Khóa luận tốt nghiệp: Nghiên cứu phân loại chi Cóc (Spondias L.) ở Việt Nam dựa trên hình thái và phân tử

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH – KTNN

ĐẶNG THỊ ÁNH

NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI CHI CÓC (SPONDIAS L.) Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN HÌNH THÁI VÀ PHÂN TỬ

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Thực vật học

Hà Nội, tháng 05 năm 2019

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH – KTNN

ĐẶNG THỊ ÁNH

NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI CHI CÓC (SPONDIAS L.) Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN HÌNH THÁI VÀ PHÂN TỬ

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Thực vật học

Ngƣời hƣớng dẫn: TS. Lê Chí Toàn

Hà Nội, tháng 05 năm 2019

LỜI CAM ĐOAN

Để đảm bảo tính trung thực của khóa luận, tôi xin cam đoan:

Khóa luận ―Nghiên cứu phân loại chi Cóc (Spondias L.) ở Việt Nam dựa trên hình thái và phân tử‖ là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi, được thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Lê Chí Toàn. Các kết quả trình bày trong khóa luận là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào trước đây.

Xuân Hòa, ngày 21 tháng 4 năm 2019

Sinh viên

Đặng Thị Ánh

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt khoảng thời gian hoàn thành đề tài khóa luận này, tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ và ủng hộ của thầy cô, người thân và bạn bè xung quanh. Tôi rất cảm kích về điều đó.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các quý thầy cô, cán bộ của khoa Sinh–KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, bằng cả tấm lòng, sự nhiệt huyết, và những tri thức uyên bác của mình đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu, những bài học kinh nghiệm mà phải mất khoảng thời gian dài mới có thể đúc kết ra được.

Đặc biệt, với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến TS. Lê Chí Toàn – người thầy, người hướng dẫn trực tiếp đề tài khóa luận này của tôi. Thầy đã đồng hành, trợ giúp tôi trong các bước đọc tài liệu, chắt lọc, thu thập thông tin, làm thí nghiệm; cho tôi những kinh nghiệm hữu ích trong quá trình nghiên cứu. Với kiến thức còn non nớt, và những kinh nghiệm còn hạn chế thì việc thất bại trong quá trình nghiên cứu là lẽ tất yếu, những lời khuyên của thầy đã giúp tôi nhận biết và khắc phục những sai sót gặp phải, vượt qua giới hạn của bản thân để hoàn thành tốt đề tài khóa luận này. Một lần nữa, tôi xin gửi lời cảm ơn tới thầy, chúc thầy có thật nhiều sức khỏe để có thêm nhiều đóng góp hơn trong lĩnh vực nghiên cứu khoa học, và chúc những dự án mà thầy đang ấp ủ thực hiện sẽ gặt hái được nhiều thành công.

Ngoài ra chúng tôi xin trân thành cảm ơn trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã hỗ trợ kinh phí cho nghiên cứu này thông qua đề tài mã số C.2019.01.

Thời gian tôi được làm quen, tiếp xúc với nghiên cứu khoa học chưa nhiều, kiến thức và kinh nghiệm còn hạn hẹp nên không tránh được những thiếu sót, tôi rất mong nhận được những lời góp ý của các quý thầy cô để bản khóa luận được hoàn thiện hơn.

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Xuân Hòa, ngày 21 tháng 4 năm 2019

Sinh viên

Đặng Thị Ánh

MỤC LỤC

PHẦN MỞ ĐẦU ................................................................................................... 1

1. Lý do chọn đề tài ...................................................................................... 1

2. Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu ........................................................... 2

3. Nội dung chính của đề tài ........................................................................ 3

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ................................................................. 3

PHẦN NỘI DUNG ............................................................................................... 4

CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN .............................................................................. 4

1.1. Tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu ...................................... 4

1.2. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .......................... 7

1.2.2. Lịch sử nghiên cứu chi Cóc của Việt Nam ........................................ 9

CHƢƠNG 2 – ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................................................................................... 11

2.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................... 11

2.2. Phạm vi nghiên cứu, địa điểm và thời gian ........................................ 11

2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 13

2.3.1. Cách tiếp cận .................................................................................... 13

2.3.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................. 13

CHƢƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 20

3.1. Kết quả nghiên cứu thực địa ............................................................... 20

3.2. Kết quả phân tích điện di và phân tích khối dữ liệu phân tử .............. 20

3.3. Kết quả nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài.................................. 22

3.4 Các sửa đổi sắp xếp phân loại cho spondias l. Ở việt nam .................. 28

CHƢƠNG 4 – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 32

4.1. Kết luận ............................................................................................... 32

4.2. Kiến nghị ............................................................................................. 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 33

iii

PHỤ LỤC BẢNG

Bảng 2.1. Thông tin mẫu vật và số hiệu trên ngân hàng Gen thế giới của các trình tự DNA được giải mới hoặc sử dụng trong nghiên cứu này. ―–‖ thể hiện thiếu dữ liệu, ―XXX‖ thể hiện các trình tự mới được giải trong nghiên ................................................................................................ 12 cứu này.

Bảng 2.2. Dụng cụ, máy móc sử dụng trong nghiên cứu ................................. 15

Bảng 2.3. Hóa chất cần thiết được sử dụng cho các thí nghiệm tách chiết DNA, PCR, và điện di ............................................................................... 17

Bảng 2.4. Thông tin các mồi được sử dụng trong nghiên cứu ......................... 18

PHỤ LỤC HÌNH

Hình 3.1. Kết quả điện di cho các trình tự của chi Cóc ................................... 20

Hình 3.2. Kết quả alignment. ........................................................................... 21

Hình 3.3. Cây phát sinh loài của chi Cóc (Spondias) theo phân tích Maximum Likelihood từ dữ liệu kết hợp. Chỉ số ủng hộ ML và PP của phân tích BI được trình bày trên các nhánh. ―–‖ thể hiện chỉ số ủng hộ thấp hơn 50%.22

Hình 3.4. Cây phát sinh loài của chi Cóc Spondias theo phân tích Maximum Likelihood từ dữ liệu gen matK. Chỉ số ủng hộ ML và PP của phân tích BI được trình bày trên các nhánh. ―–‖ thể hiện chỉ số ủng hộ thấp hơn 50%.23

Hình 3.5. Cây phát sinh loài của chi Cóc Spondias theo phân tích Maximum Likelihood từ dữ liệu gen trnLF. Chỉ số ủng hộ ML và PP của phân tích BI được trình bày trên các nhánh. ―–‖ thể hiện chỉ số ủng hộ thấp hơn ................................................................................................ 23 50%.

Hình 3.6. Hình thái lá, số lượng lá chét của Allospondias lakonensis (A) và Spondias dulcis (B) .................................................................................... 24

Hình 3.7. Gân ở mép lá của (A) Spondias dulcis và (B) Allospondias lakonenesis ................................................................................................ 25

Hình 3.8. Lông ở bề mặt lá của (A) Spondias dulcis và (B) Allospondias lakonensis ................................................................................................ 25

Hình 3.9. Mẫu chuẩn của Spondias petteloti (A) và Allospondias laxiflora (B) . .................................................................................................................. 26

PHỤ LỤC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Từ đầy đủ

Linnaeus L.

Polymerase Chain Reaction PCR

PTN SHTT Phòng thí nghiệm Sinh học trung tâm

Species sp.

Varietas var.

Viện NCKH & ƯD Viện nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng

PHẦN MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài

Chi Cóc (Spondias L.) là một chi nhỏ thuộc họ Ðào lộn hột hay còn gọi là họ Xoài (Anacardiaceae R. Br.) với khoảng 18 loài trên thế giới, chi Spondias tập trung phân bố ở Nam Mỹ, châu Á và Madagascar [24]. Spondias là chi mẫu chuẩn của phân họ Spondioideae Takht. emend. Pell & J. D. Mitch. và được ủng hộ bằng dữ liệu phân tử qua nghiên cứu của Pell (2004), Mitchell và cộng sự (2006), Pell và cộng sự (2011). Spondias là chi thực vật có giá trị kinh tế khá cao. Quả, rễ của các loài Spondias có giá trị thương mại và y dược.

Lịch sử phân loại của chi Spondias khá phức tạp, đây là một trong những chi đầu tiên của họ Ðào lộn hột (Anacardiaceae) được mô tả bởi Linnaeus (1753). Bentham và Hooker (1862) đầu tiên đã sắp xếp các chi của họ Xoài thành các nhóm và chia họ Xoài thành hai tông Anacardieae và Spondieae. Sau đó, Marchand (1869) đã công bố tông Spondiadeae (như Spondieae) và đây là lần đầu tiên hình thành một mô hình khái niệm của Spondias [16].

Hai quan điểm phân loại của Spondioideae của Châu Á còn nhiều đối lập trong sự phân chia các loài. Trong phiên bản sửa đổi chi Spondias nhiệt đới của Châu Á, Airy Shaw và Forman (1967) đã gộp Allospondias và Solenocarpus với một khái niệm rộng cho chi Spondias, và điều này làm chi này mất đi các đặc điểm nhận biết đặc trưng như: lá đơn với lá kép lông chim, noãn đơn với noãn đa, lá chét có hoặc không có một đường gân ở mép lá [6].

