Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu ứng dụng enzyme protease thương mại Tegalase R660L để thu nhận chất màu astaxanthin ở dạng carotenprotein từ phế liệu đầu tôm sú

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME PROTEASE THƯƠNG MẠI TEGALASE R660L ĐỂ THU NHẬN CHẤT MÀU ASTAXANTHIN Ở DẠNG CAROTENOPROTEIN TỪ PHẾ LIỆU ĐẦU TÔM SÚ.

Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Giảng viên hướng dẫn: GVC.TS. Nguyễn Lệ Hà

Sinh viên thực hiện: Văn Thị Công Tâm

MSSV: 1311110775

Lớp: 13DTP08

TP. Hồ Chí Minh, 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME PROTEASE THƯƠNG MẠI TEGALASE R660L ĐỂ THU NHẬN CHẤT MÀU ASTAXANTHIN Ở DẠNG CAROTENOPROTEIN TỪ PHẾ LIỆU ĐẦU TÔM SÚ.

Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Giảng viên hướng dẫn: GVC.TS. Nguyễn Lệ Hà

Sinh viên thực hiện: Văn Thị Công Tâm

MSSV: 1311110775

Lớp: 13DTP08

TP. Hồ Chí Minh, 2017

Khoa: Công nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường

PHIẾU ĐĂNG KÝ ĐỀ TÀI ĐỒ ÁN/ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Hệ:Đại học chính quy (CQ, LT, B2, VLVH) 1. Họ và tên sinh viên/ nhóm sinh viên đăng ký đề tài (sĩ số trong nhóm): 1

Văn Thị Công Tâm MSSV: 1311110775 Lớp: 13DTP08

Ngành: Công nghệ thực phẩm

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm

2. Tên đề tài đăng ký: Nghiên cứu ứng dụng enzyme protease thương mại

Tegalase R660L trong tận thu chất màu astaxanthin ở dạng carotenprotein từ phế

liệu tôm sú.

3. Giảng viên hướng dẫn: GVC.TS. Nguyễn Lệ Hà.

Sinh viên đã hiểu rõ yêu cầu của đề tài và cam kết thực hiện đề tài theo tiến độ

và hoàn thành đúng thời hạn.

Ý kiến giảng viên hướng dẫn (Ký và ghi rõ họ tên)

TP. HCM, ngày … tháng … năm ………. Sinh viên đăng ký (Ký và ghi rõ họ tên)

Trưởng khoa ký duyệt

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu độc lập của riêng tôi. Các tài liệu

và số liệu sử dụng để phân tích trong nghiên cứu đều đã được công bố trên các tạp chí,

giáo trình theo đúng quy định. Bên cạnh đó, kết quả nghiên cứu trong luận văn là do tôi

tự tìm hiểu, thực hiện thí nghiệm, phân tích một cách khách quan và phù hợp với thực

tiễn. Và các số liệu của kết quả này chưa được công bố trong các nghiên cứu đã được

thực hiện trước đây.

Sinh viên thực hiện

Văn Thị Công Tâm

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô trong Khoa Công nghệ Sinh học

– Thực phẩm – Môi trường đã truyền dạy các kiến thức cũng như sự đam mê về ngành

học cho em trong suốt bốn năm em học tại trường. Vì đây là những kiến thức nền tảng

để em có thể thực hiện đề tài nghiên cứu này và sẽ là hành trang kiến thức cho em áp

dụng vào thực tiễn công việc sau này. Bên cạnh đó, em cũng gửi lời cảm ơn đến ban

lãnh đạo Khoa đã tạo điều kiện về phòng ốc, trang thiết bị, dụng cụ cũng như hoá chất

để em thực hiện đề tài nghiên cứu.

Và em cũng gửi lời cảm ơn sâu sắc đến giảng viên Nguyễn Lệ Hà đã tận tình

hướng dẫn em trong suốt thời gian thực hiện nghiên cứu, hoàn thành báo cáo tốt

nghiệp. Em không chỉ học được thêm những kiến thức mới từ cô, ngoài ra, cô còn

truyền dạy về các kỹ năng sống bổ ích cho công việc sau này.

Cuối lời, em kính chúc quý thầy cô luôn dồi dào sức khoẻ để có thể truyền dạy

kiến thức và sự đam mê với ngành, nghề cho các thế hệ sau. Một lần nữa, em xin chân

thành cảm ơn quý thầy cô.

Sinh viên thực hiện

Văn Thị Công Tâm

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ..................................................................... vi

DANH MỤC BẢNG BIỂU ................................................................................. vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH ................................................................................. vii

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ................................................................................ 3

1.1. Tổng quan về phế liệu đầu tôm sú Penaeus monodon .............................. 3

1.1.1. Giới thiệu về tôm sú Penaeus monodon ...................................... 3

1.1.2. Phế liệu đầu tôm sú Penaeus monodon ...................................... 4

1.1.3. Tình hình xử lý đầu và vỏ tôm .................................................... 6

1.2. Carotenprotein trong động vật thuỷ sản và một số phương pháp chiết

rút 7

1.2.1. Carotenoid ................................................................................. 7

1.2.2. Astaxanthin ................................................................................ 9

1.2.3. Caotenprotein ........................................................................... 11

1.2.4. Các ứng dụng astaxanthin: ...................................................... 13

1.3. Enzyme protease ....................................................................................... 15

1.3.1. Giới thiệu chung về enzyme protease ........................................ 15

1.3.2. Phân loại proease ..................................................................... 15

i

1.3.3. Tính chất chung của enzyme ................................................... 16

1.3.4. Yếu tố ảnh hưởng hoạt độ enzyme ............................................ 17

1.4. Quá trình thuỷ phân protein [4] ............................................................... 19

1.4.1. Khái niệm và bản chất của quá trình thuỷ phân protein: .......... 19

1.4.2. Các phương pháp thuỷ phân protein ......................................... 19

1.5. Các nghiên cứu tách chiết carotenoprotein trong và ngoài nước: ........ 21

1.5.1. Các nghiên cứu trong nước: ..................................................... 21

1.5.2. Các nghiên cứu ngoài nước: .................................................... 24

CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 27

2.1. Nguyên liệu cứu: ......................................................................................... 27

2.1.1. Đầu tôm: ......................................................................................... 27

2.1.2. Enzyme protease: ............................................................................ 27

2.1.3. Hoá chất ......................................................................................... 27

2.2. Dụng cụ và thiết bị ..................................................................................... 27

2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ..................................................... 29

2.3.1. Nội dung nghiên cứu ................................................................ 29

2.3.2. Bố trí thí nghiệm ...................................................................... 30

ii

Phế liệu đầu tôm trước khi được đưa vào thủy phân được xử lý theo thứ tự

trình bày trong hình 2.2 .............................................................................. 30

2.3.3. Phương pháp nghiên cứu: .......................................................... 37

2.3.4. Xử lý số liệu: ............................................................................. 37

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................... 38

3.1. Các thông số cơ bản của nguyên vật liệu dùng trong thí nghiệm .................. 38

3.1.1. Biến đổi số đơn vị hoạt tính enzyme .................................................. 38

3.1.2. Thành phần nguyên liệu ................................................................... 39

Bảng 3.2. Thành phần nguyên liệu đầu tôm P.monodon ...................................... 39

3.2. Điểm pI của dịch thuỷ phân ........................................................................... 40

3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thuỷ phân phế liệu đầu tôm bằng enzyme

prtotease Tegalase R660L ...................................................................................... 42

3.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thuỷ phân phế liệu đầu tôm bằng

enzyme protease Tegalase R660L ............................................................... 42

3.3.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng acid amin trong dịch thủy

phân và hiệu suất thu hồi acid amin ................................................................. 42

3.3.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng astaxanthin thu nhận trong

dịch thủy phân và hiệu suất thu hồi astaxanthin ............................................... 45

3.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme (số đơn vị hoạt độ enzyme) protease

Tegalase R660L đến quá trình thuỷ phân. ................................................. 48

iii

3.3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme (số đơn vị hoạt độ enzyme) protease

Tegalase R660L đến hàm lượng acid amin thu được trong dịch thủy phân và

hiệu suất thu hồi acid amin ............................................................................... 48

3.3.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme (số đơn vị hoạt độ enzym) đến hàm lượng

astaxanthin và hiệu suất thu hồi astaxanthin ........................................................ 52

3.3.3. Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thuỷ phân ............................. 57

3.3.3.1. Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng acid amin trong dịch thủy

phân .................................................................................................................. 57

3.4. Tối ưu hoá nhiệt độ và thời gian thuỷ phân phế liệu đầu tôm để thu sản phẩm

bột carotenoprotein ............................................................................................... 60

3.4.1. Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thuỷ phân .................... 61

3.4.2. Xác định chỉ tiêu tối ưu của quá trình thuỷ phân ................................ 61

3.4.3. Thiết lập phương trình hồi qui của hàm lượng acid amin AP và xác định

nhiệt dộ và thời gian tối ưu của quá trình thuỷ phân thu nhận carotenoprotein.

................ ........................................................................................................ 62

3.4.3.1 Thiết lập phương trình hồi qui và phân tích ảnh hưởng của nồng độ,

nhiệt độ và thời gian tới thu hồi hàm lượng acid amin .................................... 62

3.4.3.2. Thiết lập phương trình hồi qui và phân tích ảnh hưởng của nhiệt độ và

thời gian tới thu hồi astaxanthin. ..................................................................... 65

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................... 70

4.1. Kết luận .......................................................................................................... 70

iv

4.2. Kiến nghị ........................................................................................................ 70

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 73

PHỤ LỤC

v

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

C Nồng độ enzyme

Tg Thời gian

T Nhiệt độ

AP Hàm lượng acid amin

AsP Hàm lượng astaxanthin

EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1: Đặc tính của enzyme protease Tegalase R660L ............................. 27

Bảng 3.1. Thành phần nguyên liệu đầu tôm P.monodon (tính trên nguyên liệu khô) .................................................................................................................. 39

Bảng 3.2: Khoảng biến thiên của các yếu tố cần tối ưu khi thuỷ phân đầu tôm61

Bảng 3.3. Thông số nhiệt độ và thời gian tối ưu của quá trình thu nhận bột carotenoprotein ................................................................................................ 67

Bảng 3.4: Thành phần hóa học trong bột carotenoprotein .............................. 68

vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Sản lượng nuôi trồng và khai thác thuỷ sản Việt Nam ............................... 5

Hình 1.2. Cấu trúc hoá học của carotenoid ................................................................. 9

Hình 2.1. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 29

Hình 2.2. Chuẩn bị đầu tôm ...................................................................................... 30

Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thuỷ phân phế liệu đầu tôm. ............ 34

Hình 2.5. Bố trí thí nghiệm xác định nồng độ enzyme dùng thuỷ phân phế liệu đầu

tôm ............................................................................................................................. 36

Hình 3.3. Hàm lượng acid amin theo thời gian ở các nhiệt độ khác nhau. ............... 42

Hình 3.4. Hàm lượng acid amin của dịch thủy phân theo nhiệt độ ở thời gian thủy

phân là 6 giờ .............................................................................................................. 43

Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi acid amin theo thời gian ở các nhiệt độ

khác nhau................................................................................................................... 44

Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi protein ở các nhiệt độ thủy phân sau 6

giờ thủy phân ............................................................................................................. 44

Hình 3.7. Hàm lượng astaxanthin theo thời gian ở các nhiệt độ khác nhau ............ 46

................................................................................................................................... 46

Hình 3.8. Hàm lượng astaxanthin sau 6 giờ thủy phân ở các nhiệt độ khác nhau. ... 46

Hình 3.9. Hiệu suất thu hồi astaxanthin qua các thời gian thủy phân ở các nhiệt độ

khác nhau................................................................................................................... 47

vii

Hình 3.10. Hiệu suất thu hồi astaxanthin sau 6 giờ thủy phân ở các nhiệt độ khác

nhau. .......................................................................................................................... 47

Hình 3.11. Biểu đồ thể hiện hàm lượng astaxanthin và acid amin của dịch thuỷ phân

sau 6 giờ với hoạt độ enzyme là 20UI ở các nhiệt độ khác nhau. ............................. 48

Hình 3.12. Hàm lượng acid amin theo thời gian ở các các số đơn vị hoạt độ enzyme

khác nhau................................................................................................................... 49

Hình 3.13. Hàm lượng acid amin sau 6 giờ thuỷ phân theo các số đơn vị hoạt độ

enzyme khác nhau ..................................................................................................... 50

Hình 3.14. Hiệu suất thu hồi protein theo thời gian ở các các số đơn vị hoạt độ khác

nhau ........................................................................................................................... 51

Hình 3.15. Hiệu suất thu hồi protein sau 6 giờ thủy phân ........................................ 51

Hình 3.16. Hàm lượng astaxanthin theo thời gian ở các số đơn vị hoạt độ enzyme

khác nhau................................................................................................................... 53

Hình 3.17. Hàm lượng astaxanthin thu được trong bột nhão carotenoprotein từ dịch

thủy phân sau 6 giờ thủy phân ở các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau ............. 54

Hình 3.18. Hiệu suất thu hồi astaxanthin trong bột nahxo caroteinoprotein từ dịch

thủy phân ở các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau. ............................................. 55

Hình 3.19. Hiệu suất thu hồi astaxanthin trong bột nhão carotenoprotein từ dịch

thủy phân phân sau 6 giờ thủy phân ở các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau..... 55

Hình 3.20. Hàm lượng acid amin và astaxanthin của dịch thuỷ phân sau 6 giờ với các số đơn vị hoạt độ khác nhau, 550C ..................................................................... 56

viii

Hình 3.21. Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng acid amin thu được khi thủy phân ở 30UI và 550C ................................................................................................. 58

Hình 3.22. Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng astaxanthin thu được khi thủy phân ở 30UI và 550C ................................................................................................. 59

Hình 3.23. Bề mặt đáp ứng của hàm AP ở nồng độ C= 5% ..................................... 64

Hình 3.24. Bề mặt đáp ứng của hàm AsP ở nồng độ enzyme C= 5% ...................... 66

Hình 4.1. Quy trình thu nhận bột nahxo carotenoprotein ....................................... 72

ix

MỞ ĐẦU

ĐẶT VẤN ĐỀ

Astaxanthin được biết đến là một chất chống oxy hoá mạnh với năng lượng

chống oxy hoá gấp 10 lần so với ß- carotene và 500 lần so với vitamin E.[23].

Chính vì lý do này, hiện nay, chất màu này được sử dụng nhiều trong y học, thực

phẩm, mỹ phẩm và cả trong thức ăn thuỷ sản, đặc biệt là thức ăn cho cá hồi. Tính

đến hiện tại, astaxanthin chủ yếu được thu nhận từ tảo Haematococcus pluvialis và

nấm men Phaffia. Và những năm gần đây, lớp vỏ của các loài giáp sát được chú ý

đến trong các nghiên cứu chiết rút astaxanthin, đặc biệt là phế liệu đầu và vỏ tôm.

