 mg) thu đƣợc sau khi phân tách phân đoạn GL5A bằng cột

silica gel pha đảo, rửa giải bằng hệ dung môi (CH3)2 CO: H2O (1:2.5, v:v).

Phân đoạn GL3C tiếp tục đƣợc phân tách qua cột silica gel pha đảo, rửa

giải bằng hệ dung môi MeOH:H2O (3:1, v:v) thu đƣợc hai phân đoạn GL6A và

GL6B. Tiếp tục phân tách phân đoạn GL6B qua cột silica gel pha đảo, rửa giải

bằng hệ dung môi môi MeOH:H2O (1.5:1, v:v) thu đƣợc sáu phân đoạn GL7A,

GL7B, GL7C, GL7D, GL7E, GL7F. Phân đoạn GL7D tiếp tục đƣợc phân

tách qua cột silica gel pha đảo, rửa giải bằng hệ dung môi MeOH:H2O (3:1,

v:v) thu đƣợc ba phân đoạn GL8A, GL8B và GL8C. Hợp chất 2 (12.5 mg) thu

đƣợc bằng cách tinh chế phân đoạn GL8B trên cột silica gel pha đảo, rửa giải

bằng hệ dung môi (CH3)2CO : H2O (1:2, v:v).

Bột GL khô (4Kg)

Chiết siêu âm với methanol (3lần x20L)

GL (MeOH) (750g)

n- Hexane

GL1C 580g

GL1A 130g

Diaion HP-20

25%M

75%M

100%M

50%M

EtOAc GL1B 400g

GL2D

GL2B 31.6 g

GL2A 20 g

GL2C 42 g

Gradient (CM 20/1 10/1 5/1)

50 g Gradient (CM 20/1 10/1 5/1)

GL3C

GL6C

GL6A

GL6B 8.0 g

GL3A GL3B

C.C, CMW 5/1/0.1

MW 1.5/1

GL4A

GL4B

GL4C GL4D GL4E

GL7F

GL7E

GL7B

GL7A

GL4F 500 mg

GL7C GL7D 650 mg

RP-18, MW 3/1

GL5B GL5C

GL8C

GL5A 120 mg

GL8A GL8B 100 mg

RP-18, AW 1/ 2.5

RP-18, AW 1/2

GL5A1 12.5 mg

GL8B1 16.4 mg

Hình 3.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn MeOH của loài G. latifolium

3.2. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập đƣợc

3.2.1. Hợp chất GL5A1

Các thông số vật lí của hợp chất GL5A1

- Mô tả: Bột vô định hình màu trắng.

: -6.3° (c 0.17, MeOH)

- Công thức phân tử: C42H68O13 (M=780)

- Độ quay cực - Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR (CD3OD, 400MHz) và 13C-

NMR(CD3OD,100MHz): xem bảng 4.1

3.2.2. Hợp chất GL8B1

Các thông số vật lí của hợp chất GL8B1

- Mô tả: Bột vô định hình màu trắng.

: -6.6° (c 0.004, MeOH)

- Công thức phân tử: C48H80O18 (M=944)

- Độ quay cực - Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR (Methanol-d4, 400MHz) và 13C-

NMR (Methanol-d4, 101MHz): xem bảng 4.2

CHƢƠNG 4: THẢO LUẬN KẾT QUẢ

4.1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất GL5A1

Hợp chất GL5A1 đƣợc phân lập đƣợc dƣới dạng bột vô định hình màu trắng. Trên phổ 1H-NMR của hợp chất GL5A1 cho thấy tín hiệu: 7 proton của

nhóm methyl dƣới dạng singlet tại δH 0.78, 0.83, 0.89, 0.91, 0.94, 1.03 và

1.14; một proton olefin tại δH 5.23 (1H, br s), 2 proton anome tại δH 4.30 (1H,

d, J = 7.6 Hz) và 5.36 (1H, d, J = 8.0 Hz) và sự xuất hiện một số lƣợng lớn

các tín hiệu proton ở vùng trƣờng cao (δH 0.78 – 2.83) cho phép dự đoán đây

là một hợp chất triterpene có gắn 2 đơn vị đƣờng.