Mitchell và Daly (2015) đưa ra một quan điểm trong đó chấp nhận Allospondias lakonensis rời khỏi Spondias dựa trên các đặc điểm của gân lá và sự phát triển của quả. Tương tự như vậy, Solenocarpus indicus cũng không thuộc về chi Spondias. Ngoài ra các loài Spondias philippinensis, Haplospondias brandisiana, Spondias bipinnata còn là những vấn đề chưa rõ ràng và có lẽ cũng không thuộc về chi Spondias với những đặc điểm hình thái khác biệt. Ngoài ra,

Mitchell và Daly (2015) cũng nhấn mạnh rằng, DNA của Spondias là rất khó khuếch đại ngay cả với các mẫu lá tươi [19].

Hiện nay dữ liệu phân tử dựa trên trình tự DNA của các đoạn gen chuẩn hay còn gọi DNA barcoding được sử dụng phổ biến trên thế giới trong các nghiên cứu hệ thống và tiến hóa thực vật. Kết quả từ dữ liệu phân tử thường đảm bảo được chất lượng và đem lại mức độ tin tưởng cao cho nghiên cứu. Tuy nhiên việc áp dụng công nghệ này vào các nghiên cứu trong nước còn ở mức hạn chế cả về chất lượng và số lượng nghiên cứu. Đối với Spondias, kết quả từ dữ liệu phân tử hiện nay gợi ý rằng, phân họ Spondioideae được chia thành hai nhánh, trong đó Spondias Nam Mỹ là chi của Spondias châu Á [27].

Chi Cóc (Spondias L.) ở Việt Nam được ghi nhận bao gồm 3 loài là S. cytherea, S. petelotii, S. pinnata tập trung phân bố ở các tỉnh miền núi phía bắc và Nam bộ (Lạng Sơn, Lai Châu, Sơn La, Hòa Bình, Lâm Đồng, Đồng Nai) [1]. Mặc dù là một chi nhỏ nhưng Spondias là chi có giá trị kinh tế và một số loài của chi này được trồng rộng rãi. Tuy vậy việc nghiên cứu phân loại và mối quan hệ phát sinh của các loài trong chi Spondias ở Việt Nam chưa được thực hiện. Do đó, một nghiên cứu phân loại cho chi Spondias ở Việt Nam là cần thiết.

Xuất phát từ lí do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: ―Nghiên cứu phân loại

chi Cóc (Spondias L.) ở Việt Nam dựa trên hình thái và phân tử‖.

2. Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu

Tiến hành điều tra và khẳng định số lượng loài thuộc chi Spondias ở Việt

Nam.

Điều tra thực địa, tiến hành thu mẫu cho việc tách chiết, phân lập DNA và xây dựng bộ sưu tập tiêu bản khô của một số loài thuộc chi Spondias ở Việt Nam.

Xây dựng khóa định loại và cây phát sinh loài bằng dữ liệu phân tử cho

chi Spondias ở Việt Nam.

3. Nội dung chính của đề tài

Nghiên cứu tài liệu, tiêu bản của các loài thuộc chi Spondias ở Việt Nam tại các phòng tiêu bản của Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Dược liệu, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, Bảo tàng Sinh học thuộc Đại học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội.

Điều tra thực địa, tiến hành thu mẫu cho việc tách chiết, phân lập DNA và xây dựng bộ sưu tập tiêu bản khô của một số loài thuộc chi Spondias ở Việt Nam.

Tiến hành các thí nghiệm như tách chiết DNA, PCR, giải trình tự một số gen (03 gen lục lạp: rbcL, matK, trnLF) cho các mẫu của chi Spondias ở Việt Nam.

Phân tích kết quả xử lí trình tự được nghiên cứu bằng chương trình và

thuật toán: Geneious, jModelTest, Maximum Likelihood, Bayesian Inference.

Xây dựng khóa định loại và cây phát sinh loài bằng dữ liệu phân tử cho

chi Spondias ở Việt Nam.

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Đề tài góp phần tìm hiểu thực trạng số lượng các loài của chi Spondias ở Việt Nam, từ đó đánh giá được mức độ đa dạng và đưa ra được các đề xuất nhằm bảo tồn chi Spondias ở Việt Nam. Hơn nữa, đề tài sẽ đóng góp các thông tin, dữ liệu cần thiết (cả hình thái, phân tử và sự phân bố) của chi Spondias ở Việt Nam cho công tác xây dựng hệ thống Thực vật chí của Việt Nam. Ngoài ra, đề tài sẽ giúp sinh viên được tìm hiểu và làm việc trực tiếp với các thí nghiệm và phân tích phân tử hiện đại.

PHẦN NỘI DUNG

CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về đối tƣợng, lĩnh vực nghiên cứu

Theo hệ loại APG thống phân III (2009), họ Xoài/Đào

lộn hột (Anacardiaceae) chứa khoảng 70 chi với khoảng 600 loài trên thế giới. Họ Xoài được chia thành hai phân họ là phân họ Xoài với khoảng 10 chi và 115 loài và phân họ Đào lộn hột với khoảng 60 chi và 485 loài [8, 28].

(quả, hạt), Harpephyllum (quả), Pleiogynium

Họ Xoài là họ thực vật có nhiều sản phẩm nông nghiệp nổi tiếng và có giá trị kinh tế cao như là hạt điều, xoài, hạt tiêu hồng, và quả hồ trăn. Nhiều loài trong các chi của họ Xoài được trồng và dùng làm thực phẩm như: Antrocaryon (lấy quả và hạt), Bouea (quả), Buchanania (quả và hạt), Choerospondias (quả), Rhus (quả), Cyrtocarpa (quả), Lannea (quả), Ozoroa (gỗ, quả), Fegimanra (hạt), (quả), Haematostaphis Pseudospondias (quả và hạt), Schinus L. (quả), Sclerocarya (quả), Searsia (quả), Sorindeia (quả), Spondias (quả), và Trichoscypha (quả và hạt) [20].

Tuy không có thành viên của Anacardiaceae nào được xếp hạng là cây gỗ lớn, nhưng giữ vai trò quan trọng trong thị trường gỗ nhỏ và được đánh giá cao về chất lượng và khả năng chống mối mọt. Gỗ của Schinopsis ở Nam Mỹ có khả năng chống mối mọt tốt và được sử dụng rộng rãi ở Argentina cho ngành đường loại gỗ khác bao gồm: Abrahamia, Anacardium, Astronium, sắt. Các Campnosperma, Ozoroa, Dracontomelon dao, Loxopterygium, Myracrodruon, Protorhus, Schinopsis, Sclerocarya, Trichoscypha được sử dụng vào nhiều mục đích khác nhau như trong sản xuất: làm diêm, tủ, cung, than, nhà ở, tay cầm rìu, củi, bát, ván, và cột [20].

Nhiều loài của Anacardiaceae có giá trị việc trong trang trí sân vườn. Các loài của Cotinus, Rhus, Schinus, Searsia, P. chinensis, P. mexicana, Harpephyllum caffrum, Lannea coromandelica, Rhodosphaera, Smodingium, và Toxicodendron được trồng thành cụm, có hoa đẹp để trang trí cho nhà cửa, tạo

hàng cây thường xanh hoặc rụng lá. Tuy nhiên, một vài loài sau khi được trồng trong nông, lâm nghiệp hay trang trí đã phát triển vượt ra sự kiểm soát và trở thành loài xâm lấn có thể kể tới như: Toxicodendron succedaneum ban đầu được trồng ở Brazil, nhưng đã phát triển rất mạnh sau khi được giới thiệu trồng tại Nhật Bản, hiện nay đang nằm trong danh sách loài xâm lấn ở Nhật Bản. Gần đây Pistacia chinensishas được nhập trồng và bắt đầu xâm lấn ở Texas (Hoa Kỳ). Ngoài ra, nhiều loài khác có giá trị cao trong y dược phẩm như: Spondias (quả: lợi tiểu; rễ: làm kem dưỡng da; vỏ cây dùng sản xuất: thuốc tẩy, thuốc xổ, chữa bệnh phong, chữa ho, trị các vết thương; lá: chữa bệnh phong, tẩy giun, trị đau dạ dày) [20].

Chi Cóc thuộc phân họ Spondoideae. Chi này gồm 18 loài đã được mô tả, trong số đó có 7 loài tìm thấy ở vùng nhiệt đới châu Á và 10 loài tìm thấy ở vùng nhiệt đới Nam Mỹ, và 01 loài ở Madagascar. Trong số 18 loài Cóc được tìm thấy, có 10 loài có lá và quả ăn được, các loài này được thuần hóa để trồng ở vùng nhiệt đới châu Á và Nam Mỹ [28], trong đó, S. dulcis được trồng phổ biến trên thế giới. S. dulcis ở vùng nhiệt đới Nam Mỹ được dùng làm nước ép, làm kem; ở vùng biển Caribbean nó được sử dụng như hương liệu tạo vị cho sữa chua chứa nhiều vitamin C [20].

Trên thế giới, các nghiên cứu phân loại và phát sinh loài của thực vật hạt kín được tiến hành từ rất sớm và đã có rất nhiều công bố khoa học được đăng trên các tạp chí và sách chuyên ngành. Tuy nhiên việc sử dụng dữ liệu phân tử vào các hướng nghiên cứu này ở Việt Nam còn rất hạn chế và tồn tại nhiều khó khăn. Ngoài ra, số lượng và chất lượng các nghiên cứu phát sinh loài và tiến hóa ở Việt Nam trong những năm gần đây là chưa cao.