Ngày nay, ngành chế biến tôm đông lạnh xuất khẩu là một trong những

ngành kinh tế mũi nhọn, tạo ra nhiều công ăn việc làm và mang lại nhiều ngoại tệ

cho đất nước. Cùng với sự phát triển của nền kinh tế trong và ngoài nước, ngành

thủy sản trong những năm gần đây đã đạt được những thành tựu đáng kể về nuôi

trồng, chế biến cũng như xuất khẩu. Trong công nghệ chế biến thủy sản xuất khẩu

của Việt Nam, tỷ lệ các mặt hàng giáp xác đông lạnh chiếm từ 70 – 80% sản lượng

chế biến. Trong các mặt hàng xuất khẩu của nước ta thì mặt hàng tôm xuất khẩu

luôn chiếm tỷ lệ lớn, chiếm hơn 50% tổng kim ngạch xuất khẩu. Cùng với khối

lượng tôm xuất khẩu hằng năm thì phế thải liệu của nó bao gồm đầu và vỏ tôm

cũng khá lớn. Thông thường đầu tôm chiếm 25 – 40% so với khối lượng toàn cơ

thể thì cùng với lượng tôm xuất khẩu năm 2016 là 6.7 triệu tấn sẽ suy ra được lượng

phế liệu đầu tôm là 1 – 3 triệu tấn được thải ra trong quá trình chế biến. Trong phế

liệu đầu tôm chứa một lượng lớn protein, chitin, chất màu astaxanthin và một số

hợp chất sinh học khác. Tuy nhiên, hiện nay phế liệu đầu tôm chỉ được sử dụng chủ

yếu để làm thức ăn gia súc, một phần nhỏ để sản xuất chitin. Đây là một cách tận

thu phế liệu mang lại hiệu quả kinh tế nhưng không mang lại hiệu quả cao. Vì vậy,

cần thiết phải có nhiều nghiên cứu hơn nữa để tìm ra hướng sử dụng nguồn phế liệu

này hiệu quả hơn, mang lại lợi ích kinh tế, kỹ thuật và môi trường. Và hiện nay

cũng đã có nhiều nghiên cứu về việc chiết rút astaxanthin từ nguồn phế liệu tôm

bằng việc thuỷ phân bằng tác nhân hoá học hay trích ly astaxanthin bằng dung môi

1

....Tuy vậy, các tác nhân hoá học ảnh hưởng đến chất lượng màu của sản phẩm cũng

như không thể sử dụng làm thực phẩm cho người.

Đề tài “Nghiên cứu ứng dụng enzyme protease trong việc thuỷ phân phế

liệu tôm sú Penaeus monodon nhằm tận thu astaxanthin ở dạng bột

carotenprotein cho mục đích thực phẩm” được tiến hành với mong muốn nâng

cao hiệu suất thu được astaxanthin với sự có mặt của protein hoà tan để có thể

ứng dụng vào mỹ phẩm, thực phẩm.

MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU

Mục đích chung của đề tài này nhằm xác định các thông số của quá trình

thủy phân để nâng cao hiệu suất thu nhận carotenprotein cao nhất và bước đầu thăm

dò điều kiện thủy phân tối ưu dựa vào bề mặt đáp ứng.

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Để đạt được mục tiêu đề ra, chúng tôi thực hiện các bước nghiên cứu như

sau:

+ Khảo sát điểm pH có thể tủa carotenprotein nhiều nhất.

+ Khảo sát các điều kiện của quá trình thuỷ phân (nồng độ enzyme, nhiệt

độ và thời gian thủy phân).

+ Bước đầu tối ưu hóa nhiệt độ và thời gian thủy phân dựa vào bề mặt đáp

ứng.

+ Xác định các thông số của bột nhão carotenprotein: màu sắc, mùi, hàm

lượng astaxanthin.

2

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về phế liệu đầu tôm sú Penaeus monodon

1.1.1. Giới thiệu về tôm sú Penaeus monodon

Tôm sú (Tên Tiếng Anh: Giant/ Black Tiger Shrimp) được định loại là:

Ngành: Arthropoda – Ngành chân khớp

Lớp: Crusstacea – Lớp giáp xác

Bộ: Decaoda – Bộ mười chân

Họ chung: Penaeidea

Họ: Penaeus Fabricius

Giống: Penaeus

Loài: Monodon

Tên khoa học: Penaeus monodon Fabricius

Cấu tạo của tôm gồm 2 phần: phần đầu và phần thân. Hầu hết các cơ quan

nằm ở phần đầu ngực, phần thân chỉ có ruột và động mạch chủ, thịt tôm nằm gần

như hoàn toàn ở thân. Vỏ tôm thường được tạo thành từ nhiều lớp protein, khoáng,

lipid bao phủ khung chitin. Toàn bộ lớp vỏ này không sinh trưởng vì vậy tôm phải

lột xác từng thời kì sinh trưởng của bản thân. Dưới lớp vỏ là lớp biểu bì có vai trò

quan trọng trong việc lột xác bỏ lớp vỏ cũ và hình thành lớp vỏ mới của tôm. Kề

trong lớp biểu bì là lớp trung bì có chứa sắc tố chủ yếu là astaxanthin. Chính nhờ sự

biến đổi của sắc tố này mà ta có thể phân biệt được chất lượng tôm. Phần đầu

thường chiếm khoảng 35 – 45% trọng lượng, phần vỏ chiếm 10 – 15% trọng lượng.

Tỷ lệ các phần đầu, thân, vỏ luôn thay đổi phụ thuộc vào giống loài.

Vỏ tôm được cấu tạo từ một phức hợp chitin – protein liên kết với một số hợp

chất hữu cơ khác (astaxanthin, lipid), bị hóa cứng do kết hợp với canxi cacbonat.

Chitin là các loại polysaccharide phổ biến trong tự nhiên chỉ sau cellulose. Nó được

cấu tạo bởi các cầu nối 1,4 glucozit. Ngoài lớp màng sáp bao phủ bên ngoài lớp vỏ

epicuticle, lipid còn tồn tại dưới dạng phức chất sterol- protein chứa trong lớp

3

endocuticle. Bên cạnh các thành phần trên, trong phế liệu đầu và vỏ tôm chứa lượng

lớn protein. Protein trong vỏ tôm thường là loại protein không hòa tan, liên kết với lớp

vỏ chitin bởi liên kết cộng hóa trị bền vững tương tự như liên kết giữa các phân tử

amino acid với nhau trong phân tử protein. Do đó nó không bị tách ra khỏi vỏ tôm.

Thành phần trong vỏ tôm mà đề tài quan tâm nhất, đó là astaxanthin. Chất này có màu

xanh, và liên kết với protein, khi gia nhiệt, chúng chuyển thành carotenoprotein có màu

cam.

1.1.2. Phế liệu đầu tôm sú Penaeus monodon

Việt Nam nằm bên bờ Tây của Biển Đông, là một biển lớn của Thái Bình Dương, có diện tích khoảng 3.448.000 km2, có bờ biển dài 3260 km. Vùng nội thuỷ và lãnh hải rộng 226.000 km2, vùng biển đặc quyền kinh tế rộng hơn 1 triệu km2 với hơn 4.000 hòn đảo, tạo nên 12 vịnh, đầm phá với tổng diện tích 1.160km2 được che

chắn tốt dễ trú đậu tàu thuyền. Biển Việt Nam có tính đa dạng sinh học khá cao,

cũng là nơi phát sinh và phát tán của nhiều nhóm sinh vật biển vùng nhiệt đới ấn Độ

- Thái Bình Dương với chừng 11.000 loài sinh vật đã được phát hiện. Bên cạnh đó,

nước ta với hệ thống sông ngòi dày đặc và có đường biển dài rất thuận lợi phát triển

hoạt động khai thác và nuôi trồng thủy sản. Sản lượng thủy sản Việt Nam đã duy trì

tăng trưởng liên tục trong 17 năm qua với mức tăng bình quân là 9,07%/năm. Với

chủ trương thúc đẩy phát triển của chính phủ, hoạt động nuôi trồng thủy sản đã có

những bước phát triển mạnh, sản lượng liên tục tăng cao trong các năm qua, bình

quân đạt 12,77%/năm, đóng góp đáng kể vào tăng trưởng tổng sản lượng thủy sản

của cả nước. Trong khi đó, trước sự cạn kiệt dần của nguồn thủy sản tự nhiên và

trình độ của hoạt động khai thác đánh bắt chưa được cải thiện, sản lượng thủy sản từ

hoạt động khai thác tăng khá thấp trong các năm qua, với mức tăng bình quân

6,42%/năm [1].

4

Hình 1.1. Sản lượng nuôi trồng và khai thác thuỷ sản Việt Nam

Theo báo cáo của Tổng cục Thủy sản, tổng sản lượng thủy sản sản xuất năm

2016 đạt hơn 6,7 triệu tấn, tăng 2,5% so với năm 2015. Năm 2016, mặc dù tình hình

hạn mặn và dịch bệnh làm ảnh hưởng nhiều tới nuôi tôm nước lợ trong 9 tháng đầu

năm. Tuy nhiên, mưa nhiều trong những tháng cuối năm, độ mặn giảm...cùng với sự

chỉ đạo sát sao của các cấp trong việc kiểm soát dịch bệnh nên sản lượng thu hoạch

tăng vào những tháng cuối năm. Sản lượng tôm nước lợ cả nước ước đạt 650 nghìn

tấn. Tại các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, diện tích tốm sú ước đạt 569.500 ha,

sản lượng đạt 251 nghìn tấn. Diện tích tôm thẻ chân trắng ước đạt 64.440 ha, tăng

11,5% so với năm 2015, sản lượng ước đạt 253,1 nghìn tấn. Tính trên cả nước,

trong những năm gần đây, diện tích và sản lượng tôm nuôi không ngừng tăng, đến

năm 2015, diện tích nuôi tôm nước lợ đạt trên 700.000 ha với sản lượng trên

650.000 tấn. Bên cạnh diện tích nuôi trồng rộng lớn, số lượng doanh nghiệp tham

gia chế biến và xuất khẩu cũng không ngừng gia tăng. Trên cả nước có khoảng 160

doanh nghiệp tham gia chế biến, xuất khẩu tôm, tập trung chủ yếu ở Miền Trung,

Nam Trung Bộ (Khánh Hòa, Phú Yên, Ninh Thuận, Bà Rịa – Vũng Tàu…), Đồng

Bằng Sông Cửu Long (Long An, Tiền Giang, Bến Tre, Trà Vinh, Sóc Trăng, Cà

5

Mau, Kiên Giang), với tổng công suất chế biến đạt gần 1 triệu tấn sản phẩm/năm.

Cùng với sự phát triển của ngành thuỷ hải sản, một lượng lớn đầu và vỏ tôm được

thải ra môi trường, gây ô nhiễm môi trường. Tuy nhiên, đây lại là nguồn phế liệu

chứa nhiều thành phần mang giá trị kinh tế cao: protein, chintin, astaxanthin.... Phế

liệu tôm chủ yếu là đầu và mảnh vỏ, ngoài ra, còn có phần thịt vụn… tùy theo giống

loài và phương pháp chế biến mà lượng phế liệu tôm có thể vượt quá 60% sản

lượng tôm khai thác được. Ví dụ tôm càng xanh, phê liệu chiếm khoảng 60% khối

lượng toàn bộ, với tôm sú thì phế liệu chiếm 40% [1].

1.1.3. Tình hình xử lý đầu và vỏ tôm

Trước đây vấn đề xử lý phụ phế phẩm tôm từ các cơ sở chế biến, các công ty

gặp nhiều khó khăn, chủ yếu đem đỗ bỏ. Gần đây phụ phế phẩm tôm đã được dùng

làm thức ăn cho gia súc, góp phần làm giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Tuy nhiên

phương pháp này không đem lại hiệu quả kinh tế cao, việc làm thức ăn đòi hỏi phải

sấy mà quá trình này không làm giảm khoáng và chitin, 2 chất này gây khó tiêu cho

gia súc.

Vì vậy người ta hướng đến một giải pháp mới là sản xuất Chitin – Chitosan.

Chất Chitin- Chitosan chứa trong vỏ tôm là một loại nguyên liệu có thể ứng dụng

cho nhiều ngành kinh tế. Theo đó, phế liệu tôm được thu gom tại các cơ sở chế biến

đông lạnh, sau khi rửa sạch, sấy khô được đưa vào nồi phản ứng để loại bỏ muối vô

cơ (muối can xi, muối phốt pho) và các protein. Sản phẩm thu được từ công đoạn

này có tên là chitin; sau đó lại được đưa vào ngâm trong dung dịch kiềm khoảng 2

giờ sẽ cho ra một chất mới là Chitosan. Theo một số nhà khoa học, Chitosan có khả

năng khống chế sự gia tăng của tế bào ung thư; đã được ứng dụng rộng rãi và có

hiệu quả khá cao trong công nghệ bào chế dược phẩm (làm thuốc chữa bỏng

(phỏng), thuốc giảm đau, hạ cholesterol, thuốc chữa bệnh dạ dày, thuốc chữa chứng

đau xương khớp, chống viêm cấp trên mô lành...). Một số kết quả nghiên cứu của

các bác sĩ ở Bệnh viện K Hà Nội, Trường Đại học Y Hà Nội, Viện Hóa học những

năm gần đây đã chứng minh những tác dụng đó của chất Chitosan trong vỏ tôm. Và

trên thị trường dược phẩm hiện nay, loại thuốc chữa bệnh khớp làm từ vỏ tôm có tên

6

Glucosamin ngày càng được sử dụng rộng rãi do ít gây tác dụng phụ. Ngoài ra, chất

Chitosan cũng được ứng dụng trong một số ngành công nghiệp: hóa chất, mỹ phẩm,

xử lý nước thải...Các nhà nghiên cứu trên thế giới từ lâu đã quan tâm đến lĩnh vực

nghiên cứu sản xuất chitin – chitosan, protein và carotenoid từ phế liệu tôm bằng

nhiều phương pháp như phương pháp hóa học, phương pháp sinh học hay kết hợp

giữa phương pháp hóa học và sinh học.

Tuy nhiên, khi xử lý phế liệu tôm để thu chitin và chitosan thì sử dụng acid

và bazo sẽ phần nào gây ảnh hưởng môi trường, tăng chi phí xử lý nước thải nhưng

chỉ thu được một phần thành phần hoá học có giá trị kinh tế trong đầu tôm. Từ đó

đã có thêm nhiều nghiên cứu tách chiết carotenprotein trong qui trình sản xuất

chintin bằng HCl, HCOOH, thu protein, tách chiết astaxanthin bằng phương pháp

lên men lactic và enzyme nhằm nâng cao hiệu quả kinh tế.

1.2. Carotenprotein trong động vật thuỷ sản và một số phương pháp chiết

rút

1.2.1. Carotenoid

Carotenoid là nhóm hợp chất màu được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp

thực phẩm. Carotenoid tồn tại rộng rãi trong tự nhiên, tất cả chất màu của rau quả

đều là nguồn hợp chất màu tốt. Carotenoid được sử dụng trong công nghiệp được

tổng hợp bằng phương pháp hoá học, một lượng nhỏ được tách từ thực vật hoặc tảo.

Tất cả sinh vật quang hợp ( bao gồm tảo thực vật và khuẩn tảo lục) và một số vi

khuẩn không quang hợp và nấm tổng hợp carotenoid. Nhóm chất màu này tan trong

chất béo bao gồm hơn 700 hợp chất tạo ra màu đỏ, cam, vàng. Carotenoid là một

mạch hydrocabon dài gồm 40 nguyên tử cacbon và 2 vòng cuối [23].

Hai loại carotenoid được tìm thấy trong tự nhiên: ß – caroten, dẫn xuất oxy

hoá của caroten như là lutein, violaxanthin, neoanxanthin, và zeanxanthin, được biết

như là xanthophylls. Từ hàng trăm hợp chất carotenoid hiện diện trong tự nhiên, chỉ

50 có hoạt tính sinh học và chúng có thể được chia thành 2 nhóm, tiền vitamin A và

không tiền vitamn A. Vitamin A có vai trò quan trọng cho sự phát triển, duy trì một

7

loạt biểu mô, tái sản xuất hệ thống miễn dịch, và đặc biệt trong vòng tái sinh tế bào

tiếp nhận kích thích ánh sáng của thị giác. Carotenoid được biến đổi thành vitamin

A khi cơ thể cần. Tiền vitamin A được tìm thấy trong lá xanh đậm hoặc vàng cam.

