TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA HÓA HỌC BỘ MÔN HÓA HỌC HỮU CƠ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC
CÂY CỎ THE
CENTIPEDA MINIMA (L).
GVHD: TS. Bùi Xuân Hào
Th.S. Dương Thúc Huy
SVTH: Vũ Thanh Hoài
MSSV: K38.201.035
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2016
LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến với thầy Bùi Xuân Hào
và thầy Dương Thúc Huy và các thầy cô trong phòng hợp chất thiên nhiên. Những
người thầy, người cô đầy tâm huyết, đã thổi vào tâm hồn em niềm đam mê nghiên
cứu khoa học và truyền dạy lại cho em những kinh nghiệm quý báu. Những bước
đầu còn gặp nhiều khó khăn, kiến thức còn chưa vững nhưng dưới sự chỉ dẫn tận
tình của các thầy cô, em đã hoàn thành tốt được công việc.
Bên cạnh đó, cũng phải kể đến sự giúp đỡ nhiệt tình của các bạn sinh viên
nghiên cứu K38 và K39 trong suốt thời gian qua. Và cuối cùng em xin gửi lời cảm
ơn đến gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh động viên, khích lệ tinh thần giúp em
i
hoàn thành tốt khóa luận.
MỤC LỤC
.i LỜI CẢM ƠN
.ii MỤC LỤC
.iii DANH MỤC CÁC CHỮ KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT
.iv DANH MỤC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU
.v DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC
.vi LỜI MỞ ĐẦU
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .............................................................................................. 1
1.1. VÀI NÉT VỀ HỌ CÚC - ASTERACEAE .......................................................... 1
1.2. CÁC CHI TRONG HỌ CÚC – ASTERACEAE ................................................. 2
1.3. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CÂY CỎ THE ............................................................ 2
1.3.1. Mô tả thực vật của cây cỏ the ....................................................................... 3
1.3.2. Công dụng của cây cỏ the ............................................................................. 3
1.4. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÓ TRONG CÂY CỎ THE ................................... 4
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 9
2.1. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ ....................................................................................... 9
2.1.1. Hóa chất ........................................................................................................ 9
2.1.2. Thiết bị .......................................................................................................... 9
2.2. NGUYÊN LIỆU VÀ ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO ......................................... 10
2.2.1. Thu hái nguyên liệu .................................................................................... 10
2.2.2. Điều chế các loại cao .................................................................................. 10
2.2.3. Cô lập các chất trong cao Ethyl acetate ...................................................... 12
2.2.4. Khảo sát phân đoạn A1 ............................................................................... 13
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 14
3.1. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT 1A ........................................................ 14
3.2. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT 1B ........................................................ 16
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................. 18
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 19
ii
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT
Ký hiệu, Tiếng Anh Tiếng Việt
chữ viết tắt 1H-NMR Proton (1) Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của
13C-NMR
Resonance proton (1)
Carbon (13) Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của
Resonance carbon (13)
HMBC Heteronuclear Multiple Bond Phổ tương tác dị hạt nhân qua
Coherence nhiều liên kết
Singlet Mũi đơn s
Doublet Mũi đôi d
Double of doublet Mũi đôi đôi dd
Double of doublet of doublet Mũi đôi đôi đôi ddd
Chemical shift Độ chuyển dịch hoá học δ
Coupling constant Hằng số ghép spin J
ppm Par per million Một phần một triệu
UV Ultra Violet Tia cực tím
AcOH Acetic acid Axit axetic
EA Ethyl Acetate Etyl acetat
C Chloroform Cloroform
H n-Hexane Hexan
Me Methanol Metanol
Bu Buthanol Butanol
W Water Nước
SKC Sắc ký cột
iii
SKLM Sắc ký lớp mỏng
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU
HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Cây cỏ the ............................................................................................... 3 Hình 1.2 Hoa cỏ the .............................................................................................. 3 Hình 3.1 Cấu trúc hợp chất 1A ........................................................................... 15 Hình 3.2 Tương quan HMBC của hợp chất 1A ................................................. 15 Hình 3.3 Cấu trúc hợp chất 1B ........................................................................... 17
SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1. Quy trình điều chế các loại cao .......................................................... 10 Sơ đồ 2.2 Quy trình sắc ký cột silica gel cao ethyl acetate ................................. 12 Sơ đồ 2.3 Quy trình sắc ký cột silica gel cao phân đoạn A1 ............................... 13
BẢNG BIỂU
iv
Bảng 2.1. Khối lượng của các loại cao và hiệu suất so với bột mẫu nguyên liệu ban đầu ................................................................................................................. Bảng 2.2 Kết quả sắc ký cột trên cao ethyl acetate (36,5 g) của cây cỏ the ....... 11 Bảng 3.1 So sánh phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất 1A và 3- methoxyquercetin .................................................................................................. 15 Bảng 3.2 So sánh phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất 1B và quercetin ................................................................................................................ 17
DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC
v
Phụ lục 1. Phổ 1H-NMR của hợp chất 1A………… Phụ lục 2. Phổ 13C-NMR của hợp chất 1A Phụ lục 3. Phổ HMBC của hợp chất 1A Phụ lục 4. Khối phổ phân giải cao của hợp chất 1B Phụ lục 5. Phổ 1H-NMR của hợp chất 1B Phụ lục 6. Phổ 13C-NMR của hợp chất 1B ……………
LỜI MỞ ĐẦU
Thiên nhiên luôn huyền bí và diệu kì, nó không những là nơi sinh sống của
mỗi con người mà còn là nguồn thực phẩm, là kho tàng thuốc vô cùng quý giá. Vì
vậy, từ ngàn xưa, con người đã biết dùng cây cỏ để làm thuốc chữa bệnh, ban đầu
chỉ là các loại thuốc đơn giản chữa trị ngoài da, mẫn ngứa, hay dùng để băng bó các
vết thương rồi phát triển lên thành các phương thuốc quý giá chữa được các bệnh
nan y. Cùng với sự phát triển của khoa học, con người đã chiết suất được nhiều hợp
chất hóa học được dùng để chữa trị nhiều căn bệnh hiểm nghèo, như hợp chất taxol
được cô lập từ cây thông đỏ, hợp chất vinblastin từ cây dừa cạn, dùng điều trị ung
thư vú ở phụ nữ. Từ đó ngành hóa học các hợp chất thiên nhiên ra đời và phát triển
mạnh mẽ, kết hợp với y dược và sinh học ngày càng cho ra đời nhiều hợp chất có
giá trị cao, nâng cao giá trị của thực vật và cuộc sống con người.