Hiện nay dữ liệu phân tử dựa trên trình tự DNA của các đoạn gen chuẩn hay còn gọi DNA barcoding được sử dụng phổ biến trên thế giới trong các nghiên cứu hệ thống và tiến hóa thực vật và di truyền. Kết quả từ dữ liệu phân tử thường đảm bảo được chất lượng và đem lại mức độ tin tưởng cao cho nghiên cứu. Trong ba hệ gen gồm: gen nhân, gen ty thể và gen lục lạp; các trình tự của

gen lục lạp được sử dụng nhiều và phổ biến đối với các nghiên cứu thực vật. Trình tự của ba gen rbcL (ribulose 1,5–bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit), matK (Maturase K), trnLF (tRNA–Leu (trnL) gene, partial sequence (trình tự từng phần); trnL–trnF intergenic spacer, complete sequence; và tRNA–Phe (trnF)) được sử dụng nhiều trong nghiên cứu hệ thống và phát sinh của thực vật hạt kín nói chung và Spondias nói riêng [29].

rbcL (ribulose 1,5–bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit), là gen được tìm thấy trong lục lạp, quy định enzyme RuBisCO trong quá trình quang hợp. rbcL có giá trị lớn và được sử dụng nhiều trong nghiên cứu đánh giá mối quan hệ phát sinh loài [29]. Tuy nhiên trình tự gen rbcL thường có tính bảo thủ loài và chi khá cao, có nghĩa là trình tự rbcL của các loài trong cùng một chi có độ tương đồng cao. Mặc dù vậy, rbcL là gen dễ khuếch đại và tạo thuận lợi cho nhiều nghiên cứu.

matK (Maturase K) là một gen lục lạp, protein của nó mã hóa một maturase intron [29]. Trình tự gen matK thường có tính bảo thủ loài thấp do đó rất hữu ích cho nghiên cứu phát sinh. Tuy nhiên, matK lại là một trong những trình tự gen lục lạp khó khuếch đại nhất. Mặc dù vậy, matK vẫn là một gen được sử dụng rất nhiều trong các nghiên cứu hiện nay. Để khắc phục khó khăn trong quá trình khuếch đại (PCR) các nhà khoa học có thể tác động đến chương trình chạy PCR hoặc thay đổi trình tự mồi. Yu và cộng sự (2011) đề xuất việc sử dụng matK và thúc đẩy việc áp dụng matK như một mã vạch DNA bằng việc sử dụng các loại mồi mới. Nghiên cứu sử dụng 58 loài từ 47 họ thực vật hạt kín, kết quả của nghiên cứu này chỉ ra rằng các đoạn mồi mới có khả năng khuếch đại mạnh mã gen matK (93,1%) và tỷ lệ trình tự có thể sử dụng được là rất cao (92,6%) [14, 23].

trnLF (tRNA–Leu (trnL) gene, partial sequence; trnL–trnF intergenic spacer, complete sequence; and tRNA–Phe (trnF) gene) cũng là một gen lục lạp, tuy nhiên trnLF là một gen khảm, phân mảnh, nó bao gồm ba đoạn là trnL, trnL–trnF intergenic spacer và trnF. Trình tự của gen trnLF có tính bảo thủ thấp,

do đó cung cấp nhiều thông tin cho việc xác định rõ ràng mối quan hệ của các loài nên có giá trị sử dụng cao trong nghiên cứu phát sinh. Tuy nhiên đây cũng là một gen khó khuếch đại và đặc biệt là rất khó gióng hàng và căn trình tự [29].

Hệ thực vật của Việt Nam rất đa dạng và chưa được nghiên cứu kĩ, đặc biệt là các nghiên cứu phát sinh loài sử dụng dữ liệu phân tử. Do đó, đây là một hướng nghiên cứu có thể đóng góp nhiều thông tin và dữ liệu quý giá cho khoa học thế giới và Việt Nam.

1.2. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc

1.2.1. Lịch sử nghiên cứu chi Cóc trên thế giới

Lịch sử phân loại của chi Cóc Spondias khá là phức tạp, đây là một trong những chi đầu tiên của họ Ðào lộn hột (Anacardiaceae) được mô tả bởi Linnaeus (1753). Bentham và Hooker (1862) đầu tiên đã sắp xếp các chi của họ này thành các nhóm và chia họ này thành hai tông Anacardieae và Spondieae [9]. Sau đó, Marchand (1869) đã công bố tông Spondiadeae (như Spondieae) và đây là lần đầu tiên hình thành một mô hình khái niệm của Spondias [16].

Hai quan điểm phân loại của Spondioideae châu Á còn nhiều đối lập trong sự phân chia các loài. Trong phiên bản sửa đổi của Spondias nhiệt đới của châu Á, Airy Shaw và Forman (1967) đã gộp Allospondias và Solenocarpus với một khái niệm rộng cho chi Spondias, và điều này làm chi này mất đi các đặc điểm nhận biết đặc trưng như: lá đơn vs. lá kép lông chim, noãn đơn vs. noãn đa, lá chét có hoặc không có một đường gân ở mép lá [6].

Mitchell và Daly (2015) đưa ra một quan điểm trong đó chấp nhận Allospondias lakonensis rời khỏi Spondias dựa trên các đặc điểm của gân lá và sự phát triển của quả. Tương tự như vậy, Solenocarpus indicus cũng không thuộc về chi Spondias [19]. Ngoài ra các loài Spondias philippinensis, Haplospondias brandisiana, Spondias bipinnata còn là những vấn đề chưa rõ ràng và có lẽ cũng không thuộc về chi Spondias với những đặc điểm hình thái khác biệt. Ngoài ra,

Mitchell và Daly (2015) cũng nhấn mạnh rằng, DNA của Spondias là rất khó khuếch đại ngay cả với các mẫu lá tươi [19].

Kết quả từ dữ liệu phân tử hiện nay gợi ý rằng, phân họ Spondioideae được chia thành hai nhánh, trong đó Spondias Nam Mỹ nằm ở một nhánh phát sinh riêng biết và có quan hệ chị em gần gũi với Spondias châu Á, điều này cũng gợi ý cho nghiên cứu lịch sử tiến hóa và phát sinh của chi Spondias trên toàn thế giới.

Chayamarit (1997) nghiên cứu mối quan hệ phát sinh của họ Ðào lộn hột ở Thái Lan dựa trên dữ liệu phân tử (bao gồm chi Spondias), tuy nhiên do sự hạn chế về việc lấy mẫu và các trình tự gen (chỉ bao gồm duy nhất một gen rbcL) nên kết quả của nghiên cứu này là rất hạn chế đối với chi Spondias. Kết quả chỉ ra rằng, Spondias có quan hệ gần gũi và nằm trên cùng một nhánh phát sinh với Dracontomelon [10].

Pell (2004) nghiên cứu mối quan hệ phát sinh của họ Ðào lộn hột dựa trên dữ liệu sinh học phân tử và hình thái (bao gồm chi Spondias). Nghiên cứu được tiến hành trên 9 chi của họ Ðào lộn hột bao gồm cả Spondias, sử dụng trình tự của 5 gen: ETS, ITS, trnLF, rps16, matK. Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng, khi kết hợp 2 gen ETS và ITS cho chỉ số ủng hộ bootstrap cao hơn khi kết hợp 3 gen ETS, ITS và trnLF [20].

Trong thực vật chí Trung Quốc, Min and Barfod (2008) ghi nhận hai loài của chi Spondias ở Trung Quốc là S. pinnata và S. lakonensis. Loài S. lakonensis bao gồm hai thứ là S. lakonensis var. lakonensis và S. lakonensis var. hirsuta [18].

Silva và cộng sự (2015) thực hiện nghiên cứu phát sinh các loài của chi Spondias ở Nam Mỹ dựa trên dữ liệu phân tử. Nghiên cứu được tiến hành trên 6 loài của chi Spondias ở Nam Mỹ sử dụng trình tự của 3 gen là rbcL, matK và trnH–psbA spacer [24]. Kết quả của nghiên cứu chỉ ra rằng, trình tự gen rbcL và matK của các loài thuộc Spondias ở Nam Mỹ là tương đối bảo thủ, trong khi đó,

trnH–psbA spacer khá là khác biệt giữa các loài và có thể cho phép phân biệt được các loài.

Al–Saghir (2017) tiến hành nghiên cứu bản đồ nhiễm sắc thể của 5 loài thuộc chi Spondias sử dụng kính hiển vi huỳnh quang [7]. Kết quả của nghiên cứu thể hiện rằng, tất cả 5 loài được nghiên cứu đều có chung bộ nhiễm sắc thể là 2n = 32. Hơn nữa, tất cả các loài Spondias có quan hệ di truyền gần gũi.

1.2.2. Lịch sử nghiên cứu chi Cóc của Việt Nam

Chi Cóc (Spondias) ở Việt Nam đến nay được ghi nhận bao gồm 3 loài là S. cytherea, S. petelotii, S. pinnata và tập trung phân bố ở các tỉnh miền núi phía bắc và Nam bộ (Lạng Sơn, Lai Châu, Sơn La, Hòa Bình, Lâm Đồng, Đồng Nai) [1]. Mặc dù là một chi nhỏ nhưng Spondias là chi có giá trị kinh tế và một số loài của chi này được trồng rộng rãi.

Tuy nhiên, theo Phạm Hoàng Hộ (2003) chi Cóc (Spondias) ở Việt Nam bao gồm 3 loài là S. cythera, S. pinnata và S. mombin. Tuy vậy, tác giả cũng nhấn mạnh rằng ông chỉ quan sát thấy S. cythera, S. pinnata (dọc ven biển từ Vinh tới Đà Lạt, Đồng Nai), trong khi S. mombin có lẽ là không chắc chắn [2].

