BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
---------------------------------
MAI NGỌC ANH
NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ
THĂM DÒ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƯ
CỦA PHỨC ION Cu2+, Zn2+, Cd2+ VỚI
SALICYLALDEHYDE-
N(4)-MORPHOLINYLTHIOSEMICARBAZONE
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
GV HƯỚNG DẪN: ThS. TRẦN BỮU ĐĂNG
Thành phố Hồ Chí Minh 9–2018
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
---------------------------------
MAI NGỌC ANH
NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ
THĂM DÒ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƯ
CỦA PHỨC ION Cu2+, Zn2+, Cd2+ VỚI
SALICYLALDEHYDE-N(4)-
MORPHOLINYLTHIOSEMICARBAZONE
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
GV HƯỚNG DẪN: ThS. TRẦN BỮU ĐĂNG
Thành phố Hồ Chí Minh 9–2018
NHẬN XÉT CỦA HỘI ĐỒNG ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ..........................................................................................................................................
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình hoàn thành khoán luận tốt nghiệp này, tôi đã nhận được nhiều
sự giúp đỡ, động viên từ gia đình, thầy cô và bạn bè.
Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy cô bộ môn Hóa Vô cơ nói
riêng và quý thầy cô khoa Hóa học nói chung. Thầy cô đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt
cho tôi những kiến thức quý báu để tôi có đủ hành trang tiến bước vào đời.
Tôi xin bày tỏ lòng tri ân sâu sắc đến thầy Trần Bữu Đăng người trực tiếp hướng dẫn,
truyền đạt rất nhiều kiến thức cần thiết, giúp đỡ tôi rất nhiều, tạo mọi điều kiện thuận
lợi nhất để tôi hoàn thành khóa luận này. Hơn thế nữa, tôi học được ở thầy đức tính tỉ
mỉ, cần cù, sáng tạo và phong cách giản dị - đó là những giá trị sống rất cao đẹp.
Và hơn hết, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè, các em khóa dưới đã tạo động lực rất
lớn cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như làm đề tài.
Trong suốt quá trình thực hiện khóa luận vẫn còn nhiều thiếu sót kính mong Quý
thầy cô nhận xét và góp ý để khóa luận được hoàn chỉnh hơn.
Một lần nữa xin gửi lời cảm ơn và lời chúc tốt đẹp nhất cho toàn thể Thầy cô và các
bạn.
Chân thành cảm ơn!
Tác giả
Mai Ngọc Anh
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là trung
thực, là kết quả nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của ThS. Trần Bữu Đăng.
Ngoài ra, trong luận văn còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của
các tác giả khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc đú ng quy đi ̣nh.
Tác giả
Mai Ngọc Anh
CÁC KÝ HIỆU VÀ VIẾT TẮT TRONG ĐỀ CƯƠNG
A549 Human alveolar epithelial cells (ung thư phổi)
COSY 2D NMR Spectroscopy (phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều proton-
13C - NMR
proton)
13C)
Carbon-13 nuclear magnetic resonance (phổ cộng hưởng từ hạt nhân
DMF Dimethylformamide
DMSO Dimethyl sulfoxide
ESI MS electrospray ionisation mass spectrometry (phổ khối lượng ion hóa bằng
dòng electron)
FT-IR Fourier transform infrared spectroscopy (phổ hấp thụ hồng ngoại)
HCT116 Human colon cancer cell line (ung thư đường ruột)
HepG2 Liver Hepatocellular carcinoma (ung thư biểu mô tế bào gan)
HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation (phổ cộng hưởng từ proton hai
1H - NMR
chiều proton-carbon, 3 nối)
Proton nuclear magnetic resonance (phổ cộng hưởng từ proton)
HuCCA-1 Human cholangiocarcinoma (ung thư đường mật của con người )
HSQC Heteronuclear Multiple Quantum Correlation (phổ cộng hưởng từ
proton hai chiều proton-carbon, 1 nối)
Nồng độ hợp chất có thể giết chết 50% tế bào IC50
NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy
UV-Vis Ultraviolet–visible spectroscopy (phổ hấp thụ electron).
s singlet (mũi đơn)
d doublet (mũi đôi)
t triplet (mũi ba)
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Các mức và khoảng biến thiên của các yếu tố ảnh hưởng ............................ 15
Bảng 2.2. Ma trận quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 1 ........................................... 16
Bảng 2.3. Ma trận quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 2 ........................................... 17
Bảng 3.1. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào xúc tác acid ................................................ 21
Bảng 3.2 : Các giá trị hằng số a trong phương trình tính các hệ số hồi quy ................. 25
Bảng 3.3 : Ma trận quy hoạch thực nghiệm kế hoạch tâm bậc 2 xoay .......................... 25
Bảng 3.4: Đánh giá thông kê các hệ số ......................................................................... 27
Bảng 3.5: Kết quả ANOVA của mô hình bậc 2 ............................................................ 28
Bảng 3.6 : Tín hiệu các dao động đặc trưng của các nhóm chức chính của HL1 ......... 28
Bảng 3.7. Đặc điểm độ chuyển dịch proton của HL1 trên NMR .................................. 30
Bảng 3.8. Một số đặc điểm cơ bản của phức chất ......................................................... 31
Bảng 3.9. Điều kiện tổng hợp phức chất ....................................................................... 32
Bảng 3.10. Giá trị m/z của pic ion phân tử và công thức phân tử dự kiến của ba phức ..... 33
Bảng 3.11. Đặc điểm các vân dao động các nhóm chức chính của phối tử và phức chất
....................................................................................................................................... 40
Bảng 3.12. Các chuyển mức chủ yếu trên phổ UV-Vis của phối tử và phức chất ........ 44
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Công thức cấu tạo chung của thiosemicarbazone ........................................... 2
Hình 1.2. Cân bằng giữa hai dạng thione và thiol trong dung dịch ................................. 3
Hình 1.3. Cấu trúc tổng quát sự chuyển dịch cân bằng thione – thiol của
thiosemicarbazone ........................................................................................................... 3
Hình 1.4. Cách phối trí thông thường của thiosemicarbazone ........................................ 4
Hình 1.5. Dạng phối trí khi tạo phức của hỗn hợp cân bằng thione và thiol trong dung
dịch .................................................................................................................................. 4
Hình 1.6. Ion kim loại phối trí với thiosemicarbazone ở N(1) ........................................ 5
Hình 1.7. Kiểu phối trí chelate vòng bốn cạnh ................................................................ 5
Hình 1.8. Khả năng phối trí khi có mặt dị tố O (a) và N (b) ........................................... 5
Hình 1.9. Dung lượng phối trí 3 của thiosemicarbazone ................................................ 6
Hình 1.10. Một số thiosemicarbazone chứa isoquinoline và pyridine ............................ 8
Hình 1.11. Một số thiosemicarbazone chứa dẫn xuất của quinoline ............................... 9
Hình 3.1. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào yếu tố tỉ lệ mol T ........................................ 21
Hình 3.2. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào nhiệt độ nước cách thủy ............................. 22
Hình 3.3. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian ...................................................... 22
Hình 3.4. Mô hình 3D của phương trình(*) Hình 3.5. Mô hình 2D của phương trình (*) . 28
Hình 3.6. Phổ IR củ a HL1 ............................................................................................. 29
Hình 3.7. Công thức cấu tạo của HL1 ........................................................................... 29
Hình 3.8. Phổ 1H-NMR của HL1 .................................................................................. 31
Hình 3.9. Phổ MS của phức ZnL1 ................................................................................. 35
Hình 3.10. Phổ MS của phức CdL1 .............................................................................. 37
Hình 3.11. Phổ MS của phức CuL1 .............................................................................. 39
Hình 3.12. Một số tương quan chính trên HMBC của CdL1 ........................................ 41
Hình 3.13. Một số tương quan chính trên HSQC của CdL1 ......................................... 42
Hình 3.14. Phổ 13C-NMR của CuL1 ............................................................................. 53
Hình 3.15. Phổ 1H-NMR của CuL1............................................................................... 54
Hình 3.16. Phổ 13C-NMR của CdL1 ............................................................................. 55
Hình 3.17. Phổ 1H-NMR của CdL1............................................................................... 56
Hình 3.18. Phổ 13C-NMR của ZnL1 .............................................................................. 57
Hình 3.19. Phổ 1H-NMR của ZnL1 ............................................................................... 58
Hình 3.20. Một số tương quan chính trên HMBC của ZnL1 ........................................ 59
Hình 3.21. Một số tương quan chính trên HMBC của CuL1 ........................................ 60
MỤC LỤC
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 2
1.1. Giới thiệu cấu trúc thiosemicarbazone (TSC) và phức chất của
thiosemicarbazone (M-TSC) .................................................................................... 2
1.1.1. Cấu tạo chung TSC ..................................................................................... 2
1.1.2. Cấu tạo chung của phức M-TSC ................................................................ 4
1.2. Một số ứng dụng của TSC và phức chất của TSC với ion kim loại............... 6
1.2.1. Các ứng dụng phổ biến ............................................................................... 6
1.2.2. Khả năng ức chế sự phát triển tế bào ung thư.......................................... 7
1.3. Định hướng nghiên cứu về phức chất của thiosemicarbazone hiện nay ....... 9
1.4. Mục tiêu nghiên cứu ......................................................................................... 11
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM .................................................................................. 12
2.1. Hóa chất và dụng cụ ......................................................................................... 12
2.2. Tổng hợp hỗn hợp Salicyaldehyde-N(4)-morpholinylthiosemicarbazone
SMT .......................................................................................................................... 13
2.2.1. Quy trình tổng hợp SMT .......................................................................... 13
2.3. Tối ưu hóa điều kiện tổng hợp SMT............................................................... 14
2.3.1. Xác định các mức cơ sở bằng phương pháp đơn biến ........................... 14
2.3.2. Mô hình bề mặt (RSM) tối ưu hóa hiệu suất tổng hợp HL1 ................. 15
2.4. Tổng hợp phức chất đồng, kẽm, cadmi .......................................................... 17
2.4.1. Tổng hợp phức chất CuL1 ........................................................................ 17
2.4.2. Tổng hợp phức chất ZnL1 ........................................................................ 18
2.4.3. Tổng hợp phức chất CdL1 ........................................................................ 18
2.5. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 19
2.5.1. Quy hoạch thực nghiệm theo phương pháp trực giao ........................... 19
2.5.3. Phương pháp nghiên cứu thành phần và cấu trúc của phối tử và phức
chất ........................................................................................................................ 19
2.5.3.2. Phổ hấp thu hồng ngoại FT- IR ........................................................ 19
2.5.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H và 13C-NMR 1D và 2D ................. 19
2.5.3.4. Phổ khối lượng ESI MS ..................................................................... 19
2.5.4. Phương pháp thăm dò hoạt tính sinh học ............................................... 20
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................. 21
3.1. Đánh giá các mức của khảo sát đơn biến ....................................................... 21
3.2. Thiết lập phương trình hồi quy ....................................................................... 23
3.3. Phân tích kết quả phổ của HL1 ...................................................................... 28
3.4.2. Xác định điều kiện tổng hợp phức chất ................................................... 31
3.4.3. Phân tích kết quả các phổ của phức CuL1, CdL1, ZnL1 ...................... 32
3.5. Phân tích kết quả phổ UV-Vis......................................................................... 44
3.6. Khảo sát hoạt tính sinh học. ............................................................................ 46
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 49
PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 53
MỞ ĐẦU
Ung thư là căn bệnh thế kỉ khi phương thuốc chữa bệnh hiệu quả rất hiếm.
Trên thế giới đã có nhiều nhà nghiên cứu khoa học đã tìm ra loại hóa dược hiệu quả nhất
trong việc ngăn chặn và tiêu diệt tế bào ung thư.
