Tiểu luận Phân tích hóa lý: Xác định protein bằng phương pháp Kjedahl

_________________________________________________________________________

BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM



BÁO CÁO TIỂU LUẬN

MÔN: PHÂN TÍCH HÓA LÝ THỰC PHẨM 1

XÁC ĐỊNH PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJEDAHL

GVHD: PHẠM THỊ CẨM HOA NHÓM THỰC HIỆN: 6

NĂM HỌC 2018-2019

_________________________________________________________________________

BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM



BÁO CÁO TIỂU LUẬN

MÔN: PHÂN TÍCH HÓA LÝ THỰC PHẨM 1

XÁC ĐỊNH PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJEDAHL

NHÓM THỰC HIỆN: 6

Nguyễn Hoàng Trâm Anh Ngô Thị Mỹ Ngọc

Nguyễn Vũ Thảo Vy Nguyễn Thị Nhật Quỳnh

Nguyễn Thị Trúc Mai Trần Thị Thúy Vy

Nguyễn Thị Thúy An Lê Thị Huệ

Đinh Nguyên Cẩm Hà Phạm Thị Tuyết Hoa

NĂM HỌC 2018-2019

_________________________________________________________________________

BẢNG ĐÁNH GIÁ

HỌ TÊN Nguyễn Hoàng Trâm Anh Nguyễn Vũ Thảo Vy Nguyễn Thị Trúc Mai Nguyễn Thị Thúy An Đinh Nguyên Cẩm Hà Nguyễn Thị Nhật Quỳnh Ngô Thị Mỹ Ngọc Trần Thị Thúy Vy Lê Thị Huệ Phạm Thị Tuyết Hoa MSSV 2022150156 2022150188 2022150074 2022150070 2022150153 2022150160 2022150103 2022150175 2022150092 2022150169 ĐÁNH GIÁ 13,25% 13,25% 13,25% 10% 10% 10% 10% 10% 5% 5% STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

DANH MỤC BẢNG

BẢNG 1. MỘT SỐ CHỈ THỊ MÀU THÔNG DỤNG ............................................................... 3 BẢNG 2. MỘT SỐ CHỈ THỊ HỖN HỢP THÔNG DỤNG ......................................................... 3 BẢNG 3. BẢNG CHUYỂN ĐỔI N THÀNH PROTEIN ........................................................... 6

DANH MỤC HÌNH

HÌNH 1. BỘ CHƯNG CẤT ĐẠM KJELDAL ....................................................................... 2 HÌNH 2. BỘ PHÁ MẪU 6 ỐNG ...................................................................................... 4

_________________________________________________________________________

MỤC LỤC

1 XÁC ĐỊNH PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL .................................. 1

1.1 Nguyên tắc ............................................................................................................. 1

1.2 Dụng cụ, hóa chất, thiết bị ..................................................................................... 1

1.3 Cách tiến hành:....................................................................................................... 4

1.4 Tính kết quả: .......................................................................................................... 5

2 ỨNG DỤNG: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITƠ TỔNG SỐ VÀ TÍNH HÀM LƯỢNG PROTEIN THÔ TRONG MALT (TCVN 10791:2015) ...................................... 7

2.1 Phạm vi áp dụng:.................................................................................................... 7

2.2 Cách tiến hành:....................................................................................................... 7

2.2.1 Phân hủy mẫu .................................................................................................. 7

2.2.2 Chưng cất ........................................................................................................ 7

2.2.3 Mẫu trắng ........................................................................................................ 8

2.3 Tính kết quả: .......................................................................................................... 8

2.3.1 Hàm lượng nitơ tổng số ................................................................................... 8

2.3.2 Hàm lượng protein tổng số .............................................................................. 8

3 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 9

PHỤ LỤC A ...................................................................................................................... 10

PHỤ LỤC B ....................................................................................................................... 14

_________________________________________________________________________

1 XÁC ĐỊNH PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL

𝐻2𝑆𝑂4 đậ𝑚 đặ𝑐,𝑡𝑜

1.1 Nguyên tắc Mẫu sau khi vô cơ hóa thu được nitơ ở dạng NH4+. Dùng kiềm mạnh đẩy ammonia ra khỏi muối trong bộ chưng cất đạm. Dùng hơi nước kéo ammonia đã được giải phóng ra sang bình hấp thu rồi định lượng bằng kỹ thuật chuẩn độ thế hoặc kỹ thuật chuẩn độ ngược với chỉ thị Tashiro

Xúc tác

𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 > (NH4)2SO4 + SO2 + CO2 +H2O

 Đẩy NH3 khỏi muối (NH4)2SO4 bằng một kiềm mạnh (NaOH):

