TNU Journal of Science and Technology
230(01): 432 - 437
http://jst.tnu.edu.vn 432 Email: jst@tnu.edu.vn
COMPARING THE ANTIFUNGAL ACTIVITY OF NANOENCAPSULATED
MAY CHANG, GARLIC AND FENNEL ESSENTIAL OILS AGAINST BOTRYTIS
CINEREA, WHICH CAUSES GRAY MOLD DISEASE ON STRAWBERRY
Tran Thi Ngoc Mai*, Le Xuan Cuong, Vu Ngoc Bich Dao
Nguyen Ngoc Thuy Trang, Le Van Toan, Pham Bao Ngoc, Nguyen Minh Hiep
Center of Radiation Technology and Biotechnology - Dalat Nuclear Research Institute
ARTICLE INFO
ABSTRACT
Received:
07/8/2024
Botrytis cinerea is a harmful fungus affecting many different crops. To
date, numerous studies have shown that plant essential oils are
effective in inhibiting pathogenic fungi and have the potential to
replace chemically synthesized fungicides. This study compares the
inhibitory effect of plant essential oils (may chang, garlic, fennel) in
nano form against Botrytis cinerea causing gray mold disease. First,
Botrytis cinerea was isolated and purified on potato dextrose agar
medium. After that, nanocarriers containing plant essential oils (may
chang, garlic, fennel) were synthesized using homogenization and
sonication method. The inhibitory effect on fungal mycelium growth
of these nanoencapsulated essential oils were carried out using the petri
dish method. The results indicated that three nanoencapsulated
essential oils of may chang, garlic, and fennel were successfully
synthesized with an average particle size of less than 120 nm and
stability maintained after 2 months of storage. In vitro results showed
that the nano form of garlic essential oil exhibited the best antifungal
effectiveness, followed by the may chang and the fennel essential oil.
Revised:
17/12/2024
Published:
18/12/2024
KEYWORDS
Botrytis cinereal
May chang essential oil
Garlic essential oil
Fennel essential oil
Nanoencapsulated
SO SÁNH KHẢ NĂNG ỨC CHẾ NẤM BOTRYTIS CINEREA
GÂY BỆNH MỐC XÁM TRÊN DÂU TÂY CỦA HỆ NANO
TINH DẦU THỰC VẬT MÀNG TANG, TỎI VÀ TIỂU HỒI HƯƠNG
Trần Thị Ngọc Mai*, Lê Xuân Cường, Vũ Ngọc Bích Đào
Nguyễn Ngọc Thùy Trang, Lê Văn Toàn, Phạm Bảo Ngọc, Nguyễn Minh Hiệp
Trung tâm Công nghệ bức xạ và Công nghệ sinh học - Viện Nghiên cứu Hạt nhân
TÓM TẮT
Ngày nhận bài:
07/8/2024
Botrytis cinerea là loài nấm gây hại trên rất nhiều loại cây trồng khác
nhau. Cho tới nay, nhiều nghiên cứu đã cho thấy tinh dầu thực vật có
hiệu quả trong ức chế nấm gây bệnh, có tiềm năng thay thế cho thuốc
trừ nấm tổng hợp hóa học. Nghiên cứu này so sánh hiệu quả ức chế
nấm Botrytis cinerea gây bệnh mốc xám của các tinh dầu thực vật
(màng tang, tỏi, tiểu hồi hương) ở dạng nano. Đầu tiên, nấm Botrytis
cinerea được phân lập và làm thuần trên môi trường thạch khoai tây.
Sau đó, hệ mang nano chứa tinh dầu thực vật (màng tang, tỏi, tiểu hồi
hương) được tổng hợp bằng phương pháp đồng hóa tốc độ cao. Kết
hợp với sử dụng sóng siêu âm. Hiệu quả ức chế sự phát triển của sợi
nấm của các hệ nano chứa tinh dầu thực vật được thực hiện bằng
phương pháp đĩa thạch. Kết quả cho thấy, ba hệ nano tinh dầu màng
tang, tỏi, tiểu hồi hương đã được tổng hợp thành công có kích thước
hạt trung bình nhỏ hơn 120 nm, ổn định sau 2 tháng bảo quản. Kết quả
in vitro cho thấy hệ nano tinh dầu tỏi có hiệu quả ức chế nấm tốt nhất,
sau đó đến hệ nano màng tang và hệ nano tiểu hồi hương.
