Luận văn : THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) part 2

Chia sẻ: Sadfaf Asfsggs | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:14

Thêm vào BST

Báo xấu

165
lượt xem 42
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Các bệnh thường gặp trên tôm nuôi thường được phân chia thành hai loại bệnh truyền nhiễm và không truyền nhiễm trong đó chủ yếu là do bệnh truyền nhiễm. Từ tình hình dịch bệnh chung ở trên cho thấy để phát triển bền vững nghề nuôi tôm đòi hỏi phải kết hợp rất nhiều yếu tố quan trọng như nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất giống và nuôi tôm thịt, các vấn đề về dinh dưỡng và môi trường, đồng thời không kém phần quan trọng đó là nghiên cứu các tác nhân gây bệnh để tìm...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn : THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) part 2

6 Các bệnh thường gặp trên tôm nuôi thường được phân chia thành hai loại bệnh truyền nhiễm và không truyền nhiễm trong đó chủ yếu là do bệnh truyền nhiễm. Từ tình hình d ịch bệnh chung ở trên cho thấy để phát triển bền vững nghề nuôi tôm đòi hỏi phải kết hợp rất nhiều yếu tố quan trọng như nghiên cứu ho àn thiện quy trình sản xuất giống và nuôi tôm th ịt, các vấn đề về dinh dư ỡng và môi trư ờng, đồng thời không kém phần quan trọng đó là nghiên cứu các tác nhân gây bệnh để tìm ra những biện pháp phòng trị bệnh hiệu quả. 2.3 Đặc điểm hệ thống miễn dịch của tôm sú. Môi trường nước gồm một loạt các thông số tác động đến sự sinh trư ởng và tái sản xuất của sinh vật. Ở điều kiện bình thường thì giữa sinh vật (vật chủ ), nguồn bệnh và môi trường giữ trạng thái cân bằng, bất cứ sự phá vỡ cân bằng nào đều có thể gây bệnh. Trong hầu hết các trường hợp, nguồn gốc chính của việc phát sinh bệnh là vấn đề môi trường dù rằng trong bản thân nội tại của vật chủ có sự tồn tại của mầm bệnh, đây không nên xem là nguyên nhân chính sinh ra bệnh. Cơ ch ế kháng bệnh của tôm chủ yếu là miễn dịch không đặc hiệu, điều này có hạn chế so với động vật có xương sống do sự khác biệt tiến hoá biểu hiện ở chỗ không có và không tạo ra đư ợc kháng thể đáp ứng lại kháng nguyên lạ xâm nhập. Các phân tử có hoạt tính miễn dịch trong huyết tương (hemolymph) của tôm gồm hai dạng chủ yếu là huyết bào (hemocyte) và các phân tử lectin. Từ máu của giáp xác có thể phân lập được ba nhóm tế b ào là b ạch cầu không hạt, bạch cầu bán hạt và b ạch cầu có hạt. Trong đó bạch cầu không hạt chủ yếu là những thực b ào loại bỏ các thể lạ xâm nhập bao gồm virus, vi khuẩn và các tế bào nấm. Số lượng tế b ào thực bào chiếm từ 2 - 28 % trong tổng số các tế b ào máu. Sự thực b ào có thể xảy ra tại nơi bị tổn thương, trong các mô và cơ quan lọc của hệ thống tuần hoàn và đôi khi cả chính trong thể dịch. Hiệu quả của sự thực bào phụ thuộc vào tác nhân xâm nhập, cũng như các yếu tố sinh lý của ký chủ và môi trường. Bạch cầu bán h ạt đóng vai trò đầu tiên trong việc phát hiện và bắt giữ các thể lạ có kích thước lớn, và trợ giúp cho hoạt động thực bào thông qua sự hoạt hoá của hệ thống Pro-phenoloxydase. Kết quả của quá trình ho ạt hoá này là các sản phẩm oxy hoá được h ình thành có ho ạt tính cao và do đó rất độc đối với vi sinh vật. Lectin là phân tử glycoprotein có khả năng gắn với phần đư ờng của các phân tử khác, đặc biệt ở các tác nhân lạ. Điều kỳ lạ là vi khu ẩn, virus, độc tố cũng có thể có