Cisplatin là hợp chất đầu tiên được sử dụng để điều trị trong các bệnh viện,
tuy nhiên cisplatin có ái lực rất lớn với các protein có chứa các ion sulfide gây vô hiệu
hóa các enzyme thiết yếu trong tế bào của cơ thể. Để cải thiện những bất cập của
cisplatin, thiosemicarbazone (TSCs) và các phức của TSCs (M-TSCs) đã được nghiên
cứu về cơ chế cũng như khả năng ngăn chặn, tiêu diệt các tế bào ung thư. Khi TSCs và
M-TSCs được tiêm vào người bệnh, các phân tử này hoạt động như các chất ức chế, có
thể tạo liên kết với DNA của tế bào ung thư bằng hệ thống liên hợp NNS, ngăn chặn sự
phiên mã và dịch mã của DNA tế bào ung thư. Nhiều báo cáo chỉ ra rằng
thiosemicarbazone thế ở N(4) có thể khuếch tán dễ dàng qua màng tế bào.
Salicylaldehyde-N(4)-nhóm thế thiosemicarbazone và phức chất của chúng
với các ion kim loại được quan tâm rất nhiều so với các hợp chất dẫn xuất của thiourea
vì chúng thể hiện các hoạt tính sinh học ưu việt như kháng virus, kháng vi khuẩn, kháng
nấm và có tiềm năng kháng ung thư, ...chính hoạt tính sinh học đa dạng của chúng đã
thu hút nhiều nghiên cứu hiện nay.
Trong xu hướng đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: Nghiên cứu tổng
hợp, xác định cấu trúc và thăm dò hoạt tính ức chế tế bào ung thư của một số phức
ion kim loại chuyển tiếp với salicylaldehyde-N(4)-morpholinylthiosemicarbazone
với mong muốn có được các chất có hoạt tính sinh học tốt.
1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu cấu trúc thiosemicarbazone (TSC) và phức chất của
thiosemicarbazone (M-TSC)
1.1.1. Cấu tạo chung TSC
Thiosemicarbazone là dẫn xuất của thiourea, được tạo thành khi ngưng tự
thiosemicarbazide hay dẫn xuất thế N(4)-aminylthiosemicarbazide với aldehyde hoặc
ketone thích hợp. Theo IUPAC, tên của dẫn xuất thế N(4) thiosemicarbazone được thành
lập bằng cách thêm “thiosemicarbazone” vào sau tên của aldehyde hay ketone tham gia
ngưng tụ và cách đánh số khung thiosemicarbazone cũng tuân theo hệ thống đánh số
quy ước cho hợp chất này. Thiosemicarbazone có công thức cấu tạo (I), và khi ở N(4)
xuất hiện nhóm thế thì nó lại có cấu tạo (II) [1].
Hình 1.1. Công thức cấu tạo chung của thiosemicarbazone
Trong đó R1, R2, R3, R4 có thể là H, ankyl, aryl, hay hệ thống vòng ….
+ Dạng đồng phân E và Z:
Sự hiện diện của C=N, làm cho thiosemicarbazone tồn tại hai dạng đồng phân
hình học E và Z. Xét tính ổn định nhiệt động lực học, dạng đồng phân E sẽ chiếm ưu
thế trong hỗn hợp. Cấu trúc xương sống của C=N-NH-CS-N thường đồng phẳng với
nguyên tử S nằm ở vị trí trans của azomethine.
+ Dạng đồng phân thione-thiol:
Sự có mặt của NH-C=S trong thiosemicarbazone có thể tạo ra hai dạng đồng
phân thione-thiol trong hỗn hợp. Trong dung dịch thiosemicarbazone tồn tại như một
hỗn hợp cân bằng của thione (III) và thiol (IV) [1].
2
Hình 1.2. Cân bằng giữa hai dạng thione và thiol trong dung dịch
Quá trình thiol hóa xảy ra là do hiệu ứng cộng hưởng trải dài trên khung sườn
thiosemicacbazone làm cho electron bất định xứ được giải tỏa mạnh trên toàn bộ hệ liên
hợp. Mặc dù dạng thione chiếm ưu thế hơn khi tồn tại trạng thái rắn ,tuy nhiên trong
dung dịch thì vẫn có thể tồn đồng thời cả hai dạng thione và thiol [1].
Cân bằng thione-thiol có thể phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong quá trình tổng hợp
thiosemicarbazone như pH của môi trường, dung môi [1].Những dung môi có tính phân
cực khác nhau cũng ảnh hưởng nhiều đến khả năng tự động chuyển dịch của thione –
thiol trong hỗn hợp [2]-[5].Nhìn chung dung môi có tính phân cực càng cao, thì khả
năng chuyển dạng cân bằng sang thione sẽ chiếm ưu thế [6].
Thione Thiol Hình 1.3. Cấu trúc tổng quát sự chuyển dịch cân bằng thione – thiol của
thiosemicarbazone
3
1.1.2. Cấu tạo chung của phức M-TSC
Trong bộ khung của thiosemicarbazone chứa 2 nguyên tử nitrogen và một
nguyên tử sunlfur là những nguyên tử còn cặp electron tự do có khả năng tham gia phối
trí với ion kim loại. Với dung lượng phối trí là 2, thiosemicarbazone đóng vai trò như
một phối tử vòng càng. Nguyên tử N(1) của nhóm azomethine và S của thione hay thiol
tham gia tạo phức vòng càng, thường xảy ra khi phối tử này tạo thành anion bằng cách
giải phóng proton của nhóm NH(2) nhờ quá trình tautomer hóa. Quá trình này tiêu tốn
nhiều năng lượng, song nó được bù đắp bởi sự hình thành thêm một liên kết và hiệu ứng
chelate. Hiệu ứng đóng vòng này giúp hệ liên hợp trải dài hơn, kết quả làm bền hóa phức
tạo thành. Do đó, trong cầu phối trí của ion kim loại chuyển tiếp, thường có sự phối trí
cơ bản sau:
Hình 1.4. Cách phối trí thông thường của thiosemicarbazone [1]
Trong dung dịch thiosemicarbazones có thể tồn tại dưới dạng hỗn hợp cân bằng tautomer
thione (I) và thiol (II). Dạng thione khi phối trí với ion kim loại tạo phức có dạng (III)
và thiol có dạng (IV) [1].
Hình 1.5. Dạng phối trí khi tạo phức của hỗn hợp cân bằng thione và thiol trong
dung dịch [1]
4
Do đó phụ thuộc vào điều kiện phản ứng (đặc biệt là pH), phức chất tạo thành có
thể là cation, trung tính hoặc anion. Tuy nhiên, các báo cáo về phức chất của ion kim
loại với thiosemicarbazone có thể tồn tại chủ yếu tồn tại ở dạng thione (III), trong khi
dữ liệu xác định về phức chất có chứa thiosemicarbazone ở dạng thiol còn thiếu, chưa
có nhiều nghiên cứu rõ rệt.
Ngoài ra, trong quá trình tạo phức thiosemicarbazone cũng có thể chỉ phối trí với ion
kim loại ở vị trí N(1) [7].
Hình 1.6. Ion kim loại phối trí với thiosemicarbazone ở N(1)
Thiosemicarbazone cũng có khả năng phối trí đồng thời tại hai vị trí N(2) và S
tạo vòng bốn cạnh, tuy nhiên trường hợp này rất ít và không phổ biến, khi aldehyde hay
ketone ở vị trí N(1) càng cồng kềnh thì khả năng tạo vòng bốn chiếm ưu thế hơn vòng
năm.[8]
Hình 1.7. Kiểu phối trí chelate vòng bốn cạnh
Tuy nhiên, dung lượng phối trí của thiosemicarbazone cũng có thể tăng lên khi
trên R1 và R2 có các nhóm thể chứa nguyên tử có khả năng cho electron (hình 1.9).
Thường xảy ra với nhóm thế -OH, những dị vòng nitrogen.
Hình 1.8. Khả năng phối trí khi có mặt dị tố O (a) và N (b)
5
Hình 1.9. Dung lượng phối trí 3 của thiosemicarbazone
1.2. Một số ứng dụng của TSC và phức chất của TSC với ion kim loại
Hiện nay thiosemicarbazone đang nhận được nhiều sự chú ý một cách rộng rãi
bởi khả năng kháng thể của nó, chống độc tố, kháng khuẩn hoặc kháng virus. Đặc biệt
rất quan tâm đến sự tương tác của nó với các ion kim loại khi xét đến hoạt tính của
thiosemicarbazone [8].
1.2.1. Các ứng dụng phổ biến
• Trong lĩnh vực hóa phân tích
Thiosemicarbazone có khả năng tạo phức màu với các ion kim loại, nên được
ứng dụng trong việc xác định vết các kim loại trong các mẫu sinh học và dược phẩm,
trong khai thác kim loại, ức chế ăn mòn, ...[9].
Trong ngành dược phẩm, khi tách các ion Cu (Il), Co (II) và Fe (ll) trong dược
phẩm có thể được xác định bằng phương pháp sắc ký cột và dung môi giải ly với 2-
acetylpyridine-4-phenyl-3-thiosemicarbazone để tạo thành phức chất như thuốc thử [10]
.
Ngoài ra một số dẫn xuất của thiosemicarbbazone như 2-acetylpyridine-4-phenyl
thiosemicarbazone, 2-acetylpyridin-4-phenylisoetyl thiosemicarbazone được dùng để
ức chế quá trình ăn mòn của nhôm trong dung dịch HCl [11].
• Hoạt tính kháng động vật đơn bào
Ở châu Phi và Mỹ Latin, những loại bệnh về nhiễm trùng đe dọa một cách nghiệm
trọng đến sức khỏe của con người như bệnh kí sinh trùng đơn bào do trùng roi
(trypanosomiasis) và trùng sốt rét (malaria) vốn là vấn đề cần giải quyết hàng đầu của
ngành y tế.
6
Đối với bệnh kí trùng đơn bào do trùng roi, những loại thuốc có sẵn, không thật
sự hiệu quả. Thuốc có hiệu quả tốt mà được sử dụng phổ biến là nifurtimox. Trong những
dẫn xuất đầy hứa hẹn được phát triển, các nhóm nghiên cứu tìm thấy thiosemicarbazone,
đặc biệt là dẫn xuất chứa nitro (NO2), và phức kim loại của chúng.
Kang và cộng sự đã đánh giá một loạt các isatin-β-thiosemicarbazone cho hoạt
động chống Herpes simplex virus loại 1 (HSV-1) và loại 2 (HSV-2). Họ đã kết luận rằng
nhóm thiourea trong thiosemicarbazone và nhóm NH trong isatin có tính quyết định cho
hoạt động chống virus của nó [12].
Họ đã kết luận rằng nhóm thiourea trong thiosemicarbazone và nhóm NH trong
isatin có tính quyết định cho hoạt động chống virus của nó. Karakucuk-iyidogan và cộng
sự [13] đã tổng hợp các phức Pd(II) và Pt(II) của thiophene-2-carboxaldehydes
thiosemicarbazone và thử nghiệm hoạt động chống virus của chúng.
Shebl và cộng sự (2010) nghiên cứu các hoạt tính kháng khuẩn của
thiosemicarbazone, semicarbazone của các phối tử thiocarbohydrazone có nguồn gốc từ
4,6-diacetylresorcinol và phức chất kim loại của chúng chống lại vi khuẩn Rhizobium
[14].
1.2.2. Khả năng ức chế sự phát triển tế bào ung thư
a. Các yếu tố ảnh hưởng hoạt tính sinh học
Thiosemicarbazone có khả năng ức chế tế bào ung thư trong cơ thể người theo
cơ chế: liên kết với các nucleotide thông qua hệ liên hợp N-N-CS, ngăn chặn quá trình
dịch mã và tổ hợp DNA của tế bào ung thư [15]-[17].