Những màu tối hơn được liên kết với tiền vitamin này cao hơn.Từ những hợp chất

không enzyme, với vai trò chống oxy hoá, một số chất khoáng, vitamin, carotenoid,

và tannin có thể bị tách ra. Cả hai carotenoid là tiền vitamin A và không tiền

vitamin A, như là lutein, zeaxanthin, và lycopene, có tác động ngăn ngừa ung thư.

Từ những hợp chất có hoạt tính sinh học quan trọng này, sự ngăn chặn bệnh tật bị

tách ra nơi mà các gốc tự do đóng vai trò chủ chốt như trong bệnh xơ vữa động

mạch, đục thủy tnh thể, ...

Carotenoid là hợp chất kỵ nước, ưa dầu mỡ, không tan trong nước và tan

trong các dung môi như acetone, alcohol và chloroform. Bởi vì carotenoid là chất

màu tan trong chất béo phổ biến trong tự nhiên, chúng có ích bởi màu của chúng

[23]

8

Hình 1.2. Cấu trúc hoá học của carotenoid (a) xanthophylls; (A) zeaxanthin, (B) lutein,

(C) beta – cryptoxnthin, (D) astaxanthin; (b) Carotenes; (E) neurosporene, (F)

lycopene, (G) ß – carotene, (H) α – carotene [Reference: Britton et al]

1.2.2. Astaxanthin

Astaxanthin (3,3’ – dyhydroxy – ß – carotene – 4,4’ – dione) với công thức

hoá hoc là C40H52O4, là chất màu đỏ, làm thay đổi màu của tôm hồng, tôm hùm,

cua, các loài nhuyễn thể và giáp sát khác [28]. Ở nhiều loài động vật không xương

sống, đặc biệt là ở động vật giáp xác, màu sắc rực rỡ ở lớp mô phía ngoài, của máu,

9

trứng và cơ thịt dưới da là kết quả của sự tương tác giữa carotenoid với protein.

Loại carotenoid thường kết hợp với protein là ketocarotenoid, trong đó thường gặp

nhất là astaxanthin và các hợp chất có chứa gốc này. Astaxanthin có khung cấu tạo

gần giống ß – carotene nhưng tính chất hoá hoc lại khác nhau, nó có tính chống oxy

hoá mạnh hơn nhiều các chất chống oxy hoá khác như ß – caroten và thậm chí cả α

– tocopherol [21]. Astaxnthin là chất màu được tìm thấy ở động vật sống dưới nước,

như là tôm hùm, cua, tôm. Một sự quan tâm trong sử dụng astaxanthin cho nuôi

trồng cá và gia cầm được phát triển, chất màu này không tổng hợp bởi động vật và

phải cho thêm vào khẩu phần ăn nhằm mục đích có màu hấp dẫn để tiêu thụ.

Xanthophyll này có tính chống oxy hoá gấp 10 lần ß - carotene và 500 lần vitamin

E. Ngoài ra, chất màu này được xem là quan trong trong việc phòng ngừa và chữa

bệnh với đặc tính chống oxy hoá và chống lại gốc tự do. Trong sự sát nhập của

astaxnthin trong thức ăn cho nuôi trồng thuỷ hải sản là kết quả của sự tạo màu cho

cá hồi và loài giáp sát, vì vậy sự hiện diện của nó trong tôm, tôm hùm, cua và động

vật có vỏ xương ngoài. Trong tự nhiên, astaxanthin được tìm thấy nhiều ở tảo

Haematococus [20]. Astaxanthin tồn tại dưới 3 dạng: sterified, phân tử tự do, phân

tử phức tạp với protein, carotenoprotein. Protein này thường tồn tại ở loài giáp sát

[17]. Trong vỏ của loài giáp sát, lớp protein đan xen với lớp chitin nơi mà chúng

cùng tồn tại [29]. Trong tự nhiên, astaxanthin thường kết hợp với các phân tử khác

nhau. Nó thường tồn tại ở dạng phức chất với protein và tạo ra nhiều màu sắc ở

nhiều động thực vật khác nhau. Ví dụ, nó là chromophore trong sắc xanh biển, xanh

lá và vàng của tôm hùm. Có nhiều trường hợp, astaxanthin chỉ đơn giản hoà tan

trong dầu mỡ của các phân tử phức tạp như lipoprotein ở trứng, cũng có thể kết hợp

với các phân tử acid béo chẳng hạn bằng một liên kết hoá học thật sự và tạo thành

ester [15]. Đúng với bản chất màu của carotenoid, astaxanthin được sử dụng trong

công nghiệp thực phẩm, dược, mỹ phẩm, và công nghiệp thức ăn động vật. Ngoài

ra, chúng được sử dụng rộng rãi trong việc tạo màu, làm bền vững thực phẩm bởi vì

hoạt động của chúng như vitamin A và hoạt tính sinh học của chúng tốt cho sức

10

khoẻ, như là cũng cố hệ thống miễn dịch, giảm nguy cơ bệnh thoái hoá, đặc tính

chống oxy hoá

1.2.3. Carotenprotein

1.2.3.1. Sự tồn tại của carotenoprotein:

Trong các loài động vật biển không xương sống, ketocaroten thường tồn tại ở

dạng phức chất carotenoprotein. Phức chất này là sự kết hợp giữa caroenoid và

protein, lipo-protein hoặc glycoprotein. Mặt khác, carotenprotein kết hợp chặt chẽ

với các chất thuộc cấu trúc lớp da như: chitin, calcium cacbonate [8]. Sự tồn tại của

carotenoprotein là nguyên nhân thay đổi sự hấp thu quang phổ, do đó phức chất

thường có màu tía, màu lam, màu xanh lục, tương phản lại màu vàng và màu cam

của carotenoid ở dạng tự do. Nhóm keto của carotenoid thường là astaxanthin hoặc

cantaxanthin [27]. Carotenoprotein tồn tại 2 dạng chính: (1) carotenoid liên kết với

lipoprotein hoặc glycoprotein, (2) carotenoid liên kết với một protein hay một

glycoprotein. Phản ứng giữa các nhóm 4 và 4’ keto trong các vòng đầu mạch của

axtaxanthin với các nhóm chức của protein là điều kiện tiên quyết để hình thành

phức carotenoprotein giữa astaxanthin và protein.

1.2.3.2. Bản chất và tính chất chung của carotenoprotein

Bản chất của carotenoprotein

Qua một số protein thu được khi tinh chế carotenoprotein, người ta thấy

rằng, các protein có mặt trong phân tử này thuộc nhiều nhóm khác nhau.

Crustacyanin, loại protein màu xanh biển ở vỏ tôm hùm được tách ra sau khi loại

nhóm carotenoid dường như là một protein thuần tuý chỉ gồm các gốc amino acid

tạo thành. Ngoài ra, còn có cả thành phần carbonhydrate có chứa hexosamin và gốc

đường không chứa nhóm amino chiếm 4,8% trọng lượng phân tử [16].

Tính chất chung của carotenoprotein

Carotenoid và carotenoprotein, cả hai dều được xem là chất màu tự nhiên và

có hoạt tính sinh học như: chống oxy hoá, kháng khuẩn [26]. Phức hợp

carotenoprotein tan trong nước và có tính bền vững. Trong một vài trường hợp, màu

11

sắc của nó bền đến về năm trong không khí ở điều kiện nhiệt độ phòng. Các

carotenoid liên kết với protein ít bị oxy hoá hơn so với chúng ở dạng tự do.

Carotenoid ở dạng tự do có màu vàng, cam hoặc đỏ. Tuy nhiên, trong cơ thể những

loài động vật biển không xương sống, các phức hợp carotenorotein tạo nên nhiều

màu khác nhau như: xanh lá cây, xanh dương và tía. Trong các loài giáp xác thuỷ

sản có chứa 3 loại crustacyanine là α,ß vàγ- crustacyanine. Cả 3 loại này đều có

astaxanthin và ở dạng nhóm liên kết. Trong đó, astaxanthin thường liên kết với các

phân tử protein tạo thành phức hợp α- crustacyanin, hấp thụ cực đại ở bước sóng

(λmax = 628 nm), có màu xanh đen đặc trưng thường thấy ở các loài thuỷ sản sống.

Dưới tác dụng của nhiệt, liên kết trên bị phá huỷ và giải phóng astaxanthin tự do có

màu đỏ cam (λmax = 480 nm).

Cấu trúc của carotenoid cũng quyết định các chức năng sinh học của chúng,

trong đó phần lớn các carotenoid có mạch 40 carbon liên kết với các nhóm chức

chứa oxy khác nhau. Trong phế liệu tôm, carotenoid chủ yếu là astaxanthin (trên

95%), thuộc nhóm chất tetraterpenoid, là sắc tố màu đỏ cam. Tương tự như

carotenoid khác, nó có tính phân cực thấp và tan tốt trong dầu mỡ [9].

1.2.3.3. Một số phương pháp chiết rút carotenoprotein từ phế liệu chế biến

động vật giáp xác

Phế liệu chế biến các loài giáp xác như tôm, cua, ghẹ, tôm hùm thường bao

gồm một số thành phần như: các muối kim loại (15 – 35%), protein (25 – 50%),

chitin (25 – 35%), lipid và chất màu. Đã có rất nhiều nghiên cứu của các tác giả

khác nhau về thành phần carotenoid và carotenoprotein trong nguồn phế liệu này.

Chất chủ yếu tạo nên màu của tôm cua là astaxanthin ở dạng tự do hay ester hoá với

hàm lượng thường dao động trong khoảng 119 và 148 μg/g, ngoài ra còn có một

lượng nhỏ các chất màu khác như lutein, zeaxanthin và astacene [25].

Hiện nay, xu hướng làm thế nào có thể sử dụng chất màu này đang được

các chuyên gia quan tâm, chủ yếu là astaxanthin đang bị bỏ phí trong phế liệu chế

biến. Các số liệu đã được công bố đã chứng tỏ, hàm lượng chất màu trong phế liệu

này thường thấp, ví dụ astaxanthin thường tồn tại với lượng nhỏ hơn 1000 μg/g

12

nguyên liệu thô. Điều này cũng cho thấy, để thu được lượng màu đáng kể thì cần

một lượng lớn phế liệu. Vì vậy, trong sản xuất thức ăn cho động vật, người ta

thường bổ sung phế phẩm này. Tuy nhiên, phương pháp này không đạt hiệu quả cao

và không thể áp dụng cho người cần bổ sung astaxanthin vào chế độ ăn. Bên cạnh

đó, quá trình sấy khô phế liệu với tác nhân nhiệt tác động mạnh mẽ lên chất màu

này, chúng sẽ bị biến đổi do quá trình oxy hoá. Cùng với đó, việc còn tồn tại chitin

và tro trong phế liệu rất cao sẽ làm cá khó tiêu hoá, do đó, việc bổ sung phế phẩm

này vào thức ăn cho cá cần phải được xem xét kỹ lưỡng.

Nhiều công trình đã nghiên cứu nhằm khắc phục nhược điểm trên khi bổ

sung nguyên phế phẩm. Một trong những hướng thử nghiệm là ủ chua, tức là xử lý

phế liệu bằng acid hữu cơ hoặc vô cơ, việc này có thể giúp ngăn cản việc xâm nhập

của vi sinh vật và tách màu được tốt hơn. Bên cạnh đó, có một số nghiên cứu chiết

rút carotenoid trong dung môi chất béo như: dầu dừa, dầu đậu nành, hướng dương,

dầu cọ...Ngoài ra, trên thế giới cũng đã có những nghiên cứu ứng dụng enzyme

thương mại vào việc tách chiết astaxanthin.

Từ những dẫn chứng trên cho thấy, carotenoprotein là một chất có tiềm năng

trong việc sử dụng làm thực phẩm chức năng cho người và trong chăn nuôi, đặc biệt

là carotenoprotein chiết rút từ động vật giáp sát giàu astaxanthin ở dạng bền vững.

Sản phẩm này không chỉ mang lai lợi ích cho con người về sức khoẻ mà ngay cả về

kinh tế. Bên cạnh đó, việc tách chiết astaxanthin từ nguồn phế liệu đầu tôm cũng

phần nào giải quyết được vấn đề chất thải rắn và tạo ra giá trị gia tăng.

1.2.4. Các ứng dụng astaxanthin:

1.2.4.1. Ứng dụng trong y khoa:

Chất chống oxy hoá mạnh: tác dụng của astaxanthin đã được chứng minh có

khả năng tăng cường lưu lượng máu, giảm các stress oxy hóa ở những người nghiện

thuốc lá và người thừa cân, béo phì. Một nghiên cứu so sánh giữa astaxanthin và các

carotenoid khác đã chỉ ra rằng hợp chất này cho thấy hoạt tính chống oxy hóa rất

mạnh chống lại các các gốc tự do [11].

13

Giảm nguy cơ mắc ung thư: do đặc tính chống oxy hóa mạnh, người ta đã

tiến hành rất nhiều nghiên cứu về tác dụng của astaxanthin trong điều trị nhiều loại

ung thư. Theo một nghiên cứu, astaxanthin có lợi ích cả trong thời gian ngắn và lâu

dài đối với bệnh ung thư vú, bao gồm việc ức chế sự tăng sinh của các tế bào ung

thư [11].

Tốt cho tim mạch: các nhà khoa học cũng đồng thời thực hiện những nghiên

cứu về tác dụng của astaxanthin đối với sức khỏe tim mạch. Một nghiên cứu vào

năm 2006 đã đánh giá hiệu quả của astaxanthin trên chuột mắc chứng cao huyết áp,

kết quả cho thấy astaxanthin giúp cải thiện mức elastin và độ dày của thành động

mạch. Người ta còn cho rằng astaxanthin có thể giúp phòng các bệnh lý tim mạch

và hạ cholesterol máu, tuy nhiên vẫn chưa có đủ bằng chứng để xác nhận những ý

kiến trên [11].

Chữa bệnh đau khớp: astaxanthin trong tương lai có thể trở thành một liệu

pháp đầy hứa hẹn trong điều trị chứng đau khớp như trong bệnh viêm khớp dạng

thấp (đây là một căn bệnh có ảnh hưởng đến 1 trong tổng số 5 người Mỹ) và hội

chứng ống cổ tay. Tuy nhiên, ý kiến này vẫn còn gây nhiều tranh cãi. Một số nghiên

cứu đã chỉ ra rằng astaxanthin có thể giúp giảm các triệu chứng đau và sưng viêm

trong bệnh viêm khớp [11].

1.2.4.2. Ứng dụng trong thức ăn nuôi trồng thuỷ hải sản

Ngăn ngừa Hội chứng màu xanh ở tôm: một nghiên cứu đã chỉ ra, khi bổ

sung Astaxanthin với lượng 50 ppm cho tôm bị “Hội chứng màu xanh” sau 4 tuần

thì tôm trở lại màu sắc bình thường của chúng. Khi phân tích mô từ các nhóm thử

nghiệm xác nhận rằng với những con tôm bị bệnh được bổ sung Astaxanthin, hàm

lượng Carotenoid tăng 318%; nhóm còn lại không bổ sung Astaxanthin, chỉ dùng

thức ăn thị trường thì sự gia tăng Carotenoid chỉ có 14% và vẫn có “màu xanh” [6].

Nâng cao tỷ lệ sống của tôm: bổ sung Astaxanthin với lượng 100 ppm sẽ làm

tăng tỷ lệ sống của ấu trùng tôm lên 91% sau 4 - 8 tuần. Bổ sung 2% nguồn

Carotenoids bằng ớt bột với thức ăn tươi cũng giúp cải thiện đáng kể tỷ lệ sống của

14

ấu trùng Zoea 2. Bổ sung Astaxanthin ở mức 50 mg/kg thức ăn giúp tăng sản lượng

trứng ở tôm sú. Với 150 ppm Astaxanthin cho tôm bố mẹ, cải thiện đáng kể chất

lượng Nauplii và tỷ lệ sống Zoea [6].