Ngày hoàn thiện:
17/12/2024
Ngày đăng:
18/12/2024
DOI: https://doi.org/10.34238/tnu-jst.10892
* Corresponding author. Email: tranthingocmai626@gmail.com
TNU Journal of Science and Technology
230(01): 432 - 437
http://jst.tnu.edu.vn 433 Email: jst@tnu.edu.vn
1. Giới thiệu
Ngày nay, khi khoa học ngày càng phát triển, con người đứng trước nhu cầu ngày càng cao về
thực phẩm sạch và an toàn. Dâu tây là một loại quả có giá trị dinh dưỡng cao. Tuy nhiên, dâu tây
dễ bị nhiễm các bệnh do nấm gây ra, trong đó có nấm Botrytis cinerea (B. cinerea) gây bệnh mốc
xám trên lá, thân quả của cây dâu tây. Nấm gây thối và hình thành lớp nấm màu xám bao phủ quả
[1], [2]. Nấm này được biết tới từ lâu vì phổ kí chủ rộng và có khả năng gây bệnh trên hơn 200 loài
cây và có khả năng phát triển trong môi trường rất đa dạng. Bệnh do nấm này gây ra gây thất thoát
khoảng một triệu euro mỗi năm và theo khảo sát cho thấy thị trường thuốc nấm cho riêng loại nấm
này đã chiếm 10% thị trường thuốc nấm [3].
Thuốc trừ nấm hóa học đã được sử dụng trong nhiều thập kỷ để ức chế nấm gây bệnh. Tuy
nhiên, ngày càng có nhiều nghiên cứu cho thấy thuốc hóa học gây nhiều ảnh hưởng không tốt đến
môi trường và con người. Thuốc hóa học gây ảnh hưởng đến môi trường đất, nước và không khí.
Ảnh hưởng đến các loài thủy sinh và hệ sinh thái môi trường trong đất. Thuốc còn có khả năng gây
dị ứng và các bệnh mạn tính liên quan đến hệ thần kinh, miễn dịch, tiêu hóa và hô hấp của con
người [3], [4]. Do đó, việc sử dụng thuốc sinh học thay thế cho thuốc hóa học được quan tâm và
nghiên cứu nhiều hơn. Thuốc sinh học thân thiện hơn với cả con người và môi trường sinh thái.
Tuy nhiên, sản phẩm sinh học thường có giá thành cao và hiệu quả không cao bằng thuốc hóa học,
làm giảm tính cạnh tranh của dòng sản phẩm này trên thị trường. Do đó, các nghiên cứu mới vẫn
đang không ngừng cải tiến để nâng cao hiệu quả và tính cạnh tranh của thuốc trừ nấm sinh học.
Một số nghiên cứu trước đó đã cho thấy chiết xuất màng tang có hiệu quả ức chế nấm Botrytis
cinerea [5]. Chiết xuất tỏi hạn chế sự phát triển của nấm xám trên táo [6]. Dầu tiểu hồi hương cho
hiệu quả ức chế nấm mốc xám trên quả mận ở nồng độ 600 µL/L [7]. Tuy nhiên, dạng dầu thường
khó ứng dụng trong thực tiễn, nồng độ sử dụng cao dẫn đến giá thành sản phẩm không thấp. Do
đó, nghiên cứu này thực hiện nghiên cứu đóng gói tinh dầu màng tang, tỏi và tiểu hồi hương vào
hệ mang nano nhằm cải thiện độ phân tán và tăng hiệu quả của các tinh dầu này.
2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1. Vật liệu
Tinh dầu đinh hương, tinh dầu tỏi, tinh dầu mù tạt, tinh dầu sả chanh độ tinh khiết 98% (Công
ty TNHH tinh dầu thảo dược Dalosa, Việt Nam). Các hóa chất khác đều có độ tinh khiết ở cấp độ
phân tích, thích hợp cho làm thí nghiệm.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phân lập và làm thuần chủng nấm gây bệnh mốc xám trên quả dâu tây
Quả dâu tây bị mốc xám tại một vườn dâu của thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng. Chủng nấm
sau đó được làm thuần và định danh sử dụng phương pháp giải trình tự Sanger vùng gen ITS rDNA.
Đối với các thử nghiệm ức chế tăng trưởng, chủng này được nuôi trên môi trường thạch khoai tây
(PDA) ở 22 ± 1°C trong 7 ngày [8].
