BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
CỬ NHÂN HÓA HỌC
KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CAO ETHYL ACETATE CỦA LÁ CÂY BÌNH BÁT NƯỚC ANNONA GLABRA L
Chuyên ngành : HÓA HỮU CƠ
TP HỒ CHÍ MINH - 2012
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
CỬ NHÂN HÓA HỌC
KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CAO ETHYL ACETATE CỦA LÁ CÂY BÌNH BÁT NƯỚC ANNONA GLABRA L
Chuyên ngành : HÓA HỮU CƠ
Hướng dẫn khoa học : TS. LÊ TIẾN DŨNG
Sinh viên thực hiện : ĐÀO THỊ NGỌC ÁNH
TP HỒ CHÍ MINH - 2012
MỤC LỤC
LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 5
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................................... 6 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHI ANNONA [1,4,5] ............................................................... 6
1.1.1 Đặc điểm thực vật ....................................................................................... 6
1.1.2. Thành phần hóa học các cây thuộc chi Annona .......................................... 6
1.1.3. Công dụng và dược tính ............................................................................ 13
1.2. CÂY BÌNH BÁT NƯỚC ................................................................................. 13 1.2.1 Mô tả thực vật [1, 5] ..................................................................................... 14
1.2.2. Thành phần hóa học .................................................................................. 15
Bảng 1.1 Mười hai hợp chất được nhóm tác giả Fang-Rong Chang phân lập ...... 15
1.2.2. Công dụng và dược tính ............................................................................ 27 1.3. SƠ LƯỢC VỀ HOẠT TÍNH KHÁNG OXI HÓA[34,35,36] ............................... 27
Chương 2. PHẦN THỰC NGHIỆM ............................................................................. 29
2.1 . THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT.............................. 29
2.1.1. Thiết bị .......................................................................................................... 29
2.1.2. Dụng cụ ........................................................................................................ 29
2.1.3. Hóa chất ....................................................................................................... 29
2.1.4. Nguyên liệu .................................................................................................. 30
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................... 30
2.2.1. Phương pháp phân lập các chất. .................................................................. 30
2.2.1. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất hóa học. ................................ 30
2.2.2. Phương pháp thử hoạt tính kháng oxy hóa .................................................. 30
2.3. THỰC NGHIỆM. ............................................................................................... 32
2.3.1. Điều chế cao thô .......................................................................................... 32
2.3.2 Cô lập và tinh chế các hợp chất ..................................................................... 33
2.3.3 Sơ đồ phân lập hợp chất. ................................................................................ 35
2.4 Hằng số vật lý và các số liệu phổ nghiệm. ....................................................... 35
2.4.1 Hợp chất AGAΙ ......................................................................................... 36
2.4.2 Hợp chất AGAΙΙ ........................................................................................ 37
2.5. Phân tích hoạt tính kháng oxi hóa. ..................................................................... 37
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 39
3.1. KẾT QUẢ CHUNG ........................................................................................... 39
3.2. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA HỢP CHẤT AGAΙ .......................................... 39
3.3. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA HỢP CHẤT AGAΙΙ ......................................... 43
3.4. HOẠT TÍNH KHÁNG OXI HÓA CỦA AGA I ............................................... 46
Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................... 48
4.1 . KẾT LUẬN ........................................................................................................ 48
4.2. KIẾN NGHỊ ....................................................................................................... 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 49
LỜI MỞ ĐẦU
----------
Ngày nay, cùng với sự phát triển vượt bậc của khoa học kỹ thuật, ngành hóa học
đóng vai trò rất quan trọng trong sự phát triển của xã hội. Các nhà khoa học, bằng
nhiều con đường khác nhau đã tạo ra những sản phẩm có ứng dụng trong các lĩnh vực
như : y học, dược học, sinh học, nông nghiệp…Những sản phẩm được tạo ra bằng
cách tổng hợp tuy có kết quả tốt nhưng lại gây ra nhiều tác dụng phụ cho con người và
môi trường. Do đó, hóa học các hợp chất thiên nhiên ngày càng được quan tâm hơn.
Các nhà hóa học đã tiến hành tách chiết, cô lập, bán tổng hợp ngày càng nhiều các hợp
chất có hoạt tính sinh học để tạo ra các sản phẩm hữu ích từ cây cỏ thiên nhiên để nâng
cao chất lượng cuộc sống.
Trên thế giới, chi Annona được nghiên cứu nhiều về thành phần hóa học cũng
như hoạt tính sinh học. Cho đến nay, có khoảng 430 công trình khoa học công bố về
thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi Annona. Chi Annona
chứa nhiều hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học hấp dẫn như các nhóm chất :
diterpenoid, alkaloid, acetogenin, sesquiterpenoid…Tuy nhiên, các cây thuộc chi
Annona ít được nghiên cứu và áp dụng vào thực tế ở Việt Nam.
Cây bình bát nước ( Annona glabra ) là một loại cây được phân bố rộng rãi ở
nước ta. Đây là loài cây rất dễ sống, có sự phát tán và sinh sôi nảy nở rất dễ dàng. Với
những hoạt tính sinh học hấp dẫn như: chống ung thư, cản trở quá trình nhân bản của
tế bào HIV, kháng kí sinh trùng…Với những ưu điểm này thì đây quả là một nguồn
dược liệu quý giá.
Nhưng những nghiên cứu về Annona glabra ở nước ta còn ít, vì thế chúng tôi
tiến hành khảo sát thành phần hóa học cao etylacetat của lá cây bình bát ở nước ta.
Mục tiêu cô lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất flavonoid và hoạt tính của
chúng trong lá cây ( được thu hái ở quận 8, Bình Chánh TP. Hồ Chí Minh). Hy vọng
rằng kết quả nghiên cứu sẽ mang lại nhiều hiểu biết mới về mặt hóa thực vật của cây
bình bát nhằm làm tăng giá trị ứng dụng của cây vào trong cuộc sống.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHI ANNONA [1,4,5]
1.1.1 Đặc điểm thực vật
Chi Annona thuộc họ Na – Annonaceae Juss gồm khoảng 15 loài. Chúng thuộc
cây gỗ nhỏ hay cây bụi . Lá dai như da. Hoa lưỡng tính, ở ngoài nách lá đối diện với lá
hoặc trên cành già. Lá đài 3, xếp van; cánh hoa 3 hoặc 6; nhị nhiều; lá noãn nhiều, lúc
đầu rời nhau, khi thành quả thì dính nhau tạo thành một khối nạc. Hạt đen, vỏ hạt nhẵn
bóng. Mọc hoang ở châu Mỹ và châu Phi.
Ở Việt Nam, có 4 loài mà 3 loài là cây trồng :
Annona glabra L ( cây bình bát nước) : có vỏ nhẵn.
Annona muricata L ( cây mẵng cầu xiêm) : có vỏ quả phủ gai ngắn.
Annona squamosa L ( cây na ) : có vỏ quả gồm những vẩy nhỏ xếp xít nhau.
Annona reticulate L ( cây bình bát) : có vỏ quả xếp sát nhau như các mắt của môt
mạng lưới.
1.1.2. Thành phần hóa học các cây thuộc chi Annona
Trên thế giới, cho đến nay có khoảng hơn 430 công trình khoa học công bố về
thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi Annona. Thành phần
chủ yếu trong chi Annona thuộc nhóm chất : diterpenoid, alkaloid, acetogenin,
sesquiterpenoid…
1.1.2.1. Annona muricata L[27]
Năm 1994, Zhou Yang Ren, Wu Shu Jun đã phân lập được 3 hợp chất từ hạt của loài
OH
OH
O
O
OH
OH
O
Annona muricata là howiicin A (1), howiicin B (2) và 4-deoxyhowiicin B (3).
Howiicin A (1)
OH
O
O
OH
OH
O
20
15
O
O
OH
OH
O
Howiicin B (2)
4-Deoxyhowiicin B (3)
Năm 1995, Ming Li chao, Tan Ning hua đã phân lập một cyclopeptidemới từ hạt của loài A. muricata là annomuricatin A (4).[20]
Annomuricatin A (4)
Năm 2000, Li De Yu, Jing Guang Yu, Xiu Zhen Luo, Lan Sun, Shi Lin Yang đã phân
O
OH
OH
O
(CH2)4
H3C(H2C)12
OH
OH
lập được 3 hợp chất là muricatenol (5), murihexol (6) và donhexocin (7) từ hạt của Annona muricata L.[14]
Muricatenol (5)
O
OH
OH
OH
OH
O
32
16
20
10
4
15
A 19
H3C(H2C)10
(CH2)5
35
OH
OH
Murihexol: A=erythro (6) Donhexocin: A=threo (7)
Năm 2002, Liaw Chih-Chuang, Fang-Rong Chang, Chih-Yuan Lin, Chi-Jung Chou,
Hui-Fen Chiu, Ming-Jung Wu, và Yang-Chang Wu, đã phân lập được một số hợp chất
OH
O
O
O
OH
OH
O
thuộc nhóm acetogenins từ hạt của loài Annona muricata L. và có độc tính tế bào là annonacinone (8), muricin A (9), muricin H (10), muricin I (11), annocatalin (12).[12]
O
4
H
O
OH
O
OH
H
26
HO
OH
Annonacinone (8)
O
H
O
O
OH
H
24
HO
OH
Muricin A (9)
Muricin H (10)
O
H
O
O
OH
H
HO
OH
O
H
O
OH
O
OH
H
HO
OH
Muricin I (11)
Annocatalin (12).
