Nguyễn M. Cn, Nguyn T. M. Trinh. HCMCOUJS-Kỹ thuật và Công nghệ, 19(2), 13-24
13
Nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của cao chiết ethanol từ
lá cây Sói Nhật (Chloranthus japonicus Sieb.)
Investigating some biological activities of ethanolic extract from
Chloranthus japonicus Sieb. leaves
Nguyn Minh Cn1, Nguyn Th M Trinh2,3*
1Trường Đại Học Phạm Văn Đồng, Quảng Ngãi, Việt Nam
2Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam
3Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, Tnh phố Hồ Chí Minh, Việt Nam
*Tác giả liên hệ, Email: ntmtrinh@hcmus.edu.vn
THÔNG TIN
TÓM TẮT
DOI:10.46223/HCMCOUJS.
tech.vi.19.2.3320.2024
Ngày nhận: 22/03/2024
Ngày nhận lại: 20/05/2024
Duyệt đăng: 29/05/2024
Từ khóa:
kháng khun; kháng oxy hoá;
kháng viêm; làm lành vết
thương; Sói Nhật
Keywords:
antimicrobial activity;
antioxidant activity; anti-
imflammatory effect; wound
healing; Chloranthus japonicus
Sieb
Sói Nht (Chloranthus japonicus Sieb.,) cây thân tho
được tìm thy các tnh vùng núi phía bc và mt s vùng phía
nam như Lâm Đồng, Kon Tum Gia Lai. Theo kho sát ca
chúng tôi, cây được người K’Ho tại Vườn Quc gia Bidoup -
Núi s dụng để cha vết l do côn trùng đốt bng. Trong
nghiên cu y, chúng tôi chng minh cao chiết t Sói Nht
cha 59.93 ± 9.66 mgGAE/gE (poly)phenol 457.39 ± 7.93
mgQE/gE flavonoid; kh năng kháng oxy hoá cao vi IC50
đạt 14.87 ± 0.31 µg/ml. Kết qu cũng chỉ ra cao chiết ch tác
dng kích thích s tăng sinh nguyên bào si chut nồng độ thp
(7.8125 - 31.25 µg/ml). Tuy nhiên, nồng độ này, cao chiết li
chưa cho thấy kh năng kháng 04 loi vi khuẩn thường hin din
trên vết thương là S. aureus, P. aerugionsa, E. faecalis, E. coli,
kh năng kháng viêm trên hình đại thc bào Raw 246.7.
Các kết qu y cung cp nhng bng chứng ban đầu cho thy
cao chiết Sói nht kh năng hỗ tr làm lành vết thương
nồng độ thp, tác dụng y đến t mt s đặc tính ca cao
chiết bao gồm hàm lượng (poly)phenol flavonoid cao, kh
năng chống oxy hoá cao và kích thích s tăng sinh nguyên bào sợi
hơn là khả năng kháng viêm và kháng khuẩn.
ABSTRACT
Chloranthus japonicus Sieb. is a perennial herb which can
be found in northern Vietnam mountains and also in some
southern areas such as Lam Dong, Kon Tum, and Gia Lai.
According to our surveys, C. japonicus Sieb. leaves were
traditionally used by K’Ho people in Bidoup - Nui Ba National
Park for the treatment of insect bites and skin burns. In this study,
we found that the 70% ethanol extract of C. japonicus leaves
contained 59.93 ± 9.66 mgGAE/gE (poly)phenol and 457.39 ±
7.93 mgQE/gE flavonoid; and exhibited a strong antioxidant
activity with the IC50 value of 14.87 ± 0.31 µg/ml. We also
14
Nguyễn M. Cần, Nguyễn T. M. Trinh. HCMCOUJS-Kỹ thuật ng nghệ, 19(2), 13-24
1. Giới thiệu
Các tổn thương da mn tính mt vấn đề ph biến trong đời sng, ảnh hưởng đến hơn
40 triệu người trên toàn thế gii (Heras, Igartua, Santos-Vizcaino, & Hernandez, 2020). Đc bit,
vết thương những người b béo phì, tiểu đường, nhim HIV hoc nghiện rượu, thuc d
nhiu biến chng phc tạp khó lành, làm tăng chi phí chữa tr. Theo thng ca Facts and
Factors Research (2023), chi phí cha tr các ca b thương trên da tiêu tn khong 9.37 t USD
vào năm 2022 d tính s tăng lên đến 14.2 t USD vào năm 2030, với mức tăng trưởng kép
trung nh hằng năm đt 5.61%. Các chế phm cha tr vết thương hin nay hu hết da trên
các sn phm tng hp hóa hc vi nhiu tác dng ph hoc các sn phm công ngh cao như
các loi gel cha c cytokine người vi giá thành cao. Bên cnh các loi thuc hoá hc,
y thuốc dân gian được xem c chế phm ngun gc t nhiên, lch s s dng hàng
nghìn năm nên thường được xem an toàn, thân thin, ít c dng ph. Nhiu cây thuc
truyn thống đã đang đưc s dụng điu tr vết thương mt cách hiu qu trong y hc c
truyn ca nhiu dân tc trên thế gii.