Hình 4.1.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất GL5A1

Phổ 13C-NMR của hợp chất GL5A1 cho thấy tín hiệu cộng hƣởng của 42

nguyên tử carbon. Các số liệu phổ proton và carbon tƣơng ứng đƣợc xác định thông qua phổ HSQC (Bảng 4.1). Phân tích số liệu phổ 1H-, 13C-NMR và

HSQC cho phép xác định sự tồn tại cấu trúc bộ khung olean-12-ene với các

tín hiệu đặc trƣng: 7 nhóm methyl tại δC 33.5 (δH 0.89, H-29), 28.6 (δH 1.03,

H-23), 26.4 (δH 1.14, H-27), 24.0 (δH 0.91, H-30), 17.7 (δH 0.78, H-26),17.0

(δH 0.83, H-24) và 16.1 (δH 0.94, H-25); 1 cacbon olefin tại δC 123.6 (δH 5.23,

1H, br s, H-12) và δC 144.8 cho thấy sự có mặt của một liên kết đôi C C đã bị

thế ba proton. Kết hợp so sánh số liệu phổ của hợp chất 1 với tài liệu tham

khảo cho thấy hợp chất này giống hợp chất oleanolic acid 3-O-β-D-

glucopyranosyl-28-O-β-D-glucopyranoside [43].

Hình 4.1.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất GL5A1

Các tƣơng tác trên phổ HMBC cho phép gắn chính xác các nhóm thế vào

aglycone. Tƣơng tác HMBC từ H-23 (δH 1.03), H-24 (δH 0.83) tới C-3 (δC

90.8)/ C-4 (δC 40.2)/ C-5 (δC 57.0) và từ H-3 (δH 3.15) tới C-4 (δC 40.2)/ C-23

(δC 28.6)/ C-24 (δC 17.0) cho thấy liên kết C-O tại C-3 và có 2 nhóm metyl tại

C-4. Tƣơng tác HMBC từ H-25 (δH 0.94) tới C-1 (δC 39.8)/ C-5 (δC 57.0)/ C-9

(δC 49.0)/ C-10 (δC 37.8), từ H-26 (δH 0.78) tới C-7 (δC 33.9)/ C-8 (δC 40.2)/

C-9 (δC 49.0)/ C-14 (δC 42.9) và từ H-27 (δH 1.14) tới C-8 (δC 40.2)/ C-13 (δC

144.8)/ C-14(δC 42.9)/ C-15 (δC 28.9) cho thấy 3 nhóm metyl lần lƣợt tại C-10

, C-8 và C-14. Các tƣơng tác HMBC từ H-29 (δH 0.89) và H-30 (δH 0.91) tới

C-19 (δC 47.2), C-20 (δC 31.5), C-21 (δC 34.9) cho thấy 2 nhóm metyl tại C-

20. Tƣơng tác HMBC từ H-12 (δH 5.23) tới C-10 (δC 37.8)/ C-11 (δC 24.0)/ C-

14 (δC 42.9) và từ H-18 (δH 2.83) tới C-12 (δC 123.8)/ C-13 (δC 144.8) cho

thấy có nối đôi tại C-12 và C-13. Các tƣơng tác HMBC từ H-18 (δH 2.83) và

H-22 (δH 1.60) tới C-28 (δC 178.0) cho thấy có nhóm cacboxyl tại C-28.

Tƣơng tác H-1′ (δH 4.30) tới C-3 cho thấy đơn vị đƣờng (H-1′ (δH 4.30)) nằm

ở C-3. Tƣơng tác H-1′′ (δH 5.36) tới C-28 cho thấy đơn vị đƣờng (H-1′′ (δH

5.36)) nằm ở C-28. Kết hợp các phân tích phổ 1 chiều, 2 chiều và so sánh với

tài liệu tham khảo, hợp chất GL5A1 đƣợc xác định là oleanolic acid 3-O-β-D-

glucopyranosyl-28-O-β-D-glucopyranoside.

Hình 4.1.3. Cấu trúc hóa học của hợp chất GL5A1

Hình 4.1.4. Phổ HSQC của hợp chất GL5A1

Hình 4.1.5. Phổ HMBC của hợp chất GL5A1

Hình 4.1.6. Phổ HMBC dãn rộng của hợp chất GL5A1

Hình 4.1.7. Phổ HMBC dãn rộng của hợp chất GL5A1

Hình 4.1.8. Các tƣơng tác HMBC chính của hợp chất GL5A1

a,cδH (mult., J in Hz)

a,bδC

Bảng 4.1. Bảng số liệu phổ của hợp chất GL5A1 và hợp chất tham khảo #δC Aglycone

1 39.6 39.8 0.96 (m)/1.60 (m)

2 26.7 27.0 1.66 (m)/1.91 (m)

3 90.7 90.8 3.15 (m)

4 40.6 40.2 -

5 56.7 57.0 0.75 (*)

6 19.3 19.3 1.39 (m)/1.52 (m)