1.3. Enzyme protease

1.3.1. Giới thiệu chung về enzyme protease

Enzyme protease thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho các quá trình thỷ phân

các liên kết peptide (-CO – NH - ) của phân tử protein và peptid thành các acid

amin tự do, một ít peptid ngắn, pepton. Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất

đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phâ bố rất

rộng rãi trên nhiều đối tương từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật

(đu đủ, dứa) và động vật (gan, dạ dày bê...). So với protease động vật và thực vật,

protesae vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật

là một hệ thống rất phức tạp bao gồm những enzyme rất giống nhau về cấu trúc,

khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách dưới dạng tinh thể đồng nhất [4].

1.3.2. Phân loại proease

Protease được chia thành 2 loại: endopeptidase và exopeptidase. Dựa vào vị trí

tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân thành 2 loại:

+ Aminopeptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptide ở đầu N tự do của

chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một

tripeptide.

+ Carboxypeptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi

polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.

Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành 4

nhóm:

+ Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine

trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc

tác của enzyme. Nhóm này bao gồm 2 nhóm nhỏ: chymotrysin và subtilisin. Nhóm

15

chymotrysin bao gồm enzyme động vật như: chymotrysin, trypsin, elastase. Nhóm

subtilisin bao gồm 2 loại enzyme vi khuẩn: subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN. Các

serineproteinase thường hoạt động ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ

chất tương đối rộng.

+ Cysteine protease: các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt

động. Cystein proteinase bao gồm proteinase thực vật như papayin, bromelin, một

vài rotein động vật và proteinase ký sinh chung. Các cystein proteinase thường hoạt

động vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.

+ Aspartic proteinase: hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin.

Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hoá như: pepsin, chymosin, cathepepsin,

renin. Các asparrticproteinase có chứa nhóm cacboxyl trong trung tâm hoạt động và

thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.

+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở

vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase

thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt động giảm mạnh dưới tác dụng của

EDTA.

Ngoài ra, proteinase được phân loại một cách đơn giản thành 3 nhóm:

+ Protease acid: pH 2 – 4

+ Protease trung tính: pH 7 – 8

+ Protease kiềm: pH 9 – 11

1.3.3. Tính chất chung của enzyme

Enzyme tan trong nước, khi tan tạo thành dung dịch keo [5].

Chúng cũng tan trong dung dịch muối loãng, glycerin và các dung môi hữu

cơ có cực khác [5].

Enzyme không bền và dễ dàng bị biến tính dưới tác dụng của nhiệt độ cao,

enzyme bị biến tính thì mất khả năng xúc tác [5].

16

1.3.4. Yếu tố ảnh hưởng hoạt độ enzyme

1.3.4.1. Ảnh hưởng của nông độ enzyme: Khi thừa cơ chất thì nồng độ

enzyme tăng, vận tốc tăng. Khi nồng độ enzyme bão hoà với nồng độ cơ chất thì

nồng độ enzyme tăng, vận tốc không thay đổi [3].

1.3.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ:

Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme. Tốc độ phản ứng enzyme

không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Tốc độ phản ứng chỉ

tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vượt quá nhiệt độ đó, tốc độ phản ứng

enzyme sẽ giảm và dẫn đến mức triệt tiêu. Nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng

enzyme cao nhất gọi là nhiệt độ tối ưu. Phần lớn enzyme hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 40 – 500C. Nhiệt độ tối ưu của các enzyme khác nhau hoàn toàn. Một số enzyme khác có nhiệt độ phản ứng tối ưu ở 600C, một số khác có nhiệt độ tối ưu ở 00C, thậm chí có một số enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis lại hoạt động mạnh ở 900C [3].

Nếu đưa nhiệt độ cao hơn mức nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm. Khi đó enzyme không có khả năng phục hồi lại hoạt tính. Ngược lại, ở nhiệt độ 00C

enzyme bị hạn chế hoạt động rất mạnh, nhưng khi đưa nhiệt độ lên từ từ hoạt tính

enzyme sẽ tăng dần đều đến mức tối ưu. Nhiệt độ tối ưu của một enzyme phụ thuộc

rất nhiều vào sự có mặt của cơ chất, kim loại, pH, các chất bảo vệ. Khi nhiệt độ cao

thường gây cho enzyme mất hoạt tính. Phản ứng vô hoạt enzyme dưới tác dụng của

nhiệt độ thường biểu diễn thứ bậc một.

1.3.4.3. Ảnh hưởng của pH đến phản ứng enzyme:

pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hoá cơ chất, enzyme và

đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh

đến phản ứng của enzyme. Nhiều enzyme hoạt động rất mạnh ở pH trung tính. Tuy

nhiên, cũng có nhiều enzyme hoạt động ở pH acid yếu. Một số khác lại hoạt đông ở

pH kiềm và cả pH acid. Người ta thường sử dụng ảnh hưởng của pH để điều hoà

17

phản ứng trong bảo quản, chế biến lương thực, thực phẩm, trong tuyển chọn giống

vi sinh vật...[3].

1.3.4.4. Ảnh hưởng của chất kìm hãm

Các chất kìm hãm hoạt đông của enzyme thường là các chất có mặt trong các

phản ứng enzyme, làm giả hoạt tính enzyme nhưng lại không bị enzyme làm thay

đổi tính chất hoá học, cấu tạo hoá học và tính chất vật lý của chúng. Các chất kìm

hãm hoạt động của các enzyme bao gồm các ion, các phần tử vô cơ, các chất hữu cơ

và cả protein. Các chất kìm hãm có ý nghĩa rất lớn trong điều khiển các quá trình

trao đổi ở tế bào vi sinh vật. Cơ chế kìm hãm của các chất kìm hãm có thể là thuận

nghịch hoặc không thuận nghịch. Trong trường hợp các chất kìm hãm thuận nghịch,

phản ứng giữa enzyme và các chất kìm hãm sẽ nhanh chóng đạt được trạng thái cân

bằng [3].

Chất kìm hãm cạnh tranh: Các chất kìm hãm cạnh tranh là những chất có cấu

trúc tương tự như cấu trúc của cơ chất. Chúng thường là những chất kìm hãm thuận

nghịch. Chúng có khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzyme. Khi đó,

chúng sẽ chiếm vị trí của cơ chất trong trung tâm hoạt động. Nếu chất kìm hãm đã

chiếm được vị trí của cơ chất trong trung tâm hoạt động thì cơ chất sẽ không còn cơ

hội tiếp cận trung tâm này. Cơ chế loại trừ lẫn nhau của chất kìm hãm và trung tâm

hoạt động làm giảm số lượng các enzyme kết hợp với cơ chất. Kết quả hoạt động

của enzyme sẽ giảm [3].

Vì có cấu trúc không gian giống nhau, nên các chất cạnh tranh và cơ chất đều

có xu hướng chiếm vị trí trong trung tâm hoạt động. Vận tốc phản ứng lúc này phụ

thuộc vào hai yếu tố [3]:

 Phụ thuộc vào nồng độ cơ chất và nồng độ chất cạnh tranh

 Phụ thuộc vào ái lực giữa cơ chất và chất cạnh tranh với ezyme.

Chất kìm hãm không cạnh tranh: Nếu như trong cơ chế kìm hãm cạnh tranh,

các chất kìm hãm chiếm trung tâm hoạt động của enzyme thì trong cơ chế kìm hãm

không cạnh tranh, chất kìm hãm không chiếm trung tâm hoạt động của enzyme mà

18

là vị trí ngoài trung tâm hoạt động của enzyme. Kết quả sự kết hợp này, chất kìm

hãm làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme theo chiều hướng bất lợi

cho hoạt động xúc tác. Vì thế, các chất kì hãm làm giảm hoạt động của enzyme.

1.3.4.5. Ảnh hưởng của chất hoạt hoá:

Các chất có tác dụng làm tăng hoạt tính enzyme gọi là chất hoạt hoá enzyme.

Các chất hoạt hoá enzyme có bản chất hoá học rất khác nhau. Chúng có thể là

những anion, các ion kim loại từ ô thứ 11 đến ô thứ 55 trong bảng tuần hoàn, các

chất hữu cơ có cấu trúc phức tạp. Các chất hoạt hoá chỉ có tác dụng hoạt hoá ở một

nồng độ nhất định. Vượt quá nồng độ chúng sẽ gây ức chế hoạt động của enzyme

[3].

1.4. Quá trình thuỷ phân protein

1.4.1. Khái niệm và bản chất của quá trình thuỷ phân protein:

Khái niệm: thuỷ phân được định nghĩa là sự phản ứng với nước. Nó là một

quá trình hoá học, cái mà phân tử bị cắt thành 2 phần bởi sự tham gia một phân tử nước. Một phân tử nhận một một ion H+ từ nước, nhóm khác thu nhận nhóm

hydroxyl [4].

Bản chất: Bản chất của quá trình thủy phân protein: là quá trình phá vỡ các

liên kết peptide khi có mặt của nước. Do liên kết peptide là liên kết bền, nên quá

trình thủy phân cần có mặt chất xúc tác. Các tác nhân xúc tác gồm:

+ Tác nhân hóa học: acid (HCl) hay base (NaOH)

+ Tác nhân hóa sinh học: enzyme thủy phân protein (protease)

1.4.2. Các phương pháp thuỷ phân protein

1.4.2.1. Phương pháp hoá học:

Đây là phương pháp thủy phân protein dưới xúc tác của acid mạnh (HCl,

H2SO4) hay kiềm mạnh (NaOH) ở nhiệt độ cao để cắt đứt các liên kết peptide. Quá

trình này cắt đứt tất cả các liên kết peptide trong protein cơ chất, đồng thời phá hủy

một số acid amine [4].

19

+ Phương pháp acid

Dùng HCl ở nồng độ 6 – 10N, nhiệt độ (100 – 1800C), thời gian thủy phân từ

24 – 48 giờ. Sau quá trình thủy phân, dung dịch được trung hòa đến pH về 6,5 – 7.

Ưu điểm của phương pháp này có thể nói đến là thời gian diễn ra thủy phân ngắn,

pH thấp có thể ngăn cản sự xâm nhập của vi sinh vật. Tuy nhiên, phương pháp này

vẫn tồn tại các khuyết điểm. Do sử dụng acid nồng độ cao và nhiệt độ thủy phân cao

nên một số acid amine bị phá hủy. Tryptophan bị phá hủy hoàn toàn, các acid amine

như serine và threonine bị phá hủy một phần. Asparagine, glutamine bị chuyển

thành dạng acid, hầu hết các vitamin bị phá hủy.

Bên cạnh đó, muối được hình thành trong quá trình trung hòa nên kết quả là

sản phẩm có hàm lượng muối đáng kể. Ngoài ra, chi phí năng lượng và thiết bị cao

do phải chịu nhiệt và chống acid ăn mòn, bên cạnh đó,mức độ độc hại cao và gây ô

nhiễm môi trường, có thể sinh ra độc tố 3-MCPD, 1,3-DCP. Thực tế, phương pháp

này được sử dụng nhiều vì thời gian thủy phân nhanh, hiệu suất cao từ 85 – 90%,

mùi vị sản phẩm ngọt và thơm ngon.

+ Phương pháp kiềm

Sử dụng NaOH nồng độ từ 4 – 8N, nhiệt độ 100 – 1100C, thời gian 24 –

48 giờ. Đối với phương pháp này, tryptophan được bảo toàn nhưng xảy ra hiện

tượng racemic hóa làm giảm giá trị dinh dưỡng, tạo lysineolanine làm giảm

lysine trong thành phần nên phương pháp này ít sử dụng trong công nghiệp.

1.4.2.2. Phương pháp hóa sinh học

+ Phương pháp vi sinh

Đây là quá trình thủy phân protein nhờ xúc tác enzyme từ vi sinh vật. Các

enzyme này có thể được tạo ra từ việc nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường riêng

sau đó được đưa vào nguyên liệu giàu đạm như trong sản xuất nước tương hoặc tận

dụng các enzyme có sẵn trong nguyên liệu ban đầu như sản xuất nước mắm. Thành

phần thu được trong dung dịch bao gồm cả protein, pepton, peptide và acid amine

[4].

20

+ Phương pháp enzyme

Đây là phương pháp thủy phân protein trong điều kiện ôn hòa không yêu cầu nhiệt độ cao (thường 40 – 500C). Sử dụng nguồn enzyme từ các chế phẩm enzyme

thương mại, có thể kết hợp nhiều loại enzyme với nhau để tăng hiệu suất thủy phân

như: protease, cellulase, amylase. Phương pháp này hạn chế sử dụng hóa chất nên ít

làm biến đổi acid amine, sản phẩm an toàn và giá trị dinh dưỡng không giảm nhiều,

hiệu suất tối đa đạt 70%. Không giống như phương pháp acid, enzyme thủy phân

liên kết peptide thường có tính đặc hiệu. Ví dụ: papain sẽ cắt liên kết peptide trong

chuỗi gần kề với arginine, lysine và phenylalanine; pepsin cắt các chuỗi có

phenylalanine hoặc leucine tham gia liên kết. Bên cạnh những ưu điểm kể trên,

phương pháp này vẫn tồn tại khuyết điểm, đó là thời gian thủy phân kéo dài [4].

Trong phương pháp này, enzyme protease đóng vai trò thủy phân chính.

Chúng phân cắt các liên kết peptide theo hai cách (exopeptidase và endopeptidase).

Vì vậy, tùy theo yêu cầu sản phẩm cuối cùng, mà có thể lựa chọn enzyme phù hợp

[4].

Từ những mô tả của các phương pháp thủy phân trên, một nhận xét có thể

được đưa ra là phương pháp thủy phân bằng tác nhân hóa học chỉ có thể rút ngắn

thời gian thủy phân, nhưng lại làm ảnh hưởng rất nhiều đến chất lượng dịch thủy

phân. Trái ngược lại, phương pháp thủy phân bằng tác nhân sinh học chỉ có mỗi

khuyết điểm là thời gian thủy phân kéo dài, nhưng lại ít làm biến đổi thành phần

hóa học dịch thủy phân, điều kiện thủy phân ôn hòa, dễ xảy ra. Vì vậy có thể nói

phương pháp thủy phân bằng enzyme cho ra sản phẩm an toàn và đảm bảo được

giá trị dinh dưỡng.

1.5. Các nghiên cứu tách chiết carotenoprotein trong và ngoài nước:

1.5.1. Các nghiên cứu trong nước:

a) Nghiên cứu tách chiết và ứng dụng enzyme protease từ tôm sú Penaeus

monodon vào chế biến thuỷ sản _ TS. Nguyễn Lệ Hà[12]

21

Trong nghiên cứu này, hỗn hợp đầu và vỏ tôm xay nhỏ 2 -5 mm được thuỷ

phân bằng chế phẩm enzyme protease tôm sú trong môi trường Na2 – EDTA với các

thông số ban đầu: tỉ lệ phế liệu: dung dịch Na2 – EDTA 0.5M pH 7 là 1:3, lượng

muối ăn bổ sung 1%, dịch thuỷ phân được khuấy trộn đều sau mỗi nửa giờ.

