Nghiên cứu
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020
8
TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO
CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT 5-METHYLBENZIMIDAZOL-2-THION
Trần Quang Phương Nam*, Ngô Duy Túy Hà**, Trương Phương*, Nguyễn Ngọc Đan Thùy*
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Nghiên cứu tổng hợp và sàng lọc hoạt tính sinh học hướng tác động kháng ung thư đang được
nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Để tạo cơ sở cho việc phát triển thuốc ung thư mới có hoạt tính cao,
chúng tôi lựa chọn nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất mới từ khung 5-methylbenzimidazol-2-thion và thử hoạt
tính gây độc tế bào của chúng.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Tổng hợp 5-methylbenzimidazol-2-thion bằng phương pháp
Thiocarbanilid từ nguyên liệu chính là 5-methyl orthophenylendiamin và CS2, alkyl hóa 5-methylbenzimidazol-2-thion
ở vị trí S trong môi trường pyridin; khi sử dụng triethylamin để alkyl hóa, sản phẩm tạo ra có 2 nhóm thế
trên 2 N hoặc 1 trên N và 1 nhóm thế trên S. Acyl hóa 5-methylbenzimidazol-2-thion tại vị trí N. Xác định cấu
trúc bằng các phổ UV, IR, 1H-NMR, 13C-NMR và MS. Thử tác dụng độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư
HEPG2, RD và MDA và 1 dòng tế bào thường LLCPK1.
Kết quả: Tổng hợp được và xác định cấu trúc của mười ba hợp chất mới (1-13) là những dẫn chất
của 5-methylbenzimidazol-2-thion. Kết quả nghiên cứu này cho thấy 6 dẫn chất có ảnh hưởng tốt đến HEPG2
(các chất 3,4,5,6,7 và 10); 7 dẫn chất có hoạt tính tốt trên MDA và RD (các chất 3,4,5,6,7,10 và 12). Hơn nữa,
tất cả chúng đều có tác dụng yếu trên dòng tế bào thường được thử nghiệm.
Kết luận: Phản ứng alkyl hóa 5-methylbenzimidazol-2-thion với các alkyl halid trong dung môi pyridin hay
trong triethylamin thu được sản phẩm tinh khiết, chỉ có 1 trường hợp có đồng phân vị trí, hiệu suất tương đối
cao, dễ thực hiện. Phản ứng acyl hóa 5-methylbenzimidazol-2-thion với acyl halid hay anhydrid acetic trong dung
môi pyridin thu được sản phẩm dễ dàng. Tất cả các sản phẩm thế alkyl 1:1 đều được thế trên S, điều này cho thấy
vị trí S sẽ ưu tiên gắn nhóm thế alkyl hơn vị trí N. Các chất thử nghiệm có tác dụng yếu trên dòng tế bào thường
nhưng 6-7/13 chất thử nghiệm có ức chế tốt các dòng tế bào ung thư thử nghiệm.
Từ khóa: 5-methylbenzimidazol-2-thion, dẫn chất acyl, dẫn chất alkyl, độc tính tế bào, tác dụng độc tính tế bào
ABSTRACT
SYNTHESIS AND EVALUATION THE CYTOTOXIC EFFECTS
OF 5-METHYLBENZIMIDAZOLE-2-THIONE’S DERIVATIVES
Tran Quang Phuong Nam, Ngo Duy Tuy Ha, Truong Phuong, Nguyen Ngoc Dan Thuy
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 24 - No. 3 - 2020: 8 - 16
Background: Presently, many scientists are interested in synthesis and screening of biological activity
towards anti-cancer effects of new compounds. In order to create a basis for the development of new highly active
cancer drugs, we selected the synthesis of new derivatives from the 5-methylbenzimidazole-2-thione framework
and testing their cytotoxic activity.