Lê Thị Kim Phụng và Trần Thị Tướng An (2013) tiến hành nghiên cứu chiết xuất pectin từ vỏ Cóc (S. cytherea) bằng phương pháp hỗ trợ bởi vi sóng [3]. Nghiên cứu đưa ra một quy trình tối ưu cho việc chiết xuất pectin từ vỏ cóc sử dụng các tác nhân hóa học (HCl và cồn 96o) kết hợp với vi sóng (MAE – microwave assisted extraction method) ở 400 W trong 10 phút. Quy trình này được cho là giúp giảm chi phí và nâng cao hiệu quả sản xuất pectin so với phương pháp chiết xuất truyền thống.

Nguyễn Xuân Quyền và cộng sự (2015) tiến hành nghiên cứu giá trị sử dụng của các loài trong họ Xoài ở Việt Nam. Nghiên cứu đã chỉ ra các giá trị sử dụng khác nhau của các loài trong họ Xoài, trong đó có giá trị của các loài Cóc (Spondias L.) là: cây ăn quả, làm thuốc, lấy gỗ, làm cảnh [4].

Tuy nhiên, việc nghiên cứu phân loại và hệ thống phát sinh của Spondias chưa được quan tâm chú trọng vì vậy mối quan hệ phát sinh của các loài thuộc chi Spondias ở Việt Nam là chưa rõ ràng. Do đó, một nghiên cứu phân loại và phát sinh cho Spondias ở Việt Nam là cần thiết.

Sử dụng phương pháp phân loại dựa trên dữ liệu hình thái và phân tử chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: ―Nghiên cứu phân loại chi Cóc (Spondias L.) ở Việt Nam dựa trên hình thái và phân tử‖.

CHƢƠNG 2 – ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu

Nghiên cứu tiến hành trên các đối tượng loài thuộc chi Cóc như đã được ghi nhận trong ―Danh lục các loài thực vật Việt Nam‖ và một số tài liệu có liên quan. Ngoài ra, nghiên cứu này cũng tiến hành thu thập và phân tích thông tin, dữ liệu phân tử một số loài Cóc trên thế giới dựa trên dữ liệu từ Ngân hàng Gen (Genbank–NCBI).

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên 14 loài (16 cá thể) của hai chi Spondias và Allospondias (Bảng 2.1). Trong đó bao gồm: 04 mẫu được thu ở Việt Nam, 12 mẫu được thu thập trên ngân hành Gen thế giới (Genbank – NCBI).

Nghiên cứu sử dụng 03 loài thuộc chi Buchanania (B. siamensis, B.

reticulata và B. glabra) làm đối chứng cho phân tích phát sinh loài.

Nghiên cứu sử dụng 03 gen lục lạp bao gồm rbcL, matK và trnLF cho các phân tích phát sinh loài. Phương pháp tách chiết, PCR, giải trình tự và phân tích được trình bày chi tiết ở mục 3.

2.2. Phạm vi nghiên cứu, địa điểm và thời gian

2.2.1. Phạm vi nghiên cứu

Phân tích hình thái và phân tử sử dụng các mẫu tươi, các tiêu bản khô, các

trình tự DNA của các loài thuộc chi Cóc ở Việt Nam.

2.2.2. Địa điểm

Một số địa điểm được ghi nhận phân bố của các loài thuộc chi Spondias

tại Việt Nam.

Địa điểm kiểm tra tiêu bản khô: Phòng tiêu bản, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật; Viện Dược liệu; Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam; Bảo tàng Sinh học thuộc Đại học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội.

Bảng 2.1. Thông tin mẫu vật và số hiệu trên ngân hàng Gen thế giới của các trình tự DNA đƣợc giải mới hoặc sử dụng trong nghiên cứu này. ―–‖ thể hiện thiếu dữ liệu, ―XXX‖ thể hiện các trình tự mới đƣợc giải trong nghiên cứu này.

rbcL

trnLF

Ngƣời thu mẫu W. Thomas s.n. (NY) Mitchell s.n. (NY); Roberto E. 528

F. Arreola & F. Mora s.n.

Địa điểm Brazil USA; Costa Rica Brazil Mexico Brazil

Loài Spondias tuberosa Arruda Spondias mombin L. Spondias venulosa (Engl.) Engl. Spondias purpurea L. Spondias sp.

matK KP774614 KP774626 KP055577 KP774609 JQ590140 KP055575 KP774610 KP774632 KR081921 KP774612 KP774619 KR081868 KP774613 KP774630

–

Brazil

R. Perez s.n.; E. Mart nez S., C. H. Ramos, R. Lombera & G. Dom nguez 25557

–

GQ981883 KR081870

Brazil

M. C. Machado & N. G. Antas 1563

– – –

KR081875 KP055574 KR081819

Brazil

Australia

KR081811 KR081767

Spondias radlkoferi Donn.Sm. Spondias testudinis J.D. Mitch. & D.C. Daly Spondias malayana Kosterm. USA Spondias globosa J.D. Mitch. & D.C. Daly Brazil Spondias bahiensis P.Carvalho, Van den Berg & M.Machado Spondias acida Blume

– –

Brazil

Spondias dulcis Parkinson Spondias pinnata (Koenig ex L.f.) Kurz Allospondias laxiflora Lace Allospondias laxiflora Lace Allospondias laxiflora Lace Buchanania glabra Wall. ex Engl.

Lai Chau, Vietnam Lang Son, Vietnam Vinh Phuc, Vietnam Vietnam Vietnam

XXX XXX XXX – –

JF739148 XXX XXX XXX – –

KR081815 XXX XXX XXX XXX KP055491

Buchanania siamensis Miq.

Vietnam

AB925072 AB925701 KP055493

Pell 775 (BKL) C. van den Berg 2171 E. Melo, M. C. Machado & B. M. Silva 11933 D.A. Powell & H'ng Kim Chey 579 M. C. Machado, A. R. Barbosa & M. R. Santos 1302; Weiblen, G. D. WS5B0380 KP774606 C.T. Le Le10 C.T. Le Le04 C.T. Le Le18 C.T. Le Le17 Pell 1062 (NY) Pell 1054 (NY); Toyama et al. 554 (KYUM) Pell 1057 (NY); Toyama et al. 167 (KYUM)

Buchanania reticulata Hance

Vietnam; Cambodia

AB924829 AB925441 KP055492

Địa điểm thu mẫu: một số tỉnh của Việt Nam như Vĩnh Phúc, Phú Thọ,

Lạng Sơn, Lai Châu, Sơn La, Hòa Bình, Tp. Hồ Chí Minh.

Địa điểm tiến hành thí nghiệm: Phòng thí nghiệm Thực vật, Viện Nghiên

cứu Khoa học và Ứng dụng trường Đại học sư phạm Hà Nội 2.

2.2.3. Thời gian: 10/2018–05/2019.

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1. Cách tiếp cận

Nghiên cứu tiêu bản của các loài Spondias tại phòng tiêu bản Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Dược liệu, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, Bảo tàng Sinh học thuộc Đại học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội.

Tiến hành nghiên cứu thực địa và thu mẫu trong điều kiện cho phép.

Tiến hành thí nghiệm tại Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, trường

Đại học Sư phạm Hà Nội 2.

2.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.2.1. Phương pháp thu thập tài liệu và nghiên cứu tiêu bản

Thu thập, tổng hợp các tài liệu liên quan đến chi Spondias và các chi có

quan hệ gần gũi với Spondias.

Nghiên cứu tiêu bản của các loài Spondias: kiểm tra đặc điểm hình thái, thu thập các thông tin cần thiết trên tiêu bản (tên khoa học, tên địa phương, địa điểm thu mẫu, người thu và các ghi chú trên tiêu bản).

2.3.2.2. Phương pháp nghiên cứu thực địa và thu mẫu

Tiến hành thực địa từ một đến hai lần tại những địa điểm được ghi nhận có sự phân bố của chi Spondias, nhằm thu mẫu tiêu bản (một hoặc hai tiêu bản với mỗi mẫu thu được) và mẫu để tách chiết DNA.

Mẫu tiêu bản sau khi được xử lý cắt tỉa sẽ được ép phẳng và sấy khô để bảo quản cho nghiên cứu lâu dài. Trong khi đó, đối với mẫu DNA, các mẫu lá sẽ được lấy và chứa trong các túi kẹp có chứa hạt hút ẩm để làm khô mẫu và tránh phá hủy cấu trúc DNA, các mẫu DNA này sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm phân tử.

2.3.2.3. Phương pháp nghiên cứu hình thái

Nghiên cứu sử dụng phương pháp hình thái so sánh dựa trên các đặc điểm cấu tạo bên ngoài của các cơ quan sinh dưỡng và sinh sản của thực vật, trong đó đặc biệt là cơ quan sinh sản [5]. Nhiều tiêu bản chi Cóc được nghiên cứu (nghiên cứu online thông qua các hình ảnh của tiêu bản được công bố) ở nhiều phòng tiêu bản và bảo tàng trên thế giới như: HN, HNU, PE, HAL, TCD, L, C, A và KUN. Các kí hiệu tên của phòng tiêu bản theo the Index Herbariorum (http://sweetgum.nybg.org/ih/). Ngoài ra, chúng tôi cũng nghiên cứu tiêu bản ở phòng tiêu bản bộ môn Thực vật trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 (*) và phòng tiêu bản của Viện Dược liệu (**).

Khóa định loại được xây dựng theo kiểu khóa lưỡng phân.

2.3.2.4. Phương pháp tách chiết DNA, PCR, giải trình tự gen

Các mẫu DNA được đánh kí hiệu tương đồng với mẫu tiêu bản và tiến hành tách DNA theo phương pháp CTAB (Cetyl trimethyl ammonium bromide) [12].