(NH4)2SO4 + 2NaOH → 2NH3↑ + 2H2O +Na2SO4

 Định lượng NH3 bay ra bẳng acid HCl 0,1N (kỹ thuật chuẩn độ thế):

- → 2NH4

+ + B4O7

2- + 5H2O

2NH3↑ + 4H2BO3

2- + 2H+ +5H2O → 4H3BO3

B4O7

 Hoặc có thể sử dụng H2SO4 0,1N dư, chuẩn độ lượng H2SO4 dư bằng dung dịch

NaOH 0,1N (kỹ thuật chuẩn độ ngược):

2NH3↑ + H2SO4 → (NH4)2SO4

2NaOH + H2SO4 (dư) → Na2SO4 + 2H2O

Phạm vi áp dụng: Áp dụng cho tất cả các loại thực phẩm.

Tài liệu trích dẫn: TCVN 8099 – 2 : 2009

1.2 Dụng cụ, hóa chất, thiết bị

 Dụng cụ

Dụng cụ thủy tinh thông thường của phòng thí nghiệm

Bình Kjeldahl dung tích 500ml

Bộ chưng cất Kjeldahl

 Hóa chất

Dung dịch H2SO4 đậm đặc

Hỗn hợp xúc tác CuSO4 : K2SO4 = 1 : 10

Dung dịch H3BO3 4% pH = 5,5, điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 0,1N

1

Dung dịch HCl 0,1N

_________________________________________________________________________

Dung dịch NaOH 0,1N

Dung dịch H2SO4 0,1N

Dung dịch Tashiro hoặc alirazin natri sunfonate

Giấy quỳ tím

 Thiết bị

Hình 1. Bộ chưng cất đạm Kjeldal

E: Ống sinh hàn A: Bình cầu

F: Bình hấp thu B: Bình rửa

P1, P2: Khóa C: Bình cất

2

D: Phễu

_________________________________________________________________________

Bảng 1. Một số chỉ thị màu thông dụng

Chất chỉ thị pT Màu pHcm pKct

Môi trường acid, dạng phân tử Đỏ Môi trường bazơ, dạng ion Vàng 3,7 3,1 – 4,4 4

Đỏ Đỏ Vàng Không màu Vàng Xanh Đỏ Đỏ 5,1 8 9,2 4,4 – 6,2 5,0 – 8,0 6,8 – 8,4 8,0 – 10,0 5 7 7 9

Metyl da cam (MO) Metyl đỏ (MR) Quỳ Phenol đỏ Phenolphtalein (PP) Thymol phtalein Alizarin vàng 9,4 – 10,6 10,0 – 12,0 10 11 Không màu Vàng Xanh Tím nhạt 9,7 10,7

Bảng 2. Một số chỉ thị hỗn hợp thông dụng

Thành phần chỉ thị pT Màu pHcm

Môi trường bazơ, dạng ion

Môi trường acid, dạng phân tử Tím hồng 5,2 – 5,6 5,4 Lục

4,1 – 4,5 4,3 Vàng Lục chàm

4,9 – 5,3 5,1 Đỏ nho Lục

10,2 Vàng Tím 10,0 – 10,4

3

Chỉ thị Tasiro A Metyl đỏ 0,2% rượu B: Metyl xanh 0,2% rượu Tỷ lệ thể tích A:B = 1:1 A: Metyl cam 0,2% nước B: Bromcresol chàm 0,1% nước có 2,9ml NaOH 0,05N cho mỗi 0,1g Tỷ lệ thể tích A:B = 1:1 A Metyl đỏ 0,2% rượu B: Bromcresol chàm 0,1% rượu Tỷ lệ thể tích A:B = 1:3 A: Thymol phtalein 0,1% rượu B: Alizarin vàng 0,1% rượu Tỷ lệ thể tích A:B = 2:1

_________________________________________________________________________

1.3 Cách tiến hành:

 Vô cơ hóa mẫu bằng bộ phá mẫu nhiều ống: Cân chính xác khoảng 2- 4 g mẫu hoặc V(ml) dung dịch mẫu cho vào ống phá mẫu, lưu ý không để mẫu dính lên thành bình. Thêm 2 g hỗn hợp xúc tác CuSO4: K2SO4 = 1:10. Rót từ từ theo thành bình 10ml H2SO4 đậm đặc. Lắc nhẹ để acid trộn đều mẫu. Đặt ống vào các vị trí trong bộ phá mẫu. Mở máy và cài đặt các thông số thời gian và công suất làm việc của máy. Thực hiện vô cơ hóa đến khi thu được dung dịch trong suốt. Để nguội và cẩn thận định mức đến 100ml bằng nước cất.