Trong y học cổ truyền Việt Nam, có rất nhiều loại cây cỏ được sử dụng làm
thuốc như: chùm ruột, cỏ sữa, cành giao, me rừng…trong đó có cây cỏ the hay còn
gọi là cóc mẳn được sử dụng rộng rãi với nhiều công dụng như: điều trị viêm mũi dị
ứng, viêm xoang, viêm họng, ung thư biểu mô...Những năm gần đây trên thế giới đã
có nhiều nghiên cứu sinh học và y dược về cỏ the và đã cô lập được một số hợp chất
có khung sườn sesquiterpen lacton có khả năng kháng khuẩn, kháng ung thư…Dựa
trên những tiền đề nghiên cứu đã có, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa
học trên cao Ethyl acetat của cây cỏ the với mong muốn đóng góp vào việc nghiên
cứu các hợp chất tự nhiên, tìm ra những hợp chất có hoạt tính sinh học góp phần
1
nâng cao giá trị của các dược thảo Việt Nam.
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. VÀI NÉT VỀ HỌ CÚC – ASTERACEAE [2]
Họ Cúc (Asteraceae) còn được gọi là họ Hướng dương hay họ Cúc tây, là một
họ thực vật có hai lá mầm. Họ Cúc là họ lớn nhất trong ngành thực vật có hoa, với
khoảng 25.000 loài, gồm 2 phân họ:
- Phân họ hoa ống (Tubuliforae hay Asteroideae): trên cụm hoa chỉ có hoa
hình ống, hoặc hoa hình ống ở giữa, hoa hình lưỡi nhỏ ở xung quanh đầu.
- Phân họ hoa lưỡi nhỏ (Liguiiflorae hay Cichorioideae): tất cả các hoa trong
cụm hoa đầu là hoa lưỡi nhỏ, không bao giờ có hoa ống. Cây có nhựa mủ.
Họ Cúc phân bố rộng khắp thế giới, nhưng phổ biến nhất là tại các khu vực ôn
đới và miền núi nhiệt đới.
Ở Việt Nam, họ Cúc có khoảng 125 chi, trên 350 loài, chủ yếu là cỏ dại, một
số được trồng làm cảnh (các loại hoa cúc), rau ăn (ngải cứu, cải cúc, rau diếp), gia
vị (cúc tần)… Họ Cúc là họ có số loài được dùng làm thuốc lớn nhất trong giới thực
vật. Có khoảng 51 loài của họ Cúc được dùng làm thuốc, trong đó có 18 loài được
dùng trong công nghiệp dược như các loài: atisô, bạch truật, cỏ nhọ nồi, cỏ ngọt,
cúc hoa, cúc tần, hồng hoa, hy thiêm, ké đầu ngựa, khoản đông hoa, mần tưới, mộc
hương, ngải cứu, ngưu bàng, sài đất, thương truật, thanh hao hoa vàng, tử uyển...
• Một số đặc điểm thực vật của họ Cúc:
Thân cỏ hay bụi, sống một năm hay nhiều năm, ít khi là dây leo hay cây gỗ.
Rễ có thể phù lên thành củ, nhưng chất dự trữ ở đây không phải là tinh bột mà
là inulin (ví dụ như cây thược dược).
Lá có hình dạng biến thiên, không có lá kèm, thường mọc đối hoặc tụ thành
hình hoa ở gốc, có những loại lá có gai. Thông thường phiến lá nguyên, xẻ sâu, hình
dạng lá kép hình lông chim.
Cụm hoa: đầu, có thể mang nhiều hoa hay ít hoa. Đầu có thể đứng riêng lẻ hay
2
tụ thành chùm, gié, xim, nhưng thông thường nhất là tụ thành ngù.
Hoa: lưỡng tính, mẫu năm, bầu dưới, không có lá bắc con. Các hoa trên một
đầu có thể giống nhau, có cùng cách cấu tạo, cùng chức năng.