Materials and methods: The 5-methylbenzimidazole-2-thione was synthesized from main materials of
5-methylorthophenylenediamine and CS2 with thiocarbanilide method. The 5-methylbenzimidazole-2-thione
was alkylated at S position in pyridine. When triethylamine was used to alkylize the products, the
*Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
**Trường Cao đẳng Y Tế Lâm Đồng
Tác giả liên lạc: PGS.TS. Trương Phương ĐT: 0938525157 Email: nguyetphuong1234@gmail.com
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020
Nghiên cứu
B – Khoa học Dược
9
derivatives were produced with alkyl group attacted on N1 and N3 positions or one on N and another on S
positions. On the other hand, 5-methylbenzimidazole-2-thione was acylated at N position. All of new
structures were determined by UV, IR, 1H-NMR, 13C-NMR and MS spectra. The antitumor effects were
tested on HEPG2, RD and MDA cancer cell lines and LLCPK1 normal cell line.
Results: Thirteen new compounds (1-13) of 5-methylbenzimidazole-2-thione were synthesized and
determined their structures. The result showed that 6 derivatives have good influences on HEPG2
(substances 3,4,5,6,7 and 10); 7 derivatives have good activitives on MDA and RD (substances 3,4,5,6,7,10 and 12).
Moreover, all of them have weak effects on a normal cell line.
Conclusion: New derivatives were produced when 5-methylbenzimidazole-2-thione was alkylated with alkyl
halides in pyridine solvent or triethylamine. On the other way, this substance was acylated with acyl halide or
anhydride acetic in pyridine solvent. The cytotoxic activity does not appear evenly in the derivatives. The tested
substances have weak effects on a normal cell line but from 6 to 7 per 13 of them have good inhibition of tested
cancer cell lines.
Key words: 5-methylbenzimidazol-2-thione, acyl derivatives, alkyl derivatives, cytotoxicity, cytotoxic effects
ĐẶT VẤN ĐỀ
Việc nghiên cứu tổng hợp và sàng lọc hoạt
tính sinh học hướng tác động kháng ung thư
đang được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên
cứu. Trong khi cấu trúc benzimidazol-2-thion có
mặt trong nhiều hoạt chất có tác dụng dược lý
khác nhau được ứng dụng rộng rãi trong ngành
Dược như diệt ký sinh trùng(1) chống động
kinh(2), kháng nấm, kháng khuẩn(3) và đặc biệt là
tác dụng gây độc tế bào ung thư(4,5). Để tạo cơ sở
cho việc phát triển thuốc ung thư mới có hoạt
tính cao, chúng tôi lựa chọn nghiên cứu tổng
hợp các dẫn xuất mới từ khung 5-
methylbenzimidazol-2-thion và thử hoạt tính
gây độc tế bào của chúng.
ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu
3,4-diaminotoluen, carbon disulfid, allyl
bromid, benzyl clorid, 2-clorobenzyl clorid,
2-methylbenzyl clorid, 2-fluorobenzyl clorid,
4-fluorobenzyl clorid, benzoyl clorid, anhydrid
acetic, kali hydroxyd tinh thể, than hoạt tính,
dung dịch acid hydrocloric đậm đặc...
Bản mỏng tráng sẵn Kieselgel 60 F254 của
Merck.
Các hệ dung môi: Hệ (A): toluen: ethyl acetat
(4:1); Hệ (B): hexan: aceton (2:1); Hệ (C):
cloroform: ethyl acetat (7:3).
Nguyên liệu thử độc tế bào
Dòng tế bào
HEPG2 (tế bào ung thư gan người), RD
(tế bào ung thư cơ vân người), MDA-MB-231
(tế bào ung thư vú người), LLC-PK1 (tế bào
thận heo) được hoạt hóa và nuôi cấy tại viện
Pasteur TP. Hồ Chí Minh.
Hóa chất
Môi trường EMEM, môi trường DMEM,
huyết thanh bào thai bê (FCS), trypsin-EDTA;
L-glutamin, penicilin-streptomycin (Gibco, Mỹ);
PBS, trypan blue, MTT (Sigma-Aldrich, Mỹ);
isopropanol (Merck, Đức).
Nuôi cấy tế bào
Tế bào HEPG2, LLC-PK1 nuôi trong môi
trường EMEM; tế bào RD, MDA-MB-231 nuôi
trong môi trường DMEM; bổ sung vào môi
trường nuôi cấy 10% FCS, 2 mM L-glutamin,
100 IU/ml penicilin, 100 µg/ml streptomycin, ủ ở
37 oC, 5% CO2. Khi đạt độ phủ 70 - 80%, thu và
đếm tế bào sống với trypan blue, cấy chuyển
hoặc chia vào đĩa nuôi cấy.
Xử lý tế bào
Dung dịch mẹ của các mẫu thử được pha
trong DMSO chiếu UV và bảo quản ở -20 oC. Tế
bào được chia vào các đĩa nuôi cấy 96 giếng ở
mật độ thích hợp. Sau khi ủ tế bào 24 giờ ở 37 oC,
5% CO2, xử lý tế bào với các mẫu thử ở nồng độ
Nghiên cứu
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020
10
khác nhau (12,5 – 100 µM), nồng độ cuối cùng
của DMSO trong môi trường nuôi cấy là 1%
(tt/tt). Paclitaxel được dùng làm chất đối
chứng dương.
Đánh giá tỉ lệ tế bào sống bằng phương pháp MTT
Tỷ lệ tế bào sống xác định nhờ hoạt tính
của enzym succinat dehydrogenase (SDH) có
trong ty thể tế bào sống. SDH chuyển MTT
[3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5diphenyl
tetrazolium bromid)] thành formazan tan
trong isopropanol acid hóa tạo dung dịch tím,
đo OD ở 570 nm; giá trị OD phản ánh số
lượng tế bào sống trong mẫu thử.
Dụng cụ và trang thiết bị
Tổng hợp và tinh chế sản phẩm: Máy khuấy
từ gia nhiệt Stuart SB162, cá từ, bếp nung Alma,
máy hút chân không, phễu Buchner, máy cô
quay Stuart, cột sắc ký.
Kiểm nghiệm sản phẩm: Sắc ký bản
mỏng GF254, bình triển khai sắc ký, buồng soi
UV VilberLourmat, ống mao quản, máy đo
điểm chảy Stuart SMP10; máy đo phổ hồng
ngoại IR: FTIR 8201 PC (SHIMADZU); máy
đo khối phổ MSQ Plus – Thermo; máy đo
phổ cộng hưởng từ hạt nhân AV500 Bruker
(500 MHz).
Phương pháp nghiên cứu
Tổng hợp các chất theo Hình 1 như sau:
Hình 1. Sơ đồ tổng hợp các dẫn chất alkyl hóa và acyl hóa 5-methylbenzimidazol-2-thion
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020
Nghiên cứu
B – Khoa học Dược
KẾT QUẢ
Tổng hợp 5-methylbenzimidazol-2-thion (1)
Cho 10 g 3,4-diaminotoluen (0,082 mol) và
1,68 g KOH tinh thể (0,03 mol) vào 50 ml ethanol
trong bình cầu đáy tròn dung tích 250 ml. Khuấy
trong 15 phút. Thêm 10ml CS2 ( 0,17 mol) vào
bình cầu, đun hồi lưu ở 70 – 80 oC trong 8 giờ.
Sau khi phản ứng kết thúc sẽ thấy hỗn hợp rắn
lại, để nguội bình phản ứng, thêm 100 ml nước
cất, khuấy và lọc lấy tủa. Hòa tủa trong 100 ml
cồn nước 1:1, đun nóng rồi lọc nhanh để lấy dịch
lọc. Để nguội sẽ thu được tinh thể, lọc lấy tinh
thể, sấy khô sản phẩm ở 60 oC. Thu được 10,34 g
sản phẩm. Hiệu suất 76,88%.
Chất (1): 5- methylbenzimidazol-2-thion
C8H8N2S. P.t.l: 164,23. Tinh thể hình kim màu
trắng, không tan trong nước, tan trong methanol,
ethanol, DMSO. Hiệu suất: 76,88%. Nhiệt độ
nóng chảy: 292 – 293 oC. Sắc ký lớp mỏng: Rf (hệ
dung môi): A (0,36), B (0,51), C (0,68). UV (λmax)
(nm): 316. IR (cm-1): 3105 (ν – NH); 3040 (ν – C–H
thơm); 2968 (ν – CH3); 1327 (ν – C–N thơm). Phổ
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, δ ppm): 12,368
(s, 2H, H1&3), 7,011 (d, J= 8 Hz, 1H, H7), 6.941
(s, 1H, H4), 6,923 (d, J= 8 Hz, 1H, H6), 2,327 (s,
3H, H10). Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO, δ
ppm): 167,77 (C2), 132,43 (C9), 131,58 (C8),
130,16 (C5), 123,12 (C6), 109,54 (C4), 109,04
(C7), 20,88 (C10, CH3). MS: Giá trị tính toán
cho [M+H]+ (C8H9N2S)+ = 165,0486; giá trị đo
được là 165,0464.
Tổng hợp các dẫn chất alkyl 5-
methylbenzimidazol-2-thion (2,3,5,7,9,11) trong
pyridin
Trong một bình cầu đáy tròn, cho vào 1 g (1)
(6,1 mmol), sau đó cho thêm 10ml pyridin vào.
Thêm 0,01 mol allyl bromid. Khuấy liên tục
trong 24 giờ. Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp
mỏng. Sau khi phản ứng kết thúc, thêm vào bình
phản ứng 50 ml nước cất, khuấy mạnh và lọc lấy
tủa. Tủa thu được sẽ tinh chế lại bằng hỗn hợp
cồn nước 1:1. Thu được 0,719g sản phẩm. Hiệu
suất 57,86%.
Các phản ứng với những dẫn chất benzyl
clorid tiến hành tương tự như phản ứng với
allyl bromid. Hiệu suất phản ứng dao động từ
30 – 50%
Chất (2): 2-(allylthio)-5-methylbenzimidazol
C11H12N2S. P.t.l: 204,29. Dạng bột màu nâu
nhạt, không tan trong nước, tan trong methanol,
ethanol, DMSO. Hiệu suất: 57,86%. Nhiệt độ
nóng chảy: 127 – 128 oC. Sắc ký lớp mỏng: Rf (hệ
dung môi): A (0,59), B (0,63), C (0,87). UV (λmax)
(nm): 300, 291. IR (cm-1): 3063 (ν – C–H
thơm); 2986(ν – CH3); 1624 (ν – C=C thơm);
1271 (ν – C–N thơm). Phổ 1H-NMR (500 MHz,
MeOD, δ ppm): 7,357 (d, J= 8 Hz, 1H, H6),
7,272(s, 1H, H4), 7,035 (dd, J1= 8 Hz, J2= 1 Hz, 1H,
H7), 5,980 (m, J1= 7 Hz, J2= 10 Hz, J3= 17 Hz, 1H,
H12), 5,242 (dd, J1= 1 Hz, J2= 17 Hz, 1H, H13a),
5,082 (d, J= 10 Hz, 1H, H13b), 3,864 (d, J= 7 Hz,
2H, H11), 2,438 (s, 3H, H10). Phổ 13C-NMR (125
MHz, MeOD, δ ppm): 150,22 (C2), 141,18 (C9),
134,50 (C8 & C12), 133,42 (C5), 124,83 (C6),
118,64 (C13), 114,53 (C4&C7), 36,52 (C11), 21,61
(C10). MS: m/z 205 (MH)+.
Chất (3): 2-(benzylthio)-5-methylbenzimidazol
C15H14N2S. P.t.l: 254,35. Dạng bột màu nâu
nhạt, không tan trong nước, tan trong methanol,
ethanol, DMSO. Hiệu suất: 62,39%. Nhiệt độ
nóng chảy: 143 – 145 oC. Sắc ký lớp mỏng: Rf (hệ
dung môi): A (0,74), B (0,52), C (0,88). UV (λmax)
(nm): 299. IR (cm-1): 3036 (ν – C–H thơm); 1626 (ν
– C=C thơm); 1275 (ν – C–N thơm). Phổ 1H-NMR
(500 MHz, MeOD, δ ppm): 7,356 (d, J= 8 Hz, 1H,
H6), 7,332 (m, 2H, H2'&H6'), 7,265 (m, 2H,
H3’&H5'), 7,224 (m, 2H, H4 &H4'), 7,032 (dd, J1=
1 Hz, J2= 8 Hz, 1H, H7), 4,449 (s, 2H, H11), 2,432
(s, 3H, H10). Phổ 13C-NMR (125 MHz, MeOD, δ
ppm): 150,40 (C2), 138,35 (C8&C9), 133,45 (C1’),
129,86 (C3'&C5'), 129,60 (C2'&C6'), 128,58 (C5 &
C4’), 124,88 (C6), 114,50 (C4&C7), 38,21 (C11),
21,62 (C10). MS: m/z 253 (MH)-.
Nghiên cứu
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020
12
Chất (5): 2-((2’-clorobenzyl) thio)-5-
methylbenzimidazol
C15H13ClN2S. P.t.l: 288,79. Dạng bột màu nâu
nhạt, không tan trong nước, tan trong methanol,
ethanol, DMSO. Hiệu suất: 65,77%. Nhiệt độ
nóng chảy: 131 – 133 oC. Sắc ký lớp mỏng: Rf
(hệ dung môi): A (0,75), B (0,63), C (0,91). UV
(λmax) (nm): 297, 292. IR (cm-1): 3057 (ν – C–
Hthơm); 2984 (ν – CH3); 1628 (ν – C=C thơm);
1277 (ν – C–N thơm). Phổ 1H-NMR (500
MHz, MeOD, δ ppm): 7,368 (m, J1= 2 Hz, J2= 9
Hz, 2H, H6&H3'), 7,327 (dd, J1= 2 Hz, J2= 8 Hz,
1H, H6'), 7,268 (s, 1H, H4), 7,212 (td, J1= 2 Hz, J2= 8
Hz, 1H, H4'), 7,133 (td, J1= 2 Hz, J2= 8 Hz, 1H,
H5'), 7,033 (ddd, J1= 1 Hz, J2= 2 Hz, J3= 9 Hz,
1H, H4), 4,551 (s, 2H, H11), 2,427 (s, 3H, H10).
Phổ 13C-NMR (125 MHz, MeOD, δ ppm): 149,82
(C2), 136,16 (C9), 135,13 (C8), 133,53 (C5), 131,95
(C1' & C2’), 130,74 (C3' & C5’), 130,34 (C4' & C6’),
128,17 (C4), 124,97 (C6), 114,73 (C7), 36,20 (C11),
21,63 (C10). MS: m/z 287 (MH)-.
Chất (7): 2-(2’-methylbenzyl) thio)-5-
methylbenzimidazol
C16H16N2S. P.t.l: 268,38. Dạng bột màu nâu
nhạt, không tan trong nước, tan trong methanol,
ethanol, DMSO. Hiệu suất: 55,43%. Nhiệt độ
nóng chảy: 123 - 125 oC. Sắc ký lớp mỏng: Rf (hệ
dung môi): A (0,70), B (0,62), C (0,77). UV (λmax)
(nm): 298, 293. IR (cm-1): 2981 (ν – CH3); 1626 (ν –
C=C thơm); 1277 (ν – C–N thơm). Phổ 1H-NMR
(500 MHz, MeOD, δ ppm): 7,366 (br, 1H, H6),
7,273 (br, 1H, H4), 7,205 (d, J= 8 Hz, 1H, H3'),
7,151 (m, 2H, H5'&H6'), 7,045 (m, 2H, H7&H4'),
4,476 (s, 2H, H11), 2,435 (s, 3H, H10), 2,414 (s,
3H, H12). Phổ 13C-NMR (125 MHz, MeOD, δ
ppm): 138,06 (C2), 135,64 (C1’&C9), 131,56
(C2’&C5), 130,80 (C3’&C6’), 129, 04 (C4’&C5’),
127,19 (C4 & C6), 124,89 (C7 & C8), 36,59 (C11),
21,63 (C10), 19,17 (C12). MS: m/z 267 (MH)-.