7 lectin bề mặt. Các phân tử lectin n ày một mặt có thể giúp nối kết tác nhân lạ với huyết bào tôm, hoạt hóa chúng làm tăng hoạt động thực bào và ho ạt tính kháng khuẩn. Mặt khác vi khuần, virus cũng có thể sử dụng lectin để sáp nhập vào tế bào tôm ở vị trí các thụ thể để khởi đầu cho quá trình nhiễm trùng. Ngoài các b ạch cầu kể trên thì ở giáp xác có các tiểu quần thể bạch cầu đảm nhiệm chức năng như tế bào diệt tự nhiên, tiêu diệt tế b ào ung thư, tế bào nhiễm virus và tế bào ngoại lai. Như vậy tôm cũng có đáp ứng miễn dịch tế b ào và d ịch thể đ ối với tác nhân virus nhưng không có tế b ào tạo ra kháng thể và không có sự bảo vệ đặc hiệu chống lại tác nhân lạ. Vì vậy sự nhiễm virus dai dẳng tồn tại hiển nhiên trong cơ th ể tôm. Vì th ế việc tăng cường sức đề kháng cho các đối tượng nuôi thuỷ sản thuộc nhóm giáp xác không th ể dựa vào việc sử dụng các loại vaccin mà chủ yếu là các biện pháp tăng cường hiệu quả đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu thông qua cải thiện điều kiện môi trường nuôi và sử dụng các chất kích thích miễn dịch. 2.4 Khái quát về bệnh đốm trắng và virus gây hội chứng đốm trắng trên tôm sú. 2.4.1 Tác nhân gây bệnh. Bệnh đốm trắng được xem là b ệnh nguy hiểm và gây hậu quả nghiêm trọng nhất đến ngành nuôi tôm công nghiệp. Bệnh được phát hiện đầu tiên vào năm 1993. Virus dạng hình trứng, kích thước 120 x 275 nm, có một đuôi phụ ở một đầu, kích thước 70 x 300 nm. Virus có ít nhất 5 lớp protein, trọng lượng phân tử từ 15 – 28 kilodalton. Vỏ bao có 2 lớp protein VP28 và VP 19; nucleocapsid có 3 lớp VP26, VP24 và Vp15. Nhân có cấu trúc DNA sợi đôi ( dsDNA ): không có th ể ẩn ( Occlusion body ). Khi bị nhiễm bệnh đốm trắng, tôm rất yếu và mềm vỏ do các đốm trắng (nên gọi là bệnh đốm trắng) có đường kính từ 0,5 – 2 mm, hiện rất rõ ở dưới vỏ kitin. Đốm trắng là ch ất đọng lại không b ình thường của muối canxi bởi biểu bì vỏ kitin. Khi đã thấy rõ dấu hiệu này thì tôm chết rất nhanh. 2.4.2 Khu vực phân bố. Bệnh đốm trắng xuất hiện đầu tiên tại Bắc Á vào năm 1992 – 1993, sau đó bệnh lan rộng ra khắp khu vực Châu Á và trên th ế giới. Dịch bệnh được phát hiện trước tiên ở Đài Loan năm 1992, Trung Quốc 1993, sau đó là Nh ật, Indonesia, Thái Lan,
8 Malaysia, Ấn Độ, Việt Nam, Bangladesh, Texas (Hoa Kỳ 1995). Bệnh đã làm giảm nghiêm trọng sản lư ợng tôm ở các quốc gia trên. 2.4.3 Ký chủ. Hầu hết các lo ài tôm he đ ều có thể nhiễm bệnh này. Một số lo ài tôm he có th ể nhiễm ngoài tự nhiên như P. monodon, P. japonicus, P. chinensis, P. indicus, P. merguiensis, P. seriferus, P. vannamei. Một số tôm he đ ã b ị nhiễm trong điều kiện thí nghiệm như P. stylirotris, P. aztecus, P. duorarum, P. setifecus,… Một điều nguy hiểm là ngoài tôm he, m ột số loài của Metapenaeus spp cũng bị nhiễm, và một số giáp xác khác như cua (Scylla serrata, Callapa lophos,…), tôm hùm (Parulinus spp), tôm càng xanh (Macrobrachium rosrnbergii), Artemia,…cũng có th ể bị nhiễm trong tự nhiên và trong cảm nhiễm nhân tạo. Mặt khác bệnh n ày có thể xảy ra ở hầu hết giai đoạn phát triển của tôm. Người ta đã gặp bệnh này ở Postlarvae 20 ngày tuổi, tôm mẹ, nhưng thường xảy ra nhất là ở Post 50 – 70 ngày tuổi. Rajendran và CTV (1999) đã nghiên cứu thực nghiệm ở bờ biển Đông Nam Ấn Độ bằng cách lấy virus bệnh đốm trắng từ tôm sú nhiễm bệnh tiêm ho ặc cho ăn với 5 loài tôm nước mặn (P. monodon, P. indicus, P. semisulcatus, Metapenaeus monoceros), 2 loài tôm