Altun và cộng sự [15] đã sử dụng phương pháp Electron-Topological Method
(ETM) để tìm ra đặc điểm quy định độc tính trong cấu trúc của thiosenicarbazone trên
dòng HSV-1. Tác giả cho rằng độc tính của thiosemicarbazone chủ yếu nằm trên nhóm
C=N(1) quy định khả năng gây độc tế bào. Khi nhóm C=N(1) bị khử thành CH-N(1)H
thì hoạt tính hoàn toàn không còn.
b. Đặc điểm nhóm thế N(4) với các dòng tế bào u
Năm 2012 nhóm tác giả Amoussatou Sakirigui và cộng sự đã kết hợp citral có
trong tinh dầu của loài cymbopogoncitratusis với thiosemicarbazide. Trong số 5 chất
được khảo sát, so với 4 hợp chất còn lại không có nhóm thế hay nhóm thế nhỏ ở N(4)
thì chỉ có citral 4-phenyl-3-thiosemicarbazone có hoạt tính đáng kể nhất (IC50= 1,96
7
μM). Đây còn là bằng chứng cho thấy sự ảnh hưởng quan trọng của nhóm thế N(4) đối
với khả năng hoạt động của thiosemicarbazone [18].
Nhóm N(4)-aminyl càng kém ưa nước thì độc tính càng cao. Theo Jonathan. R
[19] và cộng sự, hoạt tính của thiosemicarbazone phụ thuộc chủ yếu vào tính “ưa lipit”
(lipophilicity) hay còn gọi tính kị nước vì thuốc di chuyển qua màng sinh học theo cơ
chế thụ động. Theo nghiên cứu của Houssou [20] năm 2012, khi sử dụng các dẫn xuất
thiosemicarbazone để kháng lại dòng tế bào trypanosoma brucei. Hoạt tính tăng lên khi
di chuyển nguyên tử halogen (Cl hoặc Br) từ vị trí ortho đến vị trí para của vòng benzene
của acetophenone-thiosemicarbazone. Qua đó cho thấy sự có mặt của các nhóm thế kị
nước ở vị trí para là có lợi cho hoạt tính này. Việc thay thế nhóm metyl của
acetophenone-thiosemicarbazone bằng hydro đã làm giảm hoạt tính. Khi vòng phenyl
của acetophenone-thiosemicarbazone được thay thế bằng naphthyl, thì hoạt tính sẽ tăng
lên đáng kể. Theo [21], các thiosemicabazone chứa hợp phần quinoline có tính kị nước
thấp hơn các hợp phần là các dẫn xuất của benzene. Có thể sắp xếp tính kị nước của
N(4)-aminyl theo thứ tự tăng dần theo hoạt tính: 2H Năm 2010, nhóm tác giả [22] đã công bố một loạt dẫn xuất benzoyl thiosemicarbazone của isoquinoline và pyridine có khả năng chống một số dòng tế bào 1. R = OMe
2. R = H 3. R = H
4. R = Ph 5. R1 = H; R2=Ph
6. R1 = Ph; R2=H ung thư như HuCCA-1, HepG2, A549 và MOLT-3. Hình 1.10. Một số thiosemicarbazone chứa isoquinoline và pyridine Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học cho rằng hợp chất 4 khi gắn nhóm thế phenyl vào N(4) hoạt động nhất với chỉ số IC50 = 0,004 μg/ml, nhạy gấp hàng ngàn lần so với N(3), cao hơn nhiều so với 1 và 2. Nhóm nghiên cứu đã kết luận rằng hiệu ứng không gian của nhóm phenyl kị nước đóng góp quan trọng trong việc thay đổi hoạt tính của 8 loại hợp chất hữu cơ này. Mặt khác, theo [1] các dẫn xuất của thiosemicarbazone được tổng hợp từ quionline có khả năng chống lại dòng tế bào ung thư HCT116. Hình 1.11. Một số thiosemicarbazone chứa dẫn xuất của quinoline Khi nhóm thế ở vị trí N (4) ở thiosemicarbazone là aldehyde hay ketone có chứa nhân thơm thì hoạt tính sinh học cao. Nhóm thế càng cồng kềnh, chứa nhiều dị tố sẽ làm tăng hoạt tính sinh học của thiosemicarbazone [1],[23]. 1.3. Định hướng nghiên cứu về phức chất của thiosemicarbazone hiện nay Với mong muốn tạo ra những hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học cao, người ta có xu hướng sẽ chọn thiosemicarbazone có hợp phần dị vòng chứa N, do theo các tài liệu thì sự có mặt của hợp phần dị vòng có khả năng làm tăng hoạt tính của thiosemicarbazone. Mặc khác cũng mong muốn tạo ra phức chất có cấu trúc bất đối xứng để cải thiện khả năng hòa tan của chúng. Do đó chúng tôi chọn hợp phần morpholine với những tiêu chí phù hợp. Hơn nữa, các nhà nghiên cứu trên thế giới cũng rất quan tâm đến morpholine, là một amin chứa cả nhóm amin và ete và thích hợp cho khai thác, chưng cất và dung môi cho ứng dụng trong ngành công nghiệp hóa dầu [24]. Các chất dẫn xuất morpholine được sử dụng rộng rãi trong tổng hợp hữu cơ để sản xuất hoá chất nông nghiệp, thuốc diệt nấm và chất diệt khuẩn. Nhiều hợp chất thuộc nhóm này được cho là có khả năng chống viêm, giảm đau, gây tê cục bộ, chống HIV, chống ung thư, chống trầm cảm, kháng nấm và kháng khuẩn [25]. Đối với hoạt tính kháng ung thư, Bacher và cộng sự năm 2015 [26], đã công bố phức chất Cu(II) với hợp phần morpholine thiosemicarbazone. Kết quả cho thấy phức Cu(II) với hợp phần morpholine thiosemicarbazone có khả năng tan trong nước, trong khi phức Cu(II) của hợp phần piperazine- thiosemicarbazone không hòa tan trong nước được. Đó là điểm thú vị của phức Cu(II) với hợp phần morpholine thiosemicarbazone, cho phép kiểm tra độc tính hai dòng tế bào ung thư HeLa và A549 với giá trị IC50 từ 9 25,5- 65,1 μM sau 48 giờ thử nghiệm, đồng thời khi so sánh với phối tử tự do, phức chất có hoạt tính tốt hơn. Năm 2016, nhóm tác giả người Trung Quốc, nghiên cứu một loạt các hợp chất thiosemicarbazone với hợp phần morpholine, piperazine hay N-(4-methoxyphenyl)piperazine với bảy dẫn xuất methyl hydrazin-carbodithioate của 5-acetyl-2-arylamino-4-methylthiazoles dưới bức xạ vi sóng. Tất cả các hợp chất đã được kiểm tra về hoạt động gây độc tế bào của chúng trong ống nghiệm (in vitro) đối với tế bào ung thư dạ dày, phổi và ung thư vú ở người. Khi so sánh tính gây độc của tất cả các hợp chất trên, tác giả đã nhận thấy hợp phần morpholine có hoạt tính khá tốt, tùy thuộc vào các nhóm thế khác nhau. Đặc biệt với nhóm thế cloro, hoạt động kháng ung thư cao nhất với các tế bào MCF-7 với IC50 có giá trị là 5,49 μM, tương đương với cisplatin (6,53 μM) [27]. Do đặc tính tan tốt trong nước của morpholine, mà Salicylaldehyde-N(4)- morpholinylthiosemicarbazone (SMT) của chúng tôi hiện vẫn còn là đối tượng mới chưa được tổng hợp, nghiên cứu cấu trúc. Điều đó có nghĩa là phức chất Cu(II), Zn(II),Cd(II) của SMT đều là những phức chất mới cần được nghiên cứu và thăm dò hoạt tính sơ bộ trước khi đưa vào ứng dụng trong ngành y tế. Kết luận: Ở bài nghiên cứu này, Salicylaldehyde-N(4)-morpholinylthiosemicarbazone (HL1) và các phức của HL1 được điều chế và dự đoán cấu trúc bằng phổ IR, UV-Vis, MS, NMR, 1D và 2D. Trong lần nghiên cứu này một loạt thí nghiệm được thực hiện để khảo sát từng yếu tố tác động lên hiệu suất tổng hợp HL1. Hơn thế nữa, mô hình Box- Hunter được áp dụng nhằm để xác định điểm tối ưu, giảm bớt đi số thí nghiệm cần phải thực hiện cũng như cải thiện những mặt hạn chế của phương pháp đơn biến mang lại. Ngoài ra, HL1 và các phức của HL1 được khảo sát khả năng ức chế 2 dòng tế bào ung thư Hep-G2 (ung thư gan), A549 (ung thư phổi). 10 1.4. Mục tiêu nghiên cứu Với tất cả những kiến thức mà chúng tôi đã nghiên cứu và trình bày, trong nghiên cứu của đề tài này, chúng tôi tập trung vào các mục tiêu sau: bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm tâm xoay. salicylaldehyde-N(4)-morpholinylthiosemicarbazone. A549 (Tế bào ung thư phổi) của salicyaldehyde-N(4)-morpholinylthiosemicarbazone và các phức chất đã tổng hợp trên. 11 2.1. Hóa chất và dụng cụ Hóa chất Dụng cụ - Bình cầu chịu nhiệt 100 ml, 500 ml, - Carbon disulfide CS2 (d = 1,26 g/ml) (độ tinh khiết 99,5 %, Xilong, Trung Quốc) 1000 ml - Cốc thủy tinh 100 ml, 250 ml, 500 ml, - Ammonia NH3 (độ tinh khiết 99,5 %, Xilong, Trung Quốc) 1000 ml - Erlen bình tam giác - Ống đong 25 ml - Morpholine C4H9NO (độ tinh khiết 98 %, Merck, Đức) - Pipet 1 ml, 5 ml, 10 ml - Sodium chloroacetate ClCH2COONa (độ tinh khiết 98 %, Aldrich- Sigma, Mỹ) - Nhiệt kế thủy ngân - Ethanol C2H5OH (độ tinh khiết 99,5 %, Xilong, Trung Quốc) - Hydrochloride HCl đặc (độ tinh khiết 99,5 - Đũa thủy tinh %, Xilong, Trung Quốc) - Giấy lọc - Hydrazine hydrate N2H4.xH2O 50% (độ tinh khiết 99 %, Aldrich- Sigma, Mỹ) - Cân kỹ thuật - Salicylaldehyde (độ tinh khiết 98 %, Merck, Đức) - Bếp điện - Acid acetic CH3COOH (độ tinh khiết 99%, Xilong, Trung Quốc) - Máy khuấy từ, cá từ - Copper (II) nitrate tryhydrate Cu(NO3)2. 