1
M ðU
TÍNH CP THIT CA ð TÀI
Bnh cúm gia cm là mt bnh truyn nhim cp tính có tc ñ lây
lan nhanh, v!i t" l ch#t cao trong ñàn gia cm nhim bnh do các phân
týp (subtype) c,a nhóm virus cúm A (Influenza virus A) thuc h1
Orthomyxoviridae gây ra. Bnh gây thit h5i kinh t# rt l!n cho ngành
chăn nuôi c,a nhiu nư!c trên th# gi!i, và có kh; năng lây nhim t< ñng
v=t sang ngư>i.
Bnh cúm gia cm do phân týp H5N1 xut hin ln ñu tiên t5i Vit
Nam năm 2003. Trong mt th>i gian rt ngGn, bnh ñã lây lan trên toàn
b ñt nư!c, hàng triu gia cm bI ch#t và tiêu h,y, gây thit h5i rt l!n
cho nn kinh t# quc dân; và t< ñó ñ#n nay bnh x;y ra liên tLc trM thành
mt vn ñ dIch t phNc t5p cn gi;i quy#t t5i nư!c ta.
Virus cúm A/H5N1 có h gen luôn bi#n ñPi, tái tP hQp bi#n ch,ng và
thay ñPi cu trúc kháng nguyên ñR thích Nng gây bnh. Trình tT nucleotide h
gen là cơ sM ñR xác l=p mi quan h nguVn gc ti#n hóa c,a các bi#n ch,ng
virus cúm A/H5N1. K#t qu; gi;i mã h gen là nguVn dX liu cung cp thông
tin v nguVn gc xut xN, sT ti#n hóa c,a virus, giúp phát hin nhXng bi#n
ch,ng m!i trong qun thR virus cúm gia cm.
Thông qua vic gi;i mã hgen, so sánh, phân tích trình tT nucleotide
và amino acid có thR xác ñInh nhXng vùng gen thư>ng bi#n ñPi, vùng gen
Pn ñInh làm cơ sM dX liu gen h1c và protein h1c c,a các ch,ng H5N1
xut hin t< nhXng năm ñu tiên t5i nư!c ta làm cơ sM lTa ch1n lo5i
vaccine thích hQp trong công tác phòng chng dIch cúm gia cm.
ðR có thêm nguVn gen c,a virus cúm A/H5N1 lưu hành t5i Vit Nam, t<
ñó làm cơ sM dX liu cho nhXng nghiên cNu v gen/h gen c,a virus cúm
A/H5N1 và nghiên cNu s;n xut các ch# ph\m sinh h1c th# h m!i Nng dLng
trong ch\n ñoán và phòng bnh, chúng tôi ti#n hành ñ tài: Nghiên cu h
gen ca virus cúm A/H5N1 phân lp t gà nuôi t!i Hu Giang.
MC TIÊU CA ð TÀI
(1) Gi;i mã ñưQc toàn b h gen gVm 8 phân ño5n c,a mt ch,ng
virus cúm A/H5N1 t< gà nuôi t5i H=u Giang.
(2) Phân tích ñưQc mt s ñac ñiRm sinh h1c phân tb c,a h gen
nhcm thu ñưQc thêm dX liu làm cơ sM cho nghiên cNu vaccine
phòng bnh hiu qu;.
2
Ý NGHĨA KHOA HC CA ð TÀI
d ðây là lu=n án nghiên cNu khá ñy ñ,, có h thng v sinh h1c phân
tb h gen virus cúm A/H5N1 M gà nuôi t5i H=u Giang.
d Lu=n án là tài liu tham kh;o tt phLc vL cho gi;ng d5y và nghiên
cNu khoa h1c v virus cúm A/H5N1.
Ý NGHĨA THC TIN CA ð TÀI
d K#t qu; nghiên cNu c,a ñ tài giúp hiRu bi#t thêm v tính ña d5ng
c,a virus cúm. Trên cơ sM ñó góp phn xây dTng phương pháp ch\n ñoán
và lTa ch1n vaccine phòng bnh phù hQp.
d K#t qu; nghiên cNu c,a ñ tài góp phn làm sáng tf thêm mi quan
h nguVn gc ph; h c,a virus cúm A/H5N1 phân l=p trong nhXng năm
ñu tiên dIch xut hin M vùng ñVng bcng sông Cbu Long.