nước ngọt (Macrobrachium rosenbergii, M. idella), 4 loài cua (Scylla serrata, S. tranquebarica, Metapograpsus sp, Sesarma sp) và 3 loài tôm hùm (Panulirus homarus, P. ornatus, P. polyphagus). Tất cả các loài thí nghiệm đều nhiễm virus b ệnh đốm trắng. Các loài tôm nhiễm bệnh thực nghiệm đều có dấu hiệu bệnh lý và mô bệnh học như tôm sú nhiễm bệnh tự nhiên. Tỷ lệ dồn tích trong vòng 5 – 7 ngày đối với tôm tiêm virus, 7 – 9 ngày đ ối với tôm cho ăn virus. Hai loài cua (S. serra và tranquebarica) và tôm hùm không có d ấu hiệu b ệnh lý. Ở Việt Nam, mầm bệnh WSSV nhiễm trên nhiều loài tôm he nuôi ho ặc sống tự nhiên: tôm sú (P. monodon), tôm th ẻ (P. indicus), tôm rảo (Metapenaeus ensis), tôm đất (M. lysianassa) (theo Lý Th ị Thanh Loan, 2003); tôm chân trắng (L. vannamei) nhập vào nuôi ở Việt Nam (Bùi Quang Tề, 2003). 2.4.4 Điều kiện phát sinh và đường lây truyền. Sự phát sinh và bùng nổ bệnh đốm trắng phụ thuộc rất nhiều vào khí hậu, thời tiết và môi trường ao nuôi. Bệnh sẽ xảy ra nếu tôm mang virus và các yếu tố thủy lý, thủy hóa biến động rất lớn vượt ra ngo ài ngưỡng sinh thái thích hợp.
9 Bệnh lan truyền theo chiều dọc (từ bố mẹ sang con) và theo chiều ngang (qua nước và thức ăn, các loại giáp xác hoang dã trong ao và do tôm khoẻ ăn con bị nhiễm bệnh đốm trắng). Kết quả theo dõi tôm sú nuôi tại Hải Phòng và Hà Tĩnh năm 2003 của Bùi Quang Tề cho thấy lan truyền theo chiều ngang là chính. 2.4.5 Cơ chế xâm nhập. Theo L .M.passano, đây là dạng DNA virus, hình que ngắn. Khi xâm nhập vào tôm, virus sẽ cư trú ở nhiều bộ phận như nội bì, mô d ạ dày, mang, buồng trứng, tinh hoàn, hệ thống thần kinh, mắt chân bơi và các bộ phận khác. Sau khi thâm nhập vào tế bào chủ, virus tiến hành tự nhân bản dựa trên cơ sở vật chất và nguyên liệu của tế bào. Quá trình này làm số lượng virus tăng lên rất nhanh, đồng thời làm thay đ ổi hoạt động bình thường của tế b ào, virus tiếp tục phát triển đến giai đoạn làm vỡ nhân và giết chết tế bào sau đó lan truyền ra môi trường nước, tìm ký chủ khác và tiếp tục xâm nhập tấn công. Ho ặc tôm khoẻ ăn tôm bị nhiễm virus cũng tạo điều kiện cho virus tấn công vào ký chủ mới. Nếu virus không tìm được ký chủ mới nó chỉ có thể sống được trong môi trường nước khoảng 24 giờ. 2.4.6 Bệnh lý Có thể chia bệnh virus đốm trắng th ành hai dạng. Dạng 1 là bệnh cấp tính gây tỷ lệ chết cao trong vòng 2 tu ần. Bệnh thường gặp ở các loài tôm: P. monodon, P. indicus và P. penicilatus. Dạng 2 là bệnh tiềm ẩn, virus đặc biệt này tồn tại trong các loài tôm Macrobrachium sp, các lo ại cua tự nhiên, tôm hùm tự nhiên thường không có dấu hiệu bệnh lý rõ rệt. Tuy nhiên một số nhà khoa học khác đã chia b ệnh virus đốm trắng xuất hiện ở tôm he thành 3 dạng chính theo các dấu hiệu bệnh. Trong dạng I bệnh xuất hiện (cấp tính và thứ cấp tính) mức độ phá huỷ nhiều ở các mô bị nhiễm virus, tỷ lệ tôm chết trong vòng 7 – 10 ngày và dấu hiệu bệnh lý thể hiện rõ nhất là xuất hiện các đốm trắng dưới vỏ. Tỷ lệ tôm chết từ trung bình đến cao, tỷ lệ mẫu kiểm tra bị nhiễm từ trung bình đến cao. Dạng II tôm chết cấp tính. Bệnh xuất hiện tác động làm tôm chuyển màu đỏ, mức độ phá huỷ rất mạnh ở các mô bị nhiễm virus, tỷ lệ tôm chết hầu hết trong vòng từ 2 – 3 ngày, t ỷ lệ mẫu kiểm tra bị nhiễm rất cao. Dạng III bệnh xuất hiện mãn tính tổ chức mô phá huỷ thấp không có đốm trắng và không có màu đỏ, tỷ lệ tôm chết kéo dài từ 15 - 28 ngày.