7 33.1 33.9 1.30 (m)/1.46 (m)

8 40.1 40.2 -

9 48.0 49.0 1.55 (m)

10 37.7 37.8 -

11 24.4 24.0 1.71 (m)/2.00 (m)

12 123.6 123.8 5.23 (br s)

13 - 144.8 144.8

14 - 42.6 42.9

15 28.2 28.9 1.08 (m)/1.77 (m)

16 26.2 24.6 1.88 (m)

17 47.8 48.0 -

18 42.3 42.6 2.83 (dd, 4.0, 10.2)

19 47.2 47.2 1.13 (m)/1.70 (m)

20 31.5 31.5 -

21 34.7 34.9 1.18 (m)/1.38 (m)

22 33.2 33.1 1.60 (m)/1.70 (m)

23 1.03 (s) 28.2 28.6

24 0.83 (s) 16.4 17.0

25 0.94 (s) 16.7 16.1

26 0.78 (s) 17.7 17.7

27 1.14 (s) 26.1 26.4

28 178.3 178.0 -

29 0.89 (s) 33.5 33.5

30 0.91 (s) 23.8 24.0

3-O-β-D-glucopyranosyl

1′ 105.8 106.7 4.30 (d, 7.6)

2′ 3.18 (m) 73.8 75.6

3′ 3.38 (m) 78.5 78.2

4′ 3.32 (m) 71.6 71.1

5′ 3.28 (m) 78.1 78.3

6′ 62.4 62.4 3.65 (m)/3.80 (m)

28-O-β-D-glucopyranosyl

1′′ 95.6 95.7 5.36 (d, 8.0)

2′′ 74.9 73.8 3.30 (m)

3′′ 78.8 78.7 3.32 (m)

4′′ 71.4 71.6 3.25 (m)

5′′ 78.3 77.6 3.22 (m)

#δC: dữ liệu của hợp chất GL5A1[43],a) đo bằng CD3OD, b)100 MHz,

c)400 MHz

6′′ 62.6 62.7 3.65/3.80

4.2. Xác định cấu trúc của hợp chất GL8B1

Hợp chất GL8B1 phân lập đƣợc dƣới dạng bột vô định hình màu trắng. Phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất GL8B1 cho tín hiệu khá tƣơng đồng với

hợp chất GL5A1 với sự xuất hiện của 7 nhóm methyl tại δH 0.77, 0.82, 0.89,

0.93, 0.91, 1.03 và 1.14; một proton olefin tại δH 5.23 (1H, br s), 2 proton

anome tại δH 4.32 (1H, d, J = 8.0 Hz) và 5.37 (1H, d, J = 8.0 Hz). Sự khác biệt

là xuất hiện thêm 2 proton anome tại δH 4.37 (1H, d, J = 7.6 Hz) và δH 4.29

(1H, d, J = 7.6 Hz) gợi ý sự xuất hiện thêm hai đơn vị đƣờng β trong phân tử.

Hình 4.2.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất GL8B1

Tƣơng ứng trên phổ 13C-NMR là 2 cacbon anome δC 104.4 và δC 105.7.

Sự biến mất 1 nhóm CH2 (δC 62.4), thay vào đó là xuất hiện thêm hai nhóm

CH2 tại δC 70.1 và δC 69.8 dự đoán hai đơn vị đƣờng mới này đƣợcnối với các

đƣờng cũ ở vị trí C-6 của đƣờng glucose. Đặc biệt, tín hiệu δC 66.8 (CH2 –

HSQC) gợi ý sự tồn tại của một gốc đƣờng xylopyranosyl. So sánh số liệu

phổ của hợp chất GL8B1 với tài liệu tham khảo cho thấy hợp chất này giống

hợp chất 3-O-β-D-xylopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl(1→6)-β-D-

glucopyranosyl oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester [44].

Hình 4.2.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất GL8B1

Cấu trúc của hợp chất GL8B1 đƣợc khẳng định lại bằng phổ hai chiều

HMBC tƣơng tự nhƣ ở hợp chất GL5A1. Vị trí của hai đơn vị đƣờng gắn

thêm ở hợp chất GL8B1 đƣợc xác định dựa vào tƣơng tác HMBC giữa H-1′′

(δH 4.37) với C-6′ (δC 70.1) và H-1′′′ (δH 4.29) với C-6′ (δC 69.8).

Kết hợp phân tích phổ 1D, 2D của hợp chất GL8B1 và so sánh dữ kiện

phổ với chất 5 trong tài liệu tham khảo [34],Cấu trúc của hợp chất GL8B1

đƣợc xác định là 3-O-β-D-xylopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl(1→6)-β-

D-glucopyranosyl oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester.

