NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO MỘT SỐ DÒNG CÀ PHÊ VỐI (Coffea canephora) CHỌN LỌC THÔNG QUA MÔ SẸO VÀ PHÁT SINH PHÔI SOMA
Nguyễn Thị Mai1, Vương Phấn1, Trương Văn Tân1, Trần Thị Hoàng Anh1
SUMMARY
Study on in vitro propagation of some selected Coffea canephora clones via callus and somatic embryogenesis
The research was carried out to establish a protocol of micropropagation via callus and somatic embryogenesis from cultured leaf of some selected Coffea canephora clones in WASI. The results showed that 1g embryogenic callus could produce about 80g torpedo embryos within 4-5 months. After about 5 months of germination phase, from 1g torpedo embryos we could select 160 plantlets, size ~10 mm, with one pair of true leaves and root for acclimatization in commercial coconut fibres under a greenhouse. After 2-3 months of acclimatization, there were about 140 plantlets developed at least two pairs of true leaves available for transplanting into PE bags and taken the same care as the seedlings. Keywords: Coffea canephor, in vitro propagation, callus, somatic embryogenesis
1. §ÆT VÊN §Ò
Phương pháp truyền thống để nhân giống cây cà phê vối là dùng hạt. Bên cạnh đó phương pháp ghép nối ngọn cũng được ứng dụng rộng rãi tại các vùng thâm canh cà phê. Mặc dù Viện Khoa học Kỹ thuật Nông Lâm nghiệp (KHKT NLN) Tây Nguyên đã thiết lập một số vườn nhân chồi cây giống cao sản nhưng không đáp ứng đủ lượng cây giống tốt.
Việc nuôi cấy mô các loài cà phê trên thế giới đã đạt được những tiến bộ đáng kể. Quá trình phát sinh phôi vô tính cây cà phê vối Coffea canephora được Staritsky báo cáo lần đầu tiên vào năm 1970; Sondahl và Sharp, 1977 cũng tạo được cây cà phê chè Coffea arabica từ phôi vô tính. Tiếp theo đó nhằm mục đích nhân giống cà phê, nhiều tác giả đã nghiên cứu sự phát sinh phôi vô tính cây cà phê như Staristky và Van Hasselt (1980); Pierson và cộng tác viên (1983); Zamarripa và cộng tác viên (1991); Hatanaka và cộng tác viên (1991); Van Boxtel và Berthouly (1996), Ducos và cộng tác viên (1999, 2003)... Các công trình nghiên cứu này cho thấy có 3 tiến trình chính trong nhân nhanh cây cà phê bằng phương pháp phát sinh phôi vô tính, đó là: Nhân tế bào có tiềm năng phát sinh phôi và sản xuất phôi (giai đoạn thủy lôi) trong môi trường lỏng; giúp phôi nảy mầm bằng
1 Viện Khoa học Kỹ thuật Nông Lâm nghiệp Tây Nguyên.
cách làm ngập tạm thời phôi (giai đoạn có lá mầm) trong môi trường lỏng; tạo điều kiện cho phôi nảy mầm phát triển thành cây con.
Vì vậy, việc ứng dụng các tiến bộ trên về kỹ thuật nhân in vitro bằng phương pháp nuôi cấy phôi soma cho các dòng vô tính cà phê vối ưu tú đã được tuyển chọn là điều vô cùng cần thiết để đáp ứng nhu cầu cấp bách về giống tốt hiện nay của sản xuất.
II. VËT LIÖU Vµ PH¦¥NG PH¸P NGHI£N CøU
1. Vật liệu nghiên cứu
4 dòng vô tính cà phê vối (TR10, TR11, TR12, TR13) có năng suất cao, cỡ hạt lớn và
khả năng kháng bệnh gỉ sắt cao.
2. Phương pháp nghiên cứu
- Vào mẫu, tạo callus từ lá cà phê: Trước khi lấy mẫu lá, phun thuốc nấm trên lá, ngày một lần, trong 3 - 4 ngày. Hái lá bánh tẻ, rửa sạch, xử lý thuốc nấm và nhúng vào dung dịch Ethanol 70% trong 30 giây. Khử trùng bằng Hypochlorite Calci 10% trong 15 phút, rửa lại bằng nước cất khử trùng. Sau đó bỏ gân lá, rìa lá, 2 phần đầu, đuôi lá và cắt lá thành mảnh nhỏ (mỗi mảnh là một mẫu có kích thước khoảng 1cm2). Cấy mẫu lên môi trường thạch phát sinh callus, để trong tối.
- (cid:22)hân callus trong môi trường lỏng: Chuyển callus đã chọn lọc sang môi trường lỏng nhân callus, lắc tròn (110 - 120 vòng/phút). Sau 2 tuần, thay mới môi trường và tăng thể tích môi trường từ 10 ml lên 50 ml, 100 ml/bình tam giác. Quá trình lặp lại cho đến tuần thứ 8, các callus tăng về số lượng được sử dụng làm nguồn vật liệu cho quá trình sản xuất phôi.
- Tạo phôi cà phê dạng thủy lôi trong môi trường lỏng: Callus được chuyển sang môi trường lỏng sản xuất phôi, lắc tròn. Thay mới môi trường, cho đến khi phôi phát triển chủ yếu dưới dạng thủy lôi.
- Tái sinh cây từ phôi và tạo cây con hoàn chỉnh: Trên môi trường thạch tái sinh cây, phôi vô tính cà phê ở dạng thủy lôi phát triển thành cây con có một cặp lá thật được đưa ra huấn luyện trên bột xơ dừa cho đến khi phát triển thành cây con có ít nhất hai cặp lá thật. Ra ngôi trong bầu đất PE, chế độ chăm sóc giống như đối với cây con trồng bằng hạt.
III. KÕT QU¶ Vµ TH¶O LUËN
1. Khả năng phát sinh callus trên mẫu lá cà phê.
Bảng 1. Tỷ lệ phát sinh callus của 4 dòng vô tính cà phê vối sau 4-8 tháng vào mẫu (%)- (,ăm thực hiện: 2009)
TR10 TR11 TR12 TR13 DVT Môi trường
1. Yasuda, 1985. 0 0 16,0 10,7
2. Yasuda cải tiến bổ sung BA 0 0 0 0
3. Pierson, 1983 0 0 100 0
4. Pierson cải tiến bổ sung BA 0 26,7 0 0
5. Murashige & Skoog, 1962 0 0 0 0
Kết quả cho thấy khả năng phát sinh callus của các dòng vô tính cà phê vối khác nhau ở các môi trường thử nghiệm: Dòng TR10 không tạo callus có khả năng phát sinh phôi ở cả 5 môi trường. Tỷ lệ phát sinh callus có khả năng phát triển thành phôi của dòng TR11 trên môi trường Pierson cải tiến sau 4 tháng vào mẫu là 26,7%. Đối với dòng TR12 tỷ lệ này là 100% trên môi trường Pierson sau 5 tháng vào mẫu và 16% trên môi trường Yasuda sau 8 tháng vào mẫu. Đối với dòng TR13 tỷ lệ này là 10,7% trên môi trường Yasuda sau 6 tháng vào mẫu.
2. Nhân callus trong môi trường lỏng
Callus có khả năng phát sinh phôi (màu vàng, dạng hạt) được chuyển qua nhân trong môi trường lỏng. Khi sử dụng một lượng callus như nhau đưa vào nuôi cấy, sau 8 tuần trọng lượng callus tăng lên không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê, bình quân tăng 9,3 -10,6 lần so với trước khi nuôi cấy.
Bảng 2. Trọng lượng callus tăng sau nuôi cấy trên máy lắc 2 tháng (g) (,ăm thực hiện 2009 - 2010)
Dòng vô tính Tỷ lệ tăng (%) Σ lượng callus trước nuôi cấy (g) Σ lượng callus sau nuôi cấy (g)
TR11 0,5 4,69 938 TR12 0,5 4,65 930 TR13 0,5 5,28 1056
ns TB 0,5
3. Tạo phôi cà phê dạng thủy lôi trong môi trường lỏng
Trên môi trường thử nghiệm, có 2 dòng TR11 và TR13 phản ứng tốt.
Bảng 3. Khối lượng (g) và tỷ lệ (%) phôi dạng thủy lôi sau nuôi cấy (,ăm thực hiện 2009 - 2010)
Dòng vô tính Σ lượng callus nuôi cấy (g) Σ lượng phôi sau 2-3 tháng (g) Σ lượng phôi dạng thủy lôi (g) Tỷ lệ phôi dạng thủy lôi (%)
TR11 2 21,60 17,45 80,8 TR13 2 22,50 19,20 85,3
Đối với dòng vô tính TR11, tổng lượng phôi thu được sau 2 tháng nuôi cấy tăng hơn 10,8 lần, có 80,8% phôi phát triển thành dạng thủy lôi màu trắng. Đối với dòng vô tính TR13, tổng lượng phôi thu được sau 3 tháng nuôi cấy tăng 11,3 lần, tỷ lệ callus phát triển thành phôi dạng thủy lôi chiếm 85,3%.
Phôi dạng thủy lôi (kích thước từ 1-2 mm) là nguồn vật liệu cần thiết, thông qua giai
đoạn phôi tiền nảy mầm và nảy mầm để tái sinh thành cây hoàn chỉnh.
4. Tái sinh cây từ phôi và tạo cây con hoàn chỉnh
Các phôi dạng thủy lôi được trải đều trên môi trường thạch tái sinh (1g phôi/đĩa pétri). Sau 3-5 tháng, từ 1g phôi ban đầu phát triển thành 155-160 cây con (kích thước ~ 10 mm, có một cặp lá thật, có rễ) và 500-550 phôi ở các giai đoạn khác nhau (kích thước < 2mm, từ 2-5 mm hoặc từ 5-10mm; chưa có lá mầm hoặc có lá mầm phát triển tốt, có rễ hoặc không có rễ). Chọn cây con có một cặp lá thật, có rễ đưa ra huấn luyện trên giá thể bột xơ dừa.
Bảng 4. Tỷ lệ sống (%) và khả năng phát triển của cây con có một cặp lá thật trên giá thể bột xơ dừa - (,ăm thực hiện: 2010)
Chỉ tiêu Sau 1 tháng Sau 2 tháng Sau 3 tháng Sau 4 tháng
Tỷ lệ sống (%) 90 88,3 88,3 88,3 - 58,8 100 100 Tỷ lệ cây có ít nhất 2 cặp lá thật (%)