10 2.5 Một số phương pháp dùng chẩn đoán bệnh đốm trắng hiện nay. 2.5.1 Một số phương pháp phổ biến. Hiện nay có nhiều ph ương pháp để phát hiện bệnh như phát hiện bệnh: mô học, lai tại chỗ (In Situ Hybridization), PCR (Polymerase Chain Reaction), kính hiển vi điện tử. Năm 1997, Lightner đã đưa ra bản đánh giá chung các phương pháp đư ợc ứng dụng để chẩn đoán virus gây bệnh đốm trắng. Bảng 2.2: Đánh giá khả năng phát hiện bệnh đốm trắng trên tôm sú bằng các phương pháp khác nhau (Lightner, 1997). Phương pháp chẩn đoán WSSV Kết quả Kính hiển vi quang học ++ Kính hiển vi phản quang + Kính hiển vi nền đen ++ Kính hiển vi điện tử truyền suốt + Kính hiển vi điện tử quét - Kháng thể huỳnh quang - ELISA với PABs - ELISA với MABs - ++ Mô học ++ DNA mẫu dò PCR +++ Từ bảng đánh giá trên cho thấy phương pháp PCR có độ nhạy và đ ộ chính xác cao. Vì vậy hiện nay người ta thường sử dụng phương pháp PCR đ ể chẩn đoán bệnh đốm trắng trên tôm sú. 2.5.2 Sơ lược về phương pháp PCR và Realtime PCR. Nguyên tắc: P CR là một kỹ thuật in -vitro (trong ống nghiệm). Bằng kỹ thuật này, m ột chuỗi phân tử DNA đặc thù nằm giữa hai vùng của một chuỗi đ ã biết có thể được khuếch đại bởi một chu kỳ nhiệt được lặp đi lặp lại. Mỗi chu kỳ PCR gồm 3 giai đoạn chính:
11 Biến tính chuỗi DNA kép thành mạch đơn, ở nhiệt độ 92 – 95oC, - chuỗi xoắn kép DNA sẽ tách thành 2 mạch đơn. - Bắt cặp giữa đoạn mồi và (primers) và mạch DNA đ ơn, sự bắt cặp theo chiều 3’ của sợi DNA mục tiêu ở nhiệt độ khoảng 45 – 55oC. - Tổng hợp mạch DNA bổ sung từ điểm bắt cặp giữa đoạn mồi (primers) và m ạch DNA đơn nh ờ enzyme DNA polymerase, từ đầu 3’ của primers ở nhiệt độ khoảng 70 – 75oC. Mỗi chu kỳ DNA gồm 3 giai đoạn chính trên. Số chu kỳ được thực hiện là từ khoảng 25 – 40 chu kỳ. Số lượng đoạn gen được khuếch đại, theo lý thuyết là 2n, với n là số chu kỳ. Trong nh ững năm gần đây, công nghệ PCR đ ã được nâng lên một tầm cao mới với sự ra đời của Realtime PCR. Đây là k ỹ thuật dựa trên nền PCR thông thường nhưng có nhiều ưu điểm hơn. Realtime PCR là ph ản ứng PCR mà quá trình nhân bản DNA đang diễn ra theo từng chu kỳ đư ợc theo dõi trực tiếp. Hệ thống Realtime PCR gồm máy luân nhiệt (PCR) được nối với máy quang phổ huỳnh quang và máy vi tính. Realtime PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời đó là nhân bản DNA bằng phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn DNA tạo thành. Để có được tín hiệu Realtime phản ứng đang diễn ra người ta sử dụng phẩm nhuộm hoặc các probe đặc hiệu. Các phẩm nhuộm như Ethidium Bromide, SYBR green, Hoechst dye kh i chèn vào sợi đôi DNA sẽ phát huỳnh quang. Tuy nhiên các phẩm nhuộm n ày không cho kết quả đặc hiệu vì nó có thể ch èn vào cả những DNA cần tìm và DNA không cần tìm. Vì vậy người ta thường sử dụng các probe hơn, Các probe sẽ phát sáng khi gắn bổ sung với DNA đích và không phát sáng khi ở d ạng tự do. 2.6 Một số dạng hợp chất ở thực vật. 2.6.1 Alkaloid. Theo R. F. Raffauf (Plant alkaloids: Aguide To Their Discovery and Distribution, 1996), có hơn 10.000 alkaloid khác nhau được khám phá trên 300 họ thực vật khác nhau. Alkaloid là một hợp chất hữu cơ thường có một hay nhiều vòng carbon, có chứa nitơ và có tác dụng dược lý hiệu quả trên cơ th ể người và động vật.
