NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO MỘT SỐ DÒNG
CÀ PHÊ VỐI (Coffea canephora) CHỌN LỌC THÔNG QUA MÔ SẸO
VÀ PHÁT SINH PHÔI SOMA
Nguyễn Thị Mai
1
, Vương Phấn
1
,
Trương Văn Tân
1
, Trần Thị Hoàng Anh
1
SUMMARY
Study on in vitro propagation of some selected Coffea canephora clones via callus
and somatic embryogenesis
The research was carried out to establish a protocol of micropropagation via callus and somatic
embryogenesis from cultured leaf of some selected Coffea canephora clones in WASI. The results
showed that 1g embryogenic callus could produce about 80g torpedo embryos within 4-5 months.
After about 5 months of germination phase, from 1g torpedo embryos we could select 160
plantlets, size ~10 mm, with one pair of true leaves and root for acclimatization in commercial
coconut fibres under a greenhouse. After 2-3 months of acclimatization, there were about 140
plantlets developed at least two pairs of true leaves available for transplanting into PE bags and
taken the same care as the seedlings.
Keywords: Coffea canephor, in vitro propagation, callus, somatic embryogenesis
1. §ÆT VÊN §Ò
Phương pháp truyền thống để nhân giống cây cà phê vối là dùng hạt. Bên cạnh đó
phương pháp ghép nối ngọn cũng được ứng dụng rộng rãi tại các vùng thâm canh cà phê.
Mặc dù Viện Khoa học Kỹ thuật Nông Lâm nghiệp (KHKT NLN) Tây Nguyên đã thiết
lập một số vườn nhân chồi cây giống cao sản nhưng không đáp ứng đủ lượng cây giống
tốt.
Việc nuôi cấy mô các loài cà phê trên thế giới đã đạt được những tiến bộ đáng kể.
Quá trình phát sinh phôi vô tính cây cà phê vối Coffea canephora được Staritsky báo cáo
lần đầu tiên vào năm 1970; Sondahl và Sharp, 1977 cũng tạo được cây cà phê chè Coffea
arabica từ phôi vô tính. Tiếp theo đó nhằm mục đích nhân giống cà phê, nhiều tác giả đã
nghiên cứu sự phát sinh phôi vô tính cây cà phê như Staristky và Van Hasselt (1980);
Pierson và cộng tác viên (1983); Zamarripa và cộng tác viên (1991); Hatanaka và cộng
tác viên (1991); Van Boxtel và Berthouly (1996), Ducos và cộng tác viên (1999, 2003)...
Các công trình nghiên cứu này cho thấy có 3 tiến trình chính trong nhân nhanh cây cà phê
bằng phương pháp phát sinh phôi vô tính, đó là: Nhân tế bào có tiềm năng phát sinh phôi
và sản xuất phôi (giai đoạn thủy lôi) trong môi trường lỏng; giúp phôi nảy mầm bằng
cách làm ngập tạm thời phôi (giai đoạn có lá mầm) trong môi trường lỏng; tạo điều kiện
cho phôi nảy mầm phát triển thành cây con.
Vì vậy, việc ứng dụng các tiến bộ trên về kỹ thuật nhân in vitro bằng phương pháp
nuôi cấy phôi soma cho các dòng vô tính cà phê vối ưu tú đã được tuyển chọn là điều vô
cùng cần thiết để đáp ứng nhu cầu cấp bách về giống tốt hiện nay của sản xuất.
II. VËT LIÖU Vµ PH¦¥NG PH¸P NGHI£N CøU
1. Vật liệu nghiên cứu
4 dòng vô tính cà phê vối (TR10, TR11, TR12, TR13) có năng suất cao, cỡ hạt lớn và
khả năng kháng bệnh gỉ sắt cao.