Các dụng cụ, máy móc, và hóa chất cần thiết cho các thí nghiệm tách chiết

DNA, PCR, và điện di được trình bày trong Bảng 2.2 và 2.3.

Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất

Để tiến hành các thí nghiệm tách chiết DNA, PCR và điện di cần chuẩn bị:

Các loại đầu tip, bi sắt nghiền mẫu, ống eppendorf (1,5 µl; 2,0 µl) cần

được hấp vô trùng và để khô.

Bảng 2.2. Dụng cụ, máy móc sử dụng trong nghiên cứu

Số TT Tên dụng cụ máy móc

Đơn vị quản lý

1. Ống eppendorf

Nhóm nghiên cứu

2. Đầu típ các loại

Nhóm nghiên cứu

3. Bi nghiền mẫu

Nhóm nghiên cứu

4. Nhóm nghiên cứu

Kẹp, giấy lau, giấy parafilm, gang tay, khẩu trang

5. PTN Thực vật

Đèn cồn

6. PTN Thực vật

Máy sấy mẫu

7. PTN Thực vật

Tủ lạnh

8. Tủ lạnh âm sâu

PTN SHTT và Viện NCKH & ƯD

9. Bộ micropipet đơn kênh

PTN SHTT và Viện NCKH & ƯD

10. Máy nghiền mẫu Tissuelyser II

Viện NCKH & ƯD

11. Viện NCKH & ƯD

Cân phân tích

12. Viện NCKH & ƯD

Máy li tâm

13. Nồi hấp (bể ổn nhiệt)

Viện NCKH & ƯD

14. Viện NCKH & ƯD

Máy PCR

15. Viện NCKH & ƯD

Bộ điện di

16. Hệ thống chụp ảnh gel điện di

Viện NCKH & ƯD

17. Lò vi sóng

Viện NCKH & ƯD

Các ống eppendorf (1,5 µl; 2,0 µl) được dùng trong thí nghiệm cần được

đánh số mã hóa và ghi thông tin đầy đủ như: thời gian, tên mẫu…

Các mồi cần được pha loãng bằng ddH2O (nước cất 2 lần và khử ion) trước khi sử dụng.

Phƣơng pháp tách chiết DNA

Bước 1. Lấy mẫu. Dùng gang tay, kẹp để lấy 2 gram mẫu khô vào ống

eppendorf 2.0 đã được hấp vô trùng, đánh số mã hóa và chuẩn bị bi sắt.

Bước 2. Nghiền mẫu. Sử dụng máy Tissuelyser II, thời gian nghiền là 80

giây chia 4 lần.

Bước 3. Cho 800µl đệm CTAB (CTAB buffer) vào mỗi ống, lắc ống từ 5-

10 phút để mẫu trộn đều trong hóa chất.

Bước 4. Đem mẫu hấp ở nhiệt độ 65oC trong vòng 1 giờ 30 phút trong bể

ổn nhiệt.

Bước 5. Cho 700µl CI (24:1) vào từng mẫu ống, lắc đều 10 phút.

Bước 6. Ly tâm mẫu ở tốc độ 13000 vòng/15 phút, sử dụng máy ly tâm

Mikro 200R.

Bước 7. Hút và chuyển lớp dung dịch ở phía trên cùng thu được sau ly tâm

sang ống eppendorf 1,5 mới đã chuẩn bị sẵn (đã được đánh số mã hóa).

Bước 8. Cho 800µl isopropanol vào ống eppendorf 1,5 mới chuyển dung

dịch sang, lắc đều trong vòng 5-10 phút, sẽ thu được kết tủa DNA.

Bước 9. Đem ủ các ống mẫu sau lắc ở nhiệt độ -20oC trong 30 phút.

Bước 10. Lấy mẫu sau ủ và tiến hành ly tâm 13000 vòng/15 phút, lọc dịch,

thu kết tủa DNA.

Bước 11. Rửa kết tủa DNA bằng cồn 70%, tiến hành 2-3 lần. Sau đó để

khô 30 phút trong tủ hút.

Bước 12. Thêm 100µl dịch đệm TE (TE buffer) vào mỗi ống mẫu chứa

DNA lắc đều và bảo quản trong tủ lạnh âm sâu (-20 đến -50 oC).

Bảng 2.3. Hóa chất cần thiết đƣợc sử dụng cho các thí nghiệm tách chiết DNA, PCR, và điện di

Số TT Tên hóa chất

Thí nghiệm sử dụng

CTAB buffer

1. Tách chiết DNA

2. CI (chloroform–isoamyl alcohol, 24:1)

Isopropanol

3. Tách chiết DNA

Cồn 70o

4. Tách chiết DNA

TE buffer

5. Tách chiết DNA

MasterMix

6. PCR

7. PCR

ddH2O

8. Primers (mồi các loại, gồm xuôi và ngược)

PCR

9. Marker (HighRanger 1Kb DNA ladder)

Điện di

10. Agarose G10

Điện di

11. TAE 50X

Điện di

12. Thuốc nhuộm DNA

Điện di

Phƣơng pháp tiến hành phản ứng PCR:

Tiến hành chạy PCR (Polymerase Chain Reaction) sau khi tách các mẫu DNA. Phản ứng PCR sử dụng 2×Taq PCR MasterMix (Biomed, China) bao gồm 0,05 u/μL of Taq DNA Polymerase, 4 mM MgCl2, 0,4 mM of dNTPs và buffer của phản ứng.

Hỗn hợp phản ứng PCR chứa 25 µl cho mỗi phản ứng (mỗi ống mẫu) bao

gồm:

 12,5 µl MasterMix.

 2 µl mỗi mồi (bao gồm mồi xuôi và mồi ngược) (Bảng 4).

 2 µl DNA.

 6,5 µl ddH2O.

Chương trình chạy cho phản ứng PCR bao gồm: 5’ ở 95°C, 37 chu kỳ với

30’’ ở 95°C, 50’’ ở 52°C, và 1’ 30’’ ở 72°C, và giai đoạn cuối cùng 10’ ở 72°C.

Bảng 2.4. Thông tin các mồi đƣợc sử dụng trong nghiên cứu

Gen

Tên mồi

Trình tự 5’–3’

Tài liệu tham khảo

matK

78F

CAGGAGTATATTTATGCACT

Vidal–Russell và Nickrent (2008a)

1420R

TCGAAGTATATACTTTATTCG

163F

AGGTTACTAATTGTGAAACG

Vidal–Russell và

Nickrent (2008b)

1564R

ATGATTRACTAGATCGTTGA

CTATATCCACTTATCTTTCAGGGT

Ooi và CS (1995)

AAAGTTCTAGCACAAGAAAGTCGA

rbcL

ATGTCACCACAAACAGARAC

Vidal–Russell và Nickrent (2008a)

889R

CTATCAATAACTGCATGCAT

trnL–F C

CGAAATCGGTAGACGCTACG

Taberlet và CS (1991)

ATTTGAACTGGTGACACGAG

Phƣơng pháp tiến hành điện di và giải trình tự

Các sản phẩm PCR được kiểm tra và tinh sạch bằng 1,0% agarose gels và sau đó sẽ được tiến hành giải trình tự sử dụng chính các đoạn mồi đã dùng để khuếch đại.

2.3.2.5. Phương pháp tập hợp, kiểm tra các trình tự gen và dựng cây phát sinh.

tiến hành chạy BLAST trên ngân hàng Gen

Các trình tự thu được được kiểm tra và kết hợp với nhau (kết hợp mạch xuôi và mạch ngược) sử dụng phần mềm Geneious v.8.0.5 [15]. Sau đó các trình (NCBI, tự được http://www.ncbi.nlm.nih.gov) để kiểm tra tính chính xác của trình tự. Tất cả các trình tự chính xác được sắp xếp bằng cách sử dụng MUSCLE v.3.8.31 trong Geneious v.8.0.5.

Dữ liệu cuối cùng thu được được sử dụng để tạo cây phát sinh. Nghiên cứu này sử dụng hai phương pháp dựng cây phát sinh là Maximum Likelihood (ML) và Bayesian Inference (BI), sau đó được tiến hành chạy trên CIPRES Science Gateway Portal [17]. Đối với cây phát sinh xây dựng bằng phương pháp ML được chạy trên phần mềm RAxML v.8.2.8 [25, 26] với mô hình tốt nhất cho khối dữ liệu GTR + I + G được xác định từ phần mềm jModelTest v.2.1.6 [11]. Chỉ số ủng hộ của cây ML được chạy lặp lại 1000 lần. Cây phát sinh xây dựng bằng phương pháp BI được chạy trên phần mềm MrBayes v.3.1.2 [22] với cùng mô hình tốt nhất sử dụng cho cây ML. Thông số Markov chain Monte Carlo (MCMC) trong phương pháp BI được cài đặt chạy 10,000,000 thế hệ và mỗi cây phát sinh loài được tập hợp từ 1000 thế hệ. Phần mềm Tracer v.1.6 [13], được sử dụng để kiểm tra chất lượng của cây phát sinh cuối cùng. 25% thế hệ cây ban đầu được loại bỏ, cây phát sinh loài cuối cùng và chỉ số ủng hộ Posterior Probabilities (PP) được thu từ các cây còn lại.

CHƢƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả nghiên cứu thực địa

Trong quá trình nghiên cứu thực địa tại một số địa điểm nghiên cứu như đã lên kế hoạch và được trình bày ở Chương 2, chúng tôi thu được một số loài của hai chi Spondias và Allspondias (Hình S1, S2 ở phần phụ lục) và lựa chọn những loài mà dữ liệu phân tử chưa được công bố để tiến hành các thí nghiệm và thu dữ liệu phân tử.