Hình 2. Bộ phá mẫu 6 ống

 Tiến hành cất đạm bằng bộ cất đạm Kjeldahl: − Lắp bộ cất đạm, ở các khớp nối bôi một lớp mỏng vaseline. − Rửa bộ cất đạm bằng cách chưng cất đến khi dung dịch chảy ra ở đầu ống sinh hàn trung tính (không làm đổi màu giấy quỳ tím). Sau đó, giảm áp đột ngột ở bình cầu (tắt điện, thêm nước hoặc trùm khăn lạnh vào bình cầu để rút toàn bộ dung dịch từ bình cất về bình rửa và xả bỏ.

− Bình hấp thu chứa sẵn 20ml dung dịch H3BO3 bão hòa, thêm 3 giột Tashiro và

đầu ra của ống sinh hàn phải ngập trong dung dịch.

− Cho mẫu đã vô cơ hóa vào bình cất, tráng phễu bằng nước cất hai lần để tránh mất mẫu, thêm 3 giọt alizarin natri sunfonat, thêm từ từ dung dịch NaOH 30% cho đến khi dung dịch chuyển sang tím đậm, tiếp tục thêm khoảng 5ml dung dịch NaOH 30%. Tráng rửa phễu, khóa phễu, giữ 1 ít nước cất trên phễu.

4

− Chưng cất khoảng 15-30 phút, tiến hành thử NH3 hết chưa bằng cách dùng giấy quỳ tím hứng vài giọt dung dịch chảy ra ở ống sinh hàn (tráng rửa đầu ống sinh hàn trước khi kiểm tra), nếu quỳ tím không đổi màu thì kết thúc quá trình

_________________________________________________________________________

chưng cất. Nếu quỳ tím chuyển sang màu xanh thì tiếp tục chưng cất cho đến khi quỳ tím không đổi màu.

− Rửa bộ cất đạm sau khi kết thúc quá trình chưng cất.

Lưu ý: Ngoài việc cất đạm bằng bộ cất đạm Kjeldahl, ta có thể thực hiện bằng máy cất đạm tự động.

 Chuẩn độ:

- Chuẩn độ thế: Lấy bình hấp thu ra, chuẩn độ bằng dung dịch HCl 0,1N với chỉ thị Tashiro, dung dịch chuyển từ màu xanh sang màu tím. Ghi thể tích dung dịch chuẩn HCl 0,1N tiêu tốn

- Nếu chuẩn độ ngược, thay bằng 20,00ml dung dịch chuẩn H2SO4 0,1N.

Chuẩn độ bằng dung dịch chuẩn NaOH 0,1N. Dung dịch chuyển từ màu tím sang màu xanh. Ghi thể tích dung dịch chuẩn NaOH 0,1N tiêu tốn.

- Tiến hành tương tự với mẫu trắng (thay dung dịch chuẩn NaOH 0,1N bằng

nước cất 2 lần).

1.4 Tính kết quả: Hàm lượng N toàn phần được tính theo công thức:

 Đối với mẫu rắn:

⁄ 𝑁 𝑡𝑜à𝑛 𝑝ℎầ𝑛 (𝑔 100𝑔 ) = 𝑁 × 𝑉 × 10−3 × 14 × 100 𝑚

 Đối với mẫu lỏng:

𝑁 𝑡𝑜à𝑛 𝑝ℎầ𝑛 (𝑔 𝑙⁄ ) = 𝑁 × 𝑉 × 10−3 × 14 × 1000 𝑉𝑚

Trong đó:

 V: thể tích dung dịch HCl 0.1N (ml)  N: nồng độ đương lượng dung dịch HCl  Vm: thể tích mẫu thử (ml)  m: khối lượng mẫu thử (g)

Hoặc hàm lượng N tổng số theo kỹ thuật chuẩn độ ngược được tính theo công thức:

 Đối với mẫu rắn:

5

⁄ 𝑁 𝑡𝑜à𝑛 𝑝ℎầ𝑛 (𝑔 100𝑔) = 𝑁 × (𝑉2 − 𝑉1) × 10−3 × 14 × 𝐹 × 100 𝑚

_________________________________________________________________________

 Đối với mẫu lỏng:

𝑁 𝑡𝑜à𝑛 𝑝ℎầ𝑛 (𝑔 𝑙)⁄ = 𝑁 × (𝑉2 − 𝑉1) × 10−3 × 14 × 𝐹 × 1000 𝑉𝑚

Trong đó:

 V1: thể tích dung dịch NaOH 0.1N  V2: thể tích dung dịch NaOHBlank 0.1N  N: đương lượng dung dịch H2SO4 0.1N  Vm: thể tích mẫu thử (ml)  m: khối lượng mẫu thử (g)  F: hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch NaOH 0.1N

Hàm lượng protein tổng được xác định bằng cách lấy kết quả N toàn phần nhân với hệ số 6.25 (hay các hệ số tương ứng trong từng trường hợp cụ thể).