3H2O (độ tinh khiết 99,5 %, Xilong, Trung Quốc) - Hệ thống lọc chân không - Zinc (II) nitrate hexahydrate Zn(NO3)2. 6H2O (độ tinh khiết 99,5 %, Xilong, Trung Quốc) - Cadmium (II) nitrate tetrahydrate - Hệ thống sinh hàn ngược Cd(NO3)2. 4H2O (độ tinh khiết 99,5%, Xilong, Trung Quốc) 12 2.2. Tổng hợp hỗn hợp Salicyaldehyde-N(4)-morpholinylthiosemicarbazone SMT ( HL1) 2.2.1. Quy trình tổng hợp SMT Sơ đồ tổng hợp SMT qua 3 giai đoạn như sau: Giai đoạn 1: Tổng hợp Carboxymethyl-N(4)-morpholinyldithiocarbamate (CMT) Cho vào cốc 12ml CS2 (0,2 mol) và 24 ml NH3 25% được khuấy đều trên máy khuấy từ ở 0-10oC. Cho từ từ 0,2 mol morpholine (17,5 ml) vào hỗn hợp trên thật chậm từng giọt. Sau 30 phút, khi chất rắn màu vàng tách ra khỏi dung dịch, hỗn hợp được tiếp tục khuấy liên tục ở 0-100C trong 90 phút nữa để phản ứng xảy ra hoàn toàn. Lọc nhanh thu được kết tủa vàng, hòa tan kết tủa vàng trong 300 ml nước cất, khuấy trên máy khuấy từ. Sau đó, nhỏ từ từ dung dịch chứa 23,3 g ClCH2COONa đến hết. Dung dịch màu vàng nhanh chóng nhạt màu và tiếp tục được khuấy đều trong 5-6 giờ. Cho khoảng 10 ml HCl 36% vào dung dịch không màu trên tạo ngay kết tủa trắng.Lọc lấy kết tủa trắng, dịch lọc tiếp tục được axit hóa từ từ cho đến khi không còn xuất hiện kết tủa trắng thì dừng.Sản phẩm được kết tinh lại trong ethanol, lọc lấy kết tủa hình kim bằng phểu lớn, cho vào cốc để khô tự nhiên. Hiệu suất phản ứng đạt 82%. 13 Giai đoạn 2: Tổng hợp N(4)-morpholinylthiosemicarbazide (MT) Cân 22,1 g sản phẩm giai đoạn 1 hòa vào 10 ml nước cất và 25 ml N2H4.H2O cho vào bình cầu. Đun cách thủy ở 80oC khoảng 15 phút kết tủa tan tạo dung dịch đồng nhất và chuyển sang màu tím, xuất hiện kết tủa màu trắng, tiếp tục đun cách thủy thêm 45 phút nữa.Kết tinh lại sản phẩm bằng ethanol, hiệu suất phản ứng đạt 65%. Giai đoạn 3 : Quy hoạch thực nghiệm Tổng hợp Salicylaldehyde-N(4)-morpholinylthiosemicarbazone SMT (HL1) bằng cách ngưng tụ Salicylaldehyde (SAL) với N(4)-morpholinylthiosemicarbazide (MT) trong dung môi ethanol. Đun hồi lưu hỗn hợp gồm m(g) MT trong ethanol và 3 giọt acid acetic băng (hỗn hợp 1). Nhỏ từ từ V(ml) Salicylaldehyde vào hỗn hợp 1 ở nhiệt độ ToC. Sau đó, kết tủa màu vàng SMT (HL1) bắt đều xuất hiện.Các giá trị m, V, và T được khảo sát như mục 2.3 2.3. Tối ưu hóa điều kiện tổng hợp SMT 2.3.1. Xác định các mức cơ sở bằng phương pháp đơn biến - Sự ảnh hưởng của xúc tác acid đến hiệu suất: 1 mmol SA và 1 mmol MT được đun hồi lưu trong ethanol ở 900C trong vòng 2 giờ với các xúc tác acid HCl đặc, H2SO4 đặc, HNO3 đặc, CH3COOH đặc. 14 - Sự ảnh hưởng của yếu tố tỉ lệ mol SA : MT (T) lên hiệu suất: hỗn hợp SA với MT với T lần lượt là 0,8; 1,0; 1,2 và 1,5 được đun hồi lưu trong ethanol ở 900C trong vòng 2 giờ với xúc tác CH3COOH đặc. - Sự ảnh hưởng của nhiệt độ nước cách thủy (T) lên hiệu suất: 1 mmol SA và 1 mmol MT được đun hồi lưu trong ethanol lần lượt ở 60; 70; 80 và 900C trong vòng 2 giờ với xúc tác CH3COOH đặc. - Sự ảnh hưởng của yếu tố thời gian lên hiệu suất: 1 mmol SA và 1 mmol MT được đun hồi lưu trong ethanol ở 900C ở trong vòng 30, 60, 90, 120, 150 phút với xúc tác CH3COOH đặc. 2.3.2. Mô hình bề mặt (RSM) tối ưu hóa hiệu suất tổng hợp HL1 Salicylaldehyde-N(4)-morpholinylthiosemicarbazone SMT (HL1) được tổng hợp bằng cách ngưng tụ Salicylaldehyde (SAL) với N(4)-morpholinylthiosemicarbazide (MT) trong dung môi ethanol, có mặt của xúc tác acid acetic băng, chúng tôi đã chọn phương án trực giao cấp 1 và cấp 2 để mô tả bề mặt đáp ứng sự ảnh hưởng của hai biến : tỉ lệ mol tác chất và thời gian phản ứng, vì theo khảo sát theo sự ảnh hưởng theo nhiệt độ thì ở nhiệt độ 900C đã cho hiệu suất tương đối cao, ổn định và là nhiệt độ tối đa của phản ứng, nên ta bỏ qua việc tối ưu hóa nhiệt độ. Mô hình trực giao cấp 1 Gọi tỉ lệ mol SAL : MT và thời gian phản ứng lần lượt là x1 và x2. Bảng 2.1 trình bày các mức khảo sát của từng biến. Bảng 2.2 trình bày các thí nghiệm cần tiến hành N = 22 = 4 thí nghiệm theo mô hình trực giao cấp 1. Dựa trên kết quả khảo sát đơn biến, các mức của yếu tố ảnh hưởng được xác định và trình bày trong bảng 2.1 Bảng 2.1. Các mức và khoảng biến thiên của các yếu tố ảnh hưởng Các mức biến thiên Khoảng biến thiên Biến Mức dưới -1 Mức cơ sở 0 Mức trên +1 0,8 1,0 0,2 0,6 x1 120 150 30 90 x2 15 Bảng 2.2. Ma trận quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 1 % Sản phẩm y N x1x2 x0 x1 x2 +1 -1 -1 1 33 +1 +1 +1 -1 2 43 -1 +1 -1 +1 3 36 -1 +1 +1 +1 4 0 +1 Cùng với 3 thí nghiệm ở tâm phương án tâm N0 y0 x1 x2 0,8 120 1 60 0,8 120 2 58 0,8 120 3 58 Mô hình trực giao cấp 2 Cũng với các biến và mức đã chọn ở bảng 1, chúng tôi tiến hành khảo sát các thí nghiệm theo tiêu chuẩn mô hình trực giao cấp 2 như sau: + Phần cơ sở: có 2k = 22 = 4 thí nghiệm hoàn toàn giống quy hoạch trực giao cấp 1 + Phần tâm: các thí nghiệm ở tâm miền quy hoạch + Phần cánh tay đòn: là các thí nghiệm cách tâm (dạng mã hóa gốc tọa độ) một đoạn α , k là số lượng yếu tố khảo sát) ,ứng với số thí > 0 với xj = ± α ( nghiệm là 2.k = 2.2 = 4 Vậy tổng số thí nghiệm trong phương án là N = 2k + 2.k + N0 =13 Ma trận thực nghiệm cấp 2 được xây dựng theo bảng 2.3 16 2 2 Bảng 2.3. Ma trận quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 2 N y x0 x1 x2 x1x2 x1 x2 1 +1 -1 -1 +1 +1 +1 33 2 +1 +1 -1 -1 +1 +1 43 3 +1 -1 +1 -1 +1 +1 36 4 +1 +1 +1 +1 +1 +1 0 5 +1 0 0 +2 0 20 -1,414 6 +1 0 0 +2 0 0 +1,414 7 +1 0 0 0 +2 54 -1,414 8 +1 0 0 0 +2 50 +1,414 9 +1 0 0 0 0 0 60 10 +1 0 0 0 0 0 56 11 +1 0 0 0 0 0 58 12 +1 0 0 0 0 0 58 13 +1 0 0 0 0 0 58 2.4. Tổng hợp phức chất đồng, kẽm, cadmi 2.4.1. Tổng hợp phức chất CuL1 Cân 0,53g (0,002 mol) phối tử HL1, cho hoàn tan vào 30mL dung dịch ethanol. Đun ở nhiệt độ khoảng 60oC cho phối tử tan hết. Dung dịch thu được có màu vàng, sau đó hạ nhiệt độ của hỗn hợp khoảng 50oC. Cân 0,24g (0,001 mol) Cu(NO3)2.3H2O, hòa tan trong 15mL ethanol để cho muối tan hết. Dùng pipet mũi dài, nhỏ từ từ dung dịch muối vào dung dịch phối tử khi nhiệt độ dung dịch phối tử là 50oC. Đun hồi lưu hỗn hợp với máy khuấy từ trong khoảng 30 phút, kết tủa màu xanh lá xuất hiện sau 90 phút. Phức chất được để khô tự nhiên, hiệu suất phản ứng là 49%. Quá trình xảy ra được đề nghị như sau: 17 2.4.2. Tổng hợp phức chất ZnL1 Cân 0,53g (0,002 mol) phối tử HL1,cho hoàn tan vào 30mL dung dịch ethanol. Đun ở nhiệt độ khoảng 60oC cho phối tử tan hết. Dung dịch thu được có màu vàng, sau đó hạ nhiệt độ của hỗn hợp khoảng 50oC. Cân 0,30 mg (0,001 mol) Zn(NO3)2.6H2O, hòa tan trong 15mL ethanol để cho muối tan hết. Dùng pipet mũi dài, nhỏ từ từ dung dịch muối vào dung dịch phối tử khi nhiệt độ dung dịch phối tử là 50oC. Đun hồi lưu hỗn hợp với máy khuấy từ trong khoảng 30 phút, kết tủa màu trắng xuất hiện sau 90 phút. Phức chất được để khô tự nhiên, hiệu suất phản ứng là 45%. Quá trình xảy ra được đề nghị như sau: 2.4.3. Tổng hợp phức chất CdL1 Cân 0,53g (0,002 mol) phối tử HL1, cho hoàn tan vào 30mL dung dịch ethanol. Đun ở nhiệt độ khoảng 60oC cho phối tử tan hết. Dung dịch thu được có màu vàng, sau đó hạ nhiệt độ của hỗn hợp khoảng 50oC. Cân 0,31g (0,001 mol) Cd(NO3)2.4H2O, hòa tan trong 15mL ethanol để cho muối tan hết. Dùng pipet mũi dài, nhỏ từ từ dung dịch muối vào dung dịch phối tử khi nhiệt độ dung dịch phối tử là 50oC. Đun hồi lưu hỗn hợp với máy khuấy từ trong khoảng 30 phút, kết tủa màu vàng xuất hiện sau 90 phút. Phức chất được để khô tự nhiên, hiệu suất phản ứng là 59%. Quá trình xảy ra được đề nghị như sau: 18 2.5. Phương pháp nghiên cứu 2.5.1. Quy hoạch thực nghiệm theo phương pháp trực giao Tìm điều kiện tối ưu nhất để tổng hợp Salicylaldehyde-N(4)–morpholinyl thiosemicarbazone. 