Bao hoa: lá đài thường giảm vì nhiệm vụ bảo vệ đã được đảm nhiệm bởi các lá
bắc của tổng bao. Đài có thể biến mất, đôi khi chỉ còn một gờ nhỏ, nguyên hay có
thùy, gờ có thể mang những vẩy hoặc một vòng lông tơ. Sau khi thụ tinh, đài có thể
phát triển thành một mào lông, có thể láng hay có gai, có nhiệm vụ trong sự phát tán
của quả.
Bộ nhị: năm nhị bằng nhau, đính trên ống tràng và xen kẽ với cánh hoa. Bao
phấn mở dọc, hướng trong, dính nhau thành một ống bao quanh vòi.
Bộ nhụy: hai lá noãn ở vị trí trước và sau, tạo thành bầu dưới một ô, đựng một
noãn, đính đáy. Đĩa mật ở trên bầu. Ở hoa lưỡng tính và hoa cái, vòi xuyên qua đĩa
mật và chia thành hai nhánh đầu nhụy. Các nhánh đầu nhụy mang ở mặt dưới những
lông để quét hạt phấn khi vòi mọc xuyên qua ống cấu tạo bởi các bao phấn. Sự thụ
phấn nhờ côn trùng.
Quả bế, thường mang một mào lông do đài biến đổi, có khi mào lông được
mang bởi một cuống dài hay ngắn. Đôi khi quả trần hoặc có móc hay có gai. Hạt
không có nội nhũ, lá mầm to, nhiều khi chứa đầy dầu.
1.2. CÁC CHI TRONG HỌ CÚC
Ở Việt Nam, họ Cúc có khoảng 125 chi, trong đó có một số chi tiêu biểu,
thường gặp như chi Gerbera, chi Helianthus L, chi Cynara. Cây cỏ the là một loài
thuộc chi Centipeda.
1.3. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CÂY CỎ THE[3]
Cây cỏ the thuộc họ Cúc, chi Centipeda.
Tên khoa học: Centipeda minima (L).
Tên thông thường: nga bất thực thảo, địa hồ tiêu, cầu tử thảo, cóc mẳn, cúc
mẩn, thạch hồ tuy.[3]
1.3.1 Mô tả thực vật cây cỏ the
Cỏ the là loại cỏ mềm, mọc bò lan trên mặt đất ẩm, thân rất nhiều cành, ở
3
ngọn có lông mịn trắng, nhưng toàn thân trông nhẵn bóng. Lá đơn, mọc so le, hình
ba lá cạnh, đầu tù, phía cuống hẹp lại, mép có một, hai hoặc ba răng cưa. Lá dài
khoảng 10-18 mm, rộng khoảng 6-10 mm, gân chính hơi nổi ở mặt dưới lá, gân phụ
không rõ, không có cuống. Cụm hoa hình đầu mọc ở nách lá, hoa cái gồm nhiều
lớp, cánh hoa hình ống màu trắng, trên có răng cưa. Tràng hoa hình chuông, có bốn
răng, hình trứng rộng, màu hơi tím. Quả bế bốn cạnh, trên cạnh có lông mịn nhỏ.
Mùa ra hoa khoảng tháng 2 - 5, mùa quả khoảng tháng 4 - 7.
Để dùng làm thuốc, thường hái toàn cây, gồm cả rễ, dùng tươi hay phơi hoặc
sấy khô. Cây mọc hoang khắp nơi ở vùng đồng ruộng ẩm thấp, ruộng bỏ hoang, bờ
rãnh, ven đường…
Hình 1.1. Cây cỏ the Hình 1.2. Hoa cỏ the
1.3.2. Công dụng của cây cỏ the
Cây cỏ the có vị cay, mùi hắc, tính ấm, có tác dụng tiêu thũng, tiêu viêm, tiêu
sưng, giải độc. Cỏ the còn được dùng làm thuốc chữa ho, viêm phế quản, mắt đau
đỏ sưng, chảy nước dãi, đau màng mộng mắt, viêm mũi dị ứng, hay dùng ngoài để chữa bệnh mẫn ngứa (eczema), trị rắn cắn, đắp bó gãy xương.[2]
Phần thân, lá và hoa của cây cỏ the còn được sử dụng phổ biến trong các bài
thuốc dân gian. Ví dụ như trong các bài thuốc dân gian của Trung Quốc, cây cỏ the
4
được dùng để chữa bệnh đau đầu, cảm lạnh, viêm kết mạc và bệnh sốt rét. Ở Đài
Loan, cỏ the được nấu lấy nước để tắm cho trẻ em bị bệnh ghẻ lở, hay uống để trị các bệnh về hệ tiêu hóa.[9]
• Một số bài thuốc dân gian sử dụng cây cỏ the:
Chữa mẩn ngứa (eczema): cỏ the hai phần, đậu xanh một phần, muối vài hạt.
Cả ba thứ giã nhỏ đắp lên nơi bị mẩn ngứa đã được rửa sạch.
Chữa ho: cỏ the khô 20 g hoặc tươi 30 g, nước 500 ml sắc còn 100 ml chia ba
lần uống trong ngày.
Chữa viêm mũi, nghẹt mũi: dùng cỏ the, hoa mộc lan (mỗi vị 6 g), ké đầu
ngựa (10 g), sắc lấy nước uống. Nếu dùng ngoài, nghiền cỏ the, tế tân và bạch chỉ
rồi đặt mỗi lần một ít vào trong mũi.