Hình 4.2.3. Cấu trúc hóa học của hợp chất GL8B1

Hình 4.2.4. Phổ HSQC của hợp chất GL8B1

Hình 4.2.5. Phổ HMBC của hợp chất GL8B1

Hình 4.2.6. Phổ HMBC dãn rộng của hợp chất GL8B1

Hình 4.2.7. Phổ HMBC dãn rộng của hợp chất GL8B1

Hình 4.2.8. Tƣơng tác HMBC chính của hợp chất GL8B1

C Bảng 4.2. Bảng số liệu phổ của hợp chất GL8B1 và hợp chất tham khảo a,cδH (mult., J in Hz)

a,bδC

#δC

Aglycone

1 38.7 39.8 0.95 (m)/1.95 (m)

2 26.7 27.0 1.63 (m)/1.90 (m)

3 89.0 90.8 3.16 (m)

4 39.5 40.1 -

5 55.8 56.7 0.77 (m)

6 18.3 19.3 1.37 (m)/1.51 (m)

7 33.1 33.9 1.29 (m)/1.45 (m)

8 39.9 40.6 -

9 48.0 47.9 1.55 (m)

10 37.0 37.8 -

11 23.8 24.5 1.88 (m)

12 123.0 123.8 5.23 (br s)

13 144.0 144.7 -

14 42.1 42.8 -

15 28.2 28.8 1.08 (m)/1.76 (m)

16 23.4 24.5 1.69 (m)/2.01 (m)

17 47.0 47.2 -

18 41.7 42.5 2.82 (d, 12.0)

19 46.2 47.2 1.13 (m)/1.68 (m)

20 30.8 31.5 -

21 34.0 34.8 1.19 (m)/1.37 (m)

22 32.5 33.0 1.59 (m)/1.69 (m)

23 17.6 28.6 1.03 (s)

24 28.2 17.1 0.82 (s)

25 15.1 16.1 0.93 (s)

26 17.5 17.7 0.77 (s)

27 26.4 26.4 1.14 (s)

28 176.5 177.9 -

29 33.2 33.5 0.89 (s)

30 23.7 24.0 0.91 (s)

3-O-β-D-glucopyranosyl

107.0 106.6 4.32 (d, 8.0) 1′

2′ 75.0 74.9 3.21 (m)

3′ 78.3 77.7 3.23 (m)

4′ 71.5 71.3 3.34 (m)

5′ 77.0 78.5 3.34 (m)

6′ 70.4 70.1 3.80 (m)/4.08 (m)

6′-O- β-D-glucopyranosyl

1′′ 105.4 104.7 4.37 (d, 7.6)

2′′ 75.6 75.4 3.21 (m)

3′′ 78.5 77.9 3.34 (m)

4′′ 71.6 71.3 3.34 (m)

5′′ 76.9 76.7 3.42 (m)

3.71 (dd, 4.4, 6′′ 69.8 69.8 10.8)/4.08 (m)

6′′-O-β-D-xylopyranosyl

1′′′ 106.0 105.4 4.29 (d, 7.6)

2′′′ 74.7 74.7 3.21 (m)

3′′′ 77.5 77.5 3.23 (m)

4′′′ 71.1 71.0 3.49 (m)

3.19 (d, 11.2)/3.86 5′′′ 67.1 66.8 (dd, 4.8, 11.2)

28-O-β-D-glucopyranosyl

1′′′′ 95.8 95.6 5.37 (d, 8.0)

2′′′′ 74.1 73.8 3.31 (m)

3′′′′ 78.9 78.1 3.34 (m)

4′′′′ 71.1 71.1 3.49 (m)

5′′′′ 79.3 76.7 3.42 (m)

#δC: dữ liệu của hợp chất GL8B1[44].Đo trong a)Methanol-d4, b)101

6′′′′ 62.2 62.3 3.67 (m)/3.80 (m)

MHz, c)400 MHz

KẾT LUẬN

Bằng các phƣơng pháp sắc kí kết hợp, 2 hợp chất tritecpen glycoside đã

đƣợc phân lập từ lá của dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium ). Sử dụng

các phƣơng pháp phân tích phổ hiện đại nhƣ phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều (1H, 13C NMR) và phổ hai chiều(HSQC, HMBC) kết hợp với so sánh tài

liệu tham khảo, cấu trúc của các hợp chất đƣợc xác định là oleanolic acid 3-

O-β-D-glucopyranosyl-28-O-β-D-glucopyranoside (1), 3-O-β-D-

xylopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl

oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester (2).