1.1.2.2. Annona squamosa L
OH
O
15
16
2
1
O
O
35
36
19
37
20
O
24
28
23
34
OH
OH
Năm 1998, Fujimoto Yoshinori và cộng sự đã phân lập được một acetogenin mới có độc tính tế bào từ hạt của loài Anona squamosa là squamocin (13).[9]
Squamocin (13)
Năm 2004, Hiroshi và cộng sự đã phân lập được hợp chất squamostatin–A (14) từ hạt của loàiAnnona squamosa L.[10]
O
OH
OH
OH
OH
O
1
12
15
O
2
34
19
28
24
O
35
Squamostatin–A (14)
Năm 2006, Intaranongpai Junya đã phân lập được một số hợp chất thuộc nhóm
tetrahydrofuran acetogenins từ loài Annona squamosa L. là squamocin O1 (15),
squamocin O2 (16), squamocin F (17), samoquasine A (18), và một số hợp chất
acetogenin mạch thẳng là annonin IV (19), annonin VIII (20), annonin XIV (21),
OR'
O
15
16
2
1
O
R2
O
R1
35
36
19
37
20
O
24
28
23
34
OR'
OR'
annonin XVI (22); acide béo là palmitic acide(23), stearic acide(24), lignoceric acide(25), oleic acide(26) và linolic acide(27).[11]
Squamocin O1 (15): R1 = OH, R2=R'=H
OH
O
O
O
OH
O
OH
Squamocin O2 (16): R1 = R'= H, R2=OH
N
NH
O
Squamocin F (17)
OH
OH
O
O
(CH2)9CH3
OH
O
O
H3C
Samoquasine A (18)
OH
OH
O
O
(CH2)9CH3
OH
O
O
H3C
Annonin IV (19)
OH
OH
O
O
(CH2)9CH3
OH
O
O
H3C
Annonin VIII (20)
OH
OH
O
O
(CH2)9CH3
OH
O
O
H3C
Annonin XIV (21)
O
OH
Annonin XVI (22)
O
OH
Palmitic acide(23)
O
OH
Stearic acide(24)
Lignoceric acide(25)
O
OH
O
HO
Oleic acide(26)
Linolic acide(27)
Năm 2009, Rakesh Ranjan và Mahendra Sahai đã phân lập 3 hợp chất
H3CO
H3CO
H3CO
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
HOH2C
O
H3CO
CH2OH
HO
CH2OH
HO
OCH3
OCH3
OCH3
OH
Coumarinolignan từ hạt của loài Annona squamosa là cleomiscosin A (28), cleomiscosin B (29) và cleomiscosin C (30).[22]
Cleomiscosin A (28) Cleomiscosin B (29) Cleomiscosin C (30)
O
NH
O
Năm 2009, Magadula Joseph J., Ester Innocent and Joseph N. Otieno đã phân lập một alkaloid từ lá của loài A. squamosa làannonaine (31) có hoạt tính tẩy giun sán.[17]
Annonaine (31)
1.1.3. Công dụng và dược tính
Các cây thuộc chi Annona chủ yếu được sử dụng làm thuốc theo kinh nghiệm
dân gian.
Loài Annona muricata L ( mẵng cầu xiêm )
Quả mẵng cầu xiêm có thịt trắng, mùi dễ chịu, vị dịu, hơi ngọt, chua. Người ta
thường dùng quả để ăn. Thịt quả pha thêm nước và đường trộn đều làm thành một
loại sinh tố dùng để giải khát, bổ mát và chống hoại huyết. Quả xanh phơi khô tán
bột dùng trị kiết lị và sốt rét.
Lá mẵng cầu chứa tinh dầu mùi dễ chịu, một lượng khá cao chlorua kali,
tannin,và bột cùng với một lượng thấp alcaloide. Lá được dùng làm thuốc trị sốt rét
và kết hợp với vỏ làm thuốc chữa sốt, tiêu chảy và trục giun. Lá non có thể dùng làm
gia vị, nấu và dùng vào buổi tối sẽ làm dịu thần kinh.
Hạt chứa 0,05 % alcaloide dùng làm thuốc sát trùng và duốc cá. Ngoài ra, người
ta còn dùng hạt đem giã nhỏ lấy nước gội đầu trị chấy, rận.
Loài Annona squamosa L ( mẵng cầu ta hay na)
Quả mẵng cầu ta có thịt thơm, ngọt, mềm. Quả mẵng cầu ta ăn được, có tác
dụng hạ khí, tiêu đờm . Quả xanh dùng trị lỵ, đái tháo và bệnh tiểu khát. Quả điếc
dùng trị mụn nhọt.
Lá mẵng cầu ta có một alcanoide vô định hình, lá xanh chứa 0.08% là dầu. Lá
dùng trị sốt rét cơn lâu ngày, mụn nhọt, sưng tấy, ghẻ.
Hạt mẵng cầu ta có vị đắng, hơi hôi, tính lạnh, có tác dụng thanh can, giải nhiệt,
tiêu độc, sát trùng. Hạt còn được dùng diệt côn trùng, trừ chấy rận.
1.2. CÂY BÌNH BÁT NƯỚC
Tên khoa học : Annona Glabra L
Chi : Annona
Họ : Annonaceae
Tên gọi khác : Nê, Na biển, Pond apple, Mangrove annona, Alligato apple,
Monkey apple.
1.2.1 Mô tả thực vật[1, 5]
Cây gỗ nhỏ, cao 2-5 m, cành ít phân nhánh, dáng giống như mẵng cầu xiêm. Lá
không lông, hình xoan hay tròn dài, gân bên có 8-9 đôi.
Hình 1.1 Lá của cây bình bát nước Annona Glabra L
Hoa vàng, rộng 2cm; lá đài xanh khoảng 5cm, có 6 cánh hoa dài 2-3cm có bớt
đỏ ở trong, tiểu nhụy nhiều.
Hình 1.2 Hoa của cây bình bát nước Annona Glabra L
Quả dài 7-10cm, vàng xanh, không gai, vỏ nhẵn, nạt, thịt trắng. Hạt có màu nâu
đen nhạt.
Hình 1.3 Trái của cây bình bát nước Annona Glabra L.
Phân bố : Gốc ở Bắc Mĩ, được nhập vào trồng ở nước ta. Nay mọc rải rác từ
Hải Phòng, Quảng Ninh đền Quảng Nam và mọc nhiều ở các tỉnh phía Nam.
Sinh thái : Cây trồng dựa bờ rạch có nước nợ và trồng được ở cả nguồn nước
nhiễm phèn và mặn.
1.2.2. Thành phần hóa học
Năm 1995, nhóm tác giả Padmaja V., V. Thankamany, N. Hara, Y. Fujimoto, A.
Hisham đã phân lập từ vỏ cây Annona glabra L. hợp chất ent-kaur-16-en-19-oic
CH2
COOH
acide(32) có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, tẩy giun, độc tế bào và diệt côn trùng.[21]
Ent-kaur-16-en-19-oic acide(32)
Năm 1997, nhóm các tác giả Fang-Rong Chang, Pey-Yuh Yang, Jung-Yaw Lin, Kuo-
Hsiung Lee và Yang-Chang Wu đã phân lập được 13 hợp chất gây ức chế nhẹ các hoạt
R2
R3
R1
động nhân bản của tế bào HIV và gây ức chế hoạt động của virut HIV [28]
Bảng 1.1 Mười hai hợp chất được nhóm tác giả Fang-Rong Chang phân lập
Kí hiệu R1 R2 R3 Tên gọi
methyl-16β-acetoxy-19-al (33) CHO OAc COOCH3 -ent-kauran-17-oate
16α-hydro-19-acetoxy-ent-kauran (34) COOH H CH2OAc -17-oic acide
COOH ent-kaur-16-en-19-oic acide (35) =CH2
16α, 17-dihydroxy-ent-kauran-19 (36) OH COOH CH2OH -oic acide
16β-hydroxy-17-acetoxy-ent (37) COOH OH CH2OAc -kauran-19-oic acide
H COOH 16β-hydro-ent-kauran-17-oic acide (38) CH3
COOH 16α -hydro-ent-kauran-17-oic acide H (39) CH3
ent-kaur-16-en-19-ol (40) CH2OH =CH2
16α-hydro-19-al-ent-kauran-17-oic (41) H CHO COOH acide
methyl-16α-hydro-19-al-ent (42) CHO H COOCH3 -kauran-17-oate
16β-hydroxyl-17-acetoxy (43) CHO OH CH2OAc -ent-kauran-19-al
CH2OH
CH2OH
OH COOH H 19-nor-ent-kauran-4α-ol-17-oic acide (44)
Ent-kaur-15-ene-17,19-diol (45)
Năm 1997, nhóm tác giả Teresa Gallardo, Raul Aragon, Jose R. Tormo, M. Amparo
Blazquez, M. Carmen Zafra- Polo và Diego Cortes đã phân lập các hợp chất có tính
OH
OH
O
(CH2)9CH3
(CH2)5
OH
OH
O
H3C
O
kháng khuẩn, kháng vi sinh vật.