12 Alkaloid có tính kiềm và khi gặp acid tạo những muối có hoạt tính sinh học mạnh và đặc hiệu, có tác dụng lâm sàng rõ ràng như dùng thuốc giảm đau, thuốc gây tê đ ặc biệt là morphine, điều trị tăng huyết áp, rối loạn tinh thần, khối u, và thuốc chống vi khuẩn,… Ngoài ra các alkaloid có tác dụng diệt ký sinh trùng, trị nguyên sinh động vật như quinin, emezin, con essin. Tác dụng kháng khuẩn của berberin, quinon là quan trọng hơn cả. Theo Ukita Mizuno và Tamura (1994) nhận thấy th ì berberin có tác dụng tốt đối với vi khuẩn tụ cầu khuẩn, trực khuẩn. Berberin có nhiều trong họ thực vật Ranunculaceae, Rutacea, Menispermaceae. Alkaloid thay đổi trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây. Yếu tố khí hậu, đất đai và cách thu hái, b ảo quản cũng ảnh hư ởng đến sự thay đổi của alkaloid trong cây. Hầu hết alkaloid đều có vị đắng, không màu hay có màu vàng như Berberin, màu đỏ như Sangkinarine,… 2.6.2 Flavonoid. Flavonoid có trong hầu hết các loại thực vật, và được lưu trữ nhiều trong hạt, ở hoa, vỏ trái cây, hay trong vỏ cây. Theo báo cáo của nhiều tác giả cấu trúc của hợp ch ất của phân tử bao gồm 2 vòng benzen và 3 carbon nằm ngoài 2 vòng. Là sắc tố màu vàng trong cây, màu sắc đậm nhạt thay đổi theo từng loại cây. Có vị đắng h ơi chua. Flavonoid đã được nghiên cứu về hiệu quả thúc đẩy quá trình oxy hoá các ch ất, dùng trong các trường hợp chuyển hoá cơ bản giảm. Các gốc tự do như superoxide (O2-), hydroxyl (OH -), hydoperoxy (H2O2), lipidperoxide, có kh ả năng tiêu diệt hoặc ức chế vi khuẩn, có khả năng chống viêm, chống dị ứng, chống virus, chống ung thư,…ngoài ra các gốc oxygen n ày cũng có khả năng kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể. Ngoài 2 ho ạt chất kể trên thì trong thực vật còn rất nhiều hoạt chất khác như acid hữu cơ, acid béo chưa bão hoà, anthraquinon, glycoside, saponin, tinh d ầu,…cũng có tác dụng trong công tác phòng và trị bệnh ở người và động vật. 2.7 Một số công trình nghiên cứu và sử dụng thực vật trong phòng trị bệnh cho các đối tượng thuỷ sản. Trong thiên nhiên, cây cỏ rất nhiều chủng loại nhưng số lo ài cây có hoạt chất sinh học chỉ chiếm một tỷ lệ nhỏ so với tổng số các lo ài cây. Chúng đ ã và đ ang được sử dụng rộng rãi trong các ngành dư ợc phẩm, hương liệu và m ỹ phẩm.