oleanolic acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-28-O-β-D-glucopyranoside (1)

3-O-β-D-xylopyranosyl (1→6)-β-D-glucopyranosyl (1→6)-β-D-

glucopyranosyl oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester (2)

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

[1] PGS.TS. Nguyễn Hữu Đĩnh (chủ biên), PGS.TS. Đỗ Đình Rãng (2003),

Hóa học hữu cơ 1, Nxb Giáo dục

[2] Phạm Văn Hải (2010), “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa

học và tác dụng sinh học của cây Dây thìa canh lá to ở Hòa Bình”, Khóa

luận tốt nghiệp dƣợc sĩ, Thƣ viện Đại học Dƣợc Hà Nội.

[3] Phạm Thanh Kỳ (1998), Bài giảng dược liệu, tập II. Trƣờng đại học Dƣợc

Hà Nội.

[4] Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXB Y Học

[5] Đ. T. Ái. Nghĩa. "Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng hạ đƣờng

huyết của Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. Ex Wight)"

Đại Học Dƣợc Hà Nội, luận văn thạc sỹ 2014.

[6] H. T. B. Ngọc. "Điều tra, nghiên cứu một số thực vật Việt Nam có tác

dụng hỗ trợ điều hòa lƣợng đƣờng trong máu để ứng dụng cho bệnh

nhân đái tháo đƣờng type 2". Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, luận

án tiến sỹ, 2012.

[7] N. Q. Tiến, P. T. H. Minh, N. Q. An, T. T. T. Nga, N. N. Tuấn, V. Đ.

Doanh, P. H. Điển. Một số kết quả nghiên cứu mới về thành phần hóa

học của cây dây thìa canh Gymnema sylvestre. Tạp chí Dƣợc liệu, 16,

230-234 (2011)

[8]Phạm Hà Thanh Tùng (2012), “Nghiên cứu tính đa dạng thực vật và thành

phần hoá học của các loài trong chi Gymnema R.Br. ở Việt nam”, Luận

văn thạc sĩ dƣợc học, Thƣ viện trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội.

Tài liệu tiếng Anh

[9] S. S. Gupta. Inhibitory effect of Gymnema sylvestris on adrenalineinduced

hyperglycemia in rats. Indian Journal of Mecinal Sciene, 15, 883-887

(1961).

[10] K. Miyatake, S. Takenaka, T. Fujimoto, G. Kensho, S. Priya Upadhaya,

M. Kirihata, I. Ichimoto, Y. Nakano. Isolation of conduritol A from

Gymnema sylvestre and its effects against intestinal glucose absorption

in rats. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 57, 2184-2185

(1993).

[11] K. Miyatake, G. Kensho, T. Fujimoto, E. Noguchi, M. Shinohara, S.

Takenaka, T. Taira, S. Priya Upadhaya, I. Ichimoto, Y. Nakano. Effect of

Conduritol A, a Polyol from Gymnema sylvestre, on the development of

diabetic cataracts in streptozotocin-treated rats and on aldose reductase.

Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 58, 756-757 (1994).

[12] K. Yoshikawa, K. Amimoto, S. Arihara, K. Matsuura. Structure studies

of new antisweet constituents from Gymnema sylvestre. Tetrahedron

Letters, 30, 1103-1106 (1989).

[13] K. Yoshikawa, K. Amimoto, S. Arihara, K. Matsuura. Gymneic acid V,

VI and VII from gurma, the leaves of Gymnema sylvestre R. Br.

Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 37, 852-854 (1989).

[14] K. Yoshikawa, M. Nakagawa, R. Yamamoto, S. Arihara, K. Matsuura.

Antisweet natural products. V. Structures of gymnemic acids VIII-XII

from Gymnema sylvestre R. BR. Chemical and Pharmaceutical Bulletin,

40, 1779-1782 (1992).

[15] N. P. Sahu, S. B. Mahato, S. K. Sarkar, G. Poddar. Triterpenoid saponins

from Gymnema sylvestre. Phytochemistry, 41, 1181-1185 (1996).

[16] M. Yoshikawa, T. Murakami, H. Matsuda. Medicinal Foodstuffs. X.

Structures of new triterpene glycosides, Gymnemosides-c, -d, -e, and -f,

from the leaves of Gymnema sylvestre R. BR. : influence of gymnema

glycosides on glucose uptake in rat small intestinal fragments. Chemical

and Pharmaceutical Bulletin, 45, 2034-2038 (1997).