OH
OH
O
(CH2)5
(CH2)3
(CH2)10CH3
R1
R2
O
O
H3C
Gigantertrocin–A (46)
R1=R2= OH: Annonacin (47) R1=H, R2=OH: Corossolin (49)
OH
OH
O
(CH2)9CH3
(CH2)7
OH
OH
O
H3C
O
R1=OH, R2=O: Annonacinone (48) R1=H, R2=O: Corossolone (50)
OH
OH
O
(CH2)7CH3
(CH2)7
OH
OH
O
H3C
O
Glabranin (51)
OH
OH
O
(CH2)11CH3
(CH2)5
OH
OH
O
H3C
O
Muricatertrocin–B (52)
Gigantertronenin (53)
OH
OH
HO
O
O
(CH2)9
(CH2)9CH3
OH
O
O
H3C
OH
OH
HO
O
O
(CH2)7
(CH2)9CH3
OH
O
O
H3C
Laherradurin (54)
OH
OH *
O
O
(CH2)7
(CH2)9CH3
OH
O
O
H3C
Itrabin (55)
Erythro: molvizarin (56)Threo: parviflorin (57)
Năm 1997, nhóm tác giả Li Chao-Ming, Tan Ning-Hua, Mu Qing, Zheng Hui-Lan,
O
N H
N H
O
S
O
O
N H Leu
O
Val
HN
NH
Ala
O
Gly
NH
HN
VAl
Hao Xiao-Jiang, Liang Hui-Ling, Zhou Jun đã tổng hợp được 2 hợp chất cyclopeptieds mới là glabrin A (58) và glabrin B (59) từ hạt của Annona Glabra.[13]
O
Val
O Pro
O
Ne
O
Pro
N
HN
O
Tyr
O
HN
N
Tyr H N
O
Thr
O
Gly
O
H N
NH
OH
OH
OMet
Glabrin A (58) Glabrin B (59)
Năm 1997, nhóm tác giả Xiao-Xi Liu, Feras Q. Alali, Elsa Pilarinou, Jerry L.
McLaughlinphân lập được 4 hợp chất là glabracins A (60) và glabracins B (61),
3
OH
OH
OH
23
O
18
O
34
O
24
11
1
(CH2)7
(CH2)5
A
O
OH
bullatanocin (62)và javoricin (63)có hoạt tính chống ung thư mạnh.
OH
OH
OH
O
O
(CH2)7
CH3(CH2)6
O
O
OH
Glabracin A (60) (A= erythro) Glabracin B (61) (A= threo)
37
OH
OH
12
O
20
15
CH3(CH2)9
1
O
4 (CH2)7
OH
OH
O
Bullatanocin (62)
Javoricin (63)
OH
OH
O
(CH2)5
Cũng cùng năm đó, nhóm tác giảXiao-Xi Liu, Feras Q. Alali, Elsa Pilarinou, Jerry L. McLaughlin đã phân lập được 2 hợp chất glacins A (64) và glacins B (65).[32]
O
(CH2)7
H3C
OH
OH
O
(CH2)3
OH
OH
O
(CH2)5
O
(CH2)9
H3C
OH
OH
O
Glacins A (64)
Glacins B (65)
Năm 1998, nhóm tác giả Xiao-Xi Liu, Feras Q. Alali, Elsa Pilarinou, Jerry L.
McLaughlin cũng đã phân lập ra 2 hợp chất có hoạt tính chống ung thư vú ( MCF-7)
OH
OH
O
(CH2)5
(CH2)3
O
H3C
(CH2)9
OH
OH
O
và ung thư tụy (Paca-2). Đó là annoglacin A (66) và annoglacin B (67). Hai hợp chất này có hoạt tính mạnh hơn nhiều lần so với adriamycin.[15]
OH
OH
O
(CH2)3
(CH2)5
O
H3C
(CH2)9
OH
OH
O
Annoglacin A (66)
Annoglacin B (67)
Cũng cùng năm đó, nhóm tác giả Xiao-Xi Liu, Feras Q. Alali, Elsa Pilarinou,
Jerry L. McLaughlin cũng đã phân lập ra 2 hợp chất có hoạt tính sinh hoc cao từ lá của
Annona glabra. Đó là annoglaxin (68) và 27- hydroxybullatanocin (69). Trong đó hợp
chất (69) có hoạt tính chống lại ung thư thận ( A-498), ung thư biểu mô tuyến tiền liệt
OH
O
O
O
O
OH
OH
(PC-3) và ung thư tụy (Paca-2 ); mạnh hơn chất đối chứng dương adriamycin ít nhất 100 000 lần.[30]
OH
OH
O
O
O
O
OH
OH
Annoglaxin (68)
27- hydroxybullatanocin (69)
Cuối năm 1998, nhóm tác giả Xiao-Xi Liu, Feras Q. Alali, Elsa Pilarinou, Jerry
L. McLaughlin cũng đã phân lập được 2 hợp chất có hoạt tính cao từ lá của cây
OH
O
O
O
O
OH
OH
Annona Glabra L. Đó là 6-OH Desacetyluvaricin (70) và 6-OH-4-Deoxysquamotacin (71).[31]
OH
O
O
O
O
6-OH Desacetyluvaricin (70)
OH
OH
C3H7
6-OH-4-Deoxysquamotacin (71)
Năm 1999, nhóm tác giả Xiao-Xi Liu, Feras Q. Alali, Elsa Pilarinou, Jerry L.
McLaughlin đã phân lập được hợp chất blumenol A (72) từ lá của cây Annona Glabra
OH
OH
O
L.
Blumenol A (72)
Cũng vào năm này, nhóm tác giả Xiao-Xi Liu, Feras Q. Alali, Elsa Pilarinou,
O
O
Jerry L. McLaughlin đã phân lập được hợp chất pondaplin (73).[29]
Pondaplin (73)
Năm 2000, nhóm tác giả Chang Fang-Rong, Chung-Yi Chen, Tian-Jye Hsieh,
R2
R3
H
H
R1
Chun-Ping Cho, and Yang-Chang Wu đã phân lập được 6 hợp chất mới, đó là : [8]
Bảng 1.2 Sáu hợp chất được nhóm tác giả Chang Fang-Rong phân lập.
Kí hiệu R1 R2 R3 Tên gọi
COOH Annoglabasin C (74) COOCH3 OOCH3
CHO Annoglabasin D (75) COOCH3 OOCH3
COOH H Annoglabasin E (76) CH2OH
OH Annoglabasin F (77) COOCH3 OOCH3
COOH 16R-methoxy-ent-kauran- (78) CH3 OCH3
19oic acid
H 16R-hydro-ent-kauran- (79) COOCH3 COOCH3
17,19-dimethylester
Cũng cùng năm năm đó, nhóm tác giả Chang Fang-Rong, Chung-Yi Chen,
Tian-Jye Hsieh, Chun-Ping Cho, and Yang-Chang Wu đã phân lập được thêm 17 hợp chất từ trái và vỏ của Annona Glabra L.[6]
O
O
N
N
O
O
O
O
O
H3CO
H3CO
N
Cl
N
HO
H3CO
H
OCH3
OCH3
OH
OH
Annobraine (80) Liriodenine (81)
H3CO
N
H3CO
O
Kikemanine (82) Dehydrocorydalmine (83)
R1
R1
R2
R3 H
N
Nornucif erine (85) OCH3 OCH3
R2
R3
H
Anonaine (86)
H
-OCH2O-
O
N-f ormylanonaine (87)
CHO
-OCH2O-
H3CO
H3CO
NH
HO
NH
H
H3CO
H
O
O
O
Lysicamine (84)
O
HO
H N
H3CO
O
N H
O
(+)-Nordomesticine (88) (+)-Stepharine (89)
O
OH
1-aza-4-methyl-2-oxo-1,2-dihydro-9,10 N-trans- feruloyl-tyramine (91)
23
anthracenedi-one (90)
*
22
R = H, b-sitosterol (92)
RO
R = H; *22,23 =, stigmasterol (93)
R = Glu; b-sitosterol-D-glucoside (94)
O
C
(CH2)14CH3
O
H
H
O
O
HO
HO
H
OH
H
H
R = Glu; *22,23 =, stigmasteryl-D-glucoside (95)
6-O-palmitoyl-β-sitosteryl-D-glucoside (96)
Năm 2003, nhóm tác giả Yang Nian Yun, Tian Li Juan, Meng Zheng Mu, Han
Ying đã phân lập 2 hợp chất annonebinide A (97) và samoquasine A (98) từ vỏ Annona glabra L.[26]
H
O
O
N
NH
CH2
O
OH
Annonebinide A (97) Samoquasine A (98)
Năm 2004, nhóm tác giả Ching-Hsiein Chen, Tian-Jye Hsieh, Tsan-Zon Liu,
H
H
H
H
H
H
Chi-Liang Chern, Pei-Ying Hsieh và Chung-Yi Chen đã phân lập ra 2 hợp chất annoglabayin (99) và annomontacin (100).[7]
O
(CH2)6
(CH2)5
(CH2)11
O
H3C
OH
OH
OH
OH
O
Annoglabayin (99)
Annomontacin (100)
Năm 2004, nhóm tác giả Tian-Jye Hsieh, Yang-Chang Wu, Su-Ching Chen,
Ching-Shan Huang và Chung-Yi Chen đã phân lập được hợp chất annonglabasin G
(101).