Bảng 3. Bảng chuyển đổi N thành protein

Tên sản phẩm Tên sản phẩm

Chuyển đổi N thành protein 5,53 5,3 Chuyển đổi N thành protein 5,71 5,71 Kiều mạch Cùi dừa

6,25 5,3 Bột ngô

5,3 5,3 Bột hạt bông

5,5 5,83 5,45 5,83 Yến mạch Bột yến mạch

5,46 5,53 5,95 5,95 5,95 5,3 6,25 6,25

Bột đậu tương Đậu tương, hạt, bột hoặc sản phẩm của chúng Bột hoa hướng dương (khô) Bột hoa hướng dương Mầm lúa mì Bột lúa mì thô hoặc bột mịn Gạo xát, gạo trắng Hạt vùng thô Thức ăn gia súc Thực phẩm nguồn gốc động vật Sữa 5,95 6,38 Bột lạc Bột hạt dầu cải Gạo (lức, hạt dài) Gạo nghiền, gạo xát dối, gạo đổ Gạo lật hoặc gạo lức (chỉ bỏ trấu)

Lưu ý:

6

Trong quá trình chưng cất đạm, dung dịch trong bình cất bị hút về phía bình thải nếu nguồn cung cấp nhiệt cho hệ thống cất đạm không ổn định.

_________________________________________________________________________

Có thể thay thế chỉ thị Tashiro bằng chỉ thị metyl red 1% pha trong cồn. Trong quá trình chưng cất đạm, nếu màu của dung dịch ở bình hứng chuyển sang màu xanh lục đối với chỉ thị Tashiro hoặc màu vàng đối với chị thị metyl red thì có nghĩa lượng sulfuric acid bị thiếu, cần thêm một lượng sulfuric acid vào bình hứng.

2 ỨNG DỤNG: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITƠ TỔNG SỐ VÀ TÍNH HÀM

LƯỢNG PROTEIN THÔ TRONG MALT (TCVN 10791:2015)

2.1 Phạm vi áp dụng:

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp Kjeldahl để xác định hàm lượng nitơ tổng số và tính hàm lượng protein thô của malt.

- Cân khoảng 20 g mẫu thử, chính xác đến 0,01 g, nghiền mịn bằng máy

2.2 Cách tiến hành:

nghiền. Chuyển mẫu đã nghiền vào lọ, đậy nắp và trộn kĩ.

2.2.1 Phân hủy mẫu

- Cân từ 1,0 đến 1,5 g phần mẫu thử đã chuẩn bị, chính xác đến 1 mg, chuyển định lượng vào bình Kjeldahl khô. Thêm khoảng 10 g hỗn hợp xúc tác (kali sulfat dạng bột, titan dioxit và đồng sulfat ngậm năm phân tử nước theo tỉ lệ tương ứng 1000 : 30 : 30 (phần khối lượng)) trộn đều.

- Thêm 20 ml axit sulfuric 98 %, xoay nhẹ bình để trộn và làm ẩm lượng chứa trong bình. Tiến hành phân hủy mẫu ở nhiệt độ thấp cho đến khi ngừng tạo bọt. Đun sôi hỗn hợp đến khi xuất hiện màu nâu, đun tiếp trong 30 phút. Không để nguồn nhiệt tiếp xúc trực tiếp với bình ở phía trên mức chất lỏng và phải quan sát thấy hơi nước hồi lưu tại vùng thấp của cổ bình Kjeldahl.

- Để nguội dịch phân hủy. Nếu lượng chứa trong bình bị hóa rắn chứng tỏ lượng axit dư đã bị thất thoát trong quá trình phân hủy và amoni sulfat có thể đã hóa hơi.

2.2.2 Chưng cất

- Cẩn thận pha loãng dịch phân hủy với 250 ml nước cất, thêm vật liệu chống sôi trào ( cacborundum dạng bột thô, kẽm dạng viên hoặc bi thủy tinh) và thêm từ từ khoảng 70 ml dung dịch NaOH để tạo thành hai lớp rõ rệt. Lắp bình với ống bảo vệ và nối với bộ sinh hàn, chú ý không làm xáo trộn các lớp chất lỏng. Đầu ra của bộ sinh hàn phải nhúng ngập trong dung dịch axit boric.

7

- Xoay mạnh bình để trộn nhanh lượng chứa trong bình và gia nhiệt đủ. Bật sẵn thiết bị gia nhiệt trước khi nối bình, để giảm thiểu nguy hiểm do chất lỏng chảy ngược trở lại qua sinh hàn. Ngay sau khi trộn, cần tháo bình chứa

_________________________________________________________________________

axit boric để làm khô đầu ra của bình sinh hàn và để cân bằng áp suất trong bình chưng cất.