Quá trình thuỷ phân phế liệu đầu và vỏ tôm được thực hiện với enzyme CPE

(được thu nhận từ đầu hoặc nội tạng tôm sú) với ba nồng độ 2; 3,5 và 5% ở các nhiệt độ 40, 50 ,60 và 65oC theo thời gian 0; 3; 6; 9;12;15 giờ. Và kết quả thu được là thuỷ phân đầu tôm ở nhiệt độ 53oC, thời gian 10 giờ ở nồng độ CPE 4,5% sẽ thu

nhận carotenprotein với hàm lượng carotenoid là 0,7056mg/g.

b) Trích carotenoprotein từ đầu tôm sử dụng acid vô cơ và acid hữu cơ _

Phạm Thị Đa Phượng, Nguyễn Công Minh, Nguyễn Thị Như Thường, Ngyễn Văn

Hoà, Anil Kumar Anal, Trang Sĩ Trung.[8]

Trong nghiên cứu này, các tác giả sử dụng HCl và HCOOH để làm tác nhân

thuỷ phân. Đầu tiên, đầu tôm xay nhỏ được thuỷ phân với HCl ở các nồng độ khác

nhau: 0,0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5% trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó, mẫu được

thuỷ phân bằng cách cho HCCOH 0.3% trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng.

Thí nghiệm thứ hai để xác định thừi gian thuỷ phân. Mẫu được thuỷ phân với

nồng độ được xác định ở thí nghiệm 1 trong thời gian 1; 2; 3; 4; và 5 giờ ở nhiệt độ

phòng. Sau đó, mẫu được thêm HCOOH 0.3% trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng.

Thí nghiệm thứ ba để xác định nồng độ HCCOH. Mẫu đầu tôm xay nhỏ

được thuỷ phân ở nhiệt độ phòng. Dịch thu được từ nồng độ và thời gian thuỷ

phân tối ưu từ thí nghiệm 1 và 2, mẫu được thuỷ phân với HCCOH ở các nồng

độ khác nhau: 0,0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 và 1% trong 2 giờ ở nhiệt độ thường.

Thí nghiệm bốn xác định thời gian thuỷ phân với HCOOH. Đầu tôm xay nhỏ

được thuỷ phân ở nhiệt độ thường với nồng độ tối ưu thu được từ thí nghiệm 3 ở các

thười gian khác nhau: 1; 2; 3; 4; 5 giờ ở nhiệt độ phòng.

22

Kết quả thu được: điều kiện tối ưu để thuỷ phân thu carotenoprotein từ đầu

tôm là HCl 2% trong 1 giờ và sau đó thêm vào HCOOH 4% trong 2 giờ ở nhiệt độ

phòng. Với điều kiện thủy phân này, lượng carotenoid thu được là 473,9 ppm.

c) Chiết rút chế phẩm đạm giàu carotenoid từ đầu tôm thẻ chân trắng _

Phạm Thị Đan Phượng, Trần Thị Luyến. Tạp chí Khoa học – Công nghệ thuỷ sản

số 1/2013 [10]

Đạm giàu carotenoid được thu nhận bằng cách thuỷ phân dùng kết hợp 2

enzyme: Alcalase và Flavourzyme. Trong nghiên cứu này, đầu tôm được thuỷ phân

tuần tự bằng enzyme Alcalase trước và Flavourzyme. Nguyên liệu được thủy phân

bằng enzyme Alcalase với các nồng độ khác nhau từ 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4% (w/w: khối lượng enzyme trên khối lượng đầu tôm) ở nhiệt độ 550C trong bể ổn nhiệt lắc

đảo, thời gian là 2 giờ, ở pH tự nhiên (pH = 6,9) để xác định tỷ lệ Alcalase/nguyên

liệu thích hợp. Để xác định ảnh hưởng của thời gian thủy phân, nguyên liệu được

thủy phân bằng Alcalase với tỷ lệ Alcalase thích hợp đã được xác định ở thí nghiệm trên, ủ mẫu ở nhiệt độ 550C trong bể ổn nhiệt lắc đảo, thời gian thực hiện thí nghiệm là 1; 2; 3; 4; 5 giờ. Bất hoạt enzyme Alcalase ở nhiệt độ 850C trong thời gian 15 phút, sau đó làm nguội đến nhiệt độ 550C, tiếp tục thủy phân mẫu thí nghiệm bằng Flavourzyme 0,2% (w/w) trong bể ổn nhiệt lắc đảo ở 550C trong 2 giờ.

Sau khi thủy phân bằng Alcalase ở điều kiện thích hợp đã xác định, nguyên

liệu được tiếp tục thủy phân bằng Flavourzyme với các tỷ lệ khác nhau từ 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4% (w/w) ở 550C trong 2 giờ để xác định tỷ lệ Flavourzyme/nguyên liệu

thích hợp. Để xác định thời gian xử lý bằng Flavourzyme thích hợp, mẫu xử lý được

xử lý bằng Flavourzyme với nồng độ thích hợp đã được xác định ở các khoảng thời gian khác nhau: 1; 2; 3; 4; 5 giờ ở 550C. Sau khi thủy phân tiến hành ép để tách riêng

phần dịch thu hồi chế phẩm đạm giàu carotenoid bằng phương pháp điểm đẳng điện

kết hợp xử lý nhiệt có bổ sung chitosan theo Trang Sĩ Trung và cộng sự (2008). Cụ

thể: dịch thủy phân chứa đạm giàu carotenoid được điều chỉnh pH về pH 4,3 - 4,5 bằng HCl 10% để kết tủa protein sau đó kết hợp gia nhiệt ở nhiệt độ 700C trong thời

gian 10 phút và bổ sung chitosan ở nồng độ 100ppm. Việc chọn chế độ xử lý tối ưu

23

dựa trên hiệu suất thu hồi chế phẩm đạm giàu carotenoid và hàm lượng protein và

carotenoid chứa trong chế phẩm đạm giàu carotenoid.

Chế phẩm đạm giàu carotenoid có thể chiết rút từ đầu tôm bằng việc xử lý

kết hợp Alcalase và Flavourzyme ở điều kiện chiết rút thích hợp như sau: nhiệt độ 550C, pH tự nhiên, xử lý bằng Alcalase trước: tỷ lệ Alcalase/đầu tôm là 0,2% (v/w)

trong 2 giờ; tiếp tục xử lý bằng enzyme Flavourzyme: tỷ lệ Flavourzyme/đầu tôm là

0,1% (w/w) trong 1 giờ để thu hồi chế phẩm đạm giàu carotenoid với hàm lượng

protein và carotenoid cao. Hàm lượng carotenoid có trong bột carotenprotein thu

được khi thủy phân phế liệu tôm ở điều kiện tối ưu này là 365,5 mg/kg.

d) Tối ưu hoá quá trình trích ly astaxanthin từ vỏ tôm bằng dầu thực vật _ Lê

Thị Thuỳ Nga [7]

Điều kiện tối ưu để trích ly astaxanthin từ vỏ tôm sú đối với dung môi dầu mè là nhiệt độ: 92,2oC, thời gian: 169 phút, tỉ lệ dung môi : mẫu là 2,54:1; với

lượng astaxanthin tối ưu trích ly đạt được là 39,82. Điều kiện tối ưu để trích ly astaxanthin từ vỏ tôm sú đối với dung môi dầu nành là nhiệt độ: 92,2oC, thời gian:

169 phút, tỉ lệ dung môi : mẫu là 2,56:1; với lượng astaxanthin tối ưu trích ly đạt

được là 41. Điều kiện tối ưu để trích ly astaxanthin từ vỏ tôm sú đối với dung môi dầu cải là nhiệt độ: 92,2oC, thời gian: 169 phút, tỉ lệ dung môi : mẫu là 2,5:1; với

lượng astaxanthin tối ưu trích ly đạt được là 36,03mg/kg. Trong ba loại dung môi

khảo sát thì dung môi dầu nành cho hiệu suất trích ly astaxanthin tốt nhất.

1.5.2. Các nghiên cứu ngoài nước:

a) Extraction of astaxanthin from giant tiger (Penaeus monodon) shrimp

waste using palm oil: Studies of extraction kinetics and thermodynamic.[14]

Carotenoid trong phế liệu tôm khô được trích ly bằng cách sử dụng dầu cọ ở nhiệt độ 50; 60 và 700C. Sau khi đạt nhiệt độ cần thiết thì cho 50g phế liệu tôm vào.

Nồng độ carotenoid trong dầu cọ được đo bằng UV – 1200 tại λmax (482 nm).

24

b) Astaxanthin extraction from shrimp waste by lactic fermentation and

enzymatic hydrolysis of carotenprotein complex – R.Armenta – Lospez, I.Guerrero

L., and S.Huerta [24]

Mẻ cấy vi khuẩn Lactobacillus làm giảm pH hiệu quả nhất sau 48 giờ lên

men đạt được pH 4,0. Năng suất trích ly cao nhất thu được với ether dầu mỏ :

acetone : nước (15:75:10), cộng thêm BHA:BHT và đưa vào bóng tối để tránh oxy

hoá.

c) Extraction of carotenprotein from shrimp process wastes with the aid of

trysin from atlantic cod. [13]

Carotenprotein được thu nhận từ phế liệu tôm bằng cách sử dụng enzyme

proteolytic thương mại. Trích ly carotenprotein với sự hiện diện tri – sodium

EDTA. Trong nghiên cứu này, enzyme proteolytic được sử dụng trích ly

carotenprotein dễ dàng. Enzyme thương mại được so sánh với các loại khác, và di –

sodium EDTA và nước cất được sử dụng để so sánh với tri – sodium EDTA.

d) Recovery of carotenoids from shrimp waste in organic solvents –

N.M.Sachidra, N.Bhaskar, N.S Mahendrakar.[22]

Trong nghiên cứu này, tác giả đã dùng dung môi hữu cơ để tách chiết

carotenoid từ phế liệu tôm sú tại vùng Mangalore, Indo. Phế liệu được vận chuyển ở điều kiện -40C đến phòng thí nghiệm và được bảo quản lạnh ở - 200C cho đến khi sử

dụng. Tác giả đã sử dụng các dung môi như: acetone, methanol, ethanol, isopropyl

alcohol, ethyl acetate, ehtyl metyl ketone, petroleum ether, và hexane để trích ly

carotenoid trong phế liệu tôm sú và so sánh hiệu quả với việc sử dụng hỗn hợp dung

môi acetone và hexane, cũng như hỗn hợp 50:50 isopropyl alcohol và hexane. Kết

quả cho thấy được, khi dùng hỗn hợp isopropyl alcohol và hexane cho hiệu quả

trích ly cao nhất (43,9µg/g phế liệu)

Qua các kết quả của các nghiên cứu trong và ngoài nước ở trên, một điều

được nhận thấy là với phương pháp trích ly chỉ thu được astaxanthin mà không thu

được acid amin cũng như peptide mạch ngắn, ngược lại, với phương pháp thủy

25

phân bằng các tác nhân hóa học cũng như enzyme sẽ thu được cả chất màu

carotenoid, acid amin và peptide mạch ngắn. Khi so sánh kết quả thu được giữa tác

nhân hóa học và enzyme thì kết quả thủy phân với tác nhân là enzyme sẽ cho kết

quả thu được chất màu cao hơn so với tác nhân hóa học.

26

CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu cứu:

2.1.1. Đầu tôm:

Đầu tôm được thu tại bàn chế biến Nhà máy SX: XN KD CB thuỷ sản xuất

khẩu Ngọc Sinh. Đầu tôm được thải ra trong quá trình chế biến, được thu gom, làm sạch và cấp đông ở nhiệt độ -20 0C. Sản phẩm được vận chuyển và bảo quản ở nhiệt độ -18oC cho đến khi tiến hành thí nghiệm.

2.1.2. Enzyme protease:

Enzyme protease Tegalase R660L được mua tại Công ty TNHH thương mại

hoá chất và nông sản Phương Trâm. Đặc tính của enzyme Tegalase R660L được

công ty cung cấp theo bảng 2.1.

Bảng 2.1: Đặc tính của enzyme protease Tegalase R660L

Xuất xứ Tegarferm – Áo

Tên thương mại Tegalase R660L

Nhiệt độ hoạt động 15 – 700C

Nhiệt độ tối ưu 50 – 600C

pH hoạt động 7 – 10

2.1.3. Hoá chất

Các hoá chất sử dụng chủ yếu để nghiên cứu:

Hoá chất phân tích: NaOH, HCl, Acetone, Hexane, Na2SO4 khan, NaCl,

TCA, Casein, Tyrosin, Albumin, Astaxanthin...

Thuốc thử: Folin, Brafford

2.2. Dụng cụ và thiết bị

27

Dụng cụ: Các dụng cụ được dùng trong nghiên cứu bao gồm: pipet, becher,

bình định mức, ống nghiệm, bình chiết quả lê và một số dụng cụ khác.

Thiết bị dùng trong nghiên cứu:

Bể điều nhiệt, tủ đông, tủ lạnh, cân 5 số và 4 số, tủ sấy

Thiết bị ly tâm, thiết bị đo quang phổ,và một số thiết bị khác.

28

2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Nội dung nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu tổng quát được thể hiện ở hình 2.1

Nội dung nghiên cứu

Xác định thành phần nguyên vật liệu

 Hàm lượng protein  Hàm lượng lipid  Hàm lượng astaxanthin  Xác định hoạt độ enzyme

Khảo sát điểm pH có thể tủa được nhiều protein nhất Hàm lượng protein hoà tan trong dịch sau khi ly tâm

Nồng độ enzyme

Nhiệt độ

Khảo sát ảnh hưởng của các thông số công trình nghệ đến quá thuỷ phân đầu tôm sú Penaeus monodon

Hàm lượng a.a Hàm lượng astaxnthi n Thời gian

Hàm lượng astaxanthin Xác thành phần của bột carotenoprotein

Hình 2.1. Nội dung nghiên cứu

29

2.3.2. Bố trí thí nghiệm

Phế liệu đầu tôm trước khi được đưa vào thủy phân được xử lý theo thứ tự

trình bày trong hình 2.2

Đầu tôm

Cắt nhỏ 1 – 2 cm

Gia nhiệt 98oC, 10 phút

Định lượng

Bảo quản -18oC

Hình 2.2. Chuẩn bị đầu tôm

Chuẩn bị đầu tôm và thực hiện thuỷ phân:

Đầu và vỏ tôm đông lạnh sẽ được cắt nhỏ 1 – 2 cm. Sau đó, nguyên liệu được gia nhiệt lên 980C trong 10 phút. Nguyên liệu được chia nhỏ theo từng phần

20g cho mỗi thí nghiệm và được bảo quản ở tủ đông. Mỗi thí nghiệm, ta sẽ lấy từng

phần nhỏ, bổ sung nước cất tỷ lệ 1:3, nâng nhiệt độ nguyên liệu lên nhiệt độ cần thuỷ phân: 45; 55 và 650C. Sau đó, bổ sung enzyme theo từng nồng độ: 5%; 8%;

11%. Trong thời gian thuỷ phân: 0h; 3h; 6h; 9h; 12h hỗn hợp được khuấy đảo cứ 30

phút 1 lần để enzyme có thể tiếp xúc đều nguyên liệu. Hỗn hợp sau khi thuỷ phân

được lọc qua vải thô, bổ sung HCl 10% vào đưa dịch sau thuỷ phân về pH: 4; 4,5; 5; 5,5; 6. Sau đó, hỗn hợp được để lắng lạnh 4oC trong 2 giờ. Bột nhão

carotenprotein thu nhận bằng các ly tâm 40 phút ở 4,000 vòng/phút, sau đó bột nhão

được cho vào tủ đông để tách bớt nước.