[17] W.-C. Ye, Q.-W. Zhang, X. Liu, C.-T. Che, S.-X. Zhao. Oleanane

saponins from Gymnema sylvestre. Phytochemistry, 53, 893-899 (2000).

[18] W. Ye, X. Liu, Q. Zhang, C.-T. Che, S. Zhao. Antisweet Saponins from

Gymnema sylvestre. Journal of Natural Products, 64, 232-235 (2001).

[19] X. Liu, W. Ye, B. Yu, S. Zhao, H. Wu, C. Che. Two new flavonol

glycosides from Gymnema sylvestre and Euphorbia ebracteolata.

Carbohydrate Research, 339, 891-895 (2004).

[20] X.-M. Zhu, P. Xie, Y.-T. Di, S.-L. Peng, L.-S. Ding, M.-K. Wang. Two

new triterpenoid saponins from Gymnema sylvestre. Journal of

Integrative Plant Biology, 50, 589-592 (2008).

[21] M.-Q. Zhang, Y. Liu, S.-X. Xie, T.-H. Xu, T.-H. Liu, Y.-J. Xu, D.-M.

Xu. A new triterpenoid saponin from Gymnema sylvestre. Journal of

Asian Natural Products Research, 14, 1186-1190 (2012).

[22] A. Zarrelli, M. DellaGreca, A. Ladhari, R. Haouala, L. Previtera. New

triterpenes from Gymnema sylvestre. Helvetica Chimica Acta, 96, 1036-

1045 (2013).

[23] A. Zarrelli, A. Ladhari, R. Haouala, G. Di Fabio, L. Previtera, M.

DellaGreca. New acylated oleanane and lupane triterpenes from

Gymnema sylvestre. Helvetica Chimica Acta, 96, 2200-2206 (2013).

[24] D. Wang, G. Li, Y. Feng, S. Xu. Two new oleanane triterpene glycosides

from Gymnema inodorum. Journal of Chemical Research, 655-657

(2008).

[25] M. Atsuchi, C. Yamashita, Y. Iwasaki. EP636633A1; 1995, 15 pp.

[26] K. Yoshikawa, K. Matsuchika, S. Arihara, H.-C. Chang, J.-D. Wang.

Pregnane glycosides, gymnepregosides A-F from the roots of Gymnema

alternifolium. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 46, 1239-1243

(1998).

[27] K. Yoshikawa, K. Matsuchika, K. Takahashi, M. Tanaka, S. Arihara, H.-

C. Chang, J.-D. Wang. Pregnane glycosides, gymnepregosides G-Q from

the roots of Gymnema alternifolium. Chemical and Pharmaceutical

Bulletin, 47, 798-804 (1999).

[28] J. Tian, Q.-G. Ma, J.-B. Yang, A.-G. Wang, T.-F. Ji, Y.-G. Wang, Y.-L.

Su. Hepatoprotective Phenolic Glycosides from Gymnema tingens.

Planta Medica, 79, 761-767 (2013).

[29] S. Srisurichan, S. Puthong, S. Pornpakakul. Pregnane-type steroidal

glycosides from Gymnema griffithii Craib. Phytochemistry, 106, 197-

206 (2014).

[30] Y. Sugihara, H. Nojima, H. Matsuda, T. Murakami, M. Yoshikawa, I.

Kimura. Antihyperglycemic effects of gymnemic acid IV, a compound

derived from Gymnema sylvestre leaves in streptozotocin-diabetic mice.

Journal of Asian Natural Products Research, 2, 321-327 (2000).

[31] A. B. A. Ahmed, A. S. Rao, M. V. Rao. Role of in vivo leaf and in vitro

callus of Gymnema sylvestre in maintaining the normal levels of blood

glucose and lipid profile in diabetic Wistar rats. Biomedicine, 28, 134-

138 (2008).

[32] P. Daisy, J. Eliza, K. A. M. Mohamed Farook. A novel dihydroxy

gymnemic triacetate isolated from Gymnema sylvestre possessing

normoglycemic and hypolipidemic activity on STZ-induced diabetic rats.

Journal of Ethnopharmacology, 126, 339-344 (2009).

[33] A. B. A. Ahmed, A. S. Rao, M. V. Rao. In vitro callus and in vivo leaf

extract of Gymnema sylvestre stimulate β-cells regeneration and anti-

diabetic activity in Wistar rats. Phytomedicine, 17, 1033-1039 (2010).