- Chưng cất amoniac vào lượng dư axit boric nồng độ 20 g/lit (khoảng 25 ml), có chứa 0,5 ml chất chỉ thị (bromocresol xanh). Lấy khoảng 180 ml dịch chưng cất và chuẩn độ amoniac bằng dung dịch axit chuẩn độ (HCl 0,1M). Điểm kết thúc chuẩn độ đạt được khi dung dịch chuyển sang màu xám.

2.2.3 Mẫu trắng

- Thực hiện mẫu trắng thuốc thử, dùng 1,000 g sacarose (tinh khiết) thay cho phần mẫu thử.

2.3 Tính kết quả: 2.3.1 Hàm lượng nitơ tổng số Hàm lượng nitơ tổng số của mẫu thử, XN1, biểu thị theo phần trăm khối lượng, được tính theo Công thức (1):

(1)

Hàm lượng nitơ tổng số của mẫu thử, XN2, biểu thị theo phần trăm khối lượng chất khô, được tính theo Công thức (2):

(2)

Trong đó:

V

là thể tích dung dịch axit chuẩn độ cần để trung hòa amoniac sau khi trừ giá trị tương ứng của mẫu trắng, tính bằng mililit (ml);

0,0014

là số gam nitơ tương ứng với 1 ml dung dịch axit chuẩn độ (axit clohydric 0,1 M hoặc axit sulfuric 0,05 M);

là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g); M

W

là độ ẩm của phần mẫu thử, tính bằng phần trăm khối lượng, xác định được theo TCVN 10788:2015 (phụ lục A)

2.3.2 Hàm lượng protein tổng số Hàm lượng protein tổng số của mẫu thử, XP1, biểu thị theo phần trăm khối lượng, được tính theo Công thức:

XP1 = XN1 x 6,25

8

Hàm lượng protein tổng số của mẫu thử, XP2, biểu thị theo phần trăm khối lượng chất khô, được tính theo Công thức

_________________________________________________________________________

XP2 = XN2 x 6,25.

Trong đó:

là hàm lượng nitơ tổng số của mẫu thử, tính bằng phần trăm khối lượng XN1

XN2

là hàm lượng nitơ tổng số của mẫu thử, tính bằng phần trăm khối lượng chất khô

6,25 là hệ số chuyển đổi từ hàm lượng nitơ tổng số sang hàm lượng protein.

3 TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1]. Lê Thị Hồng Ánh (chủ biên), Giáo trình Phân tích hóa lý Thực phẩm 1, NXB ĐH Quốc gia TP.HCM.

9

[2]. TCVN 10791:2015: Malt - xác định hàm lượng nitơ tổng số và tính hàm lượng protein thô - phương pháp kjeldahl

_________________________________________________________________________

PHỤ LỤC A

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 10788:2015

MALT – XÁC ĐỊNH ĐỘ ẨM – PHƯƠNG PHÁP KHỐI LƯỢNG

Malt – Determination of moisture content – Gravimetric method

Lời nói đầu

TCVN 10788:2015 được xây dựng trên cơ sở tham khảo tiêu chuẩn của Hiệp hội Đồ uống châu Âu EBC Method 4.2 (2000)Moisture content of malt;

TCVN 10788:2015 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F9 Đồ uống biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

MALT – XÁC ĐỊNH ĐỘ ẨM – PHƯƠNG PHÁP KHỐI LƯỢNG

Malt – Determination of moisture content – Gravimetric method

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp khối lượng để xác định độ ẩm của các loại malt.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 10787:2015, Malt – Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử.

3. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau đây:

3.1. Độ ẩm (moisture content)

10

Hao hụt khối lượng của sản phẩm, tính bằng phần trăm, trong các điều kiện quy định trong tiêu chuẩn này.

_________________________________________________________________________

4. Nguyên tắc

Nghiền mẫu để thu được dạng bột mịn. Sấy phần mẫu thử ở nhiệt độ từ 105 oC đến 106 oC trong thời gian 3 h ± 5 min (đảm bảo thu được khối lượng không đổi).

5. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và như sau:

5.1. Máy nghiền đĩa, có khoảng cách giữa hai đĩa nghiền là 0,2 mm (ví dụ: máy nghiền đĩa Bühler Universal Laboratory Disc Mill, kiểu DLFU của hãng Bühler GmbH, Đức).