CHO
H
H
H
CH2OOCH3
Annonglabasin G (101)
Năm 2010,hai nhà hóa học Sheng-Fa Tsai and Shoei-Sheng Lee đã phân lập
được bốn hợp chất mới từ thân cây Annona Glabra L đó là : (7S,14S)-(-)-N-methyl-
10-O-demethylxylopinine (102), S-(-)-7,8-didehydro-10-O- demethylxylopininium
(103), S-(-)-7,8-didehydrocorydalminium (104) và 5-O- methylmarcanine D
H3CO
H3CO
.TFA
.TFA
N+
N+
H3CO
H
H3CO
H
H
OCH3
OH
OH
OCH3
H
S-(-)-7,8-didehydrocorydalminium (104)
S-(-)-7,8-didehydro-10-O- demethylxylopininium (103)
H3CO
N+
CH3 .TFA
O
OCH3
CH3
H3CO
H
O
OH
N H
O
OCH3
(7S,14S)-(-)-N-methyl-10-O-demethylxylopinine (102)
5-O- methylmarcanine D (105)
(105).Trong đó, hợp chất (103) và (104) là những hợp chất lần đầu tiên được tìm thấy trong tự nhiên.[23]
1.2.2. Công dụng và dược tính
Quả giống quả bình bát nhưng nhỏ hơn, có mùi thơm nhưng nếu không quen sẽ
khó ăn. Quả chín có thể ăn cùng với đường như một loại nước giải khát.
Quả bình bát nước có tính ức chế các vi khuẩn Staphylococcus hemolyticus
(chuỗi cầu khuẩn tan huyết), Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudommonas
aerogennes.
Hạt và vỏ cây dã ra có tác dụng làm thuốc trị tiêu chảy, kiết lị và làm thuốc sát
trùng.
Dịch của lá cây dùng để trừ chấy rận.
Ở Cu Ba, gỗ cây bình bát nước nhẹ nên được dùng làm giữ lưới đánh cá nổi
trên mặt nước.
Ở Trung Quốc, toàn cây dùng làm thuốc trị ung bướu; lá được dùng để trị viêm
khí quản mãn tính.
SƠ LƯỢC VỀ HOẠT TÍNH KHÁNG OXI
1.3.
HÓA[34,35,36]
Trong cơ thể con người, thường xuyên diễn ra nhiều sinh hoạt hoặc xây dựng hoặc
huỷ hoại. Có những chất tưởng như là thực phẩm chính của tế bào nhưng đồng thời
cũng lại làm hại tế bào. Có những phân tử gây ra tổn thương thì cũng có những chất
đề kháng lại hành động phá phách này. Gốc tự do, oxy hóa và chất chống oxy hóa là
một ví dụ. Những phân tử này ảnh hưởng đến cơ thể con người rất nhiều.
Chất ôxy hoá còn gọi là gốc tự do, đó là những phân tử hay hợp tử chất có chứa điện
tử độc thân không ghép đôi. Chính do chứa điện độc thân mà gốc tự do có hoạt tính rất
mạnh, nó luôn mang tính "huỷ hoại", sẵn sàng thực hiện tính ôxy hoá, cướp điện tử
của chất mà nó tiếp xúc và làm chất bị nó ôxy hoá bị huỷ hoại nặng nề.Trong cơ thể,
phản ứng của chất ôxy hoá của gốc tự do gây huỷ hoại tế bào (đặc biệt ở màng tế bào
hoặc cấu trúc di truyền trong nhân tế bào) phá huỷ các mô gây nên quá trình lão hoá.
Oxy hóa là quá trình chuyển electron từ nguyên tử này sang nguyên tử khác, oxy
hóa rất quan trọng trong quá trình trao đổi chất. Tuy nhiên, khi electron ở trạng thái
độc thân, chúng sẽ tạo ra các gốc tự do được gọi là những loại oxy hoạt động (reactive
.), peroxyl (ROO.), alkoxyl (RO.), hydroxyl oxygen species) như: superoxide (O2
(HO.) và nitric oxide (NO.). Gốc tự do RO. và HO.nhanh chóng tấn công vào các phân
tử lipid trong màng tế bào, protein trong các mô hay các enzyme, cacbohydrate và
AND gây hư hại màng tế bào, AND, biến tính protein. Quá trình này được xem là
nguyên nhân của sự lão hóa và nhiều bệnh tật khác như tim mạch, suy giảm trí nhớ,
ung thư, huyết áp,….
Trong cơ thể, bên cạnh các gốc tự do luôn có hệ thống các chất chống oxy hóa “
nội sinh” để cân bằng lại, vô hiệu hóa các gốc tự do. Hệ thống các chất chống ôxy hoá
nội sinh gồm các enzym như glutathione peroxidase, superroxid, dismutase... đặc biệt
là vitaminC, vitamin E, beta-caroten (tiền vitamin A)… xúc tác các phản ứng khử để
vô hiệu hoá gốc tự do (còn gọi là "bẫy" gốc tự do) giúp cơ thể khoẻ mạnh. Nhưng do
các yếu tố bên ngoài tác động vào làm cho các gốc tự do sinh ra quá nhiều và hệ thống
chất ôxy hoá nội sinh không đủ sức cân bằng, cơ thể sẽ sinh ra rối loạn bệnh lý, có thể
gây ung thư.
Nguyên nhân gây ra ung thư đã được làm sáng tỏ là một quá trình nhiều bước,
trong đó giai đoạn xúc tiến có liên hệ chặt chẽ đến sự hư hại mô bị viêm và mô bị oxi
hóa. Bằng thực nghiệm đã chứng minh được các gốc tự do có liên quan đến sự xúc tiến
khối u trong da chuột và các mô khác. Khi các chất hoạt hóa khối u được áp dụng cục
bộ vào da chuột đã sinh ra H2O2 trong biểu bì, điều này tương quan với khả năng xúc
tiến khối u của các chất này. Do đó các chất có hoạt tính chống oxi hóa mạnh có khả
năng ngăn chặn sự gây ung thư, đặc biệt ở giai đoạn xúc tiến.
Do vậy, xu hướng nghiên cứu gốc tự do và các chất chống oxi hóa ngày càng
được chú trọng trong lĩnh vực Y-dược nhằm phát hiện những chất chống oxi hóa mang
lại những tác dụng tốt có lợi cho sức khỏe con người, trong đó chất chống oxi hóa có
nguồn gốc thiên nhiên được nhiều quốc gia, nhiều nhà khoa học quan tâm do đặc tính
ít độc, dễ hấp phụ đối với cơ thể và ít gây ra các phản ứng phụ.
Chương 2. PHẦN THỰC NGHIỆM
2.1 . THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT
2.1.1. Thiết bị
Tủ sấy hiệu Memmert.
Bếp cách thủy hiệu Julabo 461 Water Bath.
Máy cô quay chân không hiệu Buchi-111.
Đèn UV ở 2 bước sóng 254 nm và 365 nm hiệu UVITEC.
Thiết bị gia nhiệt hồng ngoại hiệu SCHOTT.
2.1.2. Dụng cụ
Máy sấy.
Máy đánh siêu âm.
Máy hút chân không.
Cột sắc ký đường kính 2-5.5 cm.
Máy cô quay chân không Buchi-111.
Thiết bị gia nhiệt hồng ngoại hiệu SCHOTT.
Cân phân tích AB 265-S và cân kỹ thuật PB 602-S.
Đèn UV soi tử ngoại bước sóng 254-365 nm hiệu UVITEC.
Các dụng cụ thông thường dùng để ly trích như: bình tam giác, cốc thủy tinh,
ống nghiệm, bình cô quay, ống đong…
2.1.3. Hóa chất
Silica gel dùng cho pha thường của Scharlau, Kieselgel 60 (0,040-0,063 mm),
silica gel pha đảo ODS (0,040-0,063 mm), Sephadex LH-20 và sắc ký điều chế kết
hợp sắc ký lớp mỏng.
Dung môi dùng cho sắc ký cột pha thường, pha đảo, sắc ký lớp mỏng gồm:
- Ete dầu
- Methanol
- EthanolA - Etyl acetate
cetone - Chlorofom
- Hexan
Thuốc thử hiện hình các cấu tử hóa học trên sắc ký lớp mỏng: dung dịch
H2SO4/EtOH (10%), FeCl3/EtOH.
2.1.4. Nguyên liệu
Mẫu lá cây Bình bát được thu hái tại quận 8, Bình Chánh, TP.Hồ Chí Minh.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp phân lập các chất.
Sử dụng phương pháp ngâm dầm với ethanol để chiết xuất cao ethanol thô.
Các cao phân đoạn được điều chế bằng phương pháp trích pha rắn cao ethanol
ban đầu với các dung môi có độ phân cực tăng dần như: hexan, chloroform, ethyl
acetate và methanol.
Sử dụng sắc ký cột silica gel pha thường, pha đảo, Sephadex LH-20, sắc ký bản
điều chế kết hợp sắc ký lớp mỏng để phân lập các chất tinh khiết từ cao etyl acetate.