30

2.3.2.1. Bố trí nghiệm xác định điểm pI

Đầu tôm sau xử lý

Bổ sung nước cất

với tỉ lệ đầu tôm :nước 1:3 (w/w)

Nâng nhiệt lên nhiệt độ thuỷ phân (450C)

Bổ sung enzyme Protease 5%

Thuỷ phân trong thời gian 30 phút

Lọc qua vải thô

Kết tủa bằng HCl10% ở các giá trị pH

4

4,5

5

5,5

6

31

Lắng lạnh 40C trong 2 giờ

Ly tâm 4,000 vòng/phút, 40 phút

Thu dịch thuỷ phân

Kết luận về điểm đẳng điện của dịch thuỷ phân

Xác định hàm lượng protein hoà tan

Hình 2.3. Bố trí thí nghiệm xác định điểm đẳng điện kết tủa của dịch carotenoprotein

sau khi thuỷ phân.

Đầu tôm sau khi xử lý sẽ được bổ sung thêm nước cất với tỷ lệ đầu tôm với nước cất là 1:3 (w/w). Hỗn hợp sẽ được gia nhiệt lên nhiệt độ thuỷ phân là 450C sau đó,

enzyme được cho vào với nồng độ là 5% và khuấy đều để enzyme tiếp xúc với thịt đầu

tôm. Hỗn hợp sẽ được giữ ổn định ở nhiệt độ này trong 30 phút để thực hiện thuỷ phân.

Sau khi thuỷ phân, lọc hỗn hợp qua vải thô để thu dịch. Tiếp đến, bổ sung HCl 10% để

hạ pH đến các giá trị cần khảo sát, sau đó, đểyên hỗn hợp trong tủ lạnh với nhiệt độ là 40C trong 2 giờ. Kết thúc thời gian lắng, dịch sẽ được mang đi ly tâm 4,000 vòng/phút

trong thời gian 40 phút để thu dịch trong. Dịch trong này được dùng để đo hàm lượng

protein hoà tan trong chúng. Nếu hàm lượng protein trong dịch thấp nhất, ta sẽ chọn

điểm pH đó là pI.

32

2.3.2.2. Bố trí thí nghiệm khảo sát nhiệt độ thuỷ phân phế liệu đầu tôm

Đầu tôm sau xử lý

Bổ sung nước cất

Với tỉ lệ đầu tôm và nước 1:3 (w/w)

Nâng nhiệt lên nhiệt độ thuỷ phân

ở các nhiệt độ

450C 550C 650C

Bổ sung enzyme Protease 5% (20UI)

Thời gian thủy phân

0h 3h 6h 9h 12h

Lọc qua vải thô

33

Tủa đẳng điện Xác định hàm lượng protein hoà tan

Ly tâm 4.000 vòng/phút, 40 phút

Cân định lượng

Xác định hàm lượng astaxanthin

Đánh giá nhiệt độ thuỷ phân

Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ

thuỷ phân phế liệu đầu tôm.

Đầu tôm sau khi được xử lý sẽ được bổ sung nước cất với tỉ lệ đầu tôm và nước cất là 1: 3(w/w). Mẫu sẽ được gia nhiệt lên các nhiệt độ thuỷ phân: 450C; 550C; 650C.

Khi đạt đến nhiệt độ thuỷ phân, bổ sung enzyme nồng độ 5% và thuỷ phân trong các

mốc thời gian 0h (30 phút); 3h; 6h; 9h; 12h. Kết thúc thuỷ phân, lọc qua vải thô lấy

dịch trong. Dịch này sẽ được dùng để đo hàm lượng acid amin và peptide mạch ngắn. Ngoài ra, dịch còn được tủa bằng HCl đến pI, sau đó lắng lạnh 40C trong 2 giờ. Tiếp

đến, ly tâm để thu bột nhão carotenoprotein nhằm xác định hàm lượng astaxanthin

trong bột nhão.

34

2.3.2.3. Bố trí thí nghiệm xác định nồng độ enzyme dùng thuỷ phân phế liệu đầu

tôm

Đầu tôm sau xử lý

Bổ sung nước cất

Gia nhiệt 550C

Bổ sung enzyme Protease

5% (20UI) 8% (30UI) 11% (40UI)

Thời gian thủy phân

0h 3h 6h 9h 12h

Lọc qua vải thô

35

Tủa đẳng điện Xác định hàm lượng protein hoà tan

Ly tâm 4,000 vòng/phút, 40 phút

Cân định lượng

Xác định hàm lượng astaxanthin

Kết luận nồng độ enzyme tối ưu

Hình 2.5. Bố trí thí nghiệm xác định nồng độ enzyme

dùng thuỷ phân phế liệu đầu tôm

36

2.3.3. Phương pháp nghiên cứu:

Xác định hàm lượng protein hoà tan bằng phương pháp Bradford.(Bradford,

1976)

Xác định hoạt tính enzyme protease theo phương pháp Anson cải tiến (Anson,

M.L., (1938) J. Gen. Physiol. 22, 79-89)

Xác định hàm lượng astaxanthin theo phương pháp Tolasa (Tolasa et al. 30 và

cộng sự)

Xác định hàm lượng lipid theo phương pháp TCVN 4331 – 2001

Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Ref.FAO p .221 – 223, 1986

Xác định hàm lượng tro theo phương pháp TCVN 5105:2009

2.3.4. Xử lý số liệu:

Số liệu thực nghiệm được xử lý theo phương pháp thống kê toán học

ANOVA dựa trên phần mềm JMP 10 và đồ thị được vẽ trên phần mềm excel.

37

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Các thông số cơ bản của nguyên vật liệu dùng trong thí nghiệm

3.1.1. Biến đổi số đơn vị hoạt tính enzyme

Hoạt tính enzyme được khảo sát qua các thời gian bảo quản. Theo hình 3.1

thời gian bảo quản hoạt tính enzyme giảm dần.

Sau 1 tháng sử dụng, hoạt tính enzyme giảm 3.38% so với khi bắt đầu sử

dụng, sau 2 tháng hoạt tính giảm 5,84% so với khi bắt đầu sử dụng và giảm 7,31%

sau 3 tháng khi bắt đầu sử dụng. Theo kết quả khảo sát thì enzyme dạng lỏng có

hoạt tính giảm nhanh hơn enzyme dạng bột. Shie – Jea Lin và cộng sự (2010) cho rằng hoạt tính enzyme vẫn giảm khi trữ đông ở 800C hoặc thấp hơn và protein

enzyme bị biến tính bất thuận nghịch.

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme : thời gian bảo quản và điều kiện bảo quản. Ở đây enzyme protease được bảo quản ở 40C, nhưng hoạt tính

vẫn giảm. Do đó, nên sử dụng enzyme trong vòng 6 tháng kể từ ngày mở bao bì để

đảm bảo hoạt tính enzyme vẫn ổn định và tiết kiệm được lượng enzyme cho vào.

Tuy nhiên, trong nghiên cứu này tận dụng lại enzyme của đề tài nghiên cứu trước,

do đó thời gian bảo quản enzyme kéo dài làm cho hoạt tính enzyme giảm đáng kể.

Vì vậy, trước mỗi thí nghiệm trong nghiên cứu này, enzyme luôn được xác định

hoạt tính để đảm bảo nồng độ enzyme cho vào trước mỗi thí nghiệm và đảm bảo

hoạt ổn định trong suốt tất cả các thí nghiệm.

38

21

20.5

) l

20

m

19.5

/ I U

(

19

18.5

18

ộ đ t ạ o H

17.5

17

9

10

11

12

Tháng

Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn hoạt độ enzyme theo thời gian bảo quản

3.1.2. Thành phần nguyên liệu

Bảng 3.1. Thành phần nguyên liệu đầu tôm P.monodon

(tính trên nguyên liệu khô)

Ẩm (%) 79.81 ± 0.33

Protein (%) 12,2

Lipid (%) 1,29

Tro (%) 6,29

Astaxanthin (μg/g) 297,8 ± 2,33

Độ ẩm của phế liệu đầu tôm sú là 79.81%, độ ẩm này cao hơn gần 3% so với

phế liệu đầu và vỏ tôm được thu từ tôm sú nuôi trồng tại vùng Cần Giờ, nhưng thấp

hơn 6% so với độ ẩm của thịt đầu tôm sú được thu mua tại huyện Thới Bình, tỉnh

Cà Mau. Nhìn tổng thể các hàm lượng protein, lipid của phế liệu đầu tôm dùng

trong nghiên cứu này đều thấp hơn phế liệu đầu và vỏ tôm từ tôm sú được nuôi ở

vùng Cần Giờ. Cụ thể, hàm lượng protein trong phế liệu đầu tôm được sử dụng

39

trong nghiên cứu này thấp hơn gần 22% so với phế liệu đầu và vỏ tôm từ tôm sú tại

vùng biển Cần Giờ, tuy nhiên, hàm lượng protein trong phế liệu đầu tôm này không

chênh lệch nhiều so với hàm lượng protein trong thịt đầu tôm từ tôm sú của huyện

Thới Bình, Cà Mau, cùng với đó, hàm lượng này cao hơn so với hàm lượng protein

có trong đầu tôm thẻ chân trắng tại Khánh Hòa. Với một lượng protein tương đối

nhiều như thế, nếu chỉ dùng phế liệu này để sản xuất chitin và chitosan thì dường

như ta đang bỏ phí một lượng dinh dưỡng cần thiết cho động vật và con người.

Ngoài ra, khi sử dụng trực tiếp phế liệu đầu tôm này để sản xuất chitin và chitosan,

có vẻ ta cần một lượng hoá chất khá lớn để loại bỏ phần protein này. Nếu như từ

đầu, phế liệu đầu tôm này được thuỷ phân để thu hồi lượng protein này, một việc

có thể thấy, ngoài việc thu protein mang lại thêm một giá trị kinh tế, còn có thể

giảm đi lượng hoá chất cho việc sản xuất chitin – chitosan và quá trình sản xuất sản

phẩm này cũng diễn ra dễ dàng hơn, điều này nâng cao hiệu quả kinh tế hơn. Hàm

lượng chất béo thấp hơn gần 3,5% so với hàm lượng chất béo trong phế liệu đầu và

vỏ tôm tại vùng Cần Giờ (4,88%), và thấp hơn rất nhiều so phế liệu đầu tôm thẻ

chân trắng tại Khánh Hòa (10,61%).Sự khác nhau này có thể được giải thích bởi sự

ảnh hưởng của giống loài, môi trường nuôi trồng và chế độ thức ăn khi nuôi tôm

lớn, cũng có thể do thời điểm đánh bắt tôm và cách xử lý nguyên liệu tôm nguyên

con để thu nhận đầu tôm phế liệu.

3.2. Điểm pI của dịch thuỷ phân

Việc thu nhận carotenoprotein từ dịch thuỷ phân phế liệu đầu tôm được thực

hiện nhờ phương pháp kết tủa ở điểm đẳng điện. Dịch lọc được đưa về pH đẳng

điện nhằm thu hồi protein ở dạng carotenoprotein bằng dung dịch HCl10%. Nếu

điều chỉnh pH cao hơn điểm đẳng điện có thể protein chưa bị kết tủa hoàn toàn, làm

giảm hiệu suất quá trình thu nhận. Nếu điều chỉnh pH thấp hơn thì mức độ keo tụ có thể giảm xuống, lúc này có thể nồng độ H+ dư nên một số protein tích điện dương

yếu nên đẩy nhau, liên kết giữa các protein yếu đi, tăng khả năng hydrat hoá, độ hoà

tan của protein tăng lên và khó kết tụ hơn. Vì vậy, nghiên cứu đã tiến hành xác định

điểm đằng điện của dịch thuỷ phân thu được bằng cách xác định hàm lượng protein

40

hoà tan của dịch trong sau khi ly tâm thu kết tủa carotenprotein, kết quả được trình

bày trong hình 3.1.

Dựa vào đồ thị cho thấy, hàm lượng protein hoà tan trong dịch trong cao

nhất 0,1051 mg/g tại pH= 6 và thấp nhất 0.0336 mg/g tại pH= 4,5. Hàm lượng

protein của dịch trong sau khi tủa carotenoprotein tại pH bằng 4, 5, 5,5 và 6 cao hơn

tại pH= 4,5. Điều này được lý giải dựa vào sự thay đổi điện tích, khi pH= 4, lượng H+ trong dịch dư là cho protein tích điện dương nên các phân tử protein đẩy nhau,

do đó, chúng không thể tủa xuống. Khi pH= 5;5,5 và 6, protein lúc này cùng tích

điện âm nên chúng đẩy nhau, vì vậy, lượng protein tủa xuống thấp. Bên cạnh đó,

khi pH= 4,5, phân tử protein trung hoà về điện, chúng hút lẫn nhau làm tăng khối

lượng, dưới tác dụng của trọng lực chúng sẽ tủa xuống tách ra khỏi dịch. Từ đó,

nhận định rằng, pH có tác dụng tủa protein nhiều nhất là 4,5. Giá trị pH này bằng

giá trị pH đẳng điện trong nghiên cứu trên tôm sú Penaeus monodon được nuôi

trồng tại Cần Giờ. Qua giá trị này cho thấy, thành phần protein trong nguyên liệu

tôm sú Penaeus monodon được nuôi trồng tại 2 vùng khác nhau không có sự khác

0.12

0.1

biệt.

n a t à o h n

0.08

0.06

) g / g m

(

0.04

i e t o r p g n ợ ư

l

0.02

m à H

0

4

4.5

5.5

6

5 pH

Hình 3.2. Hàm lượng protein hoà tan của dịch trong thu nhận sau kết tủa

carotenoprotein

41

3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thuỷ phân phế liệu đầu tôm bằng enzyme

prtotease Tegalase R660L

3.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thuỷ phân phế liệu đầu tôm

bằng enzyme protease Tegalase R660L

Trong thí nghiệm này tiến hành khảo sát nhiệt độ thuỷ phân, với hoạt độ enzyme

là 20UI, thời gian từ 0 giờ đến 12 giờ ở các nhiệt độ 450C, 550C và 650C.

3.3.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng acid amin trong dịch thủy

phân và hiệu suất thu hồi acid amin

3.3.1.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng acid amin thu được trong

dịch thủy phân

Theo hình 3.1 cho thấy, hàm lượng acid amin tăng qua các mốc thời gian

thuỷ phân tại các nhiệt độ khác nhau. Hàm lượng acid amin tăng đáng kể khi nhiệt độ tăng từ 450C lên đến 550C, sau thời gian thuỷ phân 30 phút hàm lượng acid amin tăng 0,316 mg/g, nhưng khi tăng nhiệt độ lên 650C thì hàm lượng acid amin giảm

0,0978 mg/g. Điều này có thể được lý giải dựa vào động học enzyme và nhiệt độ khuyến khích của nhà sản xuất (50 – 600C), khi nhiệt độ tăng lên vận tốc phản ứng

tăng từ đó hàm lượng sản phẩm sau thuỷ phân tăng lên, nhưng khi nhiệt độ vượt qua

ngưỡng cho phép, vận tốc phản ứng giảm đến mức triệt tiêu khi tiếp tục tăng nhiệt

12.00

độ. Và đồ thị cho thấy, hàm lượng acid amin của dịch thủy phân đạt cao nhất sau khi thuỷ phân được 6 giờ ở cả 3 nhiệt độ 45, 55, 650C.

i

10.00

n m a d

8.00

55

6.00

65

i c a g n ợ ư

4.00

l

) u ệ i l ế h p g / g m

(

45

2.00

m à H

0.00

0

3

9

12

6 Thời gian (giờ)

Hình 3.3. Hàm lượng acid amin theo thời gian ở các nhiệt độ khác nhau.