2.2.2. Tng hp và khảo st thông số đc đim của các hệ nano chứa tinh dầu thực vật
Để tổng hợp hệ nano, cân 10g tween và lecithin với tỉ lệ 1:1 (w/w), khuấy tan rồi trộn với 10g
tinh dầu. Hỗn hợp được đồng hóa ở tốc độ cao 20 000 vòng/phút trong 5 phút. Sau đó, sử dụng
sóng siêu âm để giảm kích thước hạt. Dịch phân tán thu được được bảo quản ở nhiệt độ phòng sử
dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Dung dịch sau đó được pha loãng với nước cất để xác định các
thông số của hệ mang nano như kích thước hạt, chỉ số phân tán và điện tích bề mặt bằng máy
Zetasizer Nano ZS.
2.2.3. Khảo sát hiệu quả ức chế nấm ở điều kiện in vitro
TNU Journal of Science and Technology
230(01): 432 - 437
http://jst.tnu.edu.vn 434 Email: jst@tnu.edu.vn
Hiệu quả ức chế nấm Botrytis cinerea được thực hiện trên môi trường thạch khoai tây [8], [9]. Cụ
thể, môi trường thạch khoai tây sau khi được hấp khử trùng ở 121oC, 20 phút, làm nguội đến khoảng
55oC sẽ được bổ sung hệ mang nano chứa tinh dầu thực vật. Sau đó, để nguội và cấy tản nấm đường
kính 6 mm lên bề mặt đĩa petri. Mẫu đối chứng là mẫu bổ sung nước cất vô trùng thay cho dịch phân
tán nano. Mẫu sau khi cấy được giữ trong tủ ấm 22±1oC. Sau 7 ngày, tiến hành quan sát và đo đường
kính nấm phát triển. Hiệu quả ức chế sự phát triển sợi nấm được tính theo công thức: H (%)=(Dc-
Dt)/Dc*100. Trong đó: H là hiệu quả ức chế nấm, Dc là đường kính khuẩn lạc trên môi trường đối
chứng; Dt là đường kính khuẩn lạc trên môi trường có bổ sung tinh dầu.
2.2.4. Phương php xử lý kết quả
Số liệu được lặp lại ba lần, số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel và SPSS với
mức ý nghĩa p < 0,05.
2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu thực hiện trong khoảng 6 tháng, từ tháng 01 đến tháng 07 năm 2024 tại Trung tâm
Công nghệ bức xạ và Công nghệ sinh học, Viện Nghiên cứu Hạt nhân.
3. Kết quả và bàn luận
3.1. Phân lập và làm thuần chủng nấm gây bệnh mốc xám trên quả dâu tây
Mẫu nấm sau khi phân lập và làm thuần được định danh sử dụng phương pháp Sanger cho thấy
mẫu nấm gây bệnh mốc xám trên quả dâu tây xác thực là chủng nấm Botrytis cinerea. Sợi nấm
phát triển trên môi trường thạch khoai tây ban đầu có màu trắng ngà, sau đó đổi sang màu nâu xám
(Hình 1). Mẫu nấm sau đó được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 1. Nấm Botrytis cinerea làm thuần trên môi trường PDA
A. Sau 4 ngày nuôi cấy; B. Sau 20 ngày nuôi cấy
3.2. Tổng hợp hệ nano chứa tinh dầu thực vật
Ba hệ nano màng tang, tỏi, tiểu hồi hương sau khi tổng hợp đều có kích thước hạt trung bình
nhỏ hơn 120 nm (Bảng 1). Trong ba hệ, hệ nano tinh dầu tỏi có kích thước hạt trung bình nhỏ nhất
94,01 nm và chỉ số PDI nhỏ (tiệm cận về 0) cho thấy kích thước của các hạt trong hệ này tương
đối đồng đều. Trong khi đó, hệ nano tinh dầu màng tang và tỏi có kích thước hạt cũng chỉ khoảng
116 đến 119 nm nhưng chỉ số phân tán của hai hệ này tương đối cao cho thấy các hạt trong hệ có
sự chênh lệch kích thước hạt đáng kể.
Sau hai tháng bảo quản cả ba hệ nano tinh dầu có sự thay đổi kích thước hạt không đáng kể. Cả
ba hệ đều có sự gia tăng kích thước hạt sau quá trình bảo quản, điều này là do một số hạt không ổn
định có xu hướng kết hợp lại tạo thành các hạt lớn hơn. Tuy vậy, các hạt trong cả ba hệ nano không
có sự thay đổi quá lớn, dao động từ 2,13 nm với hệ nano tinh dầu tỏi đến 12,1 nm với hệ nano tinh
dầu tiểu hồi hương. Sau hai tháng bảo quản cả ba hệ nano tinh dầu đều duy trì được kích thước hạt
nano thay đổi không đáng kể, nhỏ hơn 130 nm.