1.4 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÓ TRONG CÂY CỎ THE
Năm 1989, Dipti Gupta và J Singh công bố bốn triterpenoid saponin từ cây cỏ
the là acid lα,3β,19α,23-tetrahydroxyurs-12-en-28-oic-28-O-β-d-xylopyranosid (1),
acid lβ,2α,3β,19α,23-pentahydroxyurs-12-en-28-oic-28-O-β-d-xylopyranosid (2),
3α,2lα,22α,28-tetrahydroxyolean-l2-en-28-O-β-d-xylopyranosid (3),
3α,l6α,2lα,22α,28-pentahydroxyolean-l2-en-3-O-β-d-xylopyranosyl-28-O-β-d- xylopyranosid (4).[4]
Năm 1990, cũng Dipti Gupta và Singh J đã nghiên cứu và tìm ra một số chất
trong cây cỏ the, gồm: tetratriacontanyl nonadecanoat (5), sitosterol (6), 3,3′,5,5′-
tetramethoxy stilben (7), 2-isopropyl-5-methylhydroquinon-4-O-β-d-xylopyranosid
(8), acid 2α,3β,23,19α-tetrahydroxyurs-12-en-28-oic-28-O-β-d-xylopyranosid (9),
(10),
3α,21β,22α,28-tetrahydroxyolean-12-en-28-O-β-d-xylopyranosid 3β,16α,2lβ,22α,28-pentahydroxyolean-12-en-28-O-β-d-xylopyranosid (11).[5]
Năm 1998, Taylor và Towers đã cô lập được ba sesquiterpen lacton có hoạt
tính kháng khuẩn là 6-O-methylacrylylplenolin (12), 6-O-isobutyroylplenolin (13), 6-O-angeloylplenolin (14).[6]
Năm 2007, Liang và cộng sự đã cô lập được được các sesquiterpen lacton là
4,5 β-dihydroxy-2β-(isobutyryloxy)-10β H-guai-11(13)-en-12,8β-olid (15), 4-
5
hydroxy-1βH-guaia-9,11(13)-dien-12,8α-olid (16), 2β-(isobutyryloxy)florilenalin (17), pulchellin-2α-O-tiglat (18), florilenalin-2α-O-tiglat (19).[4]
Năm 2012, Peng Wu và các cộng sự đã cô lập được các chất sau: 4-oxo-2β-
hydroxy-6α-angeloyloxy-pesudoguaia-8β,12-olid 4-oxo-2β-ethoxy-6α- (20),
angeloyloxy-pesudoguaia-8β, 12-olid -angeloyloxy- (21), 4,6α-dihydroxy-2α
pesudoguaia-11(13)-en-8α,12-olid (22), 4-hydroxy-2α-angeloyloxy-pesudoguaia-
11(13)-en-8α,12-olid (23), 4,5-epoxy-2α-angeloyloxy-guaia-11(13)-en-8β,12-olid
(24), 4,5-epoxy-2α-isobutyryloxy-guaia-11(13)-en-8β,12-olid (25), plenolin (26),
OH
OH
O
OH
OH
O
H
H
HO
OH
O
O
OH
O
O
HO
H
HO HOH2C
HOH2C
HO OH
HO OH
arnicolid D (27), pulchellin-2a-O-isovalerat (28), florilenalin-2a-O-isovalerat (29), florilenalin-2a-O-isobutyrat (30), florilenalin-2a-O-angelat (31) và helenalin (32).[8]
(1)
(2)
OH
OH
OH
O
O
H
H
OH
OH
O
O
HO
O
O
OH
OH
OH
OH OH
(3)
(4)
HO OH
6
Me
Me
HO
HO
O O
OH
Me
(6)
(7)
HO OH
OH
O
OMe
C
MeO
O
HO
O
OH
OMe
HO HOH2C
MeO
HO OH
(8)
(9)
OH
OH
OH
O
OH O
OH
HO
O
OH
O
OH
HO
(10)
(11)
HO OH
HO OH
7
H
H
H
H
H
H
O
O
O
O
O
O
O
O
O
H
H
HO
O
O
O
O
O
(13)
(12)
(14)
O
HO
H
HO
O
O
O
O
O
O
H
HO
HO
H
HO
(17)
OH (15)
(16)
O
O
HO
O
H
O
O
O
O
H
H
HO
HO
(18)
(19)
O
HO
O
H
H
H
H
HO
H
O
O
O
O
O
O
H
H
O
O
O
O
HO
H OH
O
O
(20)
(21)
(22)
O
O
O
HO
HO
HO
H
H
H
O
O
O
O
O
O
H
H
H
O
O
HO
(23)
(24)
(25)
8
O
H
H
H
H
O
O
HO
H
O
O
O
H
O
O
O
H OH
O
O
HO
(26)
H (28)
(27)
O
O
HO
HO
H
H
O
O
O
O
H
H
HO
HO
(29)
(30)
O
H
HO
H
H
O
O
O
O
H
HO
O
(31)
H OH (32)
9
CHƯƠNG 2
THỰC NGHIỆM
2.1 HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ.
2.1.1 Hoá chất
• Silica gel 0,04-0,06 mm, Himedia dùng cho cột sắc kí.