13 Trong nuôi trồng thủy sản, các sản phẩm có nguồn gốc từ thảo dược ngày càng được quan tâm để thay thế các hoá chất khử trùng, diệt mầm bệnh, diệt tạp độc hại và các thuốc kháng sinh chữa bệnh cho thủy sản nuôi trồng. Trên cơ sở thử kháng sinh đồ của các cây thuốc, Hà Ký và cộng tác viên (1995) đã phối chế thành thuốc KN - 04 - 12 mà thành phần chủ yếu là các cây thuốc và vitamin với tỷ lệ rất thấp từ 0,1 – 0,5 % tổng khối lư ợng của chế phẩm thuốc và các phụ gia. Thuốc KN - 04 - 12 đã và đang được sử dụng trộn vào thức ăn cho cá ăn, định kỳ 1,5 - 2 tháng 1 lần cho ăn với liều lư ợng 0,2 kg thuốc cho 100 kg cá ăn trong 1 ngày, và cho ăn liên tục 3 ngày đ ể phòng trị bệnh đốm đỏ lở loét cho cá trắm cỏ nuôi lồng. Tỷ lệ cá bệnh tại Hà Nội, Tuyên Quang, Hà Bắc, … năm 1993 là 29 %, năm 1994 là 50 %, tỷ lệ cá không bị nhiễm trong phòng bệnh là 90 %. Bùi Quang Tề (1985) đã nghiên cứu dùng hạt cau trị giun tròn ký sinh trong ruột cá trê (Spiritectus claria si), liều dùng 4 gam h ạt cau/kg cá/ngày, ăn liên tục trong 3 n gày và trị bệnh sán dây (Bothriocephalus gowkongensis) ký sinh trong ruột cá trắm cỏ (Ctenopharyngodon idellus), liều dùng 1 gam h ạt cau/1 gam thức ăn, cho ăn liên tục trong 7 ngày. Theo thông tin khoa học công nghệ và kinh tế thuỷ sản (2003) thì vi khuẩn Vibrio harveyi và Vibrio alginolyticus là hai tác nhân gây bệnh ở tôm sú đều được kiểm soát một cách hiệu quả bằng cách sử dụng MSMS. Chiết xuất methanol chứa chất chuyển hoá thứ cấp ở biển (MSMS) từ cải biển (Ulva fasciata) và bọt biển (Dendrilla nigra ) đều tỏ ra hoạt động có hiệu quả trong việc kháng khuẩn. Thử nghiệm với liều 1000mg/kg thức ăn chứa U.fasciata và / ho ặc 500mg/kg thức ăn chứa Dnigra được xem là hiệu quả nhất. Phan Xuân Thanh và cộng tác viên (2002) đ ã chọn một số loại cây có hoạt chất chính là 2 - h ydroxy 6 – p entadeca - trienylbenzoat đ ể làm nguyên liệu sản xuất ra một số loại thuốc phòng trị bệnh do vi khuẩn và vi nấm gây ra như bệnh phát sáng, bệnh đóng rong, bệnh mang đen, bệnh mang vàng, b ệnh đốm đỏ, bệnh mòn đuôi và hoại tử phụ bộ trên tôm sú, … Liều dùng trong phòng bệnh, cứ 15 ngày xử lý thuốc 1 lần với nồng độ 0,5 – 1 ppm. Liều d ùng trong trị bệnh ở nồng độ 1 – 3 ppm, sau 3 – 5 ngày lặp lại lần 2. Theo S. Direkbusarakom, L. Ruangpan, Y. Ezura và M. Yoshimizu (1998), dịch chiết từ lá cây Clinacanthus nutans trộn với thức ăn viên theo liều lượng 1 g/kg thức
14 ăn có khả năng ức chế hoạt động virus gây ra bệnh đầu vàng (Yellow - Head Rhabdovirus) trên tôm sú (P. monodon). Hiệu quả bảo vệ tôm sú khỏi virus này trong điều kiện thí nghiệm là 57,6 %. Đây là một trong số rất nhiều công trình nghiên cứu dùng các hợp chất thảo dược để hạn chế một số bệnh gây chết h àng loạt cho đối tượng nuôi thuỷ sản. Từ đó cho thấy việc tập trung nghiên cứu và ứng dụng các loại dịch chiết từ thảo dược vào thực tiễn sản xuất và một hướng đi đúng và đ ầy triển vọng.