2.5.2. Phương pháp tổng hợp Sử dụng các phương pháp truyền thống trong tổng hợp hữu cơ và trong tổng hợp phức chất. 2.5.3. Phương pháp nghiên cứu thành phần và cấu trúc của phối tử và phức chất 2.5.3.1. Đo nhiệt độ nóng chảy Khoảng nhiệt độ nóng chảy của SMT và dự đoán sự tinh khiết của CMT, MT được xác định bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy Gallenkamp MPD -350 tại phòng thí nghiệm Hóa đại cương, khoa Hóa học, trường Đại học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh. 2.5.3.2. Phổ hấp thu hồng ngoại FT- IR Phân tích thành phần nhóm chức và sự biến đổi dao động của các nhóm chức đặc trưng trong cấu trúc của phối tử và phức chất tại Viện Công nghệ Hóa học Thành phố Hồ Chí Minh. 2.5.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H và 13C-NMR 1D và 2D Thành phẩn và cấu trúc phân tử phối tử và phức chất được xác nhận qua thông tin từ các phổ cộng hưởng từ một chiều 1H, 13C-NMR, và hai chiều COSY, HSQC, HMBC được ghi trên máy Brucker 500 MHz (trong DMSO) và HRMS trên máy FT-ICR-MS, Varian 910 tại phòng NMR, viện Hóa học, viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội. 2.5.3.4. Phổ khối lượng ESI MS Phổ khối lượng của phối tử và phức chất được xác định trên máy 1100-Series LC-MSD- Trap- SL trong dung môi methanol, bằng phương pháp ion hóa bởi dòng phun ESI, viện Hóa học, viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội. 19 2.5.4. Phương pháp thăm dò hoạt tính sinh học Thử khả năng ức chế tề bào u của phối tử và phức chất tại phòng sinh học thực nghiệm Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên -Viện Hàn lâm Khoa học Công Nghệ Việt Nam Hà Nội trên hai dòng tế bào Hep-G2, A549. 20 3.1. Đánh giá các mức của khảo sát đơn biến Các kết quả của khảo sát từng yếu tố ảnh hưởng lên hiệu suất được trình bày ở bảng 3.1 dưới đây a) Sự ảnh hưởng của xúc tác acid. Điều kiện phản ứng: tỷ lệ mol 1:1, nhiệt độ 900C, thời gian 2 giờ. HCl đặc H2SO4 đặc HNO3 đặc CH3COOH
đặc Không xúc
tác 38 17 9 49 45 Xúc tác Acid
Hiệu suất % Bảng 3.1. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào xúc tác acid Kết luận : Có thể nhìn thấy CH3COOH đặc cho hiệu quả xúc tác tốt nhất khi mà phản ứng ngưng tụ giữa SA và TM đạt hiệu suất khoảng 49%. Đối với H2SO4 đặc và HNO3 đặc lại cho kết quả hiệu suất khá thấp vì do khả năng oxi hóa mạnh, thêm vào đó, vì chúng là các acid mạnh nên ngoài việc proton hóa nguyên tử O của phân tử SA, còn proton hóa nguyên tử N của TM, dẫn đến làm giảm tính nucleophile của nhóm chức amine. 𝒔ố 𝒎𝒐𝒍 𝑺𝑨𝑳 Chính vì thế, CH3COOH đặc được chọn làm xúc tác acid cho các thí nghiệm sau. 𝒔ố 𝒎𝒐𝒍 𝑴𝑻 b) Sự ảnh hưởng của tỉ lệ mol T = Hình 3.1. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào yếu tố tỉ lệ mol T Dựa trên kết quả thu được từ hình 3.1 điểm cực đại của T=0,8, phản ứng đạt hiệu suất cao nhất, nên ta chọn tỷ lệ 0.8:1 thực hiện phản ứng khảo sát tiếp theo. 21 c) Sự ảnh hưởng của nhiệt độ nước cách thủy. Với tỉ lệ mol T = 0.8:1, xúc tác acid CH3COOH đặc, ta thấy ở 900C phản ứng
đạt hiệu suất cao nhất Hình 3.2. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào nhiệt độ nước cách thủy d) Sự ảnh hưởng của thời gian. Với tỉ lệ mol T = 0.8:1 , ở 900C , và với xúc tác acid CH3COOH đặc, ta thấy ứng với thời gian t =120 phút phản ứng đạt hiệu suất cao nhất. Hình 3.3. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian Dựa trên kết quả thu được từ bảng 3.1 và hình 3, hình 4, hình 5 Salicylaldehyde (SAL) với N(4)-morpholinylthiosemicarbazide (MT) trong dung môi ethanol, có mặt của xúc tác acid acetic băng, chúng tôi đã chọn phương án trực giao cấp 1 và cấp 2 để
22 mô tả bề mặt đáp ứng sự ảnh hưởng của hai biến : tỉ lệ mol tác chất và thời gian phản ứng, vì theo khảo sát theo sự ảnh hưởng theo nhiệt độ thì ở nhiệt độ 900C đã cho hiệu suất tương đối cao, ổn định và là nhiệt độ tối đa của phản ứng, nên ta bỏ qua việc tối ưu hóa nhiệt độ. 3.2 Thiết lập phương trình hồi quy Với số liệu thu được, chúng tôi tiến hành xử lý theo phương án trực giao cấp 1 Phương trình hồi quy theo toán học có dạng: Các hệ số hồi quy bj được tính theo công thức: ; N x2y x1x2y x0y x1y -33 33 1 33 -33 -43 -43 2 43 43 36 -36 3 36 -36 0 0 4 0 0 Từ số liệu thực nghiệm ta xác định được các giá trị b0, bi như sau: bo b1 b2 b12 28 -6,5 -10 -11,5 Để kiểm định ý nghĩa của hệ số hồi quy và sự tương thích của phương trình hồi quy với thực nghiệm phải làm thêm 3 thí nghiệm ở tâm phương án để xác định phương sai tái hiện. 0 N0 yt ( - )2 1 1,77 60 2 0,45 58 3 0,45 58 Với . Phương sai tái hiện theo công thức: với N0 là số thí nghiệm lặp ở tâm. Thay vào được kết quả = 1,335 Hệ số b trong phương trình hồi quy cấp 1 độc lập nhau và xác định với độ chính xác (Sbj) thay số vào tìm được Sbj = 0,58 23 Ý nghĩa của các hệ số b được kiểm định theo chuẩn Student (t) xác định như sau: . Kết quả thu được các giá trị tj tbo tb1 tb2 tb12 48,28 11,21 17,24 19,83 Tra bảng phân phối phân vị Student với mức ý nghĩa p = 0.05, f = N0-1 = 2 ta có = 4.3. Vậy các hệ số tj đều lớn hơn t0.05(2) nên các hệ số b của phương trình hồi quy đều có nghĩa. Phương trình hồi quy có dạng sau: y =28 – 6,5x1 -10x2 -11,5x12 Kiểm định sự tương thích của phương trình hồi quy với thực nghiệm: N x0 x1 x2 x12 ythực tế ylí thuyết (ytt –
ylt)2 1 +1 -1 -1 +1 33 33 0 2 +1 +1 -1 -1 43 43 0 3 +1 -1 +1 -1 36 36 0 4 +1 +1 +1 +1 0 0 0 Phương sai dư tính theo công thức với L là hệ số ý nghĩa Ta có: = 0 . Tiêu chuẩn Fisher: = 0 Tra bảng phân vị phân bố Fisher với p = 0,05; f1 = N-L = 3; f2 = m – 1 = 2 thấy rằng F < F0,05(3,2) = 19,2 Mô hình quy hoạch cấp 1 không phù hợp với thực nghiệm nên ta tiếp tục làm thêm các thí nghiệm theo ma trận kế hoạch thực nghiệm cấp 2. Phương pháp quy hoạch cấp 2 đã xây dựng kế hoạch thí nghiệm và xử lý số liệu dựa trên một số tiêu chí giống quy hoạch cấp 1, nhưng là mô hình hồi quy dạng đa thức bậc 2 đầy đủ mô tả sự 2. 2 + b22x2 phụ thuộc của hàm y vào các thông số ảnh hưởng x1, x2, x12. Phương trình hồi quy: 𝑦̂ = b0 + b1x1 + b2x2 + b12x1x2 + b11x1 24 Với các hệ số b được tính bằng công thức sau: Do phương án thực hiện ở đây là phương án quay bậc 2 với 2 biến (k=2), nên ứng với
đó là các giá trị a. Bảng 3.2. Các giá trị hằng số a trong phương trình tính các hệ số hồi quy k a1 a2 a3 a4 a5 a6 a7 2 0,2 0,1 0,125 0,25 0,1251 0,0187 0,1438 2 2 Bảng 3.3. Ma trận quy hoạch thực nghiệm kế hoạch tâm bậc 2 xoay N y x0 x1 x1x2 x1 x2 x2 1 +1 -1 +1 +1 -1 +1 33 2 +1 +1 -1 +1 -1 +1 43 3 +1 -1 -1 +1 +1 +1 36 4 +1 +1 +1 +1 +1 +1 0 5 +1 -1,414 0 +2 0 0 20 6 +1 +1,414 0 +2 0 0 0 7 +1 0 -1,414 0 0 +2 54 8 +1 0 +1,414 0 0 +2 50 9 +1 0 0 0 0 0 60 10 +1 0 0 0 0 0 56 11 +1 0 0 0 0 0 58 12 +1 0 0 0 0 0 58 13 +1 0 0 0 0 0 58 25 Từ các dữ kiện thực nghiệm trên suy ra các giá trị b như sau. b0 b1 b2 b11 b22 b12 58 -6,785 -5,707 -24,758 -3,742 -11,5 Phương sai tái hiện được tính theo kết quả của các thí nghiệm ở tâm bằng công thức Trong đó : * no là số thí nghiệm song song ở tâm phương án (no = 5 trong nghiên cứu này). là giá trị hiệu suất ở thí nghiệm thứ u ở tâm phương án. * * là giá trị trung bình hiệu suất trong no thí nghiệm ở tâm. . Từ đó ta tính được 2 2,0 2 = Phương sai các hệ số hồi quy được tính theo các công thức bên dưới: 𝑆𝑡ℎ
𝑁 13 Với sy = = 0,15. Do đó ta có: Kiểm định các hệ số hồi quy theo tiêu chuẩn Student: t0 t1 t2 t12 t11 t22 49,55 41,68 59,39 168,57 25,48 334,86 So sánh các giá trị tj với giá trị chuẩn số Student (mức ý nghĩa p = 0,05; f = n0-1 = 4)
thì giá trị tj > t0,05(4) = 2,78.