254
(20×20), Merck. • Sắc kí bảng mỏng loại Kieselgel 60F
• Dung môi dùng cho quá trình thực nghiệm gồm: hexane, etyl acetat, acid
acetic, chloroform, acetone, methanol, ethanol, butanol và nước cất.
• Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên bảng mỏng: sử dụng dung dịch
H2SO4 20% hoặc vanillin/H2SO4.
2.1.2 Thiết bị
• Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu.
• Các cột sắc kí.
• Máy cô quay ở áp suất thấp.
• Bếp cách thuỷ.
• Đèn soi UV: bước sóng 254 nm.
• Cân điện tử.
• Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ghi trên máy Bruker Avance III 500 [500 MHz (1H) và 125 MHz (13C)] với TMS là chất nội chuẩn, CD3OD, DMSO-d6 là
dung môi. Phổ được ghi tại phòng thí nghiệm Phân tích Trung tâm, trường
Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh, số 227, Nguyễn Văn
Cừ, Quận 5, thành phố Hồ Chí Minh.
2.2. NGUYÊN LIỆU VÀ ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO
2.2.1 Thu hái nguyên liệu
Cây cỏ the được thu hái ở tỉnh Vĩnh Long vào tháng 07 năm 2013. Cây tươi được rửa sạch và để khô tự nhiên trong mát. Sau đó, sấy khô ở 50 – 60oC và được
10
xay nghiền thành bột mịn thu được 3,2 kg bột thô.
2.2.2 Điều chế các loại cao
Đun hoàn lưu 3,2 kg bột thô với dung môi methanol (3 lần x 3 giờ), lọc nóng,
cô quay ở áp suất thấp, thu hồi dung môi được cao methanol. Chiết phân bố lỏng -
lỏng cao methanol lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: eter dầu hỏa,
ethyl acetate và n-butanol. Cô quay các dịch chiết, thu được các loại cao tương ứng:
cao eter dầu hỏa (320,2 gam), cao ethyl acetate (36,5 gam), cao butanol (13,6 gam).
Quy trình điều chế các loại cao được trình bày trong sơ đồ 2.1. Hiệu suất điều
11
chế các loại cao được trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Khối lượng của các loại cao và hiệu suất so với bột mẫu nguyên
liệu ban đầu
Bột cây cỏ the (3,20 kg)
Loại cao Khối lượng (g) Hiệu suất (%)
Methanol 412,5 12,89
Eter dầu hỏa 320,2 10,01
Ethyl acetate 36,5 1,14
Butanol 13,6 0,43
2.2.3 Cô lập các chất trong cao Ethyl acetate
Thực hiện sắc ký cột silica gel trên cao ethyl acetate, hệ dung môi giải ly n-
hexane – ethyl acetate với độ phân cực tăng dần từ hệ hexane – ethyl acetate 9:1;
8:2... (tỷ lệ thể tích) đến ethyl acetate – methanol 1:1. Sau khi cô quay thu hồi dung
môi thu được năm phân đoạn tương ứng, được ký hiệu từ A1 đến A9. Toàn bộ quá
trình được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng, với thuốc thử hiện hình là Vanilin, dung
dịch acid sulfuric 20% (phun đều lên bản mỏng silica gel và sấy nóng), hoặc phát
hiện vết bằng đèn UV. Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate được trình bày trong
bảng 2.2.
Bảng 2.2. Kết quả sắc ký cột trên cao ethyl acetate (36,5 g) của cây cỏ the
Hệ dung Ký hiệu phân doạn Khối lượng (g) STT môi giải ly
12
H-EA (9:1) H-EA (8:2) H-EA (7:3) H-EA (1:1) EA MeOH 1 2 3 4 5 6 A0 A1 A2 A3 A4 A5 1,45 8,60 12,50 7,04 0,96 1,36
2.2.4 Khảo sát phân đoạn A1
Thực hiện sắc ký cột phân đoạn A1 (8,60 g) trên silica gel pha thường, hệ
dung môi giải ly chloroform-methanol, với độ phân cực tăng dần, dựa trên kết quả
sắc ký bản mỏng, gộp được năm phân đoạn và kí hiệu: CT-I, CT-II, CT-III, CT-IV
và CT-V.
Phân đoạn CT-IV (1,38 g) được chạy sắc ký cột trên silica gel pha thường
với hệ dung môi chloroform-methanol có độ phân cực tăng dần (sơ đồ 2.3) thu được
5 phân đoạn phụ. Dựa trên kết quả sắc ký lớp mỏng, phân đoạn CT-IV được chọn
để tách chất.
Thực hiện sắc ký cột nhiều lần phân đoạn CT-IV (1,38 g) với hệ dung môi
giải ly thích hợp, kết hợp với sắc ký lớp mỏng pha đảo điều chế (MeOH-H2O 1:1),
đã cô lập được hai hợp chất, ký hiệu 1A; 1B.
Sơ đồ 2.3. Quy trình sắc ký cột silica gel phân đoạn A1
SKC silica gel, CHCl3:MeOH
C-M (8:2)
C-M (9:1)
C-M (98:2)
C-M (19:1)
C-M (99:1)
Phân đoạn A1 (8,60g)
13
CT-II (0,82 g) CT-V (1,49 g) CT-I (2,56 g) CT-III (1,79 g) CT-IV (1,38 g)
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT 1A
Hợp chất 1A thu được được từ phân đoạn A1 của cao ethyl acetate với các
đặc điểm như sau:
Chất bột vô định hình màu vàng nhạt.