15 PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện. Thời gian thực tập: từ tháng 3 - 8 / 2005 Địa điểm: - Bộ môn Dược lý – Trung tâm Quốc gia Quan trắc và Cảnh báo Môi trường - Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản 2. - Trại Thực nghiệm Thuỷ sản Thủ Đức. 3.2 Vật liệu nghiên cứu. 3.2.1 Vật liệu sinh học. Mẫu tôm sú bị nhiễm virus đốm trắng đã được giữ lạnh ở nhiệt độ -20 oC. Tôm sú khoẻ mạnh không bị nhiễm virus đốm trắng được thu từ các ao nuôi tôm tại Cần Giờ, TP Hồ Chí Minh. Tôm có trọng lượng từ 8-12 g/con. 3.2.2 Dụng cụ và hoá chất. 3.2.2.1 Dụng cụ và hoá chất trong phòng thí nghiệm. - Máy khuếch đại gen, bồn điện di, máy ly tâm, b àn đọc UV (White/UV transillminator), pipetman các loại, tủ đông, tủ gia nhiệt, các loại cân, tube eppendorf, kéo, kẹp,… - Máy Realtime PCR, các bộ Kit Realtime,… - Các lo ại hóa chất thường dùng:  Cồn 95% dùng cố định mẫu.  Hóa chất dùng trong quy trình khu ếch đại DNA virus như NAOH - SDS, dung dịch PCR, các primer…  Hóa ch ất dùng trong phân tích m ẫu nư ớc như NaOH, KI, KMnO4, Na2S2O3, H2SO4, hồ tinh bột,…  DMSO dùng làm dung môi hoà tan các hợp chất thử.  Các hợp chất chiết xuất từ thảo dược: B, D2, M 3.2.2.2 Dụng cụ và hoá chất trong phòng thí nghiệm ướt. - Bể kính bố trí thí nghiệm, máy sục khí, máy bơm nước, hệ thống lọc nư ớc, các dụng cụ đo môi trường nư ớc.
16 - Hoá chất dùng khử trùng nước trước và sau khi bố trí thí nghiệm như chlorine, thuốc tím. 3.3 Phương pháp nghiên cứu. 3.3.1 Phương pháp ly trích và thu dịch chiết virus. Sử dụng mẫu tôm đã bị nhiễm virus đốm trắng WSSV, lấy phần mang hay chân bơi cho vào dung d ịch TN 1X. Sau đó đồng nhất mẫu trong eppendorf bằng ch ày đã thanh trùng. Ly tâm lạnh hỗn hợp ở 4oC, tốc độ 13000 vòng/phút/10 phút đ ể loại bỏ phần tử lớn. Dùng pipetman hút nh ẹ dịch trong và cho vào eppendorf khác. Tiếp tục huyền phù eppendorf ch ứa phần tử lớn trong dung dịch TN1X lần 2 và làm tương tự các thao tác trên để thu tiếp dịch trong. Hỗn hợp dịch trong của 2 lần ly trích trên được lọc qua màng lọc virus có kích thước lỗ 0,45 µm, thu nhận chất lọc và bảo quản dịch virus ở - 20oC. 3.3.2 Phương pháp cảm nhiễm virus trên tôm Dịch chiết virus và hỗn hợp dịch virus và thuốc được cảm nhiễm trên tôm sú không nhiễm bệnh đã được nuôi thuần từ 7 – 10 ngày bằng cách tiêm 0,05 ml dịch chiết virus hoặc hỗn hợp dịch virus và thuốc vào đốt cơ bụng thứ 2 hay 3. 3.3.3 Phương pháp thu mẫu. Sau khi cảm nhiễm, theo dõi tôm dựa vào các dấu hiệu lâm sàng, tiến hành thu mẫu tôm bằng cách lấy phần mang cho vào cồn 95 % để cố định mẫu. 3.3.4 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction). 3.3.4.1 Phương pháp PCR định tính (Non – stop single tube semi – nested PCR). Dùng để kiểm tra sự hiện diện của virus gây hội chứng đốm trắng trong mẫu hỗn hợp sau khi trộn chung dịch virus và hợp chất thuốc. Phương pháp này không sử dụng dung d ịch NaOH - SDS để ly trích DNA như thông thường. Ngoài ra các bước khác tiến hành như một phản ứng PCR b ình thường. Sau khi chuẩn bị mẫu và chạy phản ứng PCR, tiến hành điện di trên gel Agarose và đọc kết quả, nhận biết sự hiện diện của WSSV nhờ so sánh kích th ước của chúng với thang DNA chuẩn cùng với mẫu đối chứng dương và âm.