5.2. Tủ sấy, có thể duy trì nhiệt độ từ 105 oC đến 107 oC, chính xác đến 0,5 oC.

Chuẩn hóa bằng cách sấy đồng thời hai mẫu ở nhiệt độ từ 105 oC đến 106 oC trong thời gian 3 h ± 5 min, sau đó để nguội trong bình hút ẩm (5.4) ít nhất 20 min ở nhiệt độ phòng, cân và sấy thêm 1 h ở nhiệt độ nêu trên. Nếu độ ẩm hao hụt lớn hơn 0,10 g/100 g mẫu thì tăng nhiệt độ lên 1 oC và thực hiện lại với hai mẫu mới. Thực hiện chuẩn hóa ở nhiệt độ không lớn hơn 107 oC sao cho chênh lệch độ ẩm sau 3 h sấy và độ ẩm thu được ở cùng nhiệt độ sau 4 h sấy ở trong khoảng 0,10 g/100 g. Duy trì thông khí và đóng cửa tủ trong suốt thời gian sấy.

5.3. Chén cân, bằng kim loại (ví dụ bằng nhôm), đường kính khoảng 50 mm và chiều cao không lớn hơn 20 mm, có nắp đậy kín.

5.4. Bình hút ẩm, chứa chất hút ẩm hiệu quả, ví dụ silica gel.

5.5. Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,5 mg.

6. Lấy mẫu

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc không bị thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 10787:2015.

7. Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 10787:2015.

8. Cách tiến hành

11

Cân khoảng 20 g mẫu thử đã chuẩn bị, chính xác đến 0,5 mg. Sử dụng máy nghiền đĩa (5.1) để nghiền phần mẫu thử. Trộn kỹ và đưa ngay khoảng 5 g phần mẫu thử đã nghiền

_________________________________________________________________________

vào chén cân (5.3) khô, sạch đã biết trước khối lượng (cân trừ bì), chính xác đến 1 mg. Đậy nắp chén và cân ngay, chính xác đến 1 mg.

Mở nắp chén cân, đưa chén cùng với nắp vào tủ sấy (5.2) đã gia nhiệt trước đến nhiệt độ chuẩn hóa, sấy trong 3 h ± 5 min. Đậy nắp và lấy chén cân ra khỏi tủ sấy. Để nguội trong bình hút ẩm (5.4) ít nhất 20 min ở nhiệt độ phòng.

Cân lại chén cân cùng với lượng chứa trong chén, chính xác đến 1 mg.

9. Tính và biểu thị kết quả

Độ ẩm của mẫu thử, X, biểu thị theo phần trăm khối lượng, được tính theo Công thức sau:

Trong đó:

w1 là khối lượng của phần mẫu thử trước khi sấy, tính bằng gam (g);

w2 là khối lượng của phần mẫu thử sau khi sấy, tính bằng gam (g).

Biểu thị kết quả đến một chữ số thập phân.

10. Độ chụm

Các giá trị độ chụm dưới đây được xác định từ dữ liệu thử nghiệm liên phòng do Ủy ban phân tích của EBC thực hiện năm 1992. Các phòng thử nghiệm tham gia đã phân tích các mẫu malt với sáu mức độ ẩm từ 3,8 % đến 7,3 % (khối lượng), trong đó sử dụng đồng sulfat để chuẩn hóa tủ sấy. Các giá trị độ chụm này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và chất nền khác với dải nồng độ và chất nền đã nêu.

10.1. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm độc lập, đơn lẻ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong cùng một phòng thử nghiệm, do cùng một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong cùng một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn 0,13 % (0,13 g độ ẩm trên 100 g mẫu).

10.2. Độ tái lập

12

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong các phòng thử nghiệm khác

_________________________________________________________________________

nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng thiết bị khác nhau, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn 0,6 % (0,6 g độ ẩm trên 100 g mẫu).

11. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tuỳ chọn, cùng với mọi tình huống bất thường khác có thể ảnh hưởng đến kết quả;

13

e) kết quả thử nghiệm thu được, hoặc nếu thỏa mãn yêu cầu về độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

_________________________________________________________________________

PHỤ LỤC B

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 10791:2015

MALT - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITƠ TỔNG SỐ VÀ TÍNH HÀM LƯỢNG PROTEIN THÔ - PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL

Malt - Determination of the nitrogen content and calculation of the crude protein content - Kjeldahl method

Lời nói đầu

TCVN 10791:2015 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 950.09 Protein in laboratory malt. Kjeldahl method và tiêu chuẩn của Hiệp hội Đồ uống châu Âu EBC Method 4.3.1 (2004) Total nitrogen of malt. Kjeldahl method;

TCVN 10791:2015 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F9 Đồ uống biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

MALT - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITƠ TỔNG SỐ VÀ TÍNH HÀM LƯỢNG PROTEIN THÔ - PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL

Malt - Determination of the nitrogen content and calculation of the crude protein content - Kjeldahl method