NHNG ðÓNG GÓP M I CA ð TÀI
(1) Gi;i trình tT và nghiên cNu hoàn chhnh, có h thng h gen c,a
mt ch,ng virus cúm A/H5N1 thuc thR ñc lTc cao (HPAI) phân l=p t<
gà t5i H=u Giang năm 2005 (ký hiu ch,ng là CkHG4) trong ñQt dIch
cúm gia cm ln ñu tiên xut hin V 5t M Vit Nam.
(2) ðã phân tích ñac ñiRm gen h1c h gen/gen c,a ch,ng CkHG4, bao
gVm trình tT nucleotide/amino acid, cu trúc, ñVng nht/tương ñVng; so
sánh v!i các ch,ng trong vùng và th# gi!i.
(3) ðã làm sáng tf mi quan h ph; h, nguVn gc và tương quan
gen/h gen c,a virus cúm A/H5N1 cư>ng ñc dòng Qu;ng ðông (ch,ng
CkHG4), góp phn hiRu bi#t thêm v virus cúm A/H5N1 gây bnh và
ñóng góp dX liu cho ñi chi#u v!i các vaccine sb dLng t5i Vit Nam.
(4) ðã kh;o sát và xác ñInh ñưQc các cap mVi sb dLng có hiu qu; ñR
thu nh=n và gi;i trình tT h gen c,a virus cúm A/H5N1 thuc nhXng phân
dòng ln ñu tiên xut hin và hin còn lưu hành t5i Vit Nam.
B" CC CA LU$N ÁN:
lu=n án gVm 159 trang (không kR phn phL
lLc), chia thành các phn như sau: MM ñu (3 trang), Chương 1: TPng
quan tài liu (52 trang), Chương 2: Ni dung, nguyên liu và phương
pháp nghiên cNu (14 trang), Chương 3: K#t qu; nghiên cNu và th;o lu=n
(66 trang), K#t lu=n và ki#n nghI (2 trang), Các công trình ñã công b liên
quan ñ#n lu=n án (1 trang), Tài liu tham kh;o (21 trang). Lu=n án có 31
b;ng biRu, 28 hình minh h1a. TPng s tài liu tham kh;o là 170, gVm 32
tài liu ti#ng Vit, 138 tài liu ti#ng Anh (có 3 trang web).
3
CHƯƠNG 1
T*NG QUAN TÀI LI,U
1.1 ð.I CƯƠNG V B,NH CÚM GIA CM
Cúm gia cm (avian influenza) là bnh truyn nhim cp tính, do
nhóm virus cúm A, thuc h1 Orthomyxoviridae gây ra. ðây là nhóm virus
có biên ñ ch, rng, ñưQc phân chia thành nhiu phân týp khác nhau dTa
trên kháng nguyên HA và NA có trên b mat capsid c,a h5t virus. Nhóm
virus cúm A có 16 phân týp HA (t< H1 ñ#n H16) và 9 phân type NA (t<
N1 ñ#n N9).
DIch cúm gia cm do virus cúm A phân týp H5N1 thR ñc lTc cao
xut hin M vùng Qu;ng ðông, Trung Quc năm 1996 và ñã lan ra hơn 60
nư!c trên th# gi!i M châu Á, châu Âu và châu Phi, ñưQc chNng minh là có
kh; năng lây nhim t< ñng v=t sang ngư>i. Bnh cúm gia cm A/H5N1
ln ñu tiên xut hin t5i Vit Nam vào cui năm 2003, t< ñó ñ#n nay
bnh x;y ra liên tLc, ñang là vn ñ dIch t phNc t5p do xut hin nhiu
phân dòng virus m!i và là dIch bnh cn ph;i gi;i quy#t t5i nư!c ta.
1.2. H, GEN CA VIRUS CÚM A
H gen virus cúm A là RNA sQi ñơn âm, bao gVm 8 phân ño5n gen riêng
bit mang tên t< 1d8, mã hoá cho 11 protein khác nhau c,a virus gVm: PB2,
PB1, PB1dF2, PA, HA, NP, NA, M (M1 và M2), NS (NS1 và NS2).
Các phân ño5n 1, 2 và 3 là nhXng phân ño5n mã hoá tPng hQp các
enzym trong phNc hQp polymerase (RNA transcriptase) c,a virus, có ñ
dài Pn ñInh và có tính b;o tVn cao bao gVm:
d Phân ñon 1 (gen PB2) mã hoá tPng hQp protein enzym PB2, có
kích thư!c 2341 bp.
d Phân ñon 2 (gen PB1) cũng có kích thư!c 2341 bp, mã hoá tPng
hQp enzym PB1.
d Phân ñon 3 (gen PA) là phân ño5n gen b;o tVn cao, mã hoá tPng
hQp protein enzym PA, có kích thư!c 2233 bp.
Các phân ño5n 4 và 6 mã hoá cho các protein (HA và NA) b mat
capsid c,a virus, có tính kháng nguyên ñac trưng theo t<ng ch,ng virus
cúm A, bao gVm:
d Phân ñon 4 (gen HA) có ñ dài thay ñPi tùy theo t<ng ch,ng virus
cúm A (M A/H1N1 là 1778 bp, M H9N1 là 1714 bp, M H5N1 là kho;ng
1704 d 1707 bp). ðây là gen chIu trách nhim mã hoá tPng hQp protein
HA d kháng nguyên b mat c,a virus cúm.
d Phân ñon 6 (gen NA) là gen mã hóa tPng hQp protein NA, kháng
nguyên b mat capsid c,a virus, có chiu dài thay ñPi theo t<ng ch,ng
4
virus cúm A (M A/H1N1 là 1413 bp, M A/H5N1 thay ñPi kho;ng t< 1350 d
1410 bp).
Các phân ño5n gen M, NP và NS mã hóa tPng hQp các protein chNc
năng khác nhau c,a virus, có ñ dài tương ñi Pn ñInh giXa các ch,ng
virus cúm A, bao gVm:
d Phân ñon 5 (gen NP) mã hóa tPng hQp nucleoprotein (NP), kích
thư!c kho;ng 1565 bp.
d Phân ñon 7 (gen M) có kích thư!c kho;ng 1027 bp, mã hoá cho
protein ñm (matrix protein) gVm hai tiRu phn là M1 và M2 ñưQc t5o ra
bMi nhXng khung ñ1c mM khác nhau c,a cùng mt phân ño5n RNA.
d Phân ñon 8 (gen NS) là gen mã hoá protein không cu trúc, có ñ
dài Pn ñInh nht trong h gen c,a virus cúm A, kích thư!c kho;ng 890 bp,
mã hoá tPng hQp hai protein là NS1 và NS2.
Như v=y, virus cúm A (cL thR: cúm A/H5N1) có h gen ñưQc cu trúc
t< 8 phân ño5n riêng bit và không có gen mã hóa enzym sba chXa RNA,
t5o ñiu kin thu=n lQi cho sT xut hin các ñt bi#n ñiRm trong các phân
ño5n gen/h gen qua quá trình sao chép nhân lên c,a virus, hoac trao ñPi
các phân ño5n gen giXa các ch,ng virus cúm ñVng nhim trên cùng mt t#
bào, rt có thR dxn ñ#n thay ñPi ñac tính kháng nguyên t5o nên các ch,ng
virus cúm A m!i.
1.3 M6T S" NGHIÊN C7U V SINH HC PHÂN T9 VIRUS CÚM
A/H5N1 T.I VI,T NAM
Nghiên cNu ñac tính sinh h1c phân tb (ñInh týp, bi#n ñPi di truyn và gen
h1c ti#n hoá) c,a virus gây bnh cúm gia cm H5N1 ñưQc các cơ quan
nghiên cNu c,a Vit Nam ti#n hành ngay t< nhXng tháng ñu tiên x;y ra dIch
cúm gia cm cui năm 2003. Các chuyi gen giúp xác ñInh phân týp H5, phân
týp N1 và các gen cu trúc ñã ñưQc Vin Pasteur thành phHV Chí Minh,
Vin Công ngh Sinh h1c, Vin V sinh dIch t trung ương, Trung tâm ch\n
ñoán thú y trung ương, Vin Thú y gi;i mã và công b trên Ngân hàng gen.
Các nhà khoa h1c Vit Nam k#t hQp nghiên cNu v!i các tP chNc th#
gi!i xây dTng các phương pháp ch\n ñoán, phát hin nhanh virus gây
bnh, phân bit cúm A v!i các tác nhân gây triu chNng hô hp khác,
cũng như phân bit các phân týp HA và NA. Các phương pháp phát hin
nhanh virus cúm A/H5N1 và các phân týp khác bao gVm vic sb dLng
kháng nguyên hoac kháng thR, hoac sinh h1c phân tb cũng ñã ñưQc xây
dTng. Các nhà khoa h1c Vit Nam ñã có nhXng ñóng góp nht ñInh trong
lĩnh vTc nghiên cNu vaccine và min dIch. NhXng ch# ph\m kháng nguyên,
vaccine di truyn ngưQc hoac vector tái tP hQp trên nn virus cúm A/H5N1
c,a Vit Nam cũng ñã ñưQc t5o ra.
5
NhXng k#t qu; nghiên cNu v cúm A/H5N1 M gia cm và ngư>i trên
nn virus cúm A/H5N1 c,a Vit Nam ñã và ñang làm sáng tf thêm v
mi quan h ti#n triRn bnh h1c lây nhim, dIch t h1c phân tb, phát triRn
ti#n hoá và genotype, và kháng nguyêndmin dIchdvaccine c,a cúm gia
cm t5i Vit Nam.
CHƯƠNG 2
N6I DUNG, NGUYÊN LI,U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C7U
2.1 ð"I TƯ?NG NGHIÊN C7U
ði tưQng nghiên cNu c,a ñ tài là virus cúm A/H5N1 t< gà mGc bnh
cúm gia cm nuôi t5i thnh H=u Giang, Vit Nam, phân l=p năm 2005.
2.2 ð@A ðIAM VÀ THBI GIAN NGHIÊN C7U
ð tài ñưQc ti#n hành t5i Vin Công ngh sinh h1c (Vin Khoa h1c
và Công ngh Vit Nam).
Th>i gian thTc hin ñ tài: t< tháng 10/2005 ñ#n tháng 10/2009.
2.3 N6I DUNG NGHIÊN C7U
2.3.1 GiDi trình tJ toàn bN hO gen chSng virus cúm A/H5N1 (CkHG4)
phân l`p ta gà H`u Giang
d Gi;i trình tT gen kháng nguyên HA và NA
d Gi;i trình tT gen polymerase PB2, PB1 và PA
d Gi;i trình tT các gen NP, M và NS
2.3.2 Phân tích so sánh thành phen gen, mfi quan hO nguhn gfc phD
hO chSng CkHG4 vii các chSng cSa ViOt Nam và thj giii
d Phân tích thành phn nucleotide và amino acid.
d Phân tích ñVng nht v nucleotide và tương ñVng v amino acid.
d Phân tích mi quan h nguVn gc ph; h.
2.4 V$T LI,U NGHIÊN C7U
Nguyên liu nghiên cNu là dIch khí qu;n d ph# qu;n chNa virus cư>ng
ñc cúm A/H5N1 thu nh=n t< gà bI bnh t5i H=u Giang năm 2005 (ký hiu
ch,ng: A/Ck/Vietnam/HG4/2005(H5N1), vi#t tGt CkHG4). Bnh ph\m ñã
ñưQc vô ho5t M nhit ñ 100
o
C trong 30 giây, ñ;m b;o an toàn sinh h1c, b;o
qu;n M d20
o
C cho ñ#n khi sb dLng ñR tách RNA tPng s.
2.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C7U
2.5.1 Phương pháp tách chijt RNA tmng sf
Sb dLng b sinh ph\m QIAamp Viral Mini Kit (QIAGEN) ñR tách
RNA tPng s theo hư!ng dxn c,a nhà s;n xut.
2.5.2 Phương pháp RTnPCR
Chúng tôi sb dLng ph;n Nng RTdPCR mt bư!c (QIAGEN) ñR thu
nh=n các phân ño5n gen c,a virus cúm A/H5N1.
6
2.5.3 Phương pháp kiom tra sDn phpm RTnPCR
S;n ph\m RTdPCR ñưQc kiRm tra bcng cách ñin di M 100d120V, 400
mA trong 25d30 phút trên th5ch agarose 1%. Chh thI DNA sb dLng trong
nghiên cNu là DNA thTc khu\n thR Lamda, có kích thư!c 43 kb, ñưQc
cGt bcng enzym gi!i h5n HindIII.
2.5.4 Phương pháp dòng hóa
S;n ph\m PCR/RTdPCR tinh s5ch ñưQc dòng hóa vào vector là pCR2.1
hay pCR2.1TOPO (Invitrogen).
2.5.5 Phương pháp giDi trình tJ
S;n ph\m gi;i trình tT sau khi tinh s5ch, ñưQc ñông khô và ñ1c trình
tT trên máy tT ñng ABId3100 Avant Genetic Analyzer (M}).
2.5.6 Phương pháp xv lý sf liOu
Trong nghiên cNu này, chúng tôi xb lý gi;n ñV chromatogram c,a
chuyi nucleotide thô bcng chương trình SeqEd1.03, sau ñó sb dLng chương
trình AsemblyLIGN1.9 ñR so sánh các chuyi, phân tích thành phn
nucleotide và amino acid hoac các ñac tính gen và polypeptide bcng h
chương trình MacVector8.2 (Accelrys Inc.) trên máy tính Macintosh. Các
chuyi nucleotide hay amino acid ñưQc sGp x#p và tính toán mNc ñ tương
ñVng bcng chương trình GeneDoc 2.5; phân tích và xây dTng ph; h bcng
chương trình MEGA4.0.
CHƯƠNG 3
KT QUx VÀ THxO LU$N
3.1 KT QUx GIxI MÃ H, GEN VIRUS CÚM A/H5N1 CHNG CkHG4
3.1.1 Gi%i trình t' gen H5 (HA)
ðR thu nh=n gen kháng nguyên H5 (HA) c,a ch,ng CkHG4 chúng tôi sb
dLng phương pháp RTdPCR trTc ti#p v!i khuôn là RNA tPng s có chNa
RNA h gen c,a virus cúm A/H5N1.
Plasmid tái tP hQp sau khi gi;i trình tT chúng tôi thu ñưQc chuyi gen H5
(HA) gVm 1707 nucleotide c,a ch,ng CkHG4 và ñăng ký trong Ngân hàng
gen s EF051513.
3.1.2 Gi%i trình t' gen N1 (NA)
DNA plasmid tái tP hQp ñưQc gi;i trình tT, thu nh=n chuyi DNA c,a
gen N1 (NA) ch,ng CkHG4 gVm 1350 nucleotide và ñăng ký trong Ngân
hàng gen s EF057803.
3.1.3 Gi%i trình t' gen PB2
Phân ño5n 1 c,a h gen virus cúm A/H5N1 mã hóa cho protein PB2
gVm 759 amino acid. Do phân ño5n 1 có kích thư!c 2355 bp nên không
thR bcng mt ph;n Nng RTdPCR ñR nhân lên ñưQc mà ph;i thTc hin 2
ph;n Nng RTdPCR thu 2 ño5n lVng vào nhau. Cap mVi PB2FdPB2R1
7
ñưQc sb dLng ñR thu nh=n ño5n ñu và cap mVi PB2F3dPB2R dùng ñR thu
nh=n ño5n sau c,a phân ño5n 1 (gen PB2). S;n ph\m cui cùng gVm 2
ño5n DNA: phn ñu c,a phân ño5n 1 có kích thư!c kho;ng 1kb (cap mVi
PB2FdPB2R1), và phn sau c,a phân ño5n 1 có ñ dài kho;ng 1,4 kb (cap
mVi PB2F3dPB2R).
DNA plasmid tái tP hQp sau ñó ñưQc gi;i trình tT, sGp x#p ni chuyi và
phân tích bcng các chương trình tindsinh h1c chuyên bit, chúng tôi thu ñưQc
chuyi DNA c,a gen PB2 gVm 2280 nucleotide.
3.1.4 Gi%i trình t' gen PB1
Phân ño5n 2 (gen PB1) c,a ch,ng CkHG4 ñưQc nhân lên bcng ph;n
Nng RTdPCR t< nguVn khuôn RNA tPng s, bcng 2 ph;n Nng sb dLng 2
cap mVi PB1F1dPB1R2 và PB1F3dPB1R3. Ph;n Nng RTdPCR v!i cap
mVi PB1F1dPB1R2 cho ño5n DNA s;n ph\m (ñu phân ño5n) có ñ dài
1,7 kb. K#t qu; ph;n Nng RTdPCR sb dLng cap mVi PB1F3dPB1R3 cho
s;n ph\m 0,75 kb (cui phân ño5n), tPng ñ dài c,a toàn b phân ño5n 2
kho;ng 2,35 kb ñã ñưQc thu nh=n.
Các DNA plasmid tái tP hQp ñưQc gi;i trình tT và chuyi DNA c,a
phân ño5n 2 ch,ng CkHG4 thu ñưQc chNa toàn b gen PB1 gVm 2274 bp.
3.1.5 Gi%i trình t' gen PA
Phân ño5n 3 (gen PA) ñưQc nhân lên t< nguVn khuôn RNA tPng s
bcng các ph;n Nng RTdPCR sb dLng các cap mVi thi#t k# cho gen PA. S;n
ph\m cui cùng c,a ph;n Nng RTdPCR bcng cap mVi PAFdPAR là phn
ñu c,a phân ño5n 3 có ñ dài kho;ng 0,75 kb; v!i cap mVi PAF2dPAR2 là
phn giXa c,a phân ño5n có kích thư!c kho;ng 1,2 kb và v!i cap mVi
PAF3dPAR3 là phn sau c,a phân ño5n có ñ dài kho;ng 0,73 kb; tPng ñ
dài c,a toàn b phân ño5n 3 thu nh=n ñưQc là kho;ng 2,23 kb.
DNA plasmid tái tP hQp c,a các clone ñưQc gi;i trình tT và thu ñưQc
chuyi DNA c,a gen PA gVm 2151 nucleotide.
3.1.6 Gi%i trình t' gen NP
Phân ño5n 5 chNa gen NP c,a virus cúm A/H5N1 ch,ng CkHG4
ñưQc nhân lên t< nguVn khuôn RNA tPng s bcng ph;n Nng RTdPCR sb
dLng cap mVi NPFdNPR.
DNA plasmid tái tP hQp c,a clone tương Nng ñưQc gi;i trình tT và
chúng tôi thu ñưQc chuyi DNA c,a phân ño5n 5 ch,ng CkHG4 chNa toàn
b gen NP gVm 1497 nucleotide.
3.1.7 Gi%i trình t' gen M
DNA plasmid chNa gen M1 và M2 sau khi gi;i trình tT, chúng tôi thu
ñưQc chuyi DNA c,a phân ño5n 7 gVm 2 gen M1 (759 bp) và M2 (294
bp).
8
3.1.8 Gi%i trình t' gen NS
Phân ño5n 8 chNa gen NS c,a virus cúm A/H5N1 ch,ng CkHG4
ñưQc nhân lên bcng ph;n Nng RTdPCR t< nguVn khuôn RNA tPng s sb
dLng cap mVi NSF1dNSR1.
DNA plasmid tái tP hQp sau ñó ñưQc gi;i trình tT và thu nh=n ñưQc
chuyi DNA c,a phân ño5n 8 chNa 2 gen NS1 gVm 678 bp và NS2 gVm
366 bp.
3.2 PHÂN TÍCH SO SÁNH THÀNH PHN GEN, M"I QUAN H, NGUzN
G"C PHx H, CA CHNG CkHG4 V I CÁC CHNG CA VI,T NAM VÀ
TH GI I
3.2.1 Phân tích gen H5
3.2.1.1 Phân tích thành ph4n nucleotide và amino acid
Trình tT nucleotide và amino acid gen H5 c,a ch,ng CkHG4 ñưQc so
sánh v!i 26 ch,ng cúm A/H5N1 thuc phân dòng Qu;ng ðông và phân
dòng Phúc Ki#n c,a Vit Nam và th# gi!i phân l=p trong các năm 2003d
2009. K#t qu; so sánh, phân tích cho thy:
d Gen H5 c,a virus cúm A/H5N1 ch,ng CkHG4 có kích thư!c 1707
bp, mã hóa cho 568 amino acid, khMi ñu bcng b mã ATG (methionine)
và k#t thúc bcng b mã TAA.
d Chuyi nucleotide và polypeptide gen H5 ch,ng CkHG4 có cùng
kích thư!c v!i gen tương Nng c,a các ch,ng thuc phân dòng Qu;ng
ðông là 1707 bp và 568 amino acid so v!i 1704 bp (thi#u hLt 3
nucleotide) và 567 amino acid (thi#u hLt 1 amino acid) c,a các ch,ng
phân dòng Phúc Ki#n.
d Ch,ng CkHG4 có tPng cng 363 vI trí sai khác nucleotide v!i các
ch,ng so sánh, ch, y#u là ñt bi#n ñVng hoán (transition) (ñt bi#n x;y ra
giXa các base trong cùng nhóm purine hay pyrimidine v!i nhau, giXa A và G
hoac C và T).
d Gen H5 c,a ch,ng CkHG4 có 15 vI trí sai khác nucleotide v!i hu
h#t các ch,ng so sánh và 10 nucleotide sai khác so v!i các ch,ng cùng phân
l=p M vùng H=u Giang (thN tT 2d5) t5i các vI trí 159, 415, 445, 582, 676, 677,
933, 945, 1170 và 1494.
Trong tPng s 363 sai khác v nucleotide c,a ch,ng CkHG4 v!i các
ch,ng so sánh có mt s sai khác không làm thay ñPi amino acid, nhưng
mt s sai khác ñã làm bi#n ñPi b mã c,a amino acid dxn ñ#n thay ñPi
amino acid t5i 104 vI trí. Do ñó có thR ;nh hưMng ñ#n tính kháng nguyên d
min dIch và tính gây bnh c,a các ch,ng ñó.
d Chuyi polypeptide H5 c,a ch,ng CkHG4 có 5 vI trí sai khác v
amino acid v!i tt c; các ch,ng so sánh t5i các vI trí: F11V, I242M,
9
R275K, T325N và V512A (B;ng 3.1).
d Thành phn chuyi polypeptide ni giXa HA
1
và HA
2
c,a ch,ng
CkHG4 bao gVm các amino acid RRRKK, và motif này không bi#n ñPi
qua các năm 2003–2009 M hu h#t các ch,ng thuc phân dòng Qu;ng
ðông. • các ch,ng thuc phân dòng Phúc Ki#n chuyi ni này bI xóa 1
amino acid (K) do ñt bi#n mt ñi 3 nucleotide (AAG) trong trình tT
chuyi ni c,a gen H5.
BDng 3.1: So sánh v{ trí sai khác amino acid cSa chu|i polypeptide H5
gi~a 27 chSng virus cúm
V{ trí sai khác v€ amino acid ChSng
8 11 102 110 140 156 171 191 228 242 243 275 279 285 298 325 326 512 529
1 F F V D S K S M R I E R T L I T R V I
2 F V V D S K S M R M E K T L M N R A I
3 F V V D S K S M R M E K T L M N R A I
4 F V V D S K S M R M E K T L M N R A I
5 F V V D S K S M R M E K T L M N R A I
6 F V V D S K S L R M E K T L M N R A I
7 L V A D N R S L K M E K A L M N R A T
8 F V V D S K S L R M E K T L M N R A I
9 F V V D S K S M R M E K T L M N R A I
10 F V V D S K S M R M E K T L M N R A I
11 F V V D S K S M R M E K T L M N R A I
12 F V V D S K S M R M E K T L M N R A I
13 F V V D S K S M R M E K T L M N R A I
14 F V V V S K S I R M E K T L M N R A I
15 F V V V S K S M R M E K T L V N R A I
16 L I A N N N N L K M D K A L I N R A T
17 L T A N E R D L K M E K T L M N K S T
18 L T A N D R D L K M E K T L V N R S T
19 L V A N D T N L K M D K A V I N K A T
20 L V A N D T N L K M D K A V I N K A T
21 I V A N D S N L K M D K A V M N K A T
22 L I A D D V N L K M D K A V I N K A T
23 L I A N D V N L K M D K A V I N K A T
24 L V A N D S N L K M D K A V M N K A T
25 F V A N D N N L K I D K T V M N K A T
26 L V A N D T N L K M D K A V M N K A T
27 L V A N D T N L K M D E A V M N K A T
Ghi chú: Các chng ñưc ñánh s th t! t" 1 ñ#n 5 là các chng phân l'p (
vùng H'u Giang, 1.18 là các chng thu/c phân dòng Qu3ng ðông, 19.27 là các
chng thu/c phân dòng Phúc Ki#n.
d Chuyi polypeptide H5 c,a ch,ng CkHG4 và các ch,ng so sánh có 7
vI trí glycosyl hóa, bao gVm 5 vI trí trên HA
1
và 2 vI trí trên HA
2
. Không
có sT khác bit v các vI trí liên quan ñ#n kh; năng glycosyl hóa c,a
Ch
Sng
10
chuyi protein H5 giXa hu h#t các ch,ng thuc phân dòng Qu;ng ðông.
Protein H5 c,a các ch,ng phân dòng Phúc Ki#n chh có 6 vI trí glycosyl
hóa tương Nng v!i các ch,ng phân dòng Qu;ng ðông. ðã có sT thay th#
amino acid S (vI trí 171) thành N M các ch,ng phân dòng Phúc Ki#n t5i vI
trí thN III (170 d172) ñR chuyRn t< motif NST M các ch,ng phân dòng
Qu;ng ðông t5o thành motif NNT M các ch,ng phân dòng Phúc Ki#n.
3.2.1.2 Phân tích s' ñ8ng nh9t v: nucleotide và tương ñ8ng v: amino acid
Trình tT nucleotide gen H5 c,a 27 ch,ng cúm A/H5N1 so sánh
ñưQc ñưa vào chương trình GeneDoc2.5 ñR phân tích sT ñVng nht
(identity) vthành phn nucleotide và tương ñVng (homology) v amino
acid. K#t qu; phân tích cho thy:
d So sánh giXa các ch,ng vùng H=u Giang v!i nhau, t" l ñVng nht
nucleotide và tương ñVng amino acid bi#n ñng ít (96d98%). MNc ñ
ñVng nht và tương ñVng cao nht là 98%, thp nht là 96%.
d So sánh các ch,ng phân dòng Qu;ng ðông v!i nhau, t" l ñVng nht
và tương ñVng bi#n ñng rt l!n, 91d99% v nucleotide và 87d100% v
amino acid, ch, y#u là do có sT bi#n ñng l!n giXa các ch,ng phân l=p
năm 2003d2007 v!i 3 ch,ng phân l=p năm 2008d2009.
d So sánh các ch,ng phân dòng Phúc Ki#n v!i nhau, t" l ñVng nht
nucleotide bi#n ñng rt l!n (94d99%); tương tT, t" l tương ñVng amino
acid cũng ph;n ánh ñúng mNc ñ bi#n ñPi l!n (94d100%).
d T" l ñVng nht nucleotide và tương ñVng amino acid c,a các ch,ng
phân dòng Qu;ng ðông so v!i các ch,ng phân dòng Phúc Ki#n là rt thp,
90d96% v nucleotide và 88d96% v amino acid.
3.2.1.3 Phân tích m=i quan h ngu8n g=c ph% h
Gen hemagglutinin HA (H5) thu nh=n t< ch,ng CkHG4 ñưQc ñưa vào
phân tích ph; hcùng v!i 54 ch,ng cúm A/H5N1 c,a Vit Nam và th#
gi!i phân l=p qua các năm 1996d2011 (Hình 3.1).
Hình 3.1 cho thy, ch,ng CkHG4 t=p hQp trong cùng mt nhóm v!i
các ch,ng cúm A/H5N1 phân l=p M phía Nam c,a Vit Nam giai ño5n
2004d2007, ñó là: CkdVNdDTd171d04 (DQ099759), CkdVNdTGd023d04
(DQ099758), DkdVNdHG680Fd05 (ISDN230184), CkdVNdLA636d05
(ISDN230180), DkdVNd1231d05 (CY029519), DkdVNd1771d05
(CY029551), CkdVNd29d07 (CY029631); và mt s ch,ng phân l=p t<
Thái Lan là CkdTLdNIAH7618d04 (AB450562), CkdUthaithanid05
(FJ265572), CkdTLdCUd354d08 (CY047457). ðiu này cho phép nh=n xét,
có thR các ch,ng cúm A/H5N1 t< gia cm H=u Giang, ðVng Tháp, Tin
Giang, Long An, Sóc Trăng là có cùng nguVn gc và thuc nhóm di