2. Phương pháp nghiên cứu
- Vào mẫu, tạo callus từ lá cà phê: Trước khi lấy mẫu lá, phun thuốc nấm trên lá,
ngày một lần, trong 3 - 4 ngày. Hái lá bánh tẻ, rửa sạch, xử lý thuốc nấm và nhúng vào
dung dịch Ethanol 70% trong 30 giây. Khử trùng bằng Hypochlorite Calci 10% trong 15
phút, rửa lại bằng nước cất khử trùng. Sau đó bỏ gân lá, rìa lá, 2 phần đầu, đuôi lá và cắt
lá thành mảnh nhỏ (mỗi mảnh là một mẫu có kích thước khoảng 1cm
2
). Cấy mẫu lên môi
trường thạch phát sinh callus, để trong tối.
- hân callus trong môi trường lỏng: Chuyển callus đã chọn lọc sang môi trường
lỏng nhân callus, lắc tròn (110 - 120 vòng/phút). Sau 2 tuần, thay mới môi trường và tăng
thể tích môi trường từ 10 ml lên 50 ml, 100 ml/bình tam giác. Quá trình lặp lại cho đến
tuần thứ 8, các callus tăng về số lượng được sử dụng làm nguồn vật liệu cho quá trình sản
xuất phôi.
1
Viện Khoa học Kỹ thuật Nông Lâm nghiệp Tây Nguyên.
- Tạo phôi cà phê dạng thủy lôi trong môi trường lỏng: Callus được chuyển sang
môi trường lỏng sản xuất phôi, lắc tròn. Thay mới môi trường, cho đến khi phôi phát triển
chủ yếu dưới dạng thủy lôi.
- Tái sinh cây từ phôi và tạo cây con hoàn chỉnh: Trên môi trường thạch tái sinh
cây, phôi vô tính cà phê ở dạng thủy lôi phát triển thành cây con có một cặp lá thật được
đưa ra huấn luyện trên bột xơ dừa cho đến khi phát triển thành cây con có ít nhất hai cặp
lá thật. Ra ngôi trong bầu đất PE, chế độ chăm sóc giống như đối với cây con trồng bằng
hạt.
III. KÕT QU¶ Vµ TH¶O LUËN
1. Khả năng phát sinh callus trên mẫu lá cà phê.
Bảng 1. Tỷ lệ phát sinh callus của 4 dòng vô tính cà phê vối sau 4-8 tháng vào mẫu (%)-
(,ăm thực hiện: 2009)
DVT
Môi trường
TR10 TR11 TR12 TR13
1. Yasuda, 1985. 0 0 16,0 10,7
2. Yasuda cải tiến bổ sung BA 0 0 0 0
3. Pierson, 1983 0 0 100 0
4. Pierson cải tiến bổ sung BA 0 26,7 0 0
5. Murashige & Skoog, 1962 0 0 0 0
Kết quả cho thấy khả năng phát sinh callus của các dòng vô tính cà phê vối khác
nhau ở các môi trường thử nghiệm: Dòng TR10 không tạo callus có khả năng phát
sinh phôi ở cả 5 môi trường. Tỷ lệ phát sinh callus có khả năng phát triển thành phôi
của dòng TR11 trên môi trường Pierson cải tiến sau 4 tháng vào mẫu là 26,7%. Đối
với dòng TR12 tỷ lệ này là 100% trên môi trường Pierson sau 5 tháng vào mẫu và
16% trên môi trường Yasuda sau 8 tháng vào mẫu. Đối với dòng TR13 tỷ lệ này là
10,7% trên môi trường Yasuda sau 6 tháng vào mẫu.
2. Nhân callus trong môi trường lỏng
Callus có khả năng phát sinh phôi (màu vàng, dạng hạt) được chuyển qua nhân trong
môi trường lỏng. Khi sử dụng một lượng callus như nhau đưa vào nuôi cấy, sau 8 tuần
trọng lượng callus tăng lên không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê, bình quân tăng 9,3
-10,6 lần so với trước khi nuôi cấy.
Bảng 2. Trọng lượng callus tăng sau nuôi cấy trên máy lắc 2 tháng (g)
(,ăm thực hiện 2009 - 2010)
Dòng vô tính Σ lượng callus trước
nuôi cấy (g)
Σ lượng callus sau nuôi
cấy (g) Tỷ lệ tăng (%)
TR11 0,5 4,69 938
TR12 0,5 4,65 930
TR13 0,5 5,28 1056