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp Kjeldahl để xác định hàm lượng nitơ tổng số và tính hàm lượng protein thô của malt.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử

TCVN 10787:2015, Malt - Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử

14

TCVN 10788:2015, Malt - Xác định độ ẩm - Phương pháp khối lượng

_________________________________________________________________________

3. Nguyên tắc

Phân hủy các hợp chất nitơ có trong mẫu thử bằng axit sulfuric đặc nóng, có mặt chất xúc tác, để thu được amoni sulfat. Sản phẩm phân hủy được kiềm hóa bằng dung dịch natri hydroxit và giải phóng amoniac bằng cách chưng cất vào lượng dư dung dịch axit boric. Chuẩn độ amoniac bằng dung dịch chuẩn axit.

4. Thuốc thử và vật liệu thử

Sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích và nước đạt loại 3 theo TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), trừ khi có quy định khác.

4.1. Axit sulfuric, 98 % (khối lượng/thể tích).

4.2. Dung dịch natri hydroxit

Hòa tan 450 g natri hydroxit dạng viên hoặc dạng vẩy, trong 1 lít nước.

Dung dịch phải có tỉ trọng tương đối bằng hoặc lớn hơn 1,35.

4.3. Hỗn hợp chất xúc tác, gồm kali sulfat dạng bột, titan dioxit và đồng sulfat ngậm năm phân tử nước theo tỉ lệ tương ứng 1000 : 30 : 30 (phần khối lượng).

Có thể sử dụng viên xúc tác bán sẵn có thành phần tương tự.

4.4. Vật liệu chống sôi trào, cacborundum dạng bột thô, kẽm dạng viên hoặc bi thủy tinh.

4.5. Dung dịch axit boric, 20 g/lít.

4.6. Dung dịch axit chuẩn độ, axit clohydric 0,1 M hoặc axit sulfuric 0,05 M.

4.7. Chất chỉ thị bromocresol xanh

Trộn dung dịch bromocresol xanh (3,3’-5,5’-tetrabromomcresol sulfonic phthalein) nồng độ 1 g/lít trong etanol 95 % (thể tích) với dung dịch metyl đỏ (axit p- dimethylaminoazobenzeneo- cacboxylic) nồng độ 1 g/lít trong etanol 95 % (thể tích), với tỉ lệ thể tích 10 : 4.

Chất chỉ thị này có màu hồng trong môi trường axit, màu xám tại điểm kết thúc chuẩn độ và màu xanh lam trong môi trường kiềm.

4.8. Acetanilide, đã được sấy trước trong áp suất giảm ở 80 oC.

15

4.9. Sacarose, tinh khiết.

_________________________________________________________________________

5. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và như sau:

5.1. Bộ phân hủy mẫu Kjeldahl.

5.2. Bình Kjeldahl, dung tích 500 ml.

5.3. Bộ chưng cất.

5.4. Bình nón (bình hứng), dung tích 250 ml.

5.5. Ống đong, dung tích 25 ml, 100 ml và 250 ml.

5.6. Pipet, chia vạch đến 1 ml

5.7. Buret, loại 25 ml hoặc 50 ml.

5.8. Máy nghiền đĩa, có khoảng cách giữa hai đĩa nghiền là 0,2 mm, có thể nghiền mịn vật liệu nhưng không sinh nhiệt (ví dụ: máy nghiền đĩa Bühler Universal Laboratory Disc Mill, kiểu DLFU của hãng Bühler GmbH, Đức).

5.9. Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.

6. Lấy mẫu

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc không bị thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 10787:2015.

7. Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử (nghiền) theo TCVN 10787:2015.

Cân khoảng 20 g mẫu thử, chính xác đến 0,01 g, nghiền mịn bằng máy nghiền (5.8). Chuyển mẫu đã nghiền vào lọ, đậy nắp và trộn kĩ.

8. Cách tiến hành

8.1. Phân hủy mẫu

16

Cân từ 1,0 đến 1,5 g phần mẫu thử đã chuẩn bị, chính xác đến 1 mg, chuyển định lượng vào bình Kjeldahl khô (5.2). Thêm khoảng 10 g hỗn hợp xúc tác dạng bột hoặc dạng viên (4.3), trộn đều.

_________________________________________________________________________

Thêm 20 ml axit sulfuric 98 % (4.1), xoay nhẹ bình để trộn và làm ẩm lượng chứa trong bình. Tiến hành phân hủy mẫu ở nhiệt độ thấp cho đến khi ngừng tạo bọt. Đun sôi hỗn hợp đến khi xuất hiện màu nâu, đun tiếp trong 30 min. Không để nguồn nhiệt tiếp xúc trực tiếp với bình ở phía trên mức chất lỏng và phải quan sát thấy hơi nước hồi lưu tại vùng thấp của cổ bình Kjeldahl.