17 3.3.4.2 Phương pháp PCR định lượng (Realtime PCR). Cũng như PCR định tính, ph ương pháp PCR đ ịnh lượng dựa trên sự khuếch đại một đoạn DNA đặc hiệu của bộ gen virus WSSV. Tuy nhiên khác với phương pháp PCR định tính sản phẩm sau khi khuếch đại phải đem điện di và đọc kết quả trên bàn đọc UV, sản phẩm khuếch đại trong phương pháp PCR đ ịnh lư ợng đ ược đánh dấu bằng probe (mẫu dò) được thiết kế gắn chất phát huỳnh quang (FAM) ở đầu 5’ và ch ất hấp thu huỳnh quang (ở đầu 3’). Trong khi chạy PCR, đầu đọc iQ Realtime sẽ phát hiện các sản phẩm khuếch đại đặc hiệu bằng cách nhận biết và thu nhận các tín hiệu hu ỳnh quang phát ra ở bước 60o trong mỗi chu kỳ nhiệt nhờ hoạt tính 5’ - 3’exonuclease của Taq polymerase tách đầu 5’ có gắn chất phát huỳnh quang của probe ra khỏi khuôn mẫu, lúc này FAM ở dạng tự do sẽ phát quang và được thu nhận và xử lý. Nếu probe không gắn được vào khuôn hoặc hoạt tính 5’ - 3 ’ exonuclease không có thì ch ất phát huỳnh quang phát ra bao nhiêu sẽ bị hấp thu bấy nhiêu. Mẫu thử chứa nhiều DNA đích ban đầu sẽ có chu kỳ ngư ỡng phát hiện sớm hơn là m ẫu thử có ít DNA đích. Sau khi kết thúc chương trình, kết quả được phân tích trên phần mềm iQ version 3.1 và biết được nồng độ virus ban đầu của mẫu thử dựa vào các nồng độ DNA chuẩn và chúng ta sẽ đo được nồng độ DNA trong các mẫu thử bằng đường biễu diễn chuẩn (Standard curve) hiển thị mối quan hệ giữa các chu kỳ ngưỡng với các nồng dộ DNA trong các mẫu chuẩn. 3.3.5 Phương pháp xác định một số yếu tố môi trường. Đo nhiệt độ nước bằng nhiệt kế bách phân (100 oC) và đo mỗi ngày 1 lần vào một giờ cố định. Độ mặn S (%) được xác định bằng khúc xạ kế vào lúc trước khi thả tôm và khi thêm hoặc thay nước. pH đư ợc đo bằng máy đo pH. Xác định độ tiêu hao Oxy hoá học (COD) trước khi bố trí thí nghiệm: Oxy hoá mẫu n ước bằng Permanganat Kali, sau đó tiến h ành chuẩn độ bằng Thiosulphate Natri sử dụng hồ tinh bột làm chất chỉ thị. Xác định Oxy hoà tan (DO) theo phương pháp chuẩn độ Winkler trước khi bố trí thí nghiệm.
18 3.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm. 3.4.1 Sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo dược đối với virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV). Thí nghiệm được thực hiện để khảo sát tác dụng trực tiếp của thuốc đối với virus gây h ội chứng đốm trắng (WSSV). Các hợp chất thử đ ược hòa tan trong dung môi Dịch chiết virus WSSV. DMSO ở các nồng độ khác nhau. Trộn lẫn dịch chiết virus và mỗi loại hợp chất thử đ ã đ ược pha ở các nồng độ khác nhau. Ủ hỗn hợp dịch virus và hợp chất thử trong kho ảng 2 giờ ở nhiệt độ 28 – 30 oC. Kiểm tra sự hiện diện của virus WSSV bằng PCR đ ịnh tính nhưng không dùng NaOH-SDS trong quá trình ly trích DNA. Sơ đồ 3.1: Bố trí thí nghiệm sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo dược đối với virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV).
19 3.4.2 Các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm ướt. Mục đích của bố trí thí nghiệm để biết đ ược khả năng tác dụng của virus WSSV trong cơ thể sống của tôm sau khi ủ hỗn hợp virus và thu ốc thử ở các nồng độ khác nhau. Tôm sú kho ẻ kích cỡ 8 – 12 g/con Lô đối Lô đối chứng Các lô thí nghiệm tiêm chứng âm dương tiêm hỗn hợp dịch chiết virus không tiêm dịch chiết và thuốc thử ở các nồng virus virus WSSV độ khác nhau sau khi ủ 2 WSSV giờ. Theo dõi và ghi nhận hàng ngày về tình trạng sức khoẻ của tôm. Tiến hành thu mẫu những con chết (nếu có). Sau 14 ngày Thu toàn bộ mẫu kiểm tra lại bằng kỹ thu ật Realtime PCR và đánh giá kết quả . Sơ đồ 3.2: Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng tác dụng của virus WSSV trong cơ thể sống của tôm sau khi ủ hỗn hợp virus và thuốc thử ở các nồng độ khác nhau.