Hiện hình vết màu vàng khi soi UV, vết màu vàng với dung dịch H2SO4
20%, sấy nóng.
Phổ 1H-NMR (DMSO- d6): Phụ lục 1. Phổ 13C-NMR (DMSO-d6): Phụ lục 2. Phổ HMBC (DMSO-d6): Phụ lục 3
Biện luận cấu trúc
Phổ 1H-NMR của hợp chất 1A cho thấy có sự hiện diện của năm proton nhân
thơm trong khoảng 6-8 ppm, trong đó proton nhân thơm ở δH 6,18 (1H; d; J 2,0; H-
6) ghép cặp meta với proton ở δH 6,39 (1H; d; J 2,0; H-8) xác nhận hợp chất có
vòng benzene với bốn nhóm thế; proton nhân thơm ở δH 7,44 (1H; dd; J 8,0; 2,5; H-
6′) ghép cặp ortho với proton nhân thơm ở δH 6,90 (1H; d; J 8,5; H-5′) và ghép cặp
meta với proton nhân thơm ở δH 7,54 (1H; d; J 2,0; H-2′) chứng tỏ ba proton này ở các vị trí 1,2,4 trên nhân thơm B. Ngoài ra, phổ 1H-NMR còn cho thấy sự hiện diện
của một proton nhóm hydroxyl kiềm nối tại δH 12,7 và proton của nhóm methoxyl
tại δH 3,77.
Phổ 13C-NMR của hợp chất 1A cho thấy có sự hiện diện của mười sáu carbon,
trong đó carbon carbonyl cộng hưởng tại δC 177,4 (C-4), năm carbon methine thơm
cộng hưởng tại δC 115,3 (C-2’); δC 115,7 (C-5’); 120,5 (C-6’); 98,6 (C-6); 93,6 (C-
8).
Ngoài ra, phổ 13C-NMR còn cho thấy sự hiện diện của tín hiệu Csp3 gắn
14
oxygen cộng hưởng tại δC 59,6.
Các dữ liệu phổ trên xác nhận hợp chất 1A có khung sườn flavonol.
Phổ HMBC cho thấy proton của nhóm methoxyl (OCH3) tương quan với
carbon δC 137,6 xác nhận nhóm OCH3 gắn với carbon tại δC 137,6 (C-3).
Khi so sánh dữ liệu phổ hợp chất 1A với 3-methoxyquercetin đã công bố nhận
thấy có sự tương đồng, vì vậy hợp chất 1A có cấu trúc của hợp chất 3-
OH
OH 3'
OH
2'
4'
OH
3'
4'
methoxyquercetin. Hợp chất 1A lần đầu tiên được tìm thấy trong cây cỏ the.
B
2'
1'
8
5'
1'
HO
O
5'
9
6'
O
HO
7
8
2
6'
2
A
7
9
10
3
10
6
6
3
4
5
4
5
OCH3
OCH3
OH
O
OH
O
Hình 3.2 Tương quan HMBC của hợp Hình 3.1 Cấu trúc hợp chất 1A
chất 1A.
Bảng 3.1 So sánh phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất 1A và
3-methoxyquecetin[17]
Hợp chất 1A 1H - NMR (DMSO) δH (ppm) J (Hz) 6,18 (d; J 2,0) 6,39 (d; J 2,0) 7,54 (d; J 2,0) 6,90 (d; J 8,5) 7,44 (dd; J 8,0; 2,5) 3,77 (s)
3-Methoxyquercetin 13C - NMR (C) δC 157,8 139,2 179,4 163,2 99,3 164,7 94,3 156,3 105,8 122,1 115,7 145,2 149,0 116,2 123,0 59,63
13C - NMR (DMSO) δC 155,5 137,6 177,8 161,2 98,6 164, 93,6 156,3 104,0 120,7 115,3 145,2 148,7 115,7 120,5
2 3 4 5 6 7 8 9 10 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′ OCH3
15
3.2. KHẢO SÁT CẤU TRÚC 1B
Hợp chất 1B thu được được từ phân đoạn A1 của cao ethyl acetate với các
đặc điểm như sau:
Chất bột vô định hình màu vàng nhạt.
Hiện hình vết màu vàng khi soi UV.
Khối phổ phân giải cao: Phụ lục 4. Phổ 13C-NMR (CD3OD): Phụ lục 5 Phổ 1H-NMR (CD3OD): Phụ lục 6.
Phổ 1H-NMR của hợp chất 1B cho thấy có sự hiện diện của năm proton nhân
thơm trong khoảng 6-8 ppm, trong đó proton nhân thơm ở δH 6,23 (1H; d; J 2,0; H-
6) ghép cặp meta với proton ở δH 6,43 (1H; d; J 2,0; H-8) xác nhận hợp chất có
vòng benzene với bốn nhóm thế; proton nhân thơm ở δH 7,68 (1H; dd; J 8,5; 2,5; H-
6′) ghép cặp ortho với proton nhân thơm ở δH 6,93 (1H; d; J 8,5; H-5′) và ghép cặp
meta với proton nhân thơm ở δH 7,78 (1H; d; J 2,0; H-2′) chứng tỏ ba proton này ở
các vị trí 1,2,4 trên nhân thơm B.