Do đó các hệ số b đều có ý nghĩa thống kê, phương trình hồi quy thu được có dạng: Từ mô hình bậc nhất với độ tin cậy 95%, phương trình hồi quy y =28 – 6,5x1 -10x2 - 11,5x12 Mô hình quy hoạch cấp 1 không phù hợp với thực nghiệm 26 Đối với mô hình bậc 2 với độ tin cậy 95%, phương trình hồi quy được thiết lập bởi phần mềm Modde 5.0. 13 thí nghiệm ngẫu nhiên được chọn để giảm đi sự ảnh hưởng của các yếu tố không thể kiểm soát. Trong đó, 5 thí nghiệm tại mức không được dùng để ước tính lỗi thử nghiệm. Các hệ số thống kê được trình bày trong bảng 3.4 Kết quả ANOVA mô hình bậc 2 của hiệu suất được liệt kê trong bảng 3.5 Bảng 3.4. Đánh giá thông kê các hệ số Hệ số P 58,0004 Chuẩn số
Student
2,22937 3,17054e-008 Độ tin cậy
(±)
5,27169 Hiệu
suất
x0 -6,78602 1,7626 0,00629247 4,16795 x1 2 -5,70786 1,7626 0,0142864 4,16795 x2 2 -24,7556 1,89045 3,5313e-006 4,47026 x1 -3,74927 1,89045 0,0877577 4,47026 x2 -11,5 2,49251 0,00244391 5,89393 x1*x2 Phương trình hồi quy được xây dựng như sau : (*). Từ đó cho thấy sự tương tác giữa tỉ lệ mol và thời gian phản ứng không ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp. Các hệ số bậc một và bậc hai mang giá trị âm nghĩa là việc tăng tỉ lệ mol hoặc thời gian phản ứng có thể dẫn đến việc giảm hiệu suất phản ứng. Yếu tố tỉ lệ mol có tác động lên phương trình nhiều hơn yếu tố thời gian phản ứng. Giá trị 0,969 của hệ số tương quan R2 cho thấy có thể giải thích bằng mô hình này. Hệ số tương quan adjusted R2 bằng 0,947 cho thấy tương quan tốt giữa thực nghiệm và giá trị dự đoán. Chính vì thế mô hình này phù hợp để dự đoán hiệu suất phản ứng. Độ chính xác và khả năng tin cậy được xác nhận bằng RSD (hệ số biến thiên). Giá trị RSD càng lớn cho thấy mức độ biến động, độ phân tán của lượng biến càng lớn và ngược lại. Tại lần khảo sát này giá trị RSD thu được là tương đối thấp (4,985%), cho thấy độ chính xác và tính ổn định cao, điều đó phản ánh được tính tương hợp của mô hình so với thực nghiệm. 27 Bảng 3.5. Kết quả ANOVA của mô hình bậc 2 Residual 173,953 7 24,8505 Lack of fit 165,953 3 55,3177 Pure error 8,00002 4 2 Total 26878 13 2067,54 R2 = 0,969; R2 hiệu chỉnh = 0,947; RSD = 4,985% Phần mềm Modde 5.0 cho phép phát họa mô hình bề mặt 3D và 2D của phương trình (*). Điểm tối ưu được xác định thông qua phép đạo hàm từng biến phương trình (*). Như vậy hiệu suất cực đại quá trình ngưng tụ xấp xỉ 60,23% tại tỉ lệ mol là 0,81 và thời gian là 94,38 phút. Hình 3.4. Mô hình 3D của phương trình(*) Hình 3.5. Mô hình 2D của phương trình (*) 3.3. Phân tích kết quả phổ của HL1 Chất υ
(O-H) υ
(N-H) υ
(C=N) υ
(N-N) υ
(CAr-H ) HL1 3436 3279 1617 1540 1061 υ
(C=S)
1348
và
959 Bảng 3.6. Tín hiệu các dao động đặc trưng của các nhóm chức chính của HL1
28 Phân tích phổ FT-IR của HL1 ta thấy xuất hiện hầu hết các tín hiệu của các 1 (O-H) hay mũi đơn, nhọn ở 3279 cm-1 đặc trưng cho amine bậc 2. Bên cạnh đó, các nhóm chức trong HL1 hiện trên phổ. Các tín hiệu đặc trưng như mũi vân tù ở 3436cm- tín hiệu của N-N (1021 cm-1), CAr-H (1617 cm-1) hay C=N (1540 cm-1) đều thể hiện trên phổ. Thêm vào đó, ta chỉ có thể quan sát thấy tín hiệu của C=S ở 1299 cm-1 và 891 cm-1, nhưng lại không thấy tín hiệu của S-H ở khoảng 2500 cm-1. Từ đó ta có thể kết luận rằng HL1 tồn tại chủ yếu ở dạng thioketone, không phải dạng thiol. Hình 3.6. Phổ IR củ a HL1 Kết luận: Có thể bước đầu kết luận chúng tôi đã tổng hợp thành công phối tử HL1 dựa trên kết quả phân tích phổ FT-IR như trên, với đầy đủ các nhóm chức như dự kiến. Theo như sự phân tích trên, HL1 tồn tại chủ yếu ở dạng thioketone: Hình 3.7. Công thức cấu tạo của HL1 29 Proton Độ chuyển dịch hóa học 3,68ppm, 4H, t He11, Ha11, He14, Ha14 3,92ppm, 4H, t He12, Ha12, He13, Ha13 H3 và H2 6,89-6,92ppm; 2H, t H4 7,27-7,3ppm, 1H, t H5 7,4ppm, 1H, d H7 8,48ppm, 1H, s (O-H), phenol 11,495/11,55ppm, 2H, d Bảng 3.7. Đặc điểm độ chuyển dịch proton của HL1 trên NMR Phân tích phổ 1H-NMR của HL1, ta có thể quan sát thấy 2 vùng tín hiệu rõ rệt: Vùng trường cao, HL1 chỉ có 2 tín hiệu δ lần lượt là 3,68 và 3,92 ppm với dạng mũi triplet, cường độ tương ứng 8H. Như vậy đáng lẽ vùng trường cao sẽ quan sát được tín hiệu mũi multiplet. Nhưng vì các cặp proton ở vị trí trục và vị trí xích đạo là tương đương nhau về mặt hóa học nên chỉ quan sát được mũi triplet. Nguyên nhân chính là do hợp phần này còn tồn tại một cân bằng giữa hai dạng cấu hình ghế với nhau nên các proton liên tục chuyển hóa cho nhau do đó cũng tương đương nhau về mặt hóa học,các proton bị tác động bởi hiệu ứng ghép spin-spin của 2H kề bên. Vì thế chúng tôi chỉ quan sát được 2 mũi triplet, cường độ 4H. Vùng trường thấp, như phân tích ở trên, có xuất hiện tín hiệu của H7 (HC=N), H2, H3, H4, H5 với độ chuyển dịch hóa học như trên bảng phân tích. Như vậy các proton trên HL1 theo công thức dự kiến cũng đã thể hiện đủ trên phổ 1H-NMR đã phân tích trên. 30 Hình 3.8. Phổ 1H-NMR của HL1 3.4. Phân tích kết quả của phức chất CuL1, ZnL1, CdL1 3.4.1. Một số đặc điểm của phức chất Một số tính chất hóa lý cơ bản của các phức chất đã tổng hợp được thể hiện ở bảng 3.8 Bảng 3.8. Một số đặc điểm cơ bản của phức chất Dung môi hòa tan ở nhiệt độ phòng Kí hiệu Màu sắc 1,4-dioxane CHCl3 Xanh lá Ít tan Tốt Tốt Tốt Vàng Ít tan Tốt Tốt Tốt Vàng Ít tan Tốt Tốt Tốt 3.4.2. Xác định điều kiện tổng hợp phức chất Nhiệt độ: Có vai trò quan trong trong việc xác định hiệu suất phản ứng và độ tinh khiết của phức chất. Khi tăng nhiệt độ, xu thế chuyển hóa từ dạng thiol thành thione sẽ cao hơn. Tuy nhiên khi ở nhiệt độ cao thì phức sẽ không bền và có thể xảy ra quá trình oxi hóa khử (đặc biệt với phức đồng). Như vậy, để chọn nhiệt độ thích hợp chúng tôi căn cứ vào độ bền của phối tử vào phức chất. Do vậy, chúng tôi chọn nhiệt độ thích hợp để tổng hợp các loại phức chất chủ yếu khoảng 40-50oC. Dung môi: ảnh hưởng khá lớn đến hiệu suất phản ứng, nếu dung môi hòa tan rất dễ dàng phối tử, thì sản phẩm phức chất thu được với hiệu suất rất thấp. Do đó chúng tôi lựa chọn dung môi ethanol để thực hiện phản ứng, với thể tích đủ để hòa tan phối tử và muối. 31 Thời gian: phụ thuộc vào mức độ cồng kềnh của phối tử. Khi phối tử có độ cồng kềnh lớn thì thời gian phản ứng lâu hơn thì phản ứng xảy ra gần như hoàn toàn. Tuy nhiên nếu thời gian quá lâu, có thể sẽ xảy ra phản ứng thủy phân của các phức chất. Điều này ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp và độ tinh khiết của phức chất. Vì thế, chúng tôi chọn thời gian phản ứng khoảng 2 giờ sau khi phối tử đã hòa tan trong dung môi. Tỉ lệ mol các chất tham gia phản ứng Chúng tôi luôn đảm bảo rằng lượng phối tử luôn luôn dư. Do đó chúng tôi đã cho từ từ muối vào dung dịch chứa phối tử và kết hợp với việc khuấy từ. Kết luận: Do không đó điều kiện, nên chúng tôi không thể quy hoạch thực nghiệm để tìm điều kiện tối ưu để tổng hợp phức chất với hiệu suất cao nhất. Do đó chúng tôi chỉ có thể tiến hành phản ứng trong điều kiện tương đối phù hợp với phối tử và độ bền của từng phức chất. Bảng 3.9. Điều kiện tổng hợp phức chất 2:1 50oC 2h EtOH EtOH 2:1 50oC 2h EtOH EtOH 2:1 50oC 2h EtOH EtOH 3.4.3. Phân tích kết quả các phổ của phức CuL1, CdL1, ZnL1 • Phân tích phổ ESI MS Phổ khối EIS MS là công cụ phân tích phức chất hiệu quả, trên cơ sở sẽ định lượng được tỉ lệ giữa phối tử và ion trung tâm trong phức chất tổng hợp được. Phương pháp này được đánh giá là hiệu quả bởi nguyên lý hoạt động của nó, dựa trên sự ion hóa bằng cách phóng dòng elctron có thể điều kiện được điện thế sao cho phù hợp với độ bền của mẫu phân tích. Do đó các liên kết yếu trong mẫu phân tích không bị phá hủy trong quá trình khảo sát. Kết hợp với những dữ liệu NMR, chúng tôi đề nghị công thức phân tử tương ứng được tóm tắt trong bảng 3.10. 32 Bảng 3.10. Giá trị m/z của pic ion phân tử và công thức phân tử dự kiến của ba phức Phức chất m/z Phân mảnh 266 [HL1 +H]+ ZnL1 330 ZnL1+ + 595 Zn(L1)2 + + 642 Cd(L1)2 CdL1 908 Cd(L1)3 327 Cu(L1) + CuL1 653-656 [Cu(L1)2+(OMe)2]+ Phân tích phổ ESI-MS của các phức chất ZnL1, CdL1 và CuL1. • Sơ đồ phân mảnh: ZnL1
Quan sát phổ ESI-MS của ZnL1, có thể thấy những tín hiệu với cường độ mạnh ở m/z= (595,593); (328,330) và 266. Trong đó tín hiệu ở m/z=328 đạt cường độ 100%, ứng với [ZnL1-H+]. Giả thiết chúng tôi đặt ra, cùng với thông tin thu được từ phân tích các kết quả phổ NMR, IR, HMBC, được biểu diễn dưới dạng công thức phân tử ở Bảng 3.10 trên và được kiểm chứng trong sơ đồ phân mảnh cấu trúc của ZnL1 dưới đây: 33 -L1 m/z=595 m/z=330 -Zn2+ 34 Hình 3.9 Phổ MS của phức ZnL1 35 CdL1
Quan sát phổ ESI-MS của phức chất CdL1, có thể thấy những tín hiệu với cường độ mạnh ở m/z=908; (642,643); 378; 266 và179. Trong đó, tín hiệu ở m/z=643 đạt cường độ 100% ứng với cấu trúc của [CdL1+H+]. Giả thiết chúng tôi đặt ra về cấu trúc của phức chất CdL1 và các mảnh chúng tôi đặt ra, cùng với thông tin từ sự phân tích các phổ NMR, IR, HSQC, HMBC, được biểu diễn dưới dạng công thức phân tử ở Bảng 3.10 trên và được kiểm chứng trong sơ đồ phân mảnh dưới đây: -L1 + 36 Hình 3.10. Phổ MS của phức CdL1 37 CuL1