Qua điều tra thực địa, nhóm nghiên cứu của chúng tôi nhận thấy rằng đa số các thông tin trong các tài liệu nghiên cứu thực vật của Việt Nam trước đây về chi Cóc vẫn còn tương đối chính xác, tuy nhiên cũng có một số thông tin đã không còn chính xác có thể do các địa danh đã bị thay đổi hoặc do môi trường sinh thái đã thay đổi. Vì vậy cần có sự chỉnh sửa và bổ sung các thông tin chính xác cho các loài của chi Cóc ở Việt Nam.

3.2. Kết quả phân tích điện di và phân tích khối dữ liệu phân tử

Chúng tôi đã tách chiết DNA tổng số và thực hiện thành công phản ứng PCR cho 4 mẫu nghiên cứu, mỗi mẫu với 3 gen theo phương pháp đã trình bày ở Chương 2. DNA tổng số không có màu và hòa tan hoàn toàn trong dung dịch TE. Sản phẩm PCR có hàm lượng cao và cho 1 băng sắc nét (Hình 3.1).

Hình 3.1. Kết quả điện di cho các trình tự của chi Cóc

Trình tự DNA của gen rbcL, matK, và trnLF của 4 mẫu nghiên cứu đã được giải trình tự thành công với kích thước thu được lần lượt là 850, 1000, 400 bp. Sơ đồ điện di giải trình tự cho các đỉnh huỳnh quang rõ ràng. Chúng tôi giải trình tự hai chiều (hai mạch xuôi và ngược) để thu được đầy đủ thông tin và độ dài của các đoạn mạch sản phẩm.

Trình tự các gen được BLAST

trên ngân hàng Genbank (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch), và kết quả BLAST thể hiện trình tự từng gen của 4 mẫu có mức độ tương đồng rất cao (99%) so với các dữ liệu hay các trình tự đã có của mỗi gen trên ngân hàng gen. Thông tin từ kết quả tìm kiếm BLAST cho thấy, các đoạn trình tự gen mà chúng tôi giải được là chính xác.

Chúng tôi giải thành công 10 trình tự mới và tiến hành gióng hàng, sắp xếp alignment cho từng khối dữ liệu đơn rbcL, matK, và trnLF. Chúng tôi thu được ma trận dữ liệu của 3 gen rbcL, matK, và trnLF lần lượt là 890, 1200, 1000 pb. Khối dữ liệu kết hợp cả 3 gen có kích thước là 3090 bp (Hình 3.2). Trong đó khối dữ liệu trnLF và matK là khó tiến hành gióng hàng, sắp xếp nhất do có nhiều đoạn gen tiến hóa nhanh và nhiều khoảng nối giữa các đoạn gen.

Hình 3.2. Kết quả alignment.

(A)–Kết hợp (B)–gen matK (C)–gen trnLF

3.3. Kết quả nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài

Phân tích mối quan hệ phát sinh loài bằng dữ liệu phân tử từ các khối dữ liệu đơn như rbcL, matK và trnLF là không rõ ràng và mức ủng hộ thấp hơn so với kết quả từ khôi dữ liệu kết hợp (xem Hình 3.4, 3.5). Do đó chúng tôi sử dụng cây phát sinh loài từ khối dữ liệu kết hợp để trình bày mối quan hệ phát sinh loài của chi Cóc (Spondias) và được thể hiện ở Hình 3.3.

Hình 3.3. Cây phát sinh loài của chi Cóc (Spondias) theo phân tích Maximum Likelihood từ dữ liệu kết hợp. Chỉ số ủng hộ ML và PP của phân tích BI đƣợc trình bày trên các nhánh. ―–‖ thể hiện chỉ số ủng hộ thấp hơn 50%.

Kết quả phân tích phân tử thể hiện rằng Allospondias (chi Dâu gia xoan)

có quan hệ rất gần gũi với Spondias về mặt di truyền (Hình 3.3).

Allospondias được ghi nhận gồm có 02 loài trên thế giới là Allospondias laxiflora và A. lakonensis. Tuy nhiên, theo Thực vật chí Trung Quốc, Min và Barfod (2008) ghi nhận Allospondias như tên đồng nghĩa của Spondias với loài Spondias lakonensis [18]. Kết quả từ dữ liệu phân tử ủng hộ mạnh mẽ Allospondias là một chi riêng biệt so với Spondias (Hình 3.3).

Hình 3.4. Cây phát sinh loài của chi Cóc Spondias theo phân tích Maximum Likelihood từ dữ liệu gen matK. Chỉ số ủng hộ ML và PP của phân tích BI đƣợc trình bày trên các nhánh. ―–‖ thể hiện chỉ số ủng hộ thấp hơn 50%. Hình 3.5. Cây phát sinh loài của chi Cóc Spondias theo phân tích Maximum Likelihood từ dữ liệu gen trnLF. Chỉ số ủng hộ ML và PP của phân tích BI đƣợc trình bày trên các nhánh. ―–‖ thể hiện chỉ số ủng hộ thấp hơn 50%.

Pell và cộng sự (2011) cũng đã công nhận Allospondias như một thành viên của họ Xoài Anacardiaceae [21]. Hơn nữa, Allospondias có thể dễ dàng phân biệt với Spondias theo các đặc điểm hình thái như: 11–23 cặp lá chét, thường có lớp lông trên mặt lá và không có gân lá ngoại vi (so với 4–11 cặp lá chét, cả hai mặt của lá nhẵn, không có lông, có gân lá ngoại vi ở Spondias) xem Hình 3.6, 3.7, 3.8); lá đài có nhiều lông tơ (so với, lá đài nhẵn ở Spondias); quả

hạch hình trứng đến tròn đều (so với, quả hạch hình elip ở Spondias). Vì vậy từ các bằng chứng trên, một cập nhật và sắp xếp mới cho Allospondias với Allospondias lakonensis trong thực vật chi Trung Quốc là cần thiết.

Hình 3.6. Hình thái lá, số lƣợng lá chét của Allospondias lakonensis (A) và Spondias dulcis (B)

Hình 3.7. Gân ở mép lá của (A) Spondias dulcis và (B) Allospondias lakonenesis

Hình 3.8. Lông ở bề mặt lá của (A) Spondias dulcis và (B) Allospondias lakonensis

Trong ―Danh lục các loài Thực vật Việt Nam‖, Nguyễn Tiến Bân và cộng sự (2003) đã ghi nhận 03 loài của chi Cóc Spondias ở Việt Nam bao gồm S. Petteloti - loài đặc hữu ở Đồng Mô, tỉnh Lạng Sơn [1]. Tuy nhiên, qua điều tra thực địa tại thị trấn Đồng Mô, cũng như kết quả phân tích dữ liệu phân tử của mẫu Spondias petteloti được thu tại Đồng Mô, Lạng Sơn (kí hiệu Le04) cho thấy rằng, Spondias petteloti có quan hệ gần gũi về mặt di truyền và nằm cùng nhánh với Allospondias và kết quả này được ủng hộ mạnh mẽ bởi dữ liệu phân tử. Phân tích hình thái của chúng tôi cũng thể hiện rằng đặc điểm hình thái của Spondias petteloti là rất tương đồng với Allospondias lakonensis như: gồm 11–23 cặp lá chét, không có gân ở mép lá, hoa được bao bởi bẹ hoa có kích thước 0.5–1 mm, bầu 4 hoặc 5, ống nhụy 1, quả có kích thước 8–10×6–7 mm (Hình 3.6, 3.9). Do đó, từ những bằng chứng trên, một ghi nhận và sắp xếp cho Spondias petteloti như tên đồng nghĩa của Allospondias lakonensis là rất cần thiết, nghiên cứu này đề xuất rằng Spondias petteloti là một tên đồng nghĩa của Allospondias lakonensis dựa trên cả dữ liệu hình thái và phân tử.

Hình 3.9. Mẫu chuẩn của Spondias petteloti (A) và Allospondias laxiflora (B)

Ngoài ra, Pell và cộng sự (2011) đã gợi ý rằng Allospondias laxiflora có thể được ghi nhận như một chi độc lập riêng rẽ dựa trên sự khác biệt như: đầu nhụy chia thành nhánh riêng biệt, hình dạng của đầu nhụy (hình tròn), quả không có ngăn và không có thịt quả ở các khoang hạt [21]. Tuy nhiên, chúng tôi đề xuất các nghiên cứu sử dụng dữ liệu phân tử của Allospondias laxiflora trong tương lại cần được tiến hành để khẳng định ý kiến của Pell và cộng sự (2011).

Spondias được ủng hộ là nhóm đơn phát sinh (monophyletic group), hai nhánh chính được ghi nhận trong Spondias. Nhánh đầu tiên bao gồm các thành viên Cóc Nam Mỹ được ủng hộ (Hình 3.3). Nhánh thứ hai gồm có S. radlkoferi, S. mombin từ Nam Mỹ cộng với các thành viên Cóc châu Á. Các loài Cóc có ở Việt Nam như S. pinnata và S. dulcis không nằm liền nhau trên cây phát sinh loài, nhưng chúng được đặt nằm trong nhánh Cóc châu Á. Ngoài ra, hiện nay một số tài liệu thực vật của Việt Nam vẫn đang sử dụng tên S. cytherea Sonn. công bố năm 1782 như là tên chính thức hay tên hợp pháp, tuy nhiên điều này là không chính xác. Nghiên cứu này mạnh mẽ đề nghị rằng S. dulcis Parkinson công bố năm 1773 là tên hợp pháp cho loài Cóc mà đang được nhắc đến, và ngược lại, S. cytherea Sonn. là một tên đồng nghĩa của S. dulcis Parkinson.