42

i

n m a d

i c a

g n ợ ư

l

) u ệ i l ế h p g / g m

(

m à H

4.50 4.00 3.50 3.00 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50 0.00

45

65

55 Nhiệt độ (0C)

Hình 3.4. Hàm lượng acid amin của dịch thủy phân theo nhiệt độ ở thời gian thủy phân

là 6 giờ

3.3.1.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thu hồi protein

Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi acid amin theo thời gian thủy phân ở các

nhiệt độ khác nhau được trình bày ở hình 3.5 cho thấy, hiệu suất thu hồi acid amin

tăng dần qua các mốc thời gian thủy phân từ 0 giờ đến 6 giờ và sau đó giảm dần ở

cả 3 nhiệt độ. Bên cạnh đó, đồ thị còn cho thấy sau thời gian thủy phân 6 giờ, hiệu

suất thu hồi acid amin là cao nhất. Ngoài ra, hiệu suất thu hồi acid amin luôn cao hơn khi thủy phân ở nhiệt độ 550C so với hiệu suất thu hồi acid amin khi phế liệu được thủy phân ở nhiệt độ 45 và 650C qua các thời gian thủy phân. Khi xét ở cùng

thời gian thủy phân là 6 giờ, hiệu suất thu hồi acid amin tăng lên khi nhiệt độ thủy phân tăng từ 450C lên 550C và giảm khi nhiệt độ tiếp tục tăng lên 650C (Hình 3.6)

43

40.00

)

%

35.00

30.00

25.00

20.00

65oC

15.00

55oC

45oC

10.00

5.00

( n i e t o r p i ồ h u h t t ấ u s u ệ i H

0.00

0

3

9

12

6 Thời gian thuỷ phân (giờ)

Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi acid amin theo thời gian ở các nhiệt độ

18.00

16.00

14.00

12.00

)

10.00

%

8.00

(

6.00

4.00

2.00

n i e t o r p i ồ h u h t t ấ u s u ệ i H

0.00

45

65

55 Nhiệt độ thuỷ phân (oC)

khác nhau

Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi protein ở các nhiệt độ thủy phân sau 6 giờ

thủy phân

Khi được so sánh với hàm lượng protein hòa tan thu nhận được bằng cách

thủy phân phế liệu đầu và vỏ tôm sú bằng enzyme tách chiết từ đầu tôm thì cho

44

thấy, hàm lượng acid amin trong nghiên cứu này thấp hơn gần 22 mg/g phế liệu.

Điều này có thể được lý giải bởi enzyme sử dụng khác nhau, sự có mặt của EDTA,

nhiệt độ và sự tiếp xúc của enzyme với thịt tôm. Với hàm lượng acid amin thu

được theo đơn vị mg/g ở trên được chuyển đổi thành phần trăm lần lượt như sau:

10,48%; 12,81%; 12,37%. Kết quả này thấp hơn rất nhiều so với nghiên cứu thu

nhận carotenoprotein bằng enzyme trysin từ cá tuyết và dịch tụy của bò có sự bổ sung EDTA, thủy phân ở 4oC và pH= 7,7 và thời gian kéo dài gần 30 giờ trong

nghiên cứu của A.Cano – Lopez, B.K. Simpson và N.F.Haard. Cụ thể trong nghiên

cứu của A.Cano – Lopez, hàm lượng protein thu được với sự tham gia của enzyme

trysin từ cá tuyết là trên 80%, với enzyme trysin từ tuyến tụy bò là trên 60%. Từ hai

so sánh trên, có thể sự có mặt của EDTA và nhiệt độ thủy phân thấp đã hạn chế sự

tổn thất acid amin trong dịch thủy phân.

Kết quả xếp hạng theo xử lý ANOVA cho thấy, tại nhiệt độ 550C sau khi thuỷ

phân được 6 giờ thì hàm lượng acid amin cao nhất.

3.3.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng astaxanthin thu nhận

trong dịch thủy phân và hiệu suất thu hồi astaxanthin

3.3.1.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng astaxanthin thu được

trong dịch thủy phân

Các đường biểu diễn trên hình 3.7 cho thấy được xu hướng tăng giảm của hàm

lượng astaxanthin qua các thời gian thuỷ phân ở các nhiệt độ thuỷ phân khác nhau.

Hàm lượng astaxanthin tăng qua các mốc thời gian từ 0 giờ đến 6 giờ và giảm khi

thời gian thủy phân kéo dài đến 9 giờ và 12 giờ ở cả 3 nhiệt độ thủy phân. Hàm lượng astaxanthin đạt cực đại sau 6 giờ thuỷ phân ở cả 3 nhiệt độ 45, 55, 650C với các giá trị

lần lượt như sau: 11,44; 12,7; 10,31 μg/g.Và thông qua đồ thị biểu diễn ở hình 3.8 cũng cho thấy, hàm lượng astaxanthin thu được cao nhất ở 550C, cao hơn 45oC là 2,96 μg/g và 2,46 μg/g khi so với hàm lượng astaxanthin ở 650C.

45

16.00

i

14.00

12.00

10.00

8.00

45

) g / g µ (

6.00

55

n h t n a x a t s a g n ợ ư

4.00

65

l

2.00

m à H

0.00

0h

3h

9h

12h

6h Thời gian thủy phân (giờ)

14

12

10

Hình 3.7. Hàm lượng astaxanthin theo thời gian

i

8

6

4

) g / g µ ( n h t n a x a t s a g n ợ ư

l

2

m à H

0

45

65

55 Nhiệt độ (0C)

Hình 3.8. Hàm lượng astaxanthin sau 6 giờ thủy phân ở các nhiệt độ khác nhau.

3.3.1.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thu hồi astaxanthin thu được

trong dịch thủy phân

Hiệu suất thu hồi astaxanthin được biểu diễn trong hình 3.9 cho thấy một xu hướng hiệu suất thu hồi astaxanthin tăng lên khi nhiệt độ tăng từ 450C lên 550C và giảm khi nhiệt độ tăng lên 650C. Xu hướng này được cụ thể qua các con số như sau:

46

30.00

khi thủy phân ở nhiệt độ 450C, hiệu suất thu hồi astaxanthin là 19,2%, ở 550C sẽ là 21,32% và 17,32% khi thủy phân ở 650C. Và ở đồ thị biểu diễn ở hình 3.10 chứng tỏ rằng, khi thủy phân ở nhiệt độ 550C sẽ cho hiệu suất thu hồi astaxanthin là cao nhất.

)

%

i

25.00

20.00

( n h t n a x a t s a

i

45oC

15.00

55oC

10.00

65oC

5.00

i

ồ h u h t t ấ u s u ệ H

0.00

0h

3h

6h

9h

12h

Thời gian thuỷ phân (giờ)

Hình 3.9. Hiệu suất thu hồi astaxanthin qua các thời gian thủy phân ở các nhiệt độ

30.00

khác nhau.

)

%

i

25.00

20.00

( n h t n a x a t s a

15.00

i

10.00

5.00

i

0.00

ồ h u h t t ấ u s u ệ H

45

55

65

Nhiệt độ thuỷ phân (oC)

Hình 3.10. Hiệu suất thu hồi astaxanthin sau 6 giờ thủy phân ở các nhiệt độ khác nhau.

Giá trị này thấp hơn nhiều so với giá trị 91,9 % hàm lượng astaxanthin của

carotenprotein được chiết bằng enzyme protease từ Cacillus Licheniformis với sự có

47

mặt của Na3 – EDTA (Seung Hwan Lee). Và khi so sánh với giá trị hàm lượng astaxanthin được tách chiết bằng hỗn hợp enzyme trysin từ bò và cá tuyết ở 4oC với

sự có mặt của 0,5M EDTA trong nghiên cứu của A.Cano – Lopez, B.K.Simpson và

N.F.Haard, 80%. Do đó, có thể khi thuỷ phân với sự có mặt của EDTA hiệu suất thu

hồi astaxanthin sẽ cao hơn rất nhiều.

Kết quả xử lý số liệu trên ANOVA cho thấy nhiệt độ tối ưu để thuỷ phân là 55oC, ở nhiệt độ này, cả hai hàm lượng astaxanthin và hàm lượng acid amin đều

12.70

11.49

15.00

10.31

10.00

3.02

5.00

3.52

2.56

0.00

45

55

65

Hàm lượng acid amin (mg/g)

Hàm lượng astaxanthin (μg/g)

cao hơn khi thủy phân ở hai nhiệt độ còn lại.

Hình 3.11. Biểu đồ thể hiện hàm lượng astaxanthin và acid amin của dịch thuỷ phân

sau 6 giờ với hoạt độ enzyme là 20UI ở các nhiệt độ khác nhau.

3.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme (số đơn vị hoạt độ enzyme)

protease Tegalase R660L đến quá trình thuỷ phân.

Trong thí nghiệm này tiến hành khảo sát hoạt độ enzyme ảnh hưởng đến quá

trính thuỷ phân, với nhiệt độ thuỷ phân là 550C, thời gian từ 0 giờ đến 12 giờ.

3.3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme (số đơn vị hoạt độ enzyme)

protease Tegalase R660L đến hàm lượng acid amin thu được trong dịch thủy

phân và hiệu suất thu hồi acid amin

48

3.3.2.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme (số đơn vị hoạt độ enzyme) đến

hàm lượng acid amin thu được trong dịch thủy phân

Theo kết quả thí nghiệm thì hàm lượng acid amin tăng dần khi tăng hoạt độ

enzyme lên từ 20UI lên 30UI và 40UI. Sau 3 giờ thuỷ phân, hàm lượng acid amin

tăng lên 1,05, 1,512 và 0,856 mg/g lần lượt tương ứng với các hoạt độ 20UI, 30UI

và 40UI. Trong đó, hàm lượng acid amin đạt cực đại 3,339 mg/g tại hoạt độ 40UI.

Trong 6h đầu tiên, ở tất cả các hoạt độ enzyme hàm lượng acid amin tăng mạnh,

0,7661mg/g khi tăng hoạt độ enzyme từ 20UI lên 30UI và khi đầu tôm được thuỷ

phân với hoạt độ là 40UI, hàm lượng acid amin tăng một lượng không đáng kể

0,0388 mg/g. Kết quả khi được xử lý ANOVA, hàm lượng acid amin của dịch thuỷ

5.00

4.50

4.00

3.50

3.00

phân ở 30UI và 40UI sau 6 giờ không có sự khác biệt về mặt thống kê.

) g / g m

2.50

20UI

i

2.00

30UI

1.50

40UI

( n m a d i c a

1.00

à v n ắ g n h c ạ m d i t p e p g n ợ ư

l

0.50

m à H

0.00

0h

3h

9h

12h

6h Thời gian thủy phân (giờ)

Hình 3.12. Hàm lượng acid amin theo thời gian

ở các các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau

Theo hình 3.13 cho thấy càng tăng hoạt độ enzyme thì thu được sản phẩm

càng nhiều. Theo kết quả nghiên cứu thu được cho thấy sau 6 giờ phản ứng thì hàm

lượng acid amin ứng với hoạt độ 20UI, 30UI, 40UI thu được là 3,4; 4,16; 4,2 mg/g.

49

Tuy nhiên, khi tăng hoạt độ enzyme từ 30UI lên 40UI thì hàm lượng acid amin tăng

lên không đáng kể và không có sự khác biệt về mặt thống kê. Do theo thời gian

phản ứng hàm lượng peptide mạch ngắn và hàm lượng acid amin tự do được giải

phóng ra tạo thành một hỗn hợp ngăn cản sự tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất, do

đó, quá trình thuỷ phân vẫn tiếp tục diễn ra nhưng với tốc độ chậm. Theo kết quả

4.5

4

khảo sát thì tại hoạt độ 30UI thu được lượng acid amin cao nhất.

i

3.5

3

n m a d

2.5

2

i c a g n ợ ư

l

1.5

) u ệ i l ế h p g / g m

(

1

m à H

0.5

0

1

2

30

20

40

1.5 2.5 Số đơn vị hoạt độ enzyme (UI)

Hình 3.13. Hàm lượng acid amin sau 6 giờ thuỷ phân

theo các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau

3.3.2.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme (số đơn vị hoạt độ enzyme) đến

hiệu suất thu hồi protein

50

20.00

n

18.00

16.00

i e t o r p

14.00

12.00

10.00

20UI

8.00

30UI

6.00

40UI

4.00

2.00

i ồ h u h t t ấ u s u ệ i H

0.00

0

3

6

9

12

Thời gian thuỷ phân (giờ)

Hình 3.14. Hiệu suất thu hồi protein theo thời gian ở các các số đơn vị hoạt độ khác

20.00

nhau

)

%

18.00

( n

16.00

14.00

i e t o r p

12.00

10.00

8.00

6.00

4.00

2.00

0.00

i ồ h u h t t ấ u s u ệ i H

20

40

30 Số đơn vị hoạt độ (UI)

Hình 3.15. Hiệu suất thu hồi protein sau 6 giờ thủy phân

ở các các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau

51

Các đường biểu diễn hiệu suất thu hồi acid amin được biểu diễn ở hình 3.14

cho thấy được xu hướng tăng giảm hiệu suất thu hồi acid amin qua các thời thủy

phân khác nhau ở ba hoạt độ enzyme. Hiệu suất thu hồi acid amin tăng qua các mốc

thời gian thủy phân từ 0 giờ đến 6 giờ, khi kéo dài thời gian thủy phân ra 9 giờ và

12 giờ, hiệu suất thu hồi acid amin có chiều hướng giảm ở cả ba hoạt độ. Ngoài ra,

đường biểu diễn ở hình 3.15 chứng tỏ hiệu suất thu hồi acid amin tăng mạnh khi

hoạt độ tăng từ 20UI lên 30UI và tiếp tục tăng không đáng kể khi tăng hoạt độ

enzyme lên 40UI.

Các hoạt độ enzyme 20UI, 30UI và 40UI chuyển về nồng độ phần trăm so

với mẫu lần lượt 5%, 8% và 11%. Kết quả khảo sát trong nghiên cứu này được

chuyển về phần trăm lần lượt như sau: 12,37%; 15,16%; 15,31% và được so sánh

với nghiên cứu chiết rút chế phẩm đạm giàu carotenoid từ đầu tôm thẻ chân trắng

bằng hai loại enzyme Alcalase và Flavourzyme. Kết quả cho thấy khi thủy phân với

tỷ lệ enzyme Alcalase/ đầu tôm là 0,2% (v/w) trong 2 giờ thủy phân và tiếp tục xử lý với enzyme Flavourzyme/ đầu tôm là 0,1% (w/w) trong 1 giờ ở 550C, hàm lượng

protein thu được là trên 67%. Kết quả thu được trong nghiên cứu này rất thấp so với

kết quả nghiên cứu chiết rút chế phẩm bột đạm giàu carotenoprotein từ đầu tôm thẻ

chân trắng. Điều này có thể được lý giải bởi enzyme sử dụng khác nhau và số

lượng enzyme được sử dụng trong nghiên cứu.