Sói Nht (Chloranthus japonicus Sieb.,) cây thân tho thuc h Hoa sói
(Chloranthaceae). Trên thế giới, cây được tìm thy ph biến Trung Quc, Nht Bn, Hàn
Quc (An & ctg., 2020). Vit Nam, Sói Nht phân b ch yếu các tnh vùng núi phía bc,
phía nam ch mi gp Lâm Đồng, Ngc Linh (Kon Tum) Mang Yang (Gia Lai) (Do, Pham,
Nguyen, & Pham, 2015). Theo kho sát của chúng tôi, người K’Ho tại Vườn Quc gia Bidoup -
Núi Bà s dng lá cây được nướng và vò để cha vết l do côn trùng đốt. Bên cạnh đó, trong dân
gian lá tươi còn dùng để tr bng. Tuy nhiên, cơ sở khoa học ban đu ca vic s dng Sói Nht
trong điều tr vết thương chưa được nghiên cu nhiu. Cao chiết Sói Nht phn trên mặt đất thu
hái Đà Lạt được phát hin tác dng chng viêm cp tính mn tính trên chut (Do & ctg.,
2015). Mt s hp cht kháng oxy hóa (scopoletin), kháng vi sinh vt (furanodienone
scopoletin), kháng viêm (furanodienone scopoletin) đã được phát hin trong phn Sói
Nht (Joshi & Mathela, 2012; Kayser & Kolodziej, 1997; Kim & ctg., 2004; Makabe, Maru,
Kuwabara, Kamo, & Hirota, 2006; Mogana, Teng-Jin, & Wiart, 2013).
Tuy nhiên, nhiu tính cht quan trọng liên quan đến tác dng làm lành vết thương của
Sói Nht chưa được chứng minh. Do đó, trong nghiên cu y, chúng tôi kho sát mt s hot
tính in vitro ca cây Sói Nht như khả năng kháng oxy hóa, kháng vi khun nhim trùng vết
thương kh năng kích thích tăng sinh các tế bào biu da để góp phn làm công dng
dân gian trong điều tr vết thương của loài cây này.
demonstrated that this extract at low concentrations (7.8125 -
31.25 µg/ml) could improve the proliferation of the mouse
fibroblast NIH-3T3 cell line. However, at these concentrations, the
extract did not show any inhibitory effect on the growth of some
opportunistic pathogens, including S. aureus, P. aerugionsa, E.
faecalis, and E. coli; and in vitro immunomodulatory effect on
LPS-stimulated Raw 264.7 model. These findings suggested that
the C. japonicus leaf extract might have a possitive effect on
wound healing at low concentrations, but this potential effect
seems to come from its high (poly)phenol and flavonoid contents,
high antioxidant activity rather than the antimirobial and anti-
imflammatory capactities.
Nguyn M. Cần, Nguyễn T. M. Trinh. HCMCOUJS-Kỹ thuật ng nghệ, 19(2), 13-24
15
2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1. Thông tin v mu thc vt
y Sói Nht (Chloranthus japonicus Sieb.) được thu hái tại vườn quc gia Bidoup -
Núi Bà, Tỉnh Lâm Đồng. Mẫu cây được định danh lưu trữ ti phòng thí nghim Thc vt,
khoa Sinh hc - Công ngh sinh hc, trường Đi hc Khoa hc T nhiên Thành ph H Chí
Minh (Mã s: PHH0004912).