Phạm HH (2003) đã ghi nhận chi Cóc (Spondias) ở Việt Nam bao gồm S. mombin [2]. Tuy nhiên, ông cũng chú ý rằng, ông chưa từng quan sát thấy S. mombin tại Việt Nam. Michell và Daly (2015) đã gợi ý rằng S. mombin là một loài tự nhiên và có nguồn gốc ở Mexico đến nam và đông nam Brazil. Mặc dù hiện nay S. mombin được con người trồng rộng rãi ở các vùng nhiệt đới nhưng dựa trên các phân tích phân tử của chúng tôi, S. mombin là một thành viên của Cóc Nam Mỹ và không thuộc vào nhánh Cóc châu Á. Do đó, sự ghi nhận S. mombin tự nhiên ở Việt Nam là không hợp lý và không chính xác. Nghiên cứu này ghi nhận hai loài S. dulcis và S. pinnata cho chi Cóc Việt Nam.

3.4. Các sửa đổi sắp xếp phân loại cho Spondias L. ở Việt Nam

Spondias Linnaeus, Sp. Pl. 1: 371. 1753.

Mẫu chuẩn.— Spondias mombin L.

Mô tả.— Cây nhỏ hoặc to, rụng lá hoàn toàn hoặc một phần. Lá mọc xen kẽ, sắp xếp theo kiểu xoắn ốc, có cuống, không cân đối; mép lá có răng cưa một phần hoặc toàn bộ. Cụm hoa hình chùy, ở đầu cành hoặc nách lá. Hoa mẫu 4 hoặc 5, lưỡng tính hay đơn tính về mặt chức năng. Nhị hoa 8–10; chỉ nhị nhỏ, có độ dài bằng nhau. Bầu có 4 hoặc 5 ô, với 1 noãn trên mỗi ô; ống nhụy 4 hoặc 5, tự do, hoặc ống nhụy 1. Quả có hột cứng; thịt quả ngọt; hạt hóa gỗ, được bao phủ bởi một hệ thống xơ; phôi kéo dài, dạng thẳng đến hơi cong.

Phân bố.— Trong tổng số 18 loài Spondias trên thế giới, 10 loài tự nhiên ở Nam Mỹ, được phân bố từ Mexico đến phía nam Brazil; một loài tự nhiên ở Madagascar; và 7 loài là tự nhiên ở châu Á và nam Thái Bình Dương.

Khóa định loại cho Spondias ở Việt Nam

Cuống hoa rõ ràng; vỏ hạt chứa nhiều sợi xơ thẳng hoặc cong tỏa ra ngẫu nhiên, các sợi xơ không được sắp xếp theo chiều dọc, không có lớp màng ngoại vi; nhu mô (thịt quả) phát triển; được trồng; không được biết đến ở trạng thái hoang rã................................................................................ …Spondias dulcis

Gần như không có cuống hoa; vỏ hạt không có các sợi xơ tỏa ra ngẫu nhiên, các sợi xơ được sắp theo chiều dọc, và hình thành lớp màng ngoại vi nhẵn; nhu mô (thịt quả) không phát triển; hoang rã .............................. Spondias pinnata

Spondias dulcis Parkinson, J. voy. South Seas 39. 1773.

Poupartia dulcis (Parkinson) Blume, Bijdr. ﬂ. Ned. Ind. 1161. 1826–27. Evia dulcis (Parkinson) Blume, Mus. Bot. 1(15): 233. 1850.

Type:— based on Spondias dulcis Parkinson.

Spondias cytherea Sonn., Voy. Indes orient. 3: 242, t. 123. 1782.

Type:— Mauritius (cultivated), Commerson s.n. (P!).

Spondias dulcis Parkinson var. commersonii Engl. in A. DC & C. DC., Monogr. phan. 4: 247. 1883.

Type:— Several syntypes cited.

Spondias dulcis Parkinson var. mucroserrata Engl. in A. DC. & C. DC., Monogr. phan. 4: 247. 1883.

Type:— Mexico, w/o date, Pavón 744 (G n.v.; GH–photo!, NY–photo!).

Spondias dulcis Parkinson var. integra Engl. in A. DC. & C. DC., Monogr. phan. 4: 248. 1883.

Type:— Indonesia. Amboin, w/o date, Reinwardt s.n. (W!).

Mẫu chuẩn:— TAHITI. (without date), Capt. Cook [Banks & Solander] s.n. (lectotype, BM–793299 n.v., designated by A. C. Smith 1985: 453).

Mô tả:— Cây gỗ, lưỡng tính, cao từ 10–25 m. Đường kính thân cây 20–40 cm; vỏ ngoài có màu xám nhạt hoặc nâu nhạt, nhẵn đến nhám, lá bắc muộn, dạng đĩa mỏng, thân cây hoàn toàn nhẵn trừ một số tuyến có lông. Lá thường rụng hoặc rụng một phần, 4–11 cặp lá chét, dài 11–60 cm, cuống lá dài 9–15 cm, cuống lá chét dài 2–8 mm, đỉnh dài 10–30 mm, kích thước cơ bản của một lá 4.3–7.5 × 1.3–3.5 cm, đôi khi có thể lớn tới 5–15 × 1.7–5 cm, tất cả lá chét thuôn dài hoặc có hình mũi mác đến hình ovan, lá chét đầu có kích thước 5–9 × 1.9–3.5 cm, có dạng elip với nhọn cơ bản, lá chét ở đỉnh thuôn nhọn đôi khi nhọn sắc, mũi nhọn dài 4–13 mm, lá chét bán đối xứng với nhau, mép lá có viền vòng quanh và thường có răng cưa lồi lõm. Cụm hoa thường phát triển với lá mới, ở đầu cành hoặc nách lá, tập trung nhiều ở các đầu cành, dài 9–32.5 cm, đường kính 3–7 mm, trục thứ cấp dài tới 11.5 cm, lá bắc dài 0.4–5 mm, lá bắc con 0.3–0.9 mm, hình trứng, cuống dài 1–3 mm, đôi khi các lá bắc và cuống nhỏ có lông. Đài hoa dài 0.7–1.2 mm, sẻ đến gần đáy, thùy dài 0.5–1 mm, cánh hoa có kích thước 2–3

× 0.5–1.1 (1.3) mm, thuôn dài đến ovan, đỉnh nhọn đến hơi nhọn, màu kem hoặc trắng hoặc xanh trắng, bóng, nhị hoa lan rộng, bao phấn dài 0.7–0.8 mm, mặt trước và sau hình elip đến ovan, mặt bên thuôn dài, đĩa hoa cao 0.3–0.5(0.7) mm, dày 0.2–0.4 mm, màu vàng, chụy hoa dài 1.3 mm, giẹp–hình trứng đến hình trụ, dài 0.8 mm, nhụy dạng trứng ngược (đầu nhỏ ở phía cuối lá), hơi mở rộng. Quả có kích thước 4–7 × 2–4 cm, hình elip, hơi tròn hoặc thuôn dài, khi chín có màu vàng hoặc cam; xơ được tỏa ra từ vỏ hạt ngẫu nhiên.

Phân bố:— Vùng nhiệt đới của Nam Mỹ, châu Á, và châu Úc.

Phân bố ở Việt Nam:— Được trồng rộng rãi ở Việt Nam.

Thời gian sinh sản:— Ra hoa từ tháng 3–5; quả từ tháng 6–12.

Mẫu vật nghiên cứu:— Việt Nam. Phú Thọ: 21/8/2018, C.T Le LCT01 (*); Vĩnh Phúc: 23/8/2018, C.T Le LCT02 (*); Phú Thọ: 26/8/2018, V.H. Nguyen & C.T Le LCT03 (*); Ha Noi: 02/11/1981, K.L. Phan P1831 (HNU); Lạng Sơn: 28/4/ 1938, A. Petelok 6384 (HNU); 28/4/1938, A. Petelok 6384 (A). Peru. 1777, L.H. Ruiz s.n. (HAL); Thailand. Bangkok: 4/1927, Kerr & G. Arthur Francis 12795A (TCD).

Spondias pinnata (Linnaeus f.) Kurz, Prelim. Rep. Forest Pegu, App. A, 44; App. B, 42. 1875.

Type:— INDIA, (without date), König, J.G., s.n.

Mô tả:— Cây rụng lá, cao từ 10–15 m, cành màu nâu vàng, nhẵn. Cuống lá dài 10–15 cm, cuống và cuống lá chét nhẵn, lá chét 5–11 cặp đối diện, cuống lá có kích thước 3–5 mm, phiến lá có hình dạng ovan thuôn dài đến kiểu thuôn hình elip, kích thước 7–12 × 4–5 cm, mỏng, hai mặt nhẵn, đáy hình nêm đến vòng tròn, thường không đối xứng, mép lá có răng cưa hoặc không, đỉnh nhọn, gân bên có 12–25 cặp, các gân ngoại vi ở mép lá tập hợp lại. Cụm hoa hình chùy, dài 25–35cm, nhẵn. Hoa không có cuống hoặc rất ngắn, màu trắng, nhẵn. Đài hoa có thùy hình tam giác, khoảng 0.5 mm, cánh hoa hình ovan đến thuôn dài, kích

thước 2.5 × 1.5 mm, đỉnh nhọn. Nhị hoa dài 1.5 mm. Bầu nhụy hình cầu 1 mm; ống nhụy 4 hoặc 5, tự do, 0.5 mm. Quả hạch hình elip đến hình trứng, khi chín có màu cam vàng, 3.5–5 × 2.5–3.5 cm, phần bên trong hóa gỗ và có rãnh, các sợi xơ được sắp xếp theo chiều dọc và hình thành một lớp màng mịn ở phía ngoài; quả chín thường có 2 hoặc 3 hạt.