Quan sát phổ ESI-MS của CuL1, có thể quan sát thấy các tín hiệu với cường độ mạnh ở m/z=(653,655); (327,329). Trong đó, tín hiệu ở m/z= 327 đạt cường độ 100%, ứng với cấu trúc của [CuL1]. Giả thiết chúng tôi đặt ra về cấu trúc của phức chất CuL1 và các mảnh, cùng với thông tin từ sự phân tích kết quả các phổ NMR, FT-IR, HMBC, được biểu diễn dưới dạng công thức phân tử ở Bảng 3.10 trên và được kiểm chứng trong sơ đồ phân mảnh dưới đây: m/z=327 m/z=653 38 Hình 3.11. Phổ MS của phức CuL1 39 Kết luận : Khi phân tích sơ đồ phân mảnh của các phức chất ZnL1, CdL1, CuL1, chúng tôi nhận thấy các phức chất chủ yếu phân thành các mảnh với ít phối tử hơn và giải phóng HL1. Đặc biệt, trong phổ ESI-MS của CdL1 còn có thể quan sát thấy tín hiệu của [HL1-morpholine]. • Phân tích Phổ FT-IR của các phức chất O-H C=N N-N C=S ZnL1 3439 (phenol) 1586 1078 1348 và 978 CuL1 1580 1063 1383 và 955 3449 (H2O) CdL1 3417 (phenol) 1598 1064 1347 và 945 HL1 3436 (phenol) 1572 1061 1348 và 959 Bảng 3.11. Đặc điểm các vân dao động các nhóm chức chính của phối tử và phức
chất
• Phân tích phổ 1H-NMR và 13C-NMR H-C=N O-H C-OH H-C=N C=S HL1 8,48 11,49/11,56 118,2 143,2 180,1 40 ZnL1 8,46/8,39 11,51/11,47 118,4 146,4 179,6/173,4 CuL1 - - 113,9 150,0 170,0 CdL1 8,46 11,49 118,0 150,2 179,0 Kết hợp phổ 2D ,quy kết tín hiệu phổ 2 chiều của các phức chất các phức chất Hình 3.12. Một số tương quan chính trên HMBC của CdL1 41 Hình 3.13. Một số tương quan chính trên HSQC của CdL1 42 Phần biện luận phân tích các phức chất: Sau khi phân tích các tín hiệu của phổ FT-IR của các phức chất, ta có thể nhận thấy các tín hiệu của nhóm chức trên HL1 đều xuất hiện trên các phổ của phức chất ZnL1, CuL1 và CdL1. Như thế, ta có thể khẳng định các phối tử (L1) đều được bảo toàn và tồn tại ở dạng thioketone khi tạo phức với các ion kim loại Zn2+, Cu2+, Cd2+. Để xác định HL1 đã tham gia phối trí như thế nào với các ion kim loại trong dung dịch, chúng tôi tiếp tục phân tích và so sánh sự thay đổi số sóng hấp thu của các dao động nhóm chức O-H, C=N, N-N và C=S; cũng như độ chuyển dịch hóa học của các proton và carbon của HL1 trong phân tử phức và phối tử tự do. Đối với phổ FT-IR của phức chất CuL1, ta có thể nhận thấy tín hiệu tù ở 3449 cm-1 đặc trưng cho nhóm chức O-H. Tuy nhiên, trên phổ 1H-NMR của CuL1, lại không thấy tín hiệu proton của nhóm phenol (ở khoảng 11-11,5ppm). Như vậy nhóm ArOH của phenol có thể bị phân ly trong dung dịch tạo anion phenol ArO-. Đối với các phức chất CdL1 và ZnL1, ta có thể thấy các tín hiệu của O-H (phenol) trên phổ FT-IR và 1H- NMR đều xuất hiện. Như vậy, chứng tỏ trong các phức chất CdL1 và ZnL1, nhóm chức phenol vẫn giữ nguyên mà không bị phân ly trong dung dịch tạo ion phenolate. So sánh phổ 1H NMR của phối tử và phức CdL1, ZnL1 cho thấy độ chuyển dịch hóa học của proton nhóm phenol không có sự thay đổi đáng kể (khoảng 11,50 ppm). Điều này cho thấy nhóm phenol không tham gia tạo phức với ion Cd2+ và Zn2+. Vân hấp thu dao động hóa trị C=N trên phổ IR của các phức đều có số sóng tăng so với phối tử tự do. Điều này có thể giải thích do C=N tạo liên kết với ion kim loại thông qua nguyên tử nitrogen, các orbital d trống của kim loại xen phủ với orbital sp2 có chứa cặp electron tự do của nitrogen. Tuy nhiên, cặp electron tự do mang tính chất p nhiều hơn s nên liên kết sigma trong C=N sẽ mang tính s nhiều hơn. Do đó, độ phân cực liên kết C=N giảm và làm tăng năng lượng hấp thu của nhóm chức này. Bên cạnh đó, độ dịch chuyển hóa học của proton và carbon của nhóm HC=N trên phổ NMR của CdL1 và ZnL1 có xu hướng tăng. Nguyên nhân do khi HC=N M hình thành mật độ electron xung quanh proton và carbon này giảm bởi chúng bị ion kim loại hút mạnh. Điều này có nghĩa là nguyên tử proton và carbon được giảm chắn bởi electron xung quanh do đó độ chuyển hóa học dịch chuyển về phía trường thấp. Các số liệu vừa phân tích tích cho phép chúng tôi kết luận nitrogen trong nhóm immine HC=N đã tham gia phối trí với 43 Cd2+ và Zn2+. Đối với CuL1, tín hiệu cộng hưởng H7 mất đi, độ dịch chuyển hóa học của C7 cũng dịch chuyển về phía trường thấp so với C7 của HL1. Vì vậy, chúng tôi có thể kết luận HL1 đã bị mất H7 và sử dụng C7 tham gia liên kết với Cu2+. Số sóng dao động liên kết N-N của phối tử trong phân tử phức tăng so với HL1 tự do. Điều này chứng minh rằng HL1 đã tạo phức chelate (phức vòng càng) làm cố định liên kết N-N – hay nói cách khác làm N-N khó dao động hơn khi HL1 ở trạng thái tự do. Từ đó, chúng tôi có thể suy luận nguyên tử sulfur của nhóm C=S cũng tham gia tạo phức để khép vòng chelate 5 cạnh bền với ion kim loại. Điều này được làm sáng tỏ qua sự thay đổi độ chuyển dịch hóa học carbon nhóm C=S của các phân tử phức trên phổ NMR. Kết hợp phân tích phân mảnh phổ MS phức chất tương ứng và số liệu IR, NMR của chúng, chúng tôi có thể kết luận rằng phối tử HL1 trong các phức ZnL1 và CdL1 có khối lượng phân tử vào khoảng 265 amu với dung lượng phối trí là 2 và trong phức CuL1 là 263 amu với dung lượng phối trí là 3. Kết luận: ZnL1 sẽ tồn tại dưới dạng Zn(L1)2, phù hơp với số phối trí 4 của Zn2+. CdL1 sẽ tồn tại dưới dạng Cd(L1)3, phù hợp với số phối trí 6 của Cd. CuL1 sẽ tồn tại dưới dạng Cu(L1)2, điều này cũng phù hợp với số phối trí 6 của Cu2+. HL1 đã sử dụng O, N và S tham gia tạo phức vòng chelate. 3.5. Phân tích kết quả phổ UV-Vis Bảng 3.12. Các chuyển mức chủ yếu trên phổ UV-Vis của phối tử và phức chất Mẫu Bước sóng các chuyển mức cơ bản π*←n π*←π HL1 300 ; 350 200 328 ; 383 216 ; 250 CuL1 300 ; 350 213 ZnL1 300 ; 350 217 CdL1 44 1.8 1.6 1.4 )
u 1.2 1 0.8 0.6 .
a
(
e
c
n
a
b
r
o
s
b
A 0.4 0.2 0 200 250 300 350 400 450 500 -0.2 Wavelength (nm) HL1 CuL1 ZnL1 CdL1 Việc phân tích phổ UV-Vis của phối tử và phức chất để một lần nữa khẳng định lại những nhận xét ở phổ IR. Đồng thời trên phổ UV-Vis cũng sẽ dẫn đến những đề xuất các chuyển mức electron đặc trưng cơ bản nhất của phối tử và phức chất. Trên phổ UV-Vis của phối tử và phức chất đã xuất hiện hai dãy tín hiệu. Dãy 1: có bước sóng từ 220 – 250 nm, với cường độ lớn, được quy kết là sự chuyển mức năng lượng từ π*←π Dãy 2: có bước sóng từ 320 – 350 nm, với cường độ yếu hơn dãy 1, được quy kết là sự chuyển mức năng lượng từ π*←n. Việc các vân phổ này có cường độ thấp hơn so vơi dãy 1 là do các MO-n không có cùng tính chất đối xứng với MO- π* nên xác suất chuyển dời electron trên 2 loại MO này thấp hơn sự chuyển dời electron từ MO- π lên MO- π*, nhưng năng lượng giữa MO- n và MO- π* gần nhau hơn nên dãy 2 có bước sóng dài hơn. Khi so sánh phổ UV-Vis giữa phối tử và phức chất cho thấy các giá trị λ max trong từng dãy chuyển mức các phân tử phức chất đều có sự thay đổi so với λ max của phối tử tự do. Chuyển mức π*←n của phức chất dịch chuyển về phía bước sóng dài hơn do quá trình tạo liên kết C=N→M và C=S→M đã làm giải tỏa mật độ điện tích trên các MO không liên kết. Như vậy, qua việc phân tích phổ UV-Vis của phối tử tự do và phức chất tương ứng, các chuyển mức năng lượng đặc trưng đã được chỉ ra và có thể kết luận rằng cấu trúc khung thiosemicarbazone đã được hình thành và ổn định trong quá trình tạo phức. 45 3.6. Khảo sát hoạt tính sinh học. Các thử nghiệm lên các tế bào bệnh được thực hiện theo các tác giả. [27-31] Ta thu được kết quả sau : Nhìn chung, CdL1 thể hiện hoạt tính sinh học hiệu quả nhất với tỷ lệ ức chế tế bào hơn 90% đối với các dòng tế bào ung thư gan, tỷ lệ ức chế tế bào hơn 80% đối với các dòng tế bào ung thư phổi và với giá trị IC50 < 14 µg/mL. Mẫu ký hiệu CuL1 biểu hiện hoạt tính ức chế 2 dòng tế bào ung thư gan (Hep- G2) và ung cổ tử phổi (A549) với giá trị IC50 lần lượt là 45,8 µg/mL và 43,2µg/mL. Các mẫu còn lại không biểu hiện hoạt tính ở nồng độ thử nghiệm đến 50 µg/mL. Ở đây phức chất có hoạt tính cao hơn phối tử. Kết quả cũng được chứng minh qua nhiều nghiên cứu trước. [32-35]. Bởi vì sự hình thành phức chất làm tăng độ phân cực của HL1 tạo điều kiện cho các phân tử phức có thể phân tán hiệu quả qua màng tế bào và ngăn chặn chúng khỏi tác dụng phụ trong dung dịch tế bào như thủy phân, khử hoạt tính của enzyme. [36] 46 Trong nghiên cứu lần này, chúng tôi đã đạt được những kết quả cụ thể như sau: 1.Bằng mô hình quy hoạch thực nghiệm tâm xoay Box – Hunter, HL1 được tổng hợp với hiệu suất tối ưu đạt 60,23% tại tỉ lệ mol là 0,81 và thời gian là 94,38 phút. 2. Tổng hợp và xác định cấu trúc của phối tử HL1 • HL1 tồn tại dạng thione ở dạng trạng thái rắn và khi tham gia tạo phức • Hợp phần morpholine tồn tại một sự chuyển dịch cân bằng giữa 2 cấu dạng ghế. 3. Tổng hợp và dự đoán kiểu liên kết trong ba phức chất CuL1, ZnL1, CdL1 với một trong các cấu trúc phân tử được đề nghị giả định như sau: HL1 phối trí với ion trung tâm thông qua Cacbon (N=C), nitơ (C=N) oxi (C-O) và lưu huỳnh (C=S), với dung lượng phối trí trong các phức chất ZnL1, CdL1 là 2 (thông qua Nitơ và lưu huỳnh) và CuL1 là 3 [thông qua cacbon (N=C), oxi (C-O) và lưu huỳnh (C=S)]: 47 4. Thăm dò hoạt tính sinh học của phối tử HL1 và ba phức chất trên 2 dò ng tế bào Hep-G2 (Tế bào ung thư gan), A549 (Tế bào ung thư phổi).Trong đó CdL1 và CuL1 thể hiện hoạt tính khá tốt trên 2 dòng tế bào. Nếu có điều kiện thuận lợi về thời gian, kinh phí và cơ sở vật chất, tiếp theo các kết quả và kinh nghiệm có được, chúng tôi có thể sẽ: - Nghiên cứu đơn tinh thể các HL1 bằng XRD để có cơ sở xác định chính xác cấu hình E/Z của HL1 và cis/trans-MHL. - Mở rô ̣ng thăm dò khả năng gây đô ̣c tế bào vớ i nhiều dò ng ung thư khác. - Mở rộng ứng dụng các HL và MHL trong nghiên cứu điện hóa và phân tích định lượng. 