[34] A. Al-Romaiyan, B. Liu, H. Asare-Anane, C. R. Maity, S. K. Chatterjee,

N. Koley, T. Biswas, A. K. Chatterji, G. C. Huang, S. A. Amiel, S. J.

Persaud, P. M. Jones. A novel Gymnema sylvestre extract stimulates

insulin secretion from human islets in vivo and in vitro. Phytotherapy

Research, 24, 1370-1376 (2010).

[35] K. Shimizu, M. Ozeki, A. Iino, S. Nakajyo, N. Urakawa, M. Atsuchi.

Structure-activity relationships of triterpenoid derivatives extracted from

Gymnema inodorum leaves on glucose absorption. The Japanese Journal

of Pharmacology, 86, 223-229 (2001).

[36] M. Atsuji, K. Hikimoto, C. Yamashita, Y. Iwasaki. JP06128161A; 1994,

7 pp.

[37] R. M. Reddy, P. B. Latha, T. Vijaya, D. S. Rao. The saponin-rich

fraction of a Gymnema sylvestre R. Br. aqueous leaf extract reduces

cafeteria and high-fat diet-induced obesity. Zeitschrift fur

Naturforschung C: Journal of Biosciences, 67, 39-46 (2012).

[38] V. Kumar, U. Bhandari, C. D. Tripathi, G. Khanna. Anti-obesity effect of

Gymnema sylvestre extract on high fat diet-induced obesity in Wistar

rats. Drug Res 63, 625-632 (2013).

[39] J. K. Malik, F. V. Manvi, B. R. Nanjware, D. K. Dwivedi, P. Purohit, S.

Chouhan. Anti-arthritic activity of leaves of Gymnema sylvestre R.Br.

leaves in rats Der Pharmacia Lettre, 336-341 (2010).

[40] J. R. Nakkala, R. Mata, E. Bhagat, S. R. Sadras. Green synthesis of silver

and gold nanoparticles from Gymnema sylvestre leaf extract: study of

antioxidant and anticancer activities. Journal of Nanoparticle Research,

17, 1-15 (2015).

[41] K. Yasukawa, S. Okuda, Y. Nobushi. Inhibitory effects of Gymnema

(Gymnema sylvestre) leaves on tumour promotion in two-stage mouse

skin carcinogenesis. Evidence-Based Complementary and Alternative

Medicine, 2014, 5 (2014).

[42] V. Gopiesh khanna, K. Kannabiran. Antimicrobial activity of saponin

fractions of the leaves of Gymnema sylvestre and Eclipta prostrata.

World Journal of Microbiology and Biotechnology, 24, 2737 (2008).

[43] J. Agric. Food. Chem., 46, 1998, 1797-1804,

[44] Phytochemistry, 53, 2000, 893-899

[45] Ulrich Meve Jonathan Alejandro Grecebio (2013), "Taxonomy of the

Asian Gymnema latifolium (Apocynaceae, Asclepiadoideae,

Marsdenieae), including lectotypification of the synonymous G.

khandalense", Willdenowia, 43, pp. 81-86.

[46] 33. Nadkarni Dr. K. M. (1996), Indian Materia medica, pp. 59

TÀI LIỆU INTERNET

[47] https://vi.wikipedia.org/wiki/Gymnema_latifolium

[48]https://www.google.com.vn/search?q=Gymnema+latifolium&rlz=1C1CH

BF_enVN747VN747&tbm=isch&tbo=u&source=univ&sa=X&ved=0ah

UKEwihtqWR_eXaAhWLyLwKHc0VBHIQsAQIKw&biw=1366&bih=

662#imgrc=PU7gIWXjLiOXrM:

Khóa luận tốt nghiệp: Nghiên cứu thành phần triterpene glycoside từ loài Thìa canh lá to (Gymnema Latifolium)

Chủ đề:

Đồ án môn Hóa học

NGUYỄN THỊ HOÀI

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN TRITERPENE GLYCOSIDE TỪ LOÀI THÌA CANH LÁ TO (GYMNEMA LATIFOLIUM)

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Hóa Hữu Cơ

NGUYỄN THỊ HOÀI

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN TRITERPENE GLYCOSIDE TỪ LOÀI THÌA CANH LÁ TO (GYMNEMA LATIFOLIUM)

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Hóa Hữu Cơ

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học

PGS. TS. Phan Văn Kiệm

Bột GL khô (4Kg)

GL (MeOH) (750g)

GL1C 580g

GL2D

GL2B 31.6 g

GL2A 20 g

GL2C 42 g

GL3C

GL6C

GL6A

GL6B 8.0 g

GL3A GL3B

GL4A

GL4B

GL4C GL4D GL4E

GL7F

GL7E

GL7B

GL7A

GL4F 500 mg

GL7C GL7D 650 mg

GL5B GL5C

GL8C

GL5A 120 mg

GL8A GL8B 100 mg

GL5A1 12.5 mg

GL8B1 16.4 mg

a,cδH (mult., J in Hz)

a,bδC

a,bδC

#δC

Tài liệu liên quan

Khóa luận tốt nghiệp: Nghiên cứu phân lập thành phần hóa học từ phân đoạn Butanol của thân cây Sài hồ nam (Pluchea pteropoda Hemsl, Asteraceae.)