Phân bố:— Trung Quốc, Bhutan, Campuchia, Ấn Độ, Indonesia, Lào, Malaysia, Myanmar, Nepal, Philippines, Singapore, Thái Lan, và Việt Nam.

Phân bố ở Việt Nam:— Lai Châu, Sơn La, Hòa Bình, Nghệ An, Quảng Nam, Gia Lai, Lâm Đồng, Ninh Thuận, Đồng Nai.

Thời gian sinh sản:— Ra hoa tháng 4–6; ra quả tháng 7–9.

Mẫu vật nghiên cứu:— Việt Nam. Lai Châu: 13/10/2018, C.T. Le et al. LCT010 (*); 27/9/ 2000, D.K. Harder et al. DKH 5685 (HN); Tuyên Quang: 1/11/2003, N.Q. Binh & D.D. Cuong VN 1203 (HN); Gia Lai: 4/11/2002, T. Tuan 153 (**); Trung Quốc. Vân Nam: 18/11/2000, Y.M. Shiu & W.H. Chun 13125 (KUN); 10/1936, C.W. Wang 79418 (KUN); 8/1936, C.W. Wang 77690 (KUN); 8/1936, C.W. Wang 77620 (PE); Hải Nam: 20/8/ 1929, F.A. McClure 704 (PE); 26/6/ 1936, S.K. Lau 27277 (KUN); 16/6/ 1932, S.K. Lau 98 (PE); Ấn Độ: J.G. König s.n. (C); INDONESIA. Java: C.L. Blume s.n. (L).

CHƢƠNG 4 – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

Nghiên cứu được tiến hành dựa trên cả dữ liệu hình thái và phân tử, trong nghiên cứu này của chúng tôi đã giải thành công các trình tự gen có tính tương đồng cao so với các mạch gen trên Genbank. Qua nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy hai đoạn gen matK và trnLF có tính bảo thủ không cao và khó gióng hàng, sắp xếp (alignment) hơn so với rbcL. Nhưng cũng chính vì thế mà hai gen này cung cấp nhiều thông tin cho xây dựng cây phát sinh và giúp xác định được mối quan hệ của các loài trong nghiên cứu.

Kết quả phân tích của nghiên cứu khẳng định rằng, chi Dâu gia xoan (Allospondias) có mối quan hệ gần gũi với chi Cóc (Spondias) về mặt di truyền. Một đề xuất ghi nhận chi Dâu gia xoan cho hệ thực vật Trung Quốc.

Dựa trên các bằng chứng từ dữ liệu sinh thái và dữ liệu phân tử, chúng tôi khẳng định chi Cóc ở Việt Nam có 2 loài là Spondias dulcis và Spondias pinnata, hai loài Cóc ở Việt Nam tuy không có quan hệ di truyền quá gần gũi nhưng chúng đề nằm trên nhánh phát sinh của Cóc châu Á. Một lưu ý cho việc sử dụng tên hợp pháp cho loài Spondias dulcis.

Nghiên cứu này khẳng đinh Spondias petteloti là một tên đồng nghĩa của

Allospondias lakonensis dựa trên bằng chứng hình thái và phân tử.

4.2. Kiến nghị

Với kết quả có độ tin cậy cao khi kết hợp phân tích dữ liệu phân tử và hình thái, cho thấy được nhiều tiềm năng của hướng nghiên cứu này. Hơn nữa, nghiên cứu sử dụng các phương pháp phân tích dữ liệu hiện đại được công nhận (được công bố trên các tạp chí ISI uy tín của thế giới) và đang sử dụng trong các nghiên cứu cùng hướng trên thế giới. Chúng tôi đề nghị thực hiện nhiều nghiên cứu cùng hướng trên các đối tượng thuộc tông Cóc, họ Xoài và nhiều họ thực vật của Việt Nam.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu trong nước

1. Nguyễn Tiến Bân (2003) Danh lục các loài thực vật Việt Nam. Tập 2, 132.

Nxb Nông Nghiệp.

2. Phạm Hoàng Hộ (2003) Cây cỏ Việt Nam. Tập II, 372–373. Nxb Trẻ. 3. Lê Thị Kim Phụng và Trần Thị Tướng An (2013) ―Chiết xuất pectin từ vỏ cóc (Spondias cytherea) bằng phương pháp hỗ trợ bởi vi sóng‖, Tạp chí Hóa học, 51.

4. Nguyễn Xuân Quyền (2015) Giá trị sử dụng của các loài trong họ xoài (Anacardiaceae r. Br.) Ở Việt Nam. Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 6.

5. Nguyễn Nghĩa Thìn (2007), Các phương pháp nghiên cứu thực vật, tr. 5–7,

Nxb. Đại học quốc gia Hà Nội.

Tài liệu nước ngoài

6. Airy–Shaw HK, Forman LL (1967) ―The genus Spondias L. (Anacardiaceae)

in tropical Asia‖, Kew Bulletin, 21, 1–19.

7. Al–Saghir MG (2017) ―Karyotyping of Spondias L. (Anacardiaceae) using fluorescent microscope‖, Advances in plants and Agriculture research, 7, 00280.

8. APG III (2009) An update of the Angiosperm Phylogeny Group classification for the orders and families of flowering plants: APG III. Botanical Journal of the Linnean Society 161: 105–121.

9. Bentham G, Hooker JD (1862) Anacardiaceae. In: Genera Plantarum. Reeve

& Co., London 1, 415–428.

10. Chayamarit K (1997) ―Molecular phylogeny analysis of Anacardiaceae in

Thailand‖, Thai Forest Bulletin (BOT), 25, 1–13.

11. Darriba D. và cộng sự (2012) JModelTest 2: More models, new heuristics

and parallel computing. Nature Methods, 9: 772.

12. Doyle JJ, Doyle JL (1987) ―A rapid DNA isolation procedure for small

quantities of fresh leaf tissue‖, Phytochem. Bull, 19, 11–15.

13. Drummond AJ, Rambaut A. ( 2007) BEAST: Bayesian evolutionary analysis

by sampling trees. BMC Evolution Biology, 7: 214.

14. Jing YU và cộng sự (2011) ―New universal matK primers for DNA barcoding angiosperms‖, Journal of Systematics and Evolution, 49 (3), 176–181.

15. Kearse M. và cộng sự (2012). Geneious basic: an integrated and extendable desktop software platform for the organization and analysis of sequence data, Bioinformatics 28, 1647–1649.

16. Marchand NL (1869) Révision du Groupe des Anacardiacées. Baillière JB et

Fils, Paris.

(GCE)‖,

17. Miller MA, Pfeiffer W, Schwartz T (2010) ―Creating the CIPRES Science Gateway for inference of large phylogenetic trees, in: Proceedings of the Institute of gateway computing environments workshop Electrical and Electronics Engineers (IEEE), New Orleans, USA, pp. 1–8. 18. Min T, Barfod A (2008) Anacardiaceae In: Wu A, Raven PH, Hong D (Eds) Flora of China. Science Press, Beijing and Missouri Botanical Garden Press, St Louis, 11, 335–357.

19. Mitchell JD, Daly DC (2015) ―A revision of Spondias L. (Anacardiaceae) in

the Neotropics‖, Phytokeys, 55, 1–92.

20. Pell (2004) ―Molecular systematics of the cashew family (Anacardiaceae)‖

LSU Digital Commons, 4–9.

21. Pell S. K. và cộng sự (2011), Anacardiaceae, in: Kubitzki K. (Ed.), The families and genera of vascular plants, Flowering plants: Eudicots; Sapindales, Cucurbitales, Myrtaceae, vol. 10. Springer, Hamburg, Germany 7–51.

22. Ronquist F, Huelsenbeck JP. (2003) MrBayes 3: Bayesian phylogenetic

inference under mixed models. Bioinformatics, 19: 1572–1574.

23. Seung–Chul Kim và cộng sự (2007) ―Phylogenetic analysis of chloroplast DNA matK gene and ITS of nrDNA sequences reveals polyphyly of the genus Sonchus and new relationships among the subtribe Sonchinae‖, Molecular Phylogenetics and Evolution, 44, 578–597.

24. Silva JN, Costa AB, Silva JV (2015) ―DNA barcoding and phylogeny in Neotropical species of the genus Spondias‖, Biochemical Systematics and Ecology, 61, 240–243.

25. Stamatakis và cộng sự (2008) A rapid bootstrap algorithm for the RaxML

web servers. Systematic Biologists, 575: 758–771.

26. Stamatakis

(2006) RAxML–VI–HPC, Maximum Likelihood–based phylogenetic analyses with thousands of taxa and mixed models. Bioinformatics, 2221: 2688–2690.

climatic niche and

27. Weeks A và cộng sự (2014) ―To move or to evolve: Contrasting patterns of in in connectivity evolution (Anacardiaceae and Burseraceae)‖, Frontiers

intercontinental ―Terebinthaceae‖ Genetics, 409, 1–20.

Tài liệu trực tuyến 28. https://vi.wikipedia.org/wiki/Cóc_(cây). 29. https://vi.wikipedia.org/wiki/gen_matK, rbcL, trnLF.

Hình S1. Hình thái phát hoa, quả của (A) Spondias dulcis và (B) Spondias pinata.

Hình S2. Một số tiêu bản đƣợc sử dụng trong nghiên cứu

(A) Buchanania Blume, (B) Spondias pinata.