Kiểm tra độ tinh khiết các chất phân lập được bằng sắc ký lớp mỏng.
2.2.1. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất hóa học.
Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR): 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) đo
trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa học, Viện Khoa học và
Công nghệ Việt Nam, Hà Nội. Với chất chuẩn nội là TMS.
2.2.2. Phương pháp thử hoạt tính kháng oxy hóa
Hiện nay có rất nhiều phương pháp đo hoạt tính kháng oxy hóa như : oxygen radical
absorbant capacity (ORAC), total radical-trapping antioxidant parameter (TRAP),
ferrie reducing antioxidant power assay (FRAP), 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical
scavenging (DPPH),…. Tuy nhiên ở đây tôi chọn thử hoạt tính kháng oxy hóa bằng
phương pháp bắt gốc tự do DPPH tại phòng phân tích môi trường, Viện công nghệ
Hóa Học; vì những ưu điểm sau :
• Phương pháp đơn giản
• Thời gian tiến hành nhanh chóng
• Phạm vi thử nghiệm được với nhiều tác nhân kháng oxy hóa khác nhau.
Nguyên tắc
Tên khoa học: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
DPPH là gốc tự do bền, màu tím, phân tử không bị dimer hóa như một số gốc tự do
khác. Hoạt tính kháng oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH, được xác
O2N
N
N
NO2
O2N
định bằng cách đo quang ở bước sóng λ = 515 nm.
DPPH
Cơ chế
Khi DPPH phản ứng với chất có khả năng cho nguyên tử hydrogen, nó sẽ
O2N
O2N
H N
N
NO2
chuyển về dạng khử có màu vàng nhạt (màu của nhóm picryl). Phản ứng như sau:
N
N
NO2
O2N
O2N
+ RH + R.
Điều kiện tiến hành phản ứng
Dung môi phản ứng : Kết quả của nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy rằng
EtOH và MeOH là hai dung môi tối ưu nhất.
Độ hấp thu : Đỉnh hấp thu cực dại nằm ở bước sóng 515-520 nm.
Thời gian đo độ hấp thu : Thời gian phụ thuộc vào hàm lượng mẫu đem phản
ứng. Tuy nhiên, ta nên để mẫu phản ứng 30 phút trước khi đo là tối ưu nhất.
2.3. THỰC NGHIỆM.
2.3.1. Điều chế cao thô
Lá cây Bình bát được phơi khô, sấy và nghiền nhỏ thành bột mịn (5kg). Nguyên
liêu bột mịn được tận trích với ethanol 96% bằng phương pháp ngâm dầm, lọc và cô
quay loại dung môi dưới áp suất kém thu được cao ethanol thô (500 g).
Cao thô được hòa tan vào một lượng tối thiểu ethanol rồi tẩm silica gel vào,
đuổi khô dung môi trong tủ sấy ở nhiệt độ khoảng 40°C cho đến khi thu được bột tơi.
Sau đó trích pha rắn cao ethanol lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần:
hexane, chloroform, ethyl acetate, methanol, thu được các cao tương ứng. Quá trình
thực hiện được tóm theo sơ đồ 1.
Bột cây khô
5 kg
- Tận trích với EtOH 96%.
- Lọc, cô quay thu hồi dung môi.
Cao thô Ethanol
500,0g
- Trích pha rắn với các dung môi: hexane,
chloroform, ethyl acetate, methanol.
Cao Hexan
Cao Ethyl acetate
Cao Methanol
Cao Chloroform
100,0 g
- Cô quay thu hồi dung môi.
30 g 310,0 g 30,7 g
Sơ đồ 1 Quy trình chiết.
2.3.2 Cô lập và tinh chế các hợp chất
Trong khóa luận này, chúng tôi chỉ tiến hành khảo sát cao etyl acetate.
Đầu tiên, cao etyl acetate (30g) được SKC silica gel pha thường với dung môi
rửa giải là ete dầu, EtOAc và hỗn hợp của chúng ( với độ phân cực tăng dần từ 0-
100%), các phân đoạn giống nhau trên SKLM được gom thành 7 phân đoạn và mã hóa
thành A1-17. Kết quả được tóm tắt trong bảng 2.1.
Bảng 2.1 Kết quả sắc kí cột cao EtOAc
Phân đoạn Tên mã hóa Khối lượng (g) Kết quả SKLM Ghi chú
1 A1 Nhiều vết Không khảo sát 3.55g
2 A2 Nhiều vết Không khảo sát 8,81g
3 A3 Nhiều vết Không khảo sát 2,34g
4 A4 Nhiều vết Không khảo sát 3,05g
5 A5 Nhiều vết Không khảo sát 2,55g
6 A6 Rõ vết Khảo sát 3,36g
Khảo sát phân đoạn A7 (3,36g).
7 A7 Nhiều vết Không khảo sát 1,58g
Cao phân đoạn A11 có màu đen, dạng dầu; tan tốt trong MeOH nên ta tiến
hành SKC sephadex LH 20 nhiều lần với dung môi MeOH . Mẫu tách tốt với hạt
sephadex LH 20. Trên cột mẫu tách thành ba lớp, các phân đoạn giống nhau trên
SKLM được gom chung lại thành 4 phân đoạn ( A11.1-A11.4). Kết quả được tóm tắt
trong bảng 2.2.
Bảng 2.2 Kết quả SKC trên phân đoạn A11
Phân đoạn Tên mã hóa Khối lượng Kết quả SKLM Ghi chú
(mg)
A6.1 977mg Nhiều vết Không khảo sát 1
A6.2 989mg Rõ vết Khảo sát 2
A6.3 650mg Nhiều vết Không khảo sát 3
A6.4 500mg Rõ vết Khảo sát 4
Khảo sát phân đoạn A6.4.
Phân đoạn A6.4 tiếp tục được SKC sephadex LH 20 với dung môi MeOH thu
được hợp chất kí hiệu AGAΙ (m=200mg)
Khảo sát phân đoạn A6.2
Phân đoạn được SKC silica gel pha thường với hệ dung môi CHCl3:MeOH ( tỉ
lệ 100% CHCl3 , 100:1 , 80:1, 70:1, 50:1 và 100% MeOH) thu được 3 phân đoạn
(A6.2.1-3).
Phân đoạn A6.2.2 được SKC silicagel pha thường với hệ dung môi H:Ac (tỉ lệ
25:1, 15:1, 10:1,7:1) thu được 2 phân đoạn A6.2.2.1 và A6.2.2.2.
Phân đoạn A6.2.2.2 được SKC silica gel pha đảo với hệ dung môi MeOH: H2O
( với độ phân cực giảm dần từ 50% MeOH đến 100% MeOH ) sau đó giải ly SKLM
thu được hợp chất AGAΙΙ (m=70 mg).
2.3.3 Sơ đồ phân lập hợp chất.
Sơ đồ 2 Quy trình phân lập các chất.
Bột cây khô
5 kg
- Tận trích với EtOH 96%.
- Lọc, cô quay thu hồi dung môi.
Cao thô Ethanol
500,0g
chloroform, ethyl - Trích pha rắn với các dung môi: hexane, acetate, methanol.
Cao Hexan
- Cô quay thu hồi dung môi.
Cao Methanol
Cao Chloroform
100,0 g
Cao Ethyl acetate
30 g 310,0 g 30,7 g
Phân đoạn A7
Phân đoạn A1
m= 1,58g
m=3,55g
Phân đoạn A6
Phân đoạn A2
m= 3,36g
m= 8,81g
Phân đoạn A5
Phân đoạn A3
m= 2,55g
m= 2,34g
Phân đoạn A4
SKC silica gel pha thường với hệ dung môi Ether dầu : EtAc
m= 3,05g
AGAΙ AGAΙΙ
m=200mg m=70mg
2.4 Hằng số vật lý và các số liệu phổ nghiệm.
2.4.1 Hợp chất AGAΙ
Hợp chất AGAΙ thu được ở dạng bột màu vàng
Nhiệt độ nóng chảy : 316OC
Sắc kí lớp mỏng pha thường với hệ dung môi Ether dầu : EtOAc = 1:3 , hiện
bằng thuốc thử H2SO4 / EtOH cho một vết màu vàng , có Rf = 0,66.
Hình 2.2 Hợp chất AGAΙ
Hình 2.1 Sắc kí lớp mỏng hợp chất AGAΙ
Phổ 1H-NMR (500 MHz, Acetone d6), δ (ppm), J (Hz): 6,2 ( 1H; d; 2Hz; H-6);
6,5 (1H; d; 2Hz; H-8); 6,99 (1H; d; 8,5Hz; H- 5’); 7,69 ( 1H; dd;8 Hz;2Hz;H-6’); 7,8
(1H; d; 2 Hz; H- 2’) ; 12,1 (1H, s, 5-OH).
Phổ 13C-NMR (500 MHz, Acetone d6), δ (ppm) : 94,4 (C-8); 99,1 (C-6); 104
(C-10); 115,7 (C-2’); 116,1 (C-5’); 121,4 (C-6’); 123,7 (C-1’); 136,7 (C-3); 145,8 ( C-
3’); 146,9 (C-2); 148,3 (C-4’); 157,7 (C- 9); 162,2 (C-5); 165,0 (C-7); 176,5 (C-4).