Để nguội dịch phân hủy. Nếu lượng chứa trong bình bị hóa rắn chứng tỏ lượng axit dư đã bị thất thoát trong quá trình phân hủy và amoni sulfat có thể đã hóa hơi.

8.2. Chưng cất

Cẩn thận pha loãng dịch phân hủy với 250 ml nước cất, thêm vật liệu chống sôi trào (4.4) và thêm từ từ khoảng 70 ml dung dịch natri hydroxit (4.2) để tạo thành hai lớp rõ rệt. Lắp bình với ống bảo vệ và nối với bộ sinh hàn, chú ý không làm xáo trộn các lớp chất lỏng. Đầu ra của bộ sinh hàn phải nhúng ngập trong dung dịch axit boric.

Xoay mạnh bình để trộn nhanh lượng chứa trong bình và gia nhiệt đủ. Bật sẵn thiết bị gia nhiệt trước khi nối bình, để giảm thiểu nguy hiểm do chất lỏng chảy ngược trở lại qua sinh hàn. Ngay sau khi trộn, cần tháo bình chứa axit boric để làm khô đầu ra của bình sinh hàn và để cân bằng áp suất trong bình chưng cất.

Chưng cất amoniac vào lượng dư axit boric nồng độ 20 g/lit (khoảng 25 ml), có chứa 0,5 ml chất chỉ thị (4.7). Lấy khoảng 180 ml dịch chưng cất và chuẩn độ amoniac bằng dung dịch axit chuẩn độ (4.6). Điểm kết thúc chuẩn độ đạt được khi dung dịch chuyển sang màu xám.

8.3. Mẫu trắng

Thực hiện mẫu trắng thuốc thử, dùng 1,000 g sacarose (4.9) thay cho phần mẫu thử.

9. Tính và biểu thị kết quả

9.1. Hàm lượng nitơ tổng số

Hàm lượng nitơ tổng số của mẫu thử, XN1, biểu thị theo phần trăm khối lượng, được tính theo Công thức (1):

(1)

Hàm lượng nitơ tổng số của mẫu thử, XN2, biểu thị theo phần trăm khối lượng chất khô, được tính theo Công thức (2):

17

(2)

_________________________________________________________________________

Trong đó:

V là thể tích dung dịch axit chuẩn độ cần để trung hòa amoniac sau khi trừ giá trị tương ứng của mẫu trắng, tính bằng mililit (ml);

0,0014 là số gam nitơ tương ứng với 1 ml dung dịch axit chuẩn độ (axit clohydric 0,1 M hoặc axit sulfuric 0,05 M);

m là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g);

w

là độ ẩm của phần mẫu thử, tính bằng phần trăm khối lượng, xác định được theo TCVN 10788:2015.

Biểu thị kết quả đến hai chữ số thập phân.

9.2. Hàm lượng protein tổng số

Hàm lượng protein tổng số của mẫu thử, XP1, biểu thị theo phần trăm khối lượng, được tính theo Công thức (3):

XP1 = XN1 x 6,25 (3)

Hàm lượng protein tổng số của mẫu thử, XP2, biểu thị theo phần trăm khối lượng chất khô, được tính theo Công thức (4):

XP2 = XN2 x 6,25 (4)

Trong đó:

XN1 là hàm lượng nitơ tổng số của mẫu thử, tính bằng phần trăm khối lượng, theo Công thức (1);

XN2 là hàm lượng nitơ tổng số của mẫu thử, tính bằng phần trăm khối lượng chất khô, theo Công thức (2);

6,25 là hệ số chuyển đổi từ hàm lượng nitơ tổng số sang hàm lượng protein.

10. Độ chụm

18

Các giá trị độ chụm dưới đây được xác định từ dữ liệu thử nghiệm liên phòng do Ủy ban phân tích của EBC thực hiện năm 1990. Các phòng thử nghiệm tham gia đã phân tích các mẫu malt với sáu mức hàm lượng nitơ tổng số từ 1,56 % đến 1,87 % (khối

_________________________________________________________________________

lượng). Các giá trị độ chụm này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và chất nền khác với dải nồng độ và chất nền đã nêu.

10.1. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm độc lập, đơn lẻ về hàm lượng nitơ tổng số, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong cùng một phòng thử nghiệm, do cùng một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong cùng một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn 0,05 % (khối lượng).

10.2. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ về hàm lượng nitơ tổng số, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng thiết bị khác nhau, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn 0,13 % (khối lượng).

11. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường khác có thể ảnh hưởng đến kết quả;

19

e) kết quả thử nghiệm thu được, hoặc nếu thỏa mãn yêu cầu về độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.