AB
TNU Journal of Science and Technology
230(01): 432 - 437
http://jst.tnu.edu.vn 435 Email: jst@tnu.edu.vn
Bảng 1. Thông số đc đim của 3 hệ nano màng tang, tỏi và tiu hồi hương
Dịch phân tán nano
Kích thước hạt
trung bình (nm)
Chỉ số phân tán (PDI)
Điện tích bề mặt
(mV)
Tinh dầu màng tang
116,4 ± 3,15
0,424 ± 0,041
-45,10 ± 1,31
Tinh dầu tiểu hồi hương
117,6 ± 2,52
0,389 ± 0,031
-42,54 ± 1,50
Tinh dầu tỏi
94,01 ± 1,65
0,138 ± 0,032
-41,37 ± 0,67
Bảng 2. Thông số đc đim của 3 hệ nano màng tang, tỏi và tiu hồi hương sau 2 thng
Dịch phân tán nano
Kích thước hạt
trung bình (nm)
Chỉ số phân tán (PDI)
Điện tích bề mặt
(mV)
Tinh dầu màng tang
123,4 ± 2,40
0,411 ± 0,038
-43,70 ± 1,16
Tinh dầu tiểu hồi hương
129,7 ± 3,20
0,423 ± 0,023
-40,07 ± 1,03
Tinh dầu tỏi
96,14 ± 2,78
0,206 ± 0,037
-39,40 ± 0,61
Hình 2. Hệ mang nano màng tang, tỏi và tiu hồi hương (từ tri qua) phân tn trong nước
Tinh dầu thường có độ phân tán kém trong nước. Điều này hạn chế ứng dụng của tinh dầu trong
điều kiện thực tiễn. Tuy nhiên, sau khi sử dụng kết hợp tinh dầu với hệ mang nano thì hệ mang
nano chứa tinh dầu có độ phân tán rất tốt trong nước (Hình 2). Sau thời gian hai tháng bảo quản cả
ba hệ nano tinh dầu màng tang, tỏi và tiểu hồi hương vẫn duy trì độ ổn định, không hề bị tách lớp,
phân tán tốt trong nước (Bảng 2).
3.3. Hiệu quả ức chế nấm Botrytis cinerea ở điều kiện in vitro
Hiệu quả ức chế sự phát triển sợi nấm trong điều kiện in vitro được thực hiện bằng phương pháp
đĩa thạch. Kết quả bảng 3 và hình 3 cho thấy, ở nồng độ pha loãng 300 và 400 lần không có sự
khác biệt vì cả ba hệ nano tinh dầu đều cho hiệu quả ức chế nấm hoàn toàn, đạt 100%. Tuy nhiên,
ở độ pha loãng 500 lần đã có sự phân hóa sâu sắc giữa ba hệ nano tinh dầu. Cụ thể, hệ nano tinh
dầu tỏi vẫn duy trì hiệu quả ức chế hoàn toàn sự phát triển sợi nấm trên môi trường dinh dưỡng.
Trong khi đó, hệ nano tinh dầu màng tang và tiểu hồi hương hiệu quả ức chế sự phát triển sợi nấm
đã giảm hơn 50%, chỉ còn lần lượt là 44,62% và 39,78%. Ở cùng nồng độ, hiệu quả của hệ nano
tinh dầu tỏi cao hơn 2,24 lần so với hệ nano tinh dầu màng tang và cao hơn 2,51 lần so với hệ nano
tinh dầu tiểu hồi hương. Từ đó cho thấy, trong nghiên cứu này, hiệu quả của hệ nano tinh dầu tỏi
là tốt nhất, sau đó đến hệ nano tinh dầu màng tang và hệ nano tinh dầu tiểu hồi hương. Bên cạnh
đó, khi vượt quá nồng độ pha loãng 500 lần thì hiệu quả ức chế nấm có xu hướng giảm, điều này
là do nồng độ tinh dầu thấp hơn mức tối thiểu cần để ức chế nấm.