2.4.2 Hợp chất AGAΙΙ
Hợp chất AGAΙ thu được ở dạng bột màu trắng.
Sắc kí lớp mỏng pha thường với hệ dung môi CHCl3 : MeOH = 10:1 , hiện
bằng thuốc thử H2SO4 / EtOH cho một vết màu vàng nâu , có Rf = 0,52.
Phổ 1H-NMR (500 MHz, Pyridine d5), δ (ppm), J (Hz) : 0,85 (6H; t; H-24’, H-
16); 1,22- 1,3 (62H; m; H-6-15, H-3’-23’); 3,98 (1H; t;8Hz; 7,5Hz ; H-2’’); 4,1 (3H;
m, H-3’’, H-4’’, H-5’’); 4,3 (2H; m; H-6’’); 4,5 (2H; m; H-3;H-2’); 4,68( 1H; m; H-1);
4,9 (1H; d; 7,5Hz; H-1’’); 5,4 -5,5 (2H,m, H-4; H-5); 8,5 (1H; d, >N-H).
Phổ 13C-NMR (500 MHz, Pyridine d5), δ (ppm) : 14,2 ( C-16; C-24’); 51,7 ( C-
2); 62,6 ( C-6’’); 71,5 ( C-4’’); 72,4-72,5 ( C-3; C-2’); 75,1 (C-2’’); 78,4-78,5 ( C-
3’’;C-5’’); 105,5 ( C-1’’); 130,6-130,8 ( C-4; C-5 ), 175,6 ( >C=O).
2.5. Thử nghiệm hoạt tính kháng oxi hóa.
Pha dung dịch DPPH 0,6 mM trong MeOH.
Hợp chất AGAΙ được tiến hành nghiên cứu ở 5 nồng độ : 24 µg/ml, 20 µg/ml,
15µg/ml, 10 µg/ml, 5 µg/ml. (các mẫu pha trong MeOH)
Lấy 0,5 ml mẫu thử ở các nồng độ khảo sát cho phản ứng với 0,5 ml dung dịch
DPPH. Thêm MeOH vừa đủ 10 ml ( hệ số pha loãng là 20). Hỗn hợp sau khi pha đuợc
để ở nhiệt độ phòng 30 phút. Sau đó đo quang ở buớc sóng = 515 nm. Mỗi mẫu được
đo 3 lần. Kết quả đo được ghi trong bảng 2.3.
Nồng độ mẫu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Giá trị trung bình
µg/ml
0,417 0,366 0,416 0.3997 0,25
0,264 0,256 0,265 0.2617 0,5
0,181 0,184 0,197 0,1873 0,75
0,097 0,115 0.061 0,091 1
0,078 0.101 0.063 0,0807 1.2
0,49 0,49 0
Bảng 2.3 Kết quả đo quang ở bước sóng 515 nm.
Hình 2.3. Mẫu thử sau khi cho phản ứng với DPPH.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ CHUNG
Sử dụng sắc ký cột với các chất nhồi cột là silica gel pha thường, gel sephadex LH-20
kết hợp với sắc ký bản mỏng, từ cao EtOAc lá bình bát nước chúng tôi đã phân lập
được hợp chất Quercetin và JCer-3.
Tiến hành phân tích hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp bắt gốc tự do DPPH
của hợp chất AGAΙ , chúng tôi đã tìm được IC50 là 0,5245µg/ml.
3.2. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA HỢP CHẤT AGAΙ
Hợp chất AGAΙ thu được ở dạng bột màu vàng, nhiệt độ nóng chảy 316oC, sắc
kí lớp mỏng pha thường với hệ dung môi Ether dầu : EtOAc = 1:3 , hiện bằng thuốc
thử H2SO4 / EtOH cho một vết màu vàng , có Rf = 0,66 ; cho dương tính với thuốc
thử FeCl3/ EtOH , chứng tỏ đây là một dẫn xuất phenolic.
Phổ 1H-NMR (500 MHz, Acetone d6) ( phụ lục 1) xuất hiện các tín hiệu của
proton ở vùng thơm δH [6,2 ( 1H; d; 2Hz); 6,5 (1H; d; 2Hz); 6,99 (1H; d; 8,5Hz); 7,69
(1H; dd; 8 Hz); 7,8 ( 1H; d; 2 Hz) ] và một tín hiệu proton –OH kiềm nối δH 12,1
(1H; s).
Phổ 13C-NMR (500 MHz, Acetone d6) (phụ lục 2) kết hợp với kỹ thuật DEPT
(phụ lục 3) cho biết hợp chất AGAΙ có 15 carbon bao gồm 5 nhóm (>CH- ) và 10
carbon tứ cấp (>C<), trong đó có một nhóm cacbonyl (>C=O) gắn với vòng thơm có
δC (176,5 ).
Từ các số liệu trên cho ta dự đoán hợp chất AGAΙ là một flavon.
3'
2'
4'
B
8
1'
O
5'
2
7
9
6'
A
10
6
3
4
5
O
Biện luận vòng A
Khung flavon.
Vì carbon của nhóm carbonyl có δC (176,5 ; C-4) nên C-3 gắn với nhóm (-OH)
và có một nhóm thế hidroxi (-OH) ở C-5 vì có tín hiệu proton của nhóm –OH kiềm
nối δH 12,1 ( 1H; s).
Trên phổ HSQC có các tương quan sau : [δH 6,2 ( 1H; d; 2Hz); δC (99,1)] ; [δH
6,5 (1H; d; 2Hz); δC (94,4) ]; [δH 6,99 (1H; d; 8,5Hz;); δC (116,1)] ; [δH 7,69 ( 1H; dd;
8 Hz; 2Hz); δC (121,4)]; [δH 7,81 ( 1H; d; 2 Hz; ); δC (115,7)].
Trên phổ HMBC, hai proton δH ( 6,2 ;1H; d; 2Hz) và δH (6,5;1H; d; 2Hz) lần
lượt tương quan với δC (94,4) và δC (99,1) mà không có tương quan với các carbon
gắn với các proton còn lại; nên hai proton này sẽ ở vị trí H-6 và H-8. Mặt khác, δC
(99,1) tương quan với δH ( 12,1) nên δC (99,1) là C-6 và δH ( 6,2) là H-6; suy ra [δC
(94,4) : C-8 ; δH ( 6,5) : H-8 ].
Trên phổ HMBC, H-8 tương quan với δC (157,7) không tương quan với δC
(162,2) còn H-6 tương quan với δC (162,2) không tương quan với δC (157,7) nên δC
(157,7) là C-9 và δC (162,2) là C-5.
Trên phổ HMBC, ta thấy C-5, C-6 và δC (104,1) cùng tương quan với δH (12,1)
nên δC (104,1) là C-10. Bên cạnh đó, H-6 và H-8 cùng tương quan với δC (165,0) nên
H
8
9
HO
O
7
ắt hẳn đây là C-7.
A
3
10
6
5
4
H
OH
O
O
H
Hình 3.1 Các tương quan HMBC trong vòng A
Biện luận vòng B
Từ phổ 1H-NMR và phổ HMBC ta có thể thấy rằng H-5’; H-6’ ; H-2’ lần lượt
là các proton sau δH [6,99 (1H; d; 8,5Hz); 7,69 ( 1H; dd; 8 Hz; 2Hz); 7,8 ( 1H; d; 2
Hz)]. Từ đó, C-5’; C-6’ ; C-2’ lần lượt là các carbon sau δC [ 116,1; 121,4; 115,7 ].
Trên phổ HMBC, H-2’ và H-6’ cùng tương quan với carbon δC (146,9) mà H-
5’ không tương quan nên ắt hản đó là C-2. Mặt khác, H-2’ và H-5’ cùng tương quan
với carbon δC (145,8) nhưng H-6’ không tương quan nên đó chính là C-3’.
Phổ HMBC, ta thấy carbon có độ chuyển dịch δC (136,7) không có tương quan
với proton nào hết nên đó chính là C-3. Các carbon δC [(123,7); (148,3)] lần lượt là C-
H
OH
2'
H
3'
1'
8
1’ và C-4’.
B
9
HO
O
OH
4'
7
6'
A
5'
10
2 3
6
5
4
H
H
H OH
OH
O
Hình 3.2 Các tương quan HMBC trong vòng B.
H
OH
2'
H
3'
1'
8
Vậy hợp chất AGAΙ là quercetin có cấu trúc hóa học như sau.
B
9
HO
O
OH
4'
7
6'
A
10
5'
2 3
6
5
4
H
H
H OH
OH
O
2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4H-chromen-4-one
Quercetin là một flavonoids làm xương sống cho nhiều loại flavonoids khác,
gồm rutin, quercitrin, hesperidin .... Những dẫn xuất này khác với quercetin ở chỗ
chúng có các phân tử đường gắn chặt vào bộ khung quercetin. Quercetin là một
flavonoid bền vững và hoạt động nhất.