Khóa luận tốt nghiệp: Tổng hợp và tách các đối quang flavanone2- (3-hydroxyphenyl) chroman-4-one và 2-(3-methoxyphenyl) chroman-4-one

Khóa luận tốt nghiệp: Khảo sát thành phần hoá học phân đoạn Me40 từ cao chiết ethanol của thân cây Trà hoà (Camellia hoaana H. T. Khuong & S. X. Yang, Theaceae)

Khóa luận tốt nghiệp đại học: Nghiên cứu và sử dụng sơ đồ tư duy trong dạy học phần hữu cơ Hóa học lớp 9

Khóa luận tốt nghiệp đại học: Vận dụng phương pháp bàn tay nặn bột trong dạy học chương 5, 6 Hóa học 8 tại trường THCS Nguyễn Du thành phố Tam Kỳ, tỉnh Quảng Nam

Khoá luận tốt nghiệp: Đồ thị trong hóa học, ứng dụng trong bồi dưỡng học sinh giỏi THCS

Khoá luận tốt nghiệp: Thiết kế và sử dụng thí nghiệm trong dạy học môn Hóa học lớp 9

Khoá luận tốt nghiệp: Phân loại và xây dựng các dạng bài tập bồi dưỡng học sinh giỏi cấp THCS môn hóa học

Khoá luận tốt nghiệp Sư phạm Hoá học: Đồ thị trong hóa học, ứng dụng trong bồi dưỡng học sinh giỏi THCS

Khóa luận tốt nghiệp: Thành phần hóa học phân đoạn phân cực của cao acetone thô từ loài địa y parmotrema tsavoense

Tài liêu mới

Đề cương đồ án tốt nghiệp: Thành lập bản đồ địa chính khu vực xã Mỹ Lạc, huyện Thủ Thừa, tỉnh Long An bằng công nghệ GNSS-RTK

Báo cáo bài tập lớn Vật lý 1: Xác định quĩ đạo của chất điểm khi có phương trình vận tốc

Bài tiểu luận: Hệ thống sản xuất aspirin từ thiết bị vỏ áo hoạt động liên tục cho ra 10kg sản phẩm mỗi giờ

Báo cáo bài tập lớn Vật lý A1: Vẽ quỹ đạo chuyển động ném xiên trong trọng trường bỏ qua lực cản và xác định một vài thông số liên quan

Báo cáo bài tập lớn Vật lý 1: Vẽ quĩ đạo của vật khi có phương trình chuyển động

Báo cáo bài tập lớn: Vẽ quỹ đạo chuyển động ném xiên trong trọng trường bỏ qua lực cản và xác định một vài thông số liên quan

Bài tập lớn: Tính toán thiết bị trao đổi nhiệt gián tiếp loại ống chùm thẳng đứng

Báo cáo bài tập lớn Vật lý A1: Vẽ quỹ đạo chuyển động ném xiên trong trọng trường bỏ qua lực cản và xác định một vài thông số liên quan

Báo cáo bài tập lớn Vật lý 1: Vẽ quĩ đạo của vật khi có phương trình chuyển động

Báo cáo bài tập lớn Vật lý 1: Xác định quỹ đạo của vật bằng hàm Mathlab

Báo cáo bài tập lớn Vật lý 1: Vẽ quỹ đạo của electron trong điện trường tĩnh

Báo cáo bài tập lớn: Vẽ quỹ đạo chuyển động ném xiên trong trọng trường bỏ qua lực cản và xác định một vài thông số liên quan

Khóa luận tốt nghiệp: Nghiên cứu sự vận chuyển phóng xạ từ đất lên thực vật

Khóa luận tốt nghiệp: Bài toán biên dirichlet cho phương trình elliptic cấp 2 dạng bảo toàn trong hình tròn đơn vị

Khóa luận tốt nghiệp: Khảo sát điều kiện tách chiết và hoạt tính sinh học của cao chiết hoa đu đủ đực (Carica papaya L.) từ methanol và acetone

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo