PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU NHIỄM
SẮC THỂ NGƯỜI
I. ĐẠI CƯƠNG:
Nhiễm sắc thể (NST) người được xem là những yếu tố của sự di truyền.
Thuật ngữ “Chromosome” (chromo = color = MÀU và some = body = THỂ) đã
được Waldeyer đưa ra vào năm 1888. Các NST chỉ có thể quan sát được khi chúng co
ngắn lại ở kỳ giữa để chuẩn bị cho sự phân chia tế bào.
NST đã được nghiên cứu từ cuối thế kỷ 19, nhưng với trình độ khoa học kỹ thuật
thời bấy giờ các nhà khoa học đã đưa ra nhiều kết luận khác nhau về số lượng NST
người.
1891 Flemming đề nghị bộ NST người là: 2n = 24
Morre đề nghị bộ NST người là: 2n = 32
Wilcox đề nghị bộ NST người là: 2n = 36
Đầu thế kỷ 20, việc quan sát phân tích số lượng NST người đã gần đúng sự thật.
1912 Winiwater phân tích mô tinh hoàn cắt mảnh và cho rằng :
♂ = 47 NST (trong đó có 1 NST giới tính X)
♀ = 48 NST (trong đó có 2 NST giới tính XX)
1921 Tìm ra NST Y
1923 Painter cũng dùng mô tinh hoàn cắt mảnh để phân tích và đi đến
kết luận bộ NST người là 2n = 48
♂ = 46 NST thường + XY
♀ = 46 NST thường + XX
Như vậy, số lượng NST người với 2n = 48 của Painter được mọi người công nhận
và tồn tại trong các sách giáo khoa hàng chục năm.
Mãi đến năm 1956, Tjio và Levan qua phân tích tế bào thai người, xác định chính
xác số lượng NST của người là 2n = 46
Nam = 44 nst thường + XY
Nữ = 44 nst thường + XX
Năm 1960, Moorhead và cộng sự đã đề xuất phương pháp cấy tế bào lympho ở
máu ngoại vi trong vòng 48h – 72h để làm tiêu bản NST người và qua đó phân tích,
đánh giá các NST một cách chính xác.
Chu kỳ tế bào:
(Pr)
G
2
(Pr)
G
2
S
(AND)
M
G1
S interphase (gian kỳ)
G2
2 gđ chính
Prophase : kỳ đầu
Metaphase : kỳ giữa
M: Mitosis (phân chia tb) Anaphase : kỳ sau
Telophase : kỳ cuối
Trong giai đoạn phân chia tế bào, ta quan sát các NST rõ nhất ở kỳ giữa.
II. CÁC NGUYÊN TẮC KỸ THUẬT ĐỂ LÀM TIÊU BẢN NST NGƯỜI:
1. Nguyên tắc cơ bản:
Các NST chỉ có thể được xác định và phân tích cấu trúc ở cuối kỳ đầu và kỳ giữa,
vì thế, trong việc nghiên cứu NST người, ta chỉ dùng những mô có các tế bào đang
trong giai đoạn phân chia, còn đối với những mô bao gồm các tế bào ít phân chia hoặc
không phân chia, phải kích thích cho chúng phân chia và nuôi cấy chúng trong một
môi trường thích hợp (RPMI, F10, TC199…..). VD: Tế bào lympho ở máu ngoại vi là
những tế bào không phân chia, tuy nhiên dưới tác dụng của chất Phytohemagglutinin
(PHA), tế bào lympho sẽ chuyển dạng và phân chia. PHA là một loại mucoprotein
chiết xuất từ hạt đậu đỏ hình thận, tên khoa học là Phaseolus Vulgaris. PHA có tác
dụng làm chuyển dạng các tế bào lympho nhỏ thành những tế bào giống như nguyên
bào lympho (lymphoblast-like cells), gây nên sự gia tăng tổng hợp ARN và ADN
trong vòng 48 giờ nuôi cấy. PHA còn có tác dụng gây ngưng kết hồng cầu.
Làm cho các tế bào đang phân chia dừng lại ở kỳ giữa vì các NST ở kỳ giữa có
dạng điển hình nhất giúp ta dễ quan sát, phân tích và đánh giá. Hoá chất có tác dụng
này là Colchicin, là một hoạt chất của hạt cây Thu Thủy Tiên (Colchicum Autumnale)
hoặc hóa chất tổng hợp có tác dụng tương tự như Colchicin là Colcemid. Đặc tính của
hóa chất này là phá vỡ thoi vô sắc, do đó NST mất chỗ tựa và không thể di chuyển về
2 cực của tế bào được, vẫn nằm tại mặt phẳng xích đạo. Colchicin còn có tác dụng làm
cho NST co ngắn lại, dày lên và quan sát dễ dàng.
Dùng sốc nhược trương (hypotonic shock) để làm trương phồng tế bào phá vỡ
màng tế bào, các NST ở kỳ giữa sẽ phân tán không xếp chồng lên nhau, nhờ vậy có thể
quan sát dễ từng chiếc một. Dung dịch nhược trương thường được dùng là KCl 0,75M
hoặc Citrat Natri 1%.
Định hình các NST bằng dung dịch Carnoy theo tỷ lệ 3/1 (3 methanol / 1 acid
acetic)
Nhuộm NST bằng các loại phẩm nhuộm nhân: Giemsa, orcein …
2. Phương pháp làm tiêu bản NST:
Có 2 phương pháp: trực tiếp và gián tiếp
a. Phương pháp trực tiếp:
Là phương pháp lấy tế bào của cơ thể không qua giai đoạn nuôi cấy chuẩn bị, chỉ
sử dụng những tế bào đang ở trong giai đoạn phân chia rất mạnh trong cơ thể. VD: tế
bào tủy xương, mô bào thai, mô tinh hoàn ….
Chú ý :
Vẫn phải nhỏ Colchicin với mục đích làm ngưng giai đoạn phân chia tế bào ở kỳ
giữa.
Vẫn phải dùng dung dịch nhược trương KCl với mục đích làm bung các NST.
b. Phương pháp gián tiếp:
Là phương pháp mà trong đó các tế bào phải trải qua 1 quá trình nuôi cấy trong
môi trường thích hợp, kích thích các tế bào chuyển dạng và phân chia nhờ vào PHA.
Loại tế bào hay được dùng trong phương pháp gián tiếp là các lympho bào ở máu
ngoại vi vì mẫu vật dễ lấy và phương pháp nuôi cấy tương đối đơn giản.
Ngoài tế bào lympho ở máu ngoại vi, còn có thể nuôi cấy các tế bào của mô bào
thai, tế bào gai nhau, nguyên bào sợi, tế bào của các khối u ác tính …..
Sử dụng phương pháp gián tiếp thường có nhiều tế bào phân chia hơn so với
phương pháp trực tiếp, và do vậy có được nhiều cụm kỳ giữa để quan sát, phân tích và
đánh giá hơn.