Quercetin có khả năng chống viêm do ức chế trực tiếp hàng loạt phản ứng khởi
phát hiện tượng này: ức chế sự sản xuất và phóng thích histamin và các chất trung gian
khác trong quá trình viêm và dị ứng. Ngoài ra, quercetin còn có khả năng chống oxy
hóa cao nhất trong các hợp chất flavonoids. Quercetin ức chế men aldose reductase rất
mạnh, men này có nhiệm vụ chuyển glucose máu thành sorbitol – một hợp chất liên
quan chặt chẽ với sự tiến triển các biến chứng của đái tháo đường (đục thủy tinh thể do
đái tháo đường, thương tổn thần kinh, bệnh võng mạc đái tháo đường).
Bảng 3.1: Dữ liệu phổ 1H NMR, 13C NMR và HMBC của AGA I
so với dữ liệu phổ 1H NMR, 13C NMR của quercetin [18]
AGAI (acetone-d6) Quercetin (DMSO-d6)
δC δH (ppm) (J δC Vị trí C HMBC (ppm) δH (ppm) (J Hz) 500 (ppm) (H→C) 125 Hz) 300 MHz MHz 75 MHz MHz
2 146,8 146,9
3 135,8 136,7
4 175,9 176,5
5 160,7 162,2
C-5; C-7; 6,18 (d, 1,8) 98,2 6 6,26 (d, 2 ) 99,1 C-8; C-10
7 165,0 163,9
8 6,5 (d, 2) 94,4 6,40 (d, 2,1) 93,4 C-6; C-7;
C-9; C-10
157,7 156,2 9
104,1 103,0 10
1237 122,0 1’
C-2; C-1’;
7,67 (d, 2,1) 115,1 2’ 7,81 (d, 2) 115,7 C-4’, C-
3’, C-6’
145,8 145,1 3’
148,3 147,7 4’
C-3'; C-4'; 6,89 (d, 8,4) 115,6 5’ 6,99 (d, 8,5) 116,1 C-6', C-1’
7,68 (dd, 8,0 C-2; C-4'; 7,54 (dd, 8,7 121,4 120,0 6’ và 2,0) C-2’ và 2,1)
3.3. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA HỢP CHẤT AGAΙΙ
Hợp chất AGAΙI thu được ở dạng bột màu trắng.
Sắc kí lớp mỏng pha thường với hệ dung môi CHCl3 : MeOH = 10:1 , hiện
bằng thuốc thử H2SO4 / EtOH cho một vết màu vàng nâu , có Rf = 0,52.
Phổ 1H-NMR (500 MHz, PyridineD5), ( phụ lục 6 ) xuất hiện tín hiệu ở độ chuyển
dịch δH (8,5) , đây là tín hiệu proton của nhóm >N-H và các tín hiệu proton của gốc
đường có độ chuyển dịch trong khoảng δH ( 3,9 -4,9 ), tín hiệu của proton nối đôi tại
δH (5,49; 2H; m), tín hiệu của nhóm metyl cuối mạch δH (0,8), hai proton metin tại δH
4,5 (2H,m); proton Hanomer của một phân tử đường δH 4,94 (1H; d; 7,5 Hz) và tín hiệu
của các nhóm metylen ở vùng 1,20-2,00 ppm.
Phổ 13C-NMR (500 MHz, Pyridine d5), ( phụ lục 7 ) kết hợp kỹ thuật DEPT xuất
hiện tín hiệu một carbon carbonyl δC (175,6), hai carbon olefin tại δC [131,7 và 132,8]
, hai nhóm metyl tại 14,2 ppm, bảy carbon metin mang oxy hoặc nitơ tại δC [ 51,7;
71,5; 72,4; 72,5; 75,1; 78;4; 78,5] , hai carbon metilen mang oxy [δC 62,6 và 70,4)] và tín hiệu của các nhóm metilen sp3 xuất hiện trong vùng 22,0 ppm – 34,4ppm. Từ
những dữ liệu phổ nêu trên cho phép dự đoán AGA II là một cerebrosid mang một
phân tử đường.
Phổ HMBC cho thấy tương quan của hai proton không tương đương của carbon
metylen δH [4,69 (1H, m) và 4,50 (1H, m)] với carbon anomer δC 105,5 và một carbon
bậc ba kề nito δC 51,7 khẳng định tín hiệu carbon tại δC 51,7 là cùa C-2. Hai proton
của nối đôi δH 5,49 (2H, m) cho tương quan với hai carbon metylen tại δC [32,9 và
33,2] chứng tỏ đây là hai nhóm metylen gắn trực tiếp vào nối đôi. Mặt khác, độ dịch
chuyển hóa học của cacbon metilen nối trực tiếp vào nối đôi xuất hiện tại δC 32 ppm.
Như vậy cấu hình của nối đôi là E. Từ các nhận định nêu trên kết hợp với tài liệu tham
khảo, hợp chất AGA II được nhận danh là 1-O-(β-D-glucopyranosyl)-(2S,3R,4E)-2-
O
OH
H
2'
(CH2)21
6''
1'
4''
HN
H
5''
O
OH
HO
O
(CH2)10
3
HO
4
2
2''
1''
H
5
3''
1
OH
H
OH
[(2R)-2-hydroxytetracosanoyl-amino]-1,3-dihydroxy-4-hexadecene (Jcer-3).
Dựa vào phổ HSQC , HMBC và phổ so sánh[19] ta có các quy kết trong bảng sau:
Bảng 3.2 Dữ liệu phổ 1H NMR, 13C NMR và HMBC của AGA IΙ
JCer-3 ( C5D5N) AGAIΙ (Pyridine d5)
δH (ppm) (J Vị trí C HMBC δC (ppm) δC (ppm) 500 Hz) 500 (H→C) 125 MHz MHz MHz
4,68 (m) 70,1 C-1’’ 70,1 1
5,2 (d) 51,7 54,7 2
4,5 (m) 72,4 72,4 3
5,4 (m) 130,6 131,7 4
5,5 (m) 130,8 132,8 5
175,6 175,6 1’
4,5 (m) 72,5 72,6 2’
4,9 (d; 7,5Hz; 105,5 C-1, C-3’’ 105,6 1’’ β)
3,98 (t) 75,1 C-3’’, C-1’’ 75,1 2’’
4,1 (m) 78,4 C-4’’ 78,5 3’’
4’’ 4,1 (m) 71,5 C-3’’, C-5’’ 71,6
4,1 (m) 78,5 C-4’’ 78,5 5’’
4,3 (m) 62,6 C-3’’ 62,7 6’’
3.4. HOẠT TÍNH KHÁNG OXI HÓA CỦA AGA I
Nguyên lý :Phản ứng được tiến hành theo phương pháp của Shela G., Olga, M.
B., Elena, K., và C.S.Sharma (2003). Dựa trên nguyên tắc DPPH có khả năng tạo ra
các gốc tự do bền trong dung dịch MeOH bão hoà. Khi cho các chất thử nghiệm vào
hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hoà hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm
giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính kháng oxy hoá
được đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng
khi đọc trên máy Elisa ở bước sóng 515 nm.
Phần trăm ức chế gốc tự do DPPH được tính theo công thức sau.
× 100 I (%) = Trong đó : Ab : là độ hấp thu của dung dịch DPPH trong MeOH Ab − As Ab
As : là độ hấp thụ của dung dịch DPPH còn lại sau phản ứng.
Phần trăm ức chế gốc tự do DPPH của các mẫu thử được ghi trong bảng 3.3.
Bảng 3.3 Kết quả phần trăm ức chế DPPH của các mẫu thử
Nồng độ mẫu Độ hấp thu trung bình I % µg/ml
0,25 0.3997 18,43 %
0,5 0.2617 46,59 %
0,75 0,1873 61,78 %
1 0,091 81,43 %
1.2 0,0807 83,53 %
0 0,49
Bằng phương pháp hồi quy tuyến tính ta tìm được phương trình tương quan giữa
nồng độ mẫu chuẩn và phần trăm ức chế gốc tự do là :
Y= 42,91 lnx + 77,1
Vậy IC50 là 0,5245µg/ml.
90
80
70
60
50
40
30
y = 42.91ln(x) + 77.10 R² = 0.989
20
10
0
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
Kết quả cho thấy hợp chất AGAΙ có hoạt tính kháng oxi hóa cao.
Hình 3.3 Đồ thị thể hiện mối tương quan giữa nồng độ chất phản ứng và
phần trăm ức chế DPPH
Chương 4.KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1 . KẾT LUẬN
Trong khóa luận này, chúng tôi đã tiến hành khảo sát thành phần hóa học cao
EtOAc của lá cây bình bát Annona glabra L., thuộc chi Annona, được thu hái ở quận 8
(Bình Chánh) vào tháng 07 năm 2010 và khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa của hợp chất
phân lập được.
Bằng kỹ thuật SKC silica gel pha thường, pha đảo, sephadex LH-20 kết hợp
với SKLM cùng với nhiều hệ dung môi khác nhau chúng tôi đã phân lập được hợp chất AGAΙ và AGAΙΙ. Dựa vào các kết quả phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC,
HMBC và các tài liệu đã tra cứu thì cấu trúc của hợp chất được xác định là quercetin
(hợp chất mới trong loài) và JCer-3.
Tiến hành thử hoạt tính kháng oxi hóa của hợp chất AGAΙ bằng phương pháp
bắt gốc tự do DPPH chúng tôi đã tìm được giá trị IC50 là 0,5245 µg/ml.Chứng tỏ
AGAΙ có hoạt tính kháng oxi hóa rất mạnh.