Chất (9): 2-(2’-fluorobenzyl) thio-5-
methylbenzimidazol
2-(2’-fluorobenzyl)thio-5-methyl benzimidazol:
C15H13N2SF. P.t.l: 272,34. Dạng bột màu nâu nhạt,
không tan trong nước, tan trong methanol,
ethanol, DMSO. Hiệu suất: 53,69%. Nhiệt độ
nóng chảy: 114 – 115 oC. Sắc ký lớp mỏng: Rf
(hệ dung môi): A (0,74), B (0,60), C (0,92). UV
(λmax) (nm): 298. IR (cm-1): 2984 (ν – CH3); 2646
(ν – S– H); 1614 (ν – C=C thơm); 1279 (ν – C–N
thơm). 1H-NMR (500 MHz, MeOD, δ ppm): 7,366
(d, J= 8 Hz, 1H, H6), 7,316 (m, 1H, H3'), 7,264 (m,
2H, H7 & H4'), 7,074 (m, 1H, H5'), 7,039 (m, 2H,
H4& H6'), 4,484 (s, 2H, H11), 2,441 (s, 3H, H10).
Phổ 13C-NMR (125 MHz, MeOD, δ ppm): 163,20
(C2’), 161, 24 (C2), 149,77 (C9), 132,04 (C8), 130,81
(C5), 130,75 (C7), 125,67 (C1'), 125, 56 (C6), 125,39
(C6'), 125,36 (C5'), 124,98 (C3'), 116,48 (C4’), 116,31
(C4), 31,64 (C11), 21,62 (C10). MS: m/z 273 (MH)+.
Chất (11): 2-((4-fluorobenzyl) thio)-5-
methylbenzimidazol
C15H13N2SF. P.t.l: 272,34. Dạng bột màu nâu
nhạt, không tan trong nước, tan trong
methanol, ethanol, DMSO. Hiệu suất: 67,73%.
Nhiệt độ nóng chảy: 114 – 115 oC. Sắc ký lớp
mỏng: Rf (hệ dung môi): A (0,61), B (0,59), C
(0,83). UV (λmax) (nm): 298, 244. IR (cm-1):
2924 (ν – CH3); 1598 (ν – C=C thơm); 1277 (ν –
C–N thơm). Phổ 1H-NMR (500 MHz, MeOD, δ
ppm): 7,353 (m, 3H, H6&H2'&H6'), 7,272 (s,
1H, H4), 7,045 (dd, J1= 1 Hz, J2= 9 Hz, 1H, H7),
6,988 (m, 2H, H3'&H5'), 4,442 (s, 2H, H11),
2,441 (s, 3H, H10). Phổ 13C-NMR (125 MHz,
MeOD, δ ppm): 164,60 (C4’), 162,65 (C2),
150,07 (C9), 134,61 (C8), 134,59 (C6), 131,78
(C5), 131,72 (C2'&C6'), 124,95 (C5), 116,36
(C3'&C5'), 116,18 (C4&C7), 37,40 (C11), 21,62
(C10). MS: m/z 271 (MH)-.
Kết quả trên cho thấy các sản phẩm
(2,3,5,7,9,11) có cấu trúc phù hợp với cấu trúc
dự kiến.
Tổng hợp các dẫn chất dialkyl 5-
methylbenzimidazol-2-thion (4,8,10 và 6A, 6B)
trong triethylamin
Tiến hành
Trong một bình cầu đáy tròn, cho vào 1 g (1)
(6,1 mmol), thêm vào 20 ml triethylamin, thêm