Bảng 3. Hiệu quả ức chế nấm Botrytis cinerea ở điều kiện in vitro
Dịch phân tán nano
Hiệu quả ức chế nấm (%)
Độ pha loãng
300 lần
Độ pha loãng
400 lần
Độ pha loãng
500 lần
Độ pha loãng
550 lần
Tinh dầu màng tang
100 ± 0a
100 ± 0a
44,62 ± 2,46b
0 ± 0b
Tinh dầu tiểu hồi hương
100 ± 0a
100 ± 0a
39,78 ± 3,35b
0 ± 0b
Tinh dầu tỏi
100 ± 0a
100 ± 0a
100 ± 0a
94,08 ± 2,46a
TNU Journal of Science and Technology
230(01): 432 - 437
http://jst.tnu.edu.vn 436 Email: jst@tnu.edu.vn
Hình 3. Hiệu quả ức chế nấm ở điều kiện in vitro
Botrytis cinerea là mầm bệnh trên cả rau củ quả tươi và cả sản phẩm sau thu hoạch. Gây thất
thoát lượng lớn nông sản. Thuốc hóa học có hiệu quả nhanh và kiểm soát tốt mầm bệnh này. Tuy
vậy, với xu hướng nông nghiệp sạch bền vững hiện nay trên toàn thế giới nói chung và Việt Nam
nói riêng, việc tìm kiếm một sản phẩm sinh học an toàn thay thế là cần thiết. Tinh dầu có thể sử
dụng như một phương pháp thay thế trong kiểm soát nấm gây bệnh. Trong nghiên cứu này, tinh
dầu sau khi đóng gói vào trong hệ mang nano đã cho hiệu quả ức chế nấm Botrytis cinerea phân
lập trên dâu tây. Hiệu quả khác nhau phụ thuộc vào loại tinh dầu được sử dụng. Điều này cũng phù
hợp với nghiên cứu trước đây của Tančinová cho thấy tinh dầu khác nhau cho hiệu quả kháng nấm
khác nhau [8].
Cho đến nay, đã có nhiều nghiên cứu tìm hiểu về cơ chế kháng nấm của tinh dầu. Tuy nhiên,
nghiên cứu vẫn còn hạn chế, đa phần tập trung vào hiệu quả ức chế nấm. Một số nghiên cứu trước
đó cho rằng tinh dầu còn có thể làm mất ổn định màng tế bào thông qua rò rỉ các ion trên màng,
làm gián đoạn các quá trình sinh tổng hợp và phá hủy tế bào; tương tác với ty thể, làm thay đổi
điện thế màng, bơm proton và ATP synthase, tạo ra sự rối loạn về độ pH của tế bào và độ dốc điện
hóa của màng plasma [3]. Nghiên cứu của Aminifard và Mohammadi đề cập đến hiệu quả của tinh
dầu trong ức chế sự phát triển của vi sinh vật có thể là do các hợp chất phenolic của tinh dầu làm
thay đổi tính thấm của tế bào do tương tác với màng protein. Từ đó, làm thay đổi cấu trúc và chức
năng của tế bào [7]. Nghiên cứu của Wang và cộng sự (2019) đã chứng minh khi xử lý bằng tinh
dầu màng tang 1,0% sẽ ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm B. cinerea thông qua thay đổi tính
thấm của màng tế bào, tính toàn vẹn của màng, độ dẫn điện và hàm lượng đường khử hòa tan,
protein và ergosterol, dẫn đến hạn chế sự phát triển của sợi nấm, đầu sợi nấm mở rộng và sợi nấm
bị biến dạng hoặc thậm chí bị đứt, cuối cùng gây ra cái chết của tế bào soma của nấm [5]. Tuy
nhiên, nghiên cứu về cơ chế cụ thể của các tinh dầu vẫn còn hạn chế và chưa được hiểu biết rõ.
Một số nghiên cứu khác cũng cho thấy, thành phần cấu tử đa dạng của tinh dầu cũng góp phần
làm tăng hiệu quả của tinh dầu trong ức chế nấm. Nghiên cứu cho thấy tinh dầu tỏi có chứa nhóm
sulfide như diallyl disulfide, allyl methyl trisulfide, trisulfide,… [10], [11]; Tinh dầu màng tang có
E-citral (geranial), Z-citral (neral), D-limonene, β-Thujene, β-pinene, α-pinene và linalool, v.v.
[12], [13]; Tinh dầu tiểu hồi hương có Trans-anethole, fenchone, methyl chavicol, và α-
phellandrene [14] có hiệu quả trong ức chế sự phát triển nấm.
Việc kết hợp hệ mang nano để đóng gói tinh dầu giúp làm tăng độ phân tán của tinh dầu trong
nước, bảo vệ tinh dầu, kéo dài thời gian bảo quản cũng như tăng cường khả năng thấm vào tế bào
thực vật, v.v. sẽ giúp sản phẩm tăng hiệu quả ức chế nấm và kéo dài thời gian hiệu quả. Từ đó, chế