4.2. KIẾN NGHỊ
Từ kết quả nghiên cứu trên cho thấy cây bình bát nước có chứa các hợp chất
flavonoid có hoạt tính kháng oxi hóa cao. Để có một nhận định tổng quát hơn về cây
bình bát nước, hướng nghiên cứu tiếp theo sẽ tập trung vào :
• Tiếp tục cô lập và nhận danh cấu trúc các chất trong cao EtOAc.
• Khảo sát thành phần hóa học trong cao chloroform, methanol trích ly từ lá
cây bình bát nước.
• Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa trên nhiều hệ khác như xanthin oxydase;
MDA…
TÀI LIỆU THAM KHẢO
.Tài liệu tiếng việt
[1]. Đỗ Tất Lợi (1985), Tinh dầu Việt Nam, NXB Y Học, 22-43.
[2]. Nguyễn Kim Phi Phụng (2005), Phổ NMR sử dụng trong phân tích hữu cơ, Nhà
Xuất Bản Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh.
[3]. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007),Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB đại
học quốc gia Thành Phố Hồ Chí Minh.
[4]. Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ, 243-244.
[5].Võ Văn Chi, Trần Hợp (1999), Cây cỏ có ích ở Việt Nam, NXB Giáo dục, 300-303.
Tài liệu nước ngoài
[6]. Chang Fang-Rong, Chen Chung-Yi, Hsieh Tian-Jye, Cho Chun-Ping, and Wu
Yang-Chang (2000), Chemical Constituents from Annona glabra L. Journal of the
Chinese Chemical Society, 47, 913-920.
[7].Ching-Hsein Chen,Tian-Jye Hsieh,Tsan-Zon Liu,Chi-Liang Chern,Pei-Ying
Hsieh,and Chung-Yi Chen (2004) Annoglabayin, a Novel Dimeric Kaurane
Diterpenoid, and Apoptosis in Hep G2Cells of Annomontacin from the Fruits of
Annona glabra, J. Nat. Prod.(67, 1942-1946)
[8]. Chung-Yi Chen, Fang-Rong Chang, Chun-Ping Cho, and Yang-Chang Wu
(2000)ent-Kaurane Diterpenoids from Annona glabra, J. Nat. Prod. (63, 1000-1003)
[9]. Fujimoto Yoshinori, Eguchi Tadashi (1998), Squamocin, a new cytotoxic
bis-tetrahydrofuran containing acetogenin from Anona squamosa, Chem. Phamr. Bull,
36(12), 4802-4806.
[10]. Hiroshi (2004), Studies on Anonaceous tetrhydrofuranic acetogenins from
Annona squamosa L. seed, Bull. Natl. Inst. Agro-Environ. Sci., 23, 77-149.
[11]. Intaranongpai Junya, Phytochemical investigation and biological activities of
Melodorum siamensis stem and Annona squamosa seed extracts(2006), A Thesis
sumitted in partial fulfillment of the requirements for the degree of doctor or
philosophy, 10-16.
[12]. Liaw Chih-Chuang, Chang Fang-Rong, Lin Chih-Yuan, Chou Chi-Jung, Chiu
Hui-Fen, Wu Ming-Jung, and Wu Yang-Chang(2002), New Cytotoxic
Monotetrahydrofuran Annonaceous Acetogenins from Annona muricata, Nat. Prod.,
65(4), 470-475.
[13]. Li Chao-Ming, Tan Ning-Hua, Mu Qing, Zheng Hui- Lan, Hao Xiao-Jiang,
Liang Hui-Ling, Zhou Jun (1998) Cyclopepties from the seeds of Annona Glabra,
Phytochemistry(Vol 47,No.7,1293-1296)
[14]. Li De Yu, Yu Jing Guang, Luo Xiu Zhen, Sun Lan, Yang Shi Lin(2000),
Muricatenol, a Linear Acetogenin from Annona muricata (Annonaceae),Chinese
Chemical Letters, 11 (3), 239-242.
[15]. Liu Xiao-Xi, Alali Feras Q., Pilarinou Elsa, McLaughlin Jerry L., (1998), Two
bioactive mono-tetrahydrofuran acetogenins, annoglacins A and B, from Annona
glabra L., Phytochemistry, 50, 815–821.
[16]. Liu Xiao-Xi, Alali Feras Q., Pilarinou Elsa, Craig Hopp D., Rogers Lingling L.,
and McLaughlin Jerry L.(1998), Glabracins A and B, Two New Acetogenins from
Annona glabra L., Bioorganic & Medicinal Chemistry, 6, 959-965.
[17]. Magadula Joseph J., Innocent Ester and Otieno Joseph N.(2009), Mosquito
larvicidal and cytotoxic activities of 3 Annona species and isolation of active
principles, Journal of Medicinal Plants Research, 3(9), 674-680.
[18]. M. A. Aderogba, A.O. Ogundaini and J. N. Eloff (2006) Isolation of two
flavonoidsfrombauhiniamonandra (Kuzt) leaves and their antioxidative effects,African
Journal of Traditional, Complementary and Alternative Medicines(Vol. 3, No. 4,
2006, pp. 59-65)
[19] Masanori Inagaki, AkemiOyama, Kazuyoshi Arao, and Ryuichi Higuchi
(2004)Constituents of Crinoidea, 4. Isolation and Structure of Ceramides
andGlucocerebrosides from the Feather Star Comanthus japonica, Chem Pharm Bull,
52(11), 1307-1311
[20]. Ming Li chao, hua Tan Ning(1995), Annomuricatin A, a new cyclopeptide from
seeds of Annona muricata, 17(4), 459-462.
[21]. Padmaja V., Thankamany V., Hara N., Fujimoto Y., Hisham A.(1995),
Biological activities of Annona glabra L., Journal of Ethnopharmacology, 48,21-24.
[22]. Rakesh Ranjan và Mahendra Sahai(2009), Coumarinolignans from the Seeds of
Annona squamosa L., E-Journal of Chemistry, 6(2),518-522.
[22].Sheng-Fa Tsai and Shoei-Sheng Lee (2010) Characterization of
Acetylcholinesterase Inhibitory Constituents from Annona glabra Assisted by HPLC
Microfractionation, J. Nat. Prod. ( 1632–1635)
.[24]. Shi Jian Xia, Wu Hou Ming(1999), Squamin-A, Novel Cyclopeptide from
Annona squamosa,Chinese Chemical Letters,10 (4),299-302.
[25]. Vanden Bergher and Vlietinck A.J. (1991), Methols in plant Biochemistry, 6,
47-48.
[26]. Yang Nian Yun, Tian Li Juan, Meng Zheng Mu, Han Ying (2003), A New
Diterpenoid Dimer from Annona glabra L., Chinese Chemical Letters, 14(1), 58- 61.
[27]. Zhou Yang Ren, Jun Wu Shu (1994), Annonaceous acetogenins from Annona
muricata,Acta Botanica Sinica, 36(10), 805-808. a, V. Thankamany
[28]. Fang-Rong Chang, Pey-Yuh Yang, Jung-Yaw Lin, Kuo-Hsiung Lee, and
Yang-Chang Wu (1998), Bioactive Kaurane Diterpenoids from Annona glabra (61,
437-439).
[29]. Xiao-Xi Liu, Elsa Pilarinou, and Jerry L. McLaughlin (1999), Pondaplin-A novel
cyclic prenylated phenylpropanoid from Annona glabra (40,399-402).
[30]. Xiao-Xi Liu, Elsa Pilarinou, and Jerry L. McLaughlin (1999)Two Novel
Acetogenins, Annoglaxin and 27-Hydroxybullatacin, from Annonaglabra, J. Nat.
Prod. ( 62, 848-85)
[31]. Xiaoxi Liu, Elsa Pilarinou and LMclaughlin (1998) Two novel bioative adjacent
bis-THF acetogenins from the leaves of Annona Glabra, Natural Product Letters (Vol
4, 255-163)
[32]. Xiao-Xi Liu,Feras Q. Alali,Elsa Pilarinou,and Jerry L. McLaughlin(1998)Glacins
A and B: Two Novel Bioactive Mono-tetrahydrofuran Acetogenins fromAnnona
glabra’, J. Nat. Prod. (61, 620-624)
[33]. J.R. Zgoda-Pols, A.J. Freyer, L.B. Killmer, J.R. Porter (2001) Antimicrobial
diterpenes from the stem bark of Mitrephora celebica (45, 1022-1040).
Tài liệu web
[34]. http://cucytegiaothong.mt.gov.vn/PrintView.aspx?ArticleID=2306
[35]. http://ykhoa.net/cactacgia/nguyenyduc/anhuongtuoivang/08_4_Antioxidant.htm
[36].http://diendancntpdhnt.wordpress.com/2012/04/06/c%C6%A1-ch%E1%BA%BF-
ho%E1%BA%A1t-d%E1%BB%99ng-ch%E1%BB%91ng-oxi-hoa/
NHẬN XÉT CỦA HỘI ĐỒNG
Nhận xét của chủ tịch hội đồng
………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… …………………
Nhận xét của thư kí hội dồng
………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………….
Nhận xét của ủy viên hội đồng
………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………...
PHỤ LỤC