Phổ 13C-NMR cho thấy tín hiệu cộng hưởng của mười lăm carbon, trong đó
carbon carbonyl cộng hưởng tại δC 177,4 (C-4), có năm carbon methine thơm cộng
hưởng tại δC 116,2 (C-2’); δC 116,4 (C-5’); 121,8 (C-6’); 99,4 (C-6); 4,6 (C-8).
Khi so sánh dữ liệu phổ hợp chất 1B với quercetin đã công bố nhận thấy có sự
tương đồng, vì vậy hợp chất 1B có cấu trúc của hợp chất quercetin.
OH
3'
OH
2'
4'
8
1'
5'
HO
O
2
7
9
6'
10
3
6
4
OH
5
O
OH
.
16
Hình 3.3: Cấu trúc hợp chất 1B
Bảng 3.2 So sánh phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất 1B và quercetin
Hợp chất 1B Quercetin
1H - NMR (CD3OD) δH (ppm); J (Hz) 6,23(d; 2,0) 6,43 (d; 2,0) 7,78 (d; 2,0) 6,93 (d; 8,5) 7,68 (dd; 8,5; 2,5)
1H – NMR (CD3OD) δH (ppm); J (Hz) 6,27 6,47 7,82 6,97 7,72
Hợp chất 1B Quercetin 13C - NMR 13C - NMR (CD3OD) (CD3OD) δC δC 148,0 148,4 137,2 137,2 177,3 177,4 162,5 162,4 99,3 99,4 165,3 165,6 94,4 94,6 158,2 158,3 104,5 104,7 124,2 124,2 116,0 116,2 148,8 148,8 146,2 146,2 116,2 116,4 121,7 121,8
2 3 4 5 6 7 8 9 10 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′
17
CHƯƠNG 4.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Từ mẫu cây cỏ the thu hái được ở huyện Long Hồ, tỉnh Vĩnh Long, chúng tôi
đã khảo sát thành phần hoá học trong cao etyl acetate của cây cỏ the. Bằng kỹ thuật
sắc ký cột trên silica gel pha thường, sắc ký bản mỏng, chúng tôi đã cô lập được 2
OH
OH
OH
OH
2'
2'
3'
3'
4'
4'
1'
8
8
1'
5'
HO
O
5'
2
9
O
HO
2
9
7
6'
7
6'
10
10
3
3
6
6
5
5
4
4
OH
OCH3
O
OH
O
OH
hợp chất: 1A (3-methoxyquercetin) và 1B (quercetin).
(1A)
(1B)
Cấu trúc của các hợp chất trên được xác định dựa vào các phương pháp phổ nghiệm hiện đại như 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC.
Hướng nghiên cứu tiếp theo của chúng tôi là tiến hành thăm dò hoạt tính sinh
học các hợp chất đã cô lập được và tiếp tục khảo sát các phân đoạn cao còn lại, góp
18
phần làm sáng tỏ thành phần hóa học và nâng cao giá trị sử dụng của cây cỏ the.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
[1] Phan Văn Cư (2010), “Phân lập flavonoid từ cao butanol trong cây diếp cá
(Houttuynia cordata thumb) ở tỉnh Thừa Thiên Huế”,Tạp chí khoa học, Đại
học Huế, 63,Trang 30-30.
[2] Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2007), Thực vật học, NXB Y học Hà Nội, Hà
Nội, Trang 319-322.
[3] Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học Hà
Nội, Hà Nội, Trang 931- 933.
[4] Nguyễn Kim Phi Phụng (2005), Phổ NMR sử dụng trong Hóa Phân Tích
Hữu Cơ, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TP, Hồ Chí Minh.
[5] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất Hữu Cơ, Nhà
xuất bản Đại học Quốc Gia TP, Hồ Chí Minh.
[6] Trần Ngọc Hoàng (2011), Khảo sát thành phần hóa học lá cây An Điền Cửu
Long Hedyotis uncinella Hook.F họ Cà phê (Rubiaceae), Luận văn thạc sĩ
Khoa học Hóa học, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học Quốc
Gia TP.HCM, Trang 51-54.
Tiếng Anh
[7] David Vargas, Xorge a Dominguez, Karim,p marcos gijtierrez, hostettmann
(1988), “Orditerpenes and Norditerpene glycosides from Drymarla
Areivarloldes”, Phytochemistry, 27(5), pp. 1532-1534.
jie-kai Cheng, e. Roeder(1993), [8] Dong-liang Cheng, Xiao-ping Cao,
“Diterpene glycosides from Seneclo Rufus”, Phyrochemistry, 32(1), pp.
151-153.
Dipti Gupta and Singh J (1989), “Triterpenoid Saponins from [9]
Centipeda minima”, Phytochemistry, 28(4), pp. 1197-1201.
Dipti Gupta and Singh J (1990), “Triterpenoid Saponins from [10]
19
Centipeda minima”, Phytochemistry, 29(6), pp. 1945-1950.
[11] Liang H.x, Fukai Bao, Xiaoping Dong, Huajie Zhu, Xiaojia Lu, Ming Shi,
Quing Lu and Yongxian Cheng (2007), “Two New Sesquiterpenoids from
Centipeda minima”, Chemistry and Biodiversity, 4, pp. 2810-2816.