2.2. Phương pháp chiết cao
y được phơi kđến độ m < 10% nhiệt độ dưới 40˚C tránh ánh sáng trc
tiếp, sau đó đưc xay thành bt mn bo qun nhiệt độ phòng. Mu sau khi x lý được
chiết vi ethanol (EtOH) 70% trong 48 gi vi t l mu dung môi 1:10 (w:v). Dch chiết
sau đó được thu nhn, lọc, và đuổi dung môi bng y quay (Hahnvapor, n Quc). Sau
đó, mẫu cao được loại nước hoàn toàn bng h thống đông khô (Benchtop K Virtis, M). Cui
cùng, bt cao chiết đưc hoà tan trong 99.9% DMSO (Merck, Đc) bo qun -30˚C. Trưc
khi s dng, cao chiết được pha loãng trong dung dch PBS lc qua màng lc 0.22µM
(Sartorius, Đức).
2.3. Phương pháp xác định hàm lượng phenol tng và flavonoid tng
Hàm ng phenol tng (Total Phenolic Content, TPC) được xác định theo TCVN 9745-
1:2013 (Tiêu chun Vit Nam, 2013) theo Do cng s (2014) ci tiến. Mẫu được pha
loãng đến nồng độ phù hợp, sau đó hút 80µl dịch chiết cho vào ng nghim cha sn 80µl
thuc th Foline-Ciocalteu 720µl nước ct. B sung 800µl Na2CO3 (7.5%) trộn đều, sau đó
b sung nước cất đủ 2ml. ti ng nghiệm 30 phút, sau đó đo mật độ quang bước sóng 760nm
(OD760). Acid gallic được dùng làm cht chuẩn, lượng phenol tng s s được xác định da trên
đường chun ca acid gallic (25 - 400 µg/ml) được th hiện dưới dng miligram acid gallic
trên gram cao chiết (mgGAE/gE) hoc trên gram mu lá khô (mgGAE/gdw).
Hàm ng flavonoid tng (Total Flavonoid Content, TFC) được xác định theo phương
pháp ca Do cng s (2014). Theo đó, mu được pha loãng đến nồng độ phù hp bng EtOH
70%. Cho 200µl mu vào ng nghim có cha 120µl dung dch NaNO2 5%, vortex trong 10 giây
để n nhiệt độ phòng 05 phút, sau đó bổ sung 120µl dung dch AlCl3 10%, thêm 800µl
NaOH 1M b sung nước cất đủ 2ml, vortex trong 10 giây đo phổ hp th bước sóng
415nm (OD415). Quercetin được dùng làm cht chuẩn, lượng phenol tng s s được xác định
dựa trên đường chun ca quercetin (31.25 - 1,000 µg/ml) được th hiện dưới dng miligram
quercetin trên gram cao chiết (mgQ/gE) hoc trên gram mu lá khô (mgQE/gdw).
2.4. Đánh giá hot tính kháng oxy hoá bng kh năng bắt gc t do DPPH
Hn hp phn ng th tích 2,500µL, gm 500µL mu kho sát các nồng độ trong
khong t 12.5 - 200 µg/ml 2,000µL dung dch DPPH nồng độ 100µM được chun b. Các
hn hp phn ứng được lc trong 01 phút nhiệt độ phòng trong 30 phút, sau đó tiến nh
đo mật độ quang bước sóng 517nm (OD517).
Kh năng kháng oxya (Radical Scavenging Activity (%RSA)) ca mẫu đượcnh theo
công thc: %RSA = (Ao-Aj)/Ao*100%, trong đó Ao giá tr OD517 ca th không (thc hin
tương tự mu cần đo nhưng thay 500µl mu cao chiết bng 500µl dung dch ethanol 70%) và Aj
giá tr OD517 ca mu cần đo (Yakaew & ctg., 2016). Acid gallic được dùng làm cht chun,
hot tính kháng oxy hoá ca cao chiết s được xác định da trên giá tr IC50 ca cao chiết ca
acid gallic, và được th hiện dưới dng miligram acid gallic trên gram cao chiết (mgGAEAC/gE)
16
Nguyễn M. Cần, Nguyễn T. M. Trinh. HCMCOUJS-Kỹ thuật ng nghệ, 19(2), 13-24
hoc trên gram mu khô (mgGAEAC/gdw). Giá tr IC50 ca cao chiết của acid gallic được
ni suy t đường cong đáp ứng gia %RSA và nồng độ cao chiết hoc nồng độ acid gallic.