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Rapheal P.F (2006), Diversity in structural and spectral chacracteristics of some transition metal complexes derived from aldehyde based thiosemicarbazone ligands, Department of Applied Chemistry Cochin University of Science and Technology, India. [2] S. Poorhaji, M. Pordel, S. Ramezani (2016), New heterocyclic green, blue and orange dyes from indazole: Synthesis, tautomerism, alkylation studies, spectroscopic characterization [3] A.R. Hajipour, S. Ghorbani, M. Karimzadeh, S. Jajarmi, A.N. Chermahini (2016), A DFT approach for simple and solvent assisted-proton movement: Biurea as a case of study, Computational and Theoretical Chemistry 1084, pp. 67-74. [4] G. Marchand, P. Giraudeau, Z.R. Chen, M. Elhabiri, O. Siri, D. Jacquemin (2016), Understanding the tautomerism in azacalixphyrins. Physical Chemistry Chemical Physics 18, pp. 9608-9615. [5] A. Schade, K. Schreiter, T. Ruffer, H. Lang, S. Spange (2016), Interactions of Enolizable Barbiturate Dyes. Chemistry–A European Journal 22, pp. 5734-5748 [6]C. H. Gu, H. Li, R.B. Gandhi, K. Raghavan (2004) ,Grouping solvents by statistical analysis of solvent property parameters: implication to polymorph screening, International Journal of Pharmaceutics, 283, pp. 117-125. [7] Bingham, Alistair G., et al (1987), Synthetic, spectroscopic, and X-ray crystallographic studies on binuclear copper (II) complexes with a tridentate NNS- bonding 2-formylpyridine thiosemicarbazone ligand. The characterization of both neutral and deprotonated co-ordinated ligand structures, Journal of the Chemical Society, Dalton Transactions 3, pp. 493-499. [8] Giorgio Pelosi (2010), Thiosemicarbazone Metal Complexes: From Structure to Activity, The Open Crystallography Journal, 3, pp. 16-28. [9] Tarlok S. Lobana, Rekha Sharma, Gagandeep Bawa, Sonia Khanna (2009), Bonding and structure trends of thiosemicarbazone derivatives of metals—An overview, Coordination Chemistry Reviews, Vol 253, 7–8, pp. 977-1055 [10] Y. Khuhawar, Z.P. Memon, S.N. Lanjwani (1995), HPLC determination of copper(II), cobalt(II) and iron(II) in pharmaceutical preparations using 2-acetylpyridine- 49 4-phenyl-3-thiosemicarbazone derivatizing agent, Chromatographia, Vol 41,3–4, pp. 236–23741, 236. [11] P.C. Okafor, E.E. Ebenso, UJ. Ekpe (2004), Inhibition of the acid corrosion of aluminium by some derivatives of thiosemicarbazone, Bulletin of the Chemical Society of Ethiopia, 18(2), pp. 181-192. [12] Kang, Iou-Jiun, et al (2011), Isatin-β-thiosemicarbazones as potent herpes simplex virus inhibitors, Bioorganic & medicinal chemistry, pp. 1948-1952. [13] Karaküçük-İyidoğan, Ayşegül, et al (2011), Novel platinum (II) and palladium (II) complexes of thiosemicarbazones derived from 5-substitutedthiophene-2- carboxaldehydes and their antiviral and cytotoxic activities, European journal of medicinal chemistry 46.11, pp. 5616-5624. [14] Shebl, M., H. S. Seleem, and B. A. El-Shetar (2010), Ligational behavior of thiosemicarbazone, semicarbazone and thiocarbohydrazone ligands towards VO (IV), Ce (III), Th (IV) and UO 2 (VI) ions: synthesis, structural characterization and biological studies, Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy 75.1, pp. 428-436. [15] Altun, A., M. Kumru, and A. Dimoglo (2001), The role of conformational and electronic parameters of thiosemicarbazone and thiosemicarbazide derivatives for their dermal toxicity, Journal of Molecular Structure: THEOCHEM 572.1, pp. 121-134. [16] Dilworth, Jonathan R., and Rebekka Hueting (2012), Metal complexes of thiosemicarbazones for imaging and therapy, Inorganica Chimica Acta 389, pp. 3-15. [17] Liu, Mao-Chin, Tai-Shun Lin, and Alan C. Sartorelli (1995), Chemical and Biological Properties of Cytotoxic α-(N)-Heterocyclic Carboxaldehyde Thiosemicarbazones, Progress in medicinal chemistry 32, pp. 1-35. [18] Sakirigui, Amoussatou, et al (2012), Selective trypanocide activity of some substituted thiosemicarbazones of citral from benin Cymbopogon citratus essential oil and their toxicity against Artemia salina Leach, International Journal of Research and Reviews in Applied Sciences 12.3. [19]Dilworth, Jonathan R., and Rebekka Hueting (2012), Metal complexes of thiosemicarbazones for imaging and therapy, Inorganica Chimica Acta 389, pp. 3-15. 50 [20] Fatondji, Houssou Raymond, et al (2013), Structure–activity relationship study of thiosemicarbazones on an African trypanosome: Trypanosoma brucei brucei, Medicinal Chemistry Research 22.5, pp. 2151-2162. [21]Serda, Maciej, et al (2012), Investigation of the biological properties of (hetero) aromatic thiosemicarbazones, Molecules 17.11, pp.13483-13502. [22]Pingaew, Ratchanok, Supaluk Prachayasittikul, and Somsak Ruchirawat (2010), Synthesis, cytotoxic and antimalarial activities of benzoyl thiosemicarbazone analogs of isoquinoline and related compounds, Molecules 15.2, pp. 988-996. [23] Bingham, Alistair G., et al (1987), Synthetic, spectroscopic, and X-ray crystallographic studies on binuclear copper (II) complexes with a tridentate NNS- bonding 2-formylpyridine thiosemicarbazone ligand. The characterization of both neutral and deprotonated co-ordinated ligand structures, Journal of the Chemical Society, Dalton Transactions 3, pp. 493-499. [24] Makavana, Madhuresh, and Sangita Sharma (2016), Ultrasonic, optical and IR studies of binary mixtures of morpholine with some aromatic hydrocarbons at T=(303.15, 308.15 and 313.15) K, Journal of Molecular Liquids 222, pp. 535-548. [25] Ghosh, Priya, Manash J. Deka, and Anil K. Saikia (2016), Lewis acid mediated intramolecular C–O bond formation of alkanol-epoxide leading to substituted morpholine and 1, 4-oxazepane derivatives: total synthesis of (±)–Viloxazine, Tetrahedron 72.5, pp. 690-698. [26] Bacher, Felix, et al (2015), Strong effect of copper (II) coordination on antiproliferative activity of thiosemicarbazone–piperazine and thiosemicarbazone– morpholine hybrids, Dalton transactions 44.19, pp. 9071-9090. [27] Shi, Hai-Bo, et al (2016), Synthesis of 5-acetyl-2-arylamino-4-methylthiazole thiosemicarbazones under microwave irradiation and their in vitro anticancer activity, [28] lan A. Cree (ed.), Cancer Cell Culture: Methods and Protocols, Second Edition, Journal of Chemical Research 40.2, pp. 67-72. Methods in Molecular Biology, vol. 731, DOI 10.1007/978-1-61779-080-5_20, @)j [29] Mosman, T. (1983) Rapid colorimetrie assay for cellular growth and survival: Springer Science+Business Media, LLC 2011. application to proliferation and cytotoxicity assay. J. Immunol. Method., 65, 55-63. 51 [30] Xang, L„ Tu, Ủ., Zha0, Z., Cui, J, (2017) Cytotoxicity and apoptosis induced by mixed mycotoxins (T-2 and HT-2 toxin) on primary hepatocytes of broilers ¿ wiro. Toxicon. 129, 1-10 [31] Zhang, J., Ma, L., Wu, Z-F., Yu, S-L., Wang, L., Ye, W-C., Zhang, Q-W., Yin, Z- Q. (2017) Cytotoxic and apoptosis-inducing activity of C21 steroids from the roots of Cynanchum airafum. Steroid. [32] D. Kovala-Demertzi, M. A. Demertzis, J. R. Miller, C. Papadopoulou, C. Dodorou, and G. Filousis. Platinum(II) complexes with 2-acetyl pyridine thiosemicarbazone: Synthesis, crystal structure, spectral properties, antimicrobial and antitumour activity, J. Inorg. Biochem, 2001, 86 (2-3), pp. 555–563. [33] M. Jagadeesh, M. Lavanya, S. K. Kalangi, Y. Sarala, C. Ramachandraiah, and A. Varada Reddy. Spectroscopic characterization, antioxidant and antitumour studies of novel bromo substituted thiosemicarbazone and its copper(II), nickel(II) and palladium(II) complexes, Spectrochim. Acta - Part A Mol. Biomol. Spectrosc, 2015, 135, pp. 180–184. [34] M. Jagadeesh, S. K. Kalangi, L. Sivarama Krishna, and A. V. Reddy. Halo- substituted thiosemicarbazones and their copper(II), nickel(II) complexes: Detailed spectroscopic characterization and study of antitumour activity against HepG2 human hepatoblastoma cells, Spectrochim. Acta - Part A Mol. Biomol. Spectrosc, 2014, 118, pp. 552–556. [35] M. Adams, C. De Kock, P. J. Smith, K. Chibale, and G. S. Smith. Synthesis, characterization and antiplasmodial evaluation of cyclopalladated thiosemicarbazone complexes, J. Organomet. Chem, 2013, 736, pp. 19–26. [36] Jonathan R. Dilworth, Rebekka Hueting. Metal complexes of thiosemicarbazones for imaging and therapy, Inorganica Chimica Acta, 2012, 389, pp. 315. 52 PHỤ LỤC Hình 3.14. Phổ 13C-NMR của CuL1 53 Hình 3.15. Phổ 1H-NMR của CuL1 54 Hình 3.16. Phổ 13C-NMR của CdL1 55 Hình 3.17. Phổ 1H-NMR của CdL1 56 Hình 3.18. Phổ 13C-NMR của ZnL1 57 Hình 3.19. Phổ 1H-NMR của ZnL1 58 Hình 3.20. Một số tương quan chính trên HMBC của ZnL1 59 Hình 3.21. Một số tương quan chính trên HMBC của CuL1
60- Tối ưu hóa điều kiện tổng hợp salicylaldehyde-N(4)-morpholinylthiosemicarbazone
- Tổng hợp và xác định cấu trúc salicylaldehyde-N(4)-morpholinylthiosemicarbazone.
- Tổng hợp và xác định cấu trúc một số phức ion kim loại Cu2+, Zn2+, Cd2+ với
- Thăm dò khả năng gây độc tế bào u trên 2 dòng tế bào Hep-G2 (Tế bào ung thư gan),
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
đến hiệu suất
Bậc tự do
Tổng bình
phương
Bình
phương
trung bình
EtOH
DMF
CuL1
ZnL1
CdL1
Tỉ lệ mol giữa
Dung môi hòa tan
Nhiệt
Thời
phối tử và ion
Muối
Phức chất
độ
gian
HL1
trung tâm
nitrat
CuL1
ZnL1
CdL1
13C-NMR
Độ chuyển dịch hóa học carbon (ppm)
1H-NMR
Độ chuyển dịch hóa học
proton (ppm)
PHỔ UV VIS CỦA PHỐI TỬ VÀ PHỨC CHẤT
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