[12] Peng Wua, Miao-Xian Su, Ying Wang, Guo-Cai Wang, Wen-Cai Ye, Hau-
Yin Chung, Juan Li, Ren-Wang Jiang, Yao-Lan Li (2012), “Supercritical
fluid extraction assisted isolation of sesquiterpene lactones with
antiproliferative effects from Centipeda minima”, Phytochemistry, 76, pp.
133–140.
[13] Robin S. L Taylor and G. H. Neil Towers (1998), “Antibacterial constituents
of the nepalese medicinal Herb, Centipeda minima”, Phytochemistry, 47(4),
pp. 631-634.
[14] Surjani Soetardjo, Jong Poh Chan, Ahmad Mohamad Noor, Yoga Latha
Lachimanan and Sasidharan Sreenivasan (2007), “Chemical Composition
and Biological Activity of the Centipeda minima (Asteracea)”, Mal J Nutr,
13(1), pp. 81-87.
[15] Torgils Fossen, Atle T. Pedersen and Oyvind M. Anderse (1998),
“Flavonoids from Red Onion (Allium Cepa)”, Phytochemistry, 47(2), pp.
281-285.
[16] D. K. Obatomi, P. H. Bach, (1998), “Biochemistry and Toxicology of the
Diterpenoid Glycoside Atractyloside”, Food and Chemical Toxicology, 36,
20
pp. 335-346.
PHỤ LỤC
21
1A-DMSO-1H
5 7 7 . 3
6 7 1 . 6
0 8 1 . 6
0 9 3 . 6
4 9 3 . 6
1 9 8 . 6
8 0 9 . 6
0 3 4 . 7
5 3 4 . 7
7 4 4 . 7
8 9 6 . 2 1
3 4 5 . 7
9 3 5 . 7
1 5 4 . 7
3 4 5 . 7
9 3 5 . 7
1 5 4 . 7
7 4 4 . 7
5 3 4 . 7
0 3 4 . 7
8 0 9 . 6
1 9 8 . 6
4 9 3 . 6
0 9 3 . 6
0 8 1 . 6
6 7 1 . 6
H-2'
H-6
H-8
H-5'
H-6'
8 8 . 0
2 1 . 1
2 1 . 1
2 1 . 1
2 1 . 1
7.4
7.0
6.2
7.6
6.6
6.4
6.0
5.6
8.6
8.4
8.2
8.0
7.8
6.8
5.8
7.2 f1 (ppm)
.
.
.
.
.
.
2 1 1
2 1 1
2 1 1
8 8 0
2 1 1
0 0 1
17
14
12
11
7
4
2
1
-1
16
15
13
10
6
5
3
0
18
9 8 f1 (ppm)
22
PHỤ LỤC 1: PHỔ 1H-NMR CỦA HỢP CHẤT 1A
3 4 5 . 5 5 1
9 4 7 . 8 4 1
1 5 2 . 5 4 1
5 2 6 . 7 3 1
9 5 7 . 0 2 1
3 5 5 . 0 2 1
1 4 7 . 5 1 1
9 6 3 . 5 1 1
7 3 6 . 9 5
1A-DMSO-13C 4 6 0 . 4 0 1
8 9 5 . 8 9
9 9 5 . 3 9
7 3 8 . 7 7 1
3 0 4 . 4 6 1
9 4 2 . 1 6 1
0 4 3 . 6 5 1
7 3 8 . 7 7 1
3 0 4 . 4 6 1
9 4 2 . 1 6 1
0 4 3 . 6 5 1
3 4 5 . 5 5 1
9 4 7 . 8 4 1
1 5 2 . 5 4 1
5 2 6 . 7 3 1
9 5 7 . 0 2 1
3 5 5 . 0 2 1
1 4 7 . 5 1 1
9 6 3 . 5 1 1
4 6 0 . 4 0 1
8 9 5 . 8 9
9 9 5 . 3 9
6'
5'2'
8
4' 3'
6
4
10
7 5
1'
92
3
125
120
115
100
95
90
110
85
190
170
150
140
130
180
105 f1 (ppm)
160 f1 (ppm)
6' 5'2'
8
6
10
1'
230
220
210
200
190
170
160
150
140
130
120
110
90
70
60
50
40
30
20
10
0
-10
-20
-30
180
80
100 f1 (ppm)
23
PHỤ LỤC 2: PHỔ 13C-NMR CỦA HỢP CHẤT 1A
1A-DMSO-HMBC
70
80
90
100
110
)
120
m p p ( 1 f
130
140
150
160
170
180
3.5
4.0
11.5
11.0
10.5
10.0
9.5
9.0
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
8.5
8.0
7.5 f2 (ppm)
24
PHỤ LỤC 3: PHỔ HMBC CỦA HỢP CHẤT 1A
25
PHỤ LỤC 4: KHỐI PHỔ PHÂN GIẢI CAO CỦA HỢP CHẤT 1B
OH
3'
OH
2'
4'
8
1'
5'
HO
O
2
7
9
6'
10
3
6
4
OH
5
O
OH
26
PHỤ LỤC 6: PHỔ 13C-NMR CỦA HỢP CHẤT 1B
OH
3'
OH
2'
4'
8
1'
5'
O
HO
2
7
9
6'
10
3
6
4
OH
5
OH
O
27
PHỤ LỤC 5: PHỔ 1H-NMR CỦA HỢP CHẤT 1B