2.5. Đánh giá khả năng kháng khuẩn
Kh năng kháng khuẩn được đánh giá bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch theo mô t
ca Agyare cng s (2013) ci tiến. Theo đó, 100µl dch vi khun mục tiêu đã pha loãng
đến OD600 = 0.1 được trn với 5ml môi trường TSB mm (0.8% agar) và được đổ lên mặt đĩa
chứa môi trường TSB agar (2% agar). Sau khi môi trường đã đông hoàn toàn, các giếng
đường kính 8-mm được to ra trên mt thch 100µl cao chiết các nồng độ pha loãng khác
nhau t 50 - 400 µg/ml được thêm vào mi giếng. Đĩa sau đó được 37˚C trong 16 giờ. Kết
qu được tính bng hiệu đường kính vòng khun với đường kính l thch. Các chng vi
khun E. coli, P. aeruginosa, E. faecalis, E. coli được chúng tôi t phân lập đã được định
danh phân t da trên trình t gene mã hoá 16S rRNA.
2.6. Đánh giá khả năng kháng viêm in vitro ca cao chiết
Tế bào RAW 264.7 (ATCC-TIB-71) được nuôi ổn định trong đĩa 96 giếng vi mật độ 104
tế bào/giếng trong 100µl môi trường DMEM-F12 có b sung 10% FBS. Đĩa được 37˚C, 5%
CO2 trong 24 giờ. Sau đó, thay môi trường bằng 100µl môi trường DMEM-F12 mi b sung
1% FBS. Sau khi 37˚C, 5% CO2 trong 06 gi, tiến hành thay thế môi trường thành môi
trường DMEM-F12 mi cha 10% FBS, 0.1% DMSO b sung 1% lypopolysaccharide (LPS)
và cao chiết các nồng độ khác nhau. Đĩa được 37˚C, 5% CO2 trong 24 gi. Cui cùng, 50µl
môi trường được rút ra 50µl thuc th Gress được thêm vào giếng. Đĩa được 10 phút
tiến hành đo bước sóng 550nm (OD550). Mức độ kháng viêm ca cao chiết được đánh giá qua t
l c chế ng NO sinh ra (%) theo phương trình 1 bên dưới (Heo & ctg., 2010):
T h - a h
- h (1)
Trong đó, ODLPS, ODLPS + cao chiết, ODKhông x LPS ln lượt gtr OD550 ca nghim
thc x LPS nhưng không có cao chiết, nghim thc x LPS và b sung cao chiết; và nghim
thc không x LPS. Dexamethasone 50µM (Sigma) được s dụng m đi chng ơng.
2.7. Đánh giá khả năng kích thích tăng sinh nguyên bào sợi chut NIH-3T3
Tế bào NIH-3T3 (ATCC CRL-1658) được b sung vào đĩa 96 giếng vi mật độ 104 tế
bào/giếng trong 100µl môi trường DMEM-F12 b sung 10% FBS. Đĩa được 37˚C, 5%
CO2 trong 24 giờ. Sau đó, môi trường được thay bằng 100µl môi trường DMEM-F12 được b
sung 2% FBS và cao chiết vi các nồng độ khác nhau. Đĩa được tiếp tc 37˚C, 5% CO2 trong
48 gi. Thc hiện đồng thi với đối chứng âm là môi trường như trên không cao thuốc đối
chứng dương DMEM-F12 DMSO 0.1% FBS 7.5%. Mật độ tế bào được xác định bng
phương pháp MTT theo quy trình của Nguyen, Truong, Nguyen, Tran, và Dang (2020).
2.8. X lý thng kê
Trong nghiên cu này, tt c các thí nghiệm được thc hin ti thiu 03 ln kết qu
được phân tích thng kê s dng ANOVA 1 chiu bng phn mm Graphpad Prism 7.0.
3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận
3.1. Hàm lượng phenol tng và flavonoid tng trong cao chiết lá Sói Nht
Ethanol mt trong những dung môi dùng để chiết cao ph biến nht do nh an toàn
hiu qu cao. Do vy, trong nghiên cu này, chúng tôi s dụng ethanol 70˚ làm dung môi để để
chun b cao chiết t lá cây Sói Nht. Vi dung môi này, hiu sut thu nhn cao là 23.4%.
Nguyn M. Cần, Nguyễn T. M. Trinh. HCMCOUJS-Kỹ thuật ng nghệ, 19(2), 13-24
17
Hàm lượng TPC và TFC trong cao chiết ethanol t Sói Nht được xác định lần lượt
259.93 ± 9.66 mgGAE/gE (60.87 ± 0.16 mgGAE/gdw) và 457.39 ± 7.93 mgQE/gE (107.12 ±
0.07 mgQE/gdw) (Bng 1). Theo chúng tôi tìm hiểu, đây nghiên cứu đầu tiên công b v hàm
ng phenol và flavonoid tng ca lá Sói Nht. Tuy nhiên, mt s nghiên cứu trước đây đã công
b v hàm lượng các hp cht này trong các cây cùng chi Chloranthus. C th, nghiên cu ca
Zemry và cng s (2023) cho thấy hàm lượng TPC trong y Sói Đng (Chloranthus erectus)
đạt 9.64 ± 0.5 mgGAE/gdw. Xu cng s (2020) đã công bố hàm lượng TPC TFC ca loài
Chloranthus henryi đạt khong 4.36 - 19.64 mgGAE/gdw. Bên cạnh đó, khi nghiên cứu trên 13
cây dược liu gia v ph biến, Muzolf-Panek Stuper-Szablewska (2021) cho thy TPC
TFC ca các loài này nm trong khong 0.89 - 167 mgGAE/gdw 0.47 - 31.58 mgQE/gdw.
Như vậy, khi so sánh vi các nghiên cu này, chúng tôi nhn thấy hàm lượng phenol
flavonoid tng ca Sói Nhật cao hơn hẳn nhng cây cùng chi Chloranthus cao hơn mặt
bng chung ca c cây thuc. Nhiu nghiên cứu trước đây cho thấy các hp cht (poly)phenol
và flavonoid vai trò quan trng trong việc thúc đy quá trình làm lành vết thương của các cây
thuc dân gian (Budovsky, Yarmolinsky, & BenShabat, 2015; Fraga, Martino, Ferraro, Coussio,
& Boveris, 1987; Ghosh & Gaba, 2013; Sharma Ali, Ali, Sahni, & Baboota, 2013). Do vy, vic
phát hiện hàm lượng (poly) phenol flavonoid cao trong y Sói Nht cung cp nhng d liu
đầu tiên cho hot tính làm lành vết thương của loài cây này.
Bng 1
Thành phn hóa hc cao chiết ethanol t lá Sói Nht
Ch tiêu
Hàm lượng
Hàm lượng (poly)phenol (mgGAE/gE)
259.93 ± 9.66
Hàm lượng (poly)phenol (mgGAE/gdw)
60.87 ± 0.16
Hàm lượng flavonoid (mgQE/gE)
457.39 ± 7.93
Hàm lượng flavonoid (mgQE/gdw)
107.12 ± 0.07
3.2. Kh năng kháng oxy hóa của cao chiết ethanol t lá Sói Nht
Kh năng kháng oxy hóa thông qua bắt cơ chế bt gc t do DPPH ca cao chiết t lá Sói
Nht được th hin Bng 2. Kết qu cho thy cao chiết Sói Nht th hin kh năng kháng oxy
hóa vi IC50 14.87 µg/ml vi hàm lượng cht kháng oxy hóa trong bt cây thuốc khô quy đổi
tương đương với hàm ng gallic acid đạt 45.67 mgGAEAC/gdw. Tương tự TPC TFC, đây
cũng là nghiên cứu đầu tiên công b v kh năng kháng oxy hoá của lá cây Sói Nht.
Theo Phongpaichit cng s (2007), mt cao chiết được đánh giá là khả năng kháng
oxy hoá cao khi IC50 trong khong 10 - 50 µg/ml, va khi IC50 đạt 50 - 100 µg/ml, và yếu khi
IC50 >100 µg/ml. Khi đối chiếu vi cách phân chia này, cao chiết t y Sói Nht có kh năng
kháng oxy hoá cao. Mt s công b cho thy mối tương quan chặt ch giữa hàm lượng TPC,
TFC kh năng kháng oxy hóa ca các cây thuc dân gian (Chaubey & ctg., 2017; Wojdyło,
Oszmiański, & Czemerys, 2007). Do đó, khả năng kháng oxy hóa rt mnh ca cao chiết Sói
Nht th do các hp cht phenol flavonoid trong cây mang li. Cht chống oxy hoá đã
được chng minh rng rãi vai trò quan trng trong việc điều hoà qtrình viêm ngăn
cn s hoạt động quá mc ca các tế bào min dch ti vết thương, do đó góp phần đẩy nhanh
quá trình làm lành vết thương (Comino-Sanz, López-Franco, Castro, & Pancorbo-Hidalgo, 2021;
Fitzmaurice, Sivamani, & Isseroff, 2011). Như vy, cùng vi d liu v hàm lượng TPC, TFC,
d liu v kh ng kháng oxy hóa ca Sói Nht góp phn gii thích công dng dân gian trong
điều tr vết thương của cây thuc này.