3.3.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme (số đơn vị hoạt độ enzym) đến hàm

lượng astaxanthin và hiệu suất thu hồi astaxanthin

3.3.1.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme (số đơn vị hoạt độ enzyme) đến

hàm lượng astaxanthin thu được trong dịch thủy phân

52

20.00

18.00

i

16.00

14.00

12.00

10.00

20UI

8.00

30UI

n h t n a x a t s a g n ợ ư

l

40UI

6.00

) u ệ i l ế h p g / g μ (

4.00

m à H

2.00

0.00

0h

3h

9h

12h

6h Thời gian thuỷ phân (giờ)

Hình 3.16. Hàm lượng astaxanthin theo thời gian

ở các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau

Hàm lượng astaxanthin của dịch thuỷ phân ở các hoạt độ enzyme khác nhau

được thể hiện ở hình 3.7 cho thấy, khi hoạt độ enzyme tăng từ 20UI đến 40UI thì

hàm lượng astaxanthin tăng. Điều này được thể hiện cụ thể qua số liệu như sau:

hàm lượng astaxanthin tăng 1,2659; 3,3515μg/g tương ứng khi hoạt độ enzyme tăng

từ 20UI lên 30UI và từ 30UI lên 40UI sau thời gian thuỷ phân là 30 phút. Hàm

lượng astaxanthin của dịch thuỷ phân sau 6 giờ đạt cực đại ở tất cả các hoạt độ. Sự

gia tăng hàm lượng astaxanthin của dịch thuỷ phân sau 6 giờ khi tăng hoạt độ

enzyme được cụ thể qua các con số như sau: khi hoạt độ tăng từ 20UI dến 30UI,

hàm lượng astaxanthin tăng một cách mạnh mẽ, 5.0061 μg/g, và khi hoạt độ tăng từ

30UI đến 40UI, hàm lượng astaxanthin tăng không đáng kể, 0,1212 μg/g. Xu

hướng trên được thể hiện bởi các đưởng biểu diễn trong hình 3.17. Từ đó, nhận

định có thể đựơc đưa ra: khi tăng lượng enzyme thì hàm lượng astaxanthin tăng, tuy

nhiên, khi nồng độ enyme tăng đến mức bão hoà với cơ chất thì hàm lượng

astaxanthin tăng không đáng kể. Tuy khi tăng số đơn vị hoạt độ enzyme từ 30UI lên

53

40UI thì hàm lượng acid amin và peptide mạch ngắn tăng, nhưng khi xử lý số liệu

bằng phương pháp thống kê ANOVA thì không có sự khác biệt về mặt ý nghĩa

20.00

18.00

16.00

thống kê giữa chúng.

i

14.00

12.00

10.00

8.00

) u ệ i l ế h p

6.00

4.00

g / g µ ( n h t n a x a t s a g n ợ ư

l

2.00

0.00

m à H

20UI

40UI

30UI Số đơn vị hoạt độ enzyme (UI)

Hình 3.17. Hàm lượng astaxanthin thu được trong bột nhão carotenoprotein từ dịch

thủy phân sau 6 giờ thủy phân ở các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau

3.3.1.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme (số đơn vị hoạt độ enzyme) đến

hiệu suất thu hồi astaxanthin

Các đường biểu diễn ở hình 3.18 cho thấy xu hướng tăng và giảm của hiệu

suất thu hồi astaxanthin qua các thời gian thủy phân từ 0 giờ đến 12 giờ ở cả ba hoạt

độ enzyme protease Tegalase R660L. Tương tự như chiều hướng của hàm lượng

astaxanthin, hiệu suất astaxanthin tăng mạnh từ 0 giờ đến 6 giờ và sau đó giảm dần

khi kéo dài thời gian thủy phân ở cả ba hoạt độ. Bên cạnh đó, hiệu suất thu hồi

astaxanthin tăng mạnh khi tăng hoạt độ từ 20UI lên 30UI, và tăng không đáng kể

khi tiếp tục tăng hoạt độ lên 40UI. Chiều hướng này được thể hiện bởi các

đườngbiểu diễn trong hình 3.19.

54

20.00

18.00

16.00

14.00

12.00

)

10.00

20UI

%

(

8.00

30UI

6.00

40UI

4.00

2.00

0.00

n i h t n a x a r s a i ồ h u h t t ấ u s u ệ i H

0h

3h

9h

12h

6h Thời gian thuỷ phân (giờ)

Hình 3.18. Hiệu suất thu hồi astaxanthin trong bột nahxo caroteinoprotein từ dịch

35.00

thủy phân ở các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau.

)

30.00

%

25.00

( n

i

20.00

15.00

10.00

h t n a x a t s a

5.00

i ồ h u h t t ấ u s u ệ i H

0.00

20UI

40UI

30UI Số đơn vị hoạt độ enzyme (UI)

Hình 3.19. Hiệu suất thu hồi astaxanthin trong bột nhão carotenoprotein từ dịch

thủy phân phân sau 6 giờ thủy phân ở các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau.

Các hoạt độ 20UI, 30UI và 40UI được chuyển về nồng độ phần trăm tương

ứng: 5%, 8% và 11%. Trong khảo sát này, nồng độ enzyme được xem tốt nhất là

8%. Khi so sánh với các nghiên cứu khác, kết quả hàm lượng astaxanthin thu được

trong khảo sát này thấp hơn. Trong nghiên cứu quá trình thuỷ phân thu nhận bột

55

carotenoprotein từ đầu và vỏ tôm bằng chế phẩm enzyme protease tách chiết từ đầu

tôm sú, hàm lượng carotenoid thu được cao nhất khoảng 53% ở nồng độ enzyme là

4,5%. Còn hàm lượng astaxanthin trong nghiên cứu này đạt cao nhất 24,72% đối

với nồng độ enzyme là 11% và 24,64% với nồng độ enzyme là 8%. Nồng độ

enzyme dùng trong nghiên cứu này cao hơn so với trong nghiên cứu thủy phân phế

liệu đầu và vỏ tôm bằng enzyme được tách chiết từ đầu tôm, nhưng hiệu suất thu

hồi lại thấp hơn. Điều này có thể được giải thích bởi sự khác nhau về enzyme sử

14.68

14.72

15.00

6.34

10.00

3.02

5.00

3.70

3.73

0.00

20UI

30UI

40UI

Hàm lượng acid amin (mg/g)

Hàm lượng astaxanthin (μg/g)

dụng trong hai nghiên cứu và sự có mặt hay không có EDTA.

Hình 3.20. Hàm lượng acid amin và astaxanthin của dịch thuỷ phân sau 6 giờ với các số đơn vị hoạt độ khác nhau, 550C

Từ việc phân tích trên, ở hoạt độ 30UI, hay nồng độ enzyme là 8% thì hàm

lượng astaxanthin thu được trong dịch thủy phân và hiệu suất thu hồi astaxanthin

đều cao nhất. Và bên cạnh đó, kết quả ở hình 3.20 cho thấy rằng, khi đầu tôm được thuỷ phân với hoạt độ 30UI ở 550C sau 6 giờ, hàm lượng astaxanthin và acid amin

đạt cao nhất. Từ đó, 30UI được coi là hoạt độ tối ưu để thuỷ phân đầu tôm.

56

3.3.3. Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thuỷ phân

Trong thí nghiệm này tiến hành khảo sát thời gian thuỷ phân, với hoạt độ

enzyme là 30UI, nhiệt độ 550C.

3.3.3.1. Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng acid amin trong dịch

thủy phân

Nhìn vào đồ thị được biểu diễn ở hình 3.21, ta thấy chiều hướng thay đổi

hàm lượng acid amin theo thời gian. Hàm lượng acid amin tăng khi thời gian thủy

phân kéo dài từ 0 giờ đến 6 giờ và giảm khi tiếp tục kéo dài thời gian thủy phân.

Ngoài ra, đồ thị có đỉnh tại điểm 6 giờ, điều này chứng tỏ rằng, sau khi thủy phân

được 6 giờ hàm lượng acid amin thu được cao nhất. Cụ thể như sau: sau 30 phút

thuỷ phân hàm lượng acid amin thu được trong dịch thuỷ phân là 1,60 mg/g phế

liệu. Trong 3 giờ thuỷ phân đầu tiên, hàm lượng acid amin sinh ra rất nhiều, tăng

thêm 1,51 mg/g phế liệu. Sau 6 giờ thuỷ phân, hàm lượng acid amin tiếp tục tăng,

tuy nhiên lượng acid amin chỉ tăng thêm 1,0473 mg/g phế liệu. Thời gian tiếp tục

tăng lên 9 giờ, hàm lượng acid amin lại giảm 0,3402 mg/g, và sau 12 giờ thuỷ phân

hàm lượng acid amin tiếp tục giảm 1,26696 mg/g. Điều này có thể được lý giải bởi

thời gian thuỷ phân kéo dài, sản phẩm thuỷ phân sinh ra ngăn cản enzyme tiếp xúc

với cơ chất làm cho vận tốc phản ứng thuỷ phân không tăng đáng kể, bên cạnh đó,

việc kéo dài thời gian thuỷ phân tạo điều kiện cho vi sinh vật sử dụng một phần sản

phẩm thuỷ phân được taọ thành sản phẩm thứ cấp như NH3 bay hơi. Và thực tế

trong thí nghiệm đã làm rõ điều này, dịch thuỷ phân sau 12 giờ bắt đầu có mùi hôi.

57

4.00

3.50

i

3.00

n m a d

2.50

2.00

) g / g m

(

1.50

i c a g n ợ ư

l

1.00

m à H

0.50

0.00

0h

9h

12h

3h 6h Thời gian thuỷ phân (giờ)

Hình 3.21. Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng acid amin thu được khi thủy phân ở 30UI và 550C

Trong kết quả nghiên cứu thu nhận carotenoprotein từ phế liệu đầu và vỏ tôm

sú bằng enzyme tách chiết từ đầu tôm, thời gian thuỷ phân kéo dài đến 15 giờ và

hàm lượng acid amin đạt của dịch thuỷ phân đạt cao nhất khoảng 40 mg/g, sau khi

đầu và vỏ tôm thuỷ phân được 9 giờ. Và trong nghiên cứu thu carotenoprotein bằng

cách thủy phân phế liệu tôm với tác nhân là enzyme trysin từ ca truyết của tác giả

A. Cano – Lopez, thời gian thuỷ phân kéo dài đến gần 30 giờ. Từ đó, kết quả của

nghiên cứu này so sánh với kết quả của 2 nghiên cứu nêu trên, ta thấy thời gian thuỷ

phân trong nghiên cứu này ngắn hơn so với 2 nghiên cứu trên, và hàm lượng acid

amin cũng thấp hơn. Nguyên nhân của sự khác nhau này có thể kể đến là loại

enzyme sử dụng, sự có mặt hay không của EDTA và nhiệt độ. Trong nghiên cứu

này, sử dụng enzyme protease thương mại, do đó, khi thủy phân đến 6 giờ, lượng

acid amin và peptide mạch ngắn được tạo ra nhiều ngăn cản sự tiếp xúc enzyme với

cơ chất, bên cạnh đó, lượng acid amin làm giảm pH của dịch thủy phân xuống thấp

hơn pH tối ưu của của enzyme mà nhà sản xuất đề nghị. Do đó, sau 6 giờ thủy phân

58

lượng acid amin và peptide mạch ngắn tạo ra không nhiều nhưng một số acid amin

lại bị bay hơi, nên hàm lượng acid amin giảm sau đó.

20.00

18.00

3.3.3.2. Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng astaxanthin.

i

16.00

14.00

12.00

10.00

) g / g µ (

8.00

n h n t a x a t s a g n ợ ư

6.00

l

4.00

m à H

2.00

0.00

0h

12h

3h 6h 9h Thời gian thủy phân (giờ)

Hình 3.22. Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng astaxanthin thu được khi thủy phân ở 30UI và 550C

Sự biến thiên hàm lượng astaxanthin theo thời gian được thể hiện trong hình

3.22 cho thấy, hàm lượng astaxanthin tăng dần qua các mốc thời gian, nhưng đạt

đến một thời gian nhất định, hàm lượng astaxanthin giảm xuống. Bên cạnh đó, đồ

thị còn cho thấy đỉnh cao nhất của hàm lượng astaxanthin là tại điểm 6 giờ của thời

gian thủy phân. Ngoài ra, nhìn vào đồ thị, từ điểm 3 giờ đến 6 giờ thủy phân, đồ thị

là một đoạn thẳng có độ dốc đứng, điều này chứng tỏ hàm lượng astaxanthin tăng

mạnh từ 3 giờ thủy phân đến 6 giờ thủy phân. Và khi xử lý số liệu theo phương

pháp thống kê ANOVA cho ta thấy hàm lượng astaxanthin sau 6 giờ thủy phân

được xếp hạng cao nhất, điều này càng làm cho ta tin rằng 6 giờ là thời gian thủy

phân tốt nhất. Sau khi thuỷ phân được 30 phút, lượng astaxanthin thu được là

3,02μg/g phế liệu, và sau 3 giờ thuỷ phân là 4,56 μg/g phế liệu. Hàm lượng

astaxanthin tiếp tục tăng đáng kể sau 6 giờ thuỷ phân, lúc này lượng astaxanthin thu

59

được là 14,68μg/g phế liệu, tăng lên 10,11μg/g phế liệu khi so sánh với hàm lượng

astaxanthin trong bột nhão carotenoprotein từ dịch thuỷ phân sau 3 giờ. Tuy nhiên,

hàm lượng astaxanthin lại giảm xuống còn 8,85μg/g phế liệu khi thời gian thuỷ

phân đạt đến 9 giờ, và 6,27 μg/g phế liệu đối với 12 giờ. Nguyên nhân của sự giảm

của hàm lượng astaxanthin khi kéo dài thời thuỷ phân có thể do chúng bị phân huỷ

dưới tác dụng của nhiệt độ. Lúc ban đầu, chúng còn liên kết mạnh mẽ với protein

nên bền vững, thời gian thuỷ phân kéo dài, protein bị phân huỷ sâu sắc tạo thành

các acid amin tự do và giải phóng astaxanthi tự do không bền, dễ bị phân huỷ.

Theo kết quả nghiên cứu thu hồi carotenoprotein bằng cách thủy phân phế

liệu tôm với tác nhân là enzyme trysin từ cá tuyết của tác giả A. Cano – Lopez, hiệu

suất thu hồi astaxanthin tăng dần qua các giờ thuỷ phân và đạt cao nhất khi thời gian

thuỷ phân gần 50 giờ. Trong nghiên cứu của A.Cano – Lopez được giữ ở nhiệt độ 40C, có lẽ việc khác nhau về nhiệt độ so với nhiệt độ trong nghiên cứu này làm nên

sự khác biệt về thời gian thuỷ phân và hiệu suất thu hồi astaxanthin. Và theo kết quả

nghiên cứu thu nhận bột carotenoprotein từ phế liệu đầu và vỏ tôm bằng enzyme

tách chiết từ đầu tôm, hàm lượng cartenoprotein tăng dần qua các mốc thời gian, đạt

cực đại sau 9 giờ thuỷ phân, và sau đó hàm lượng carotenoprotein giảm. Cũng như

hàm lượng acid amin, thời gian thuỷ phân để thu hồi astaxanthin trong nghiên cứu

này vẫn ngắn hơn thời gian thuỷ phân trong 2 nghiên cứu nêu trên. Việc này có thể

được giải thích bởi sự khác nhau về loại enzyme dùng để thủy phân và nhiệt độ thủy

phân. Trong nghiên cứu này sử dụng enzyme thương mại, nên có thể nó có hoạt tính

mạnh hơn so với enzyme được tách chiết, do đó thời gian thủy phân ngắn hơn.

3.4. Tối ưu hoá nhiệt độ và thời gian thuỷ phân phế liệu đầu tôm để thu sản phẩm

bột carotenoprotein

Mục đích của việc tối ưu hoá quá trình thuỷ phân phế liệu đầu tôm là để tìm

ra các thông số thời gian, nhiệt độ và nồng độ enzyme sử dụng cho kết quả thu nhận

carotenoprotein với hàm lượng acid amin và astaxanthin cao nhất. Trong đó,

astaxanthin được chú trọng hàng đầu vì giá trị kinh tế của nó cao hơn nhiều so với

bột đạm.

60

3.4.1. Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thuỷ phân

Căn cứ vào kết quả thực nghiệm, thông số được cung cấp bởi nhà sản xuất

enzyme và các bố trí thí nghiệm ở các nghiên cứu khác, thí nghiệm thuỷ phân phế

liệu đầu tôm bằng enzyme protease Tegalase R660L với mục đích thu nhận bột

carotenoprotein được xác định như sau:

Các yếu tố cố định:

+ Phế liệu đầu tôm, cắt nhỏ 1- 2cm, gia nhiệt 980C trong thời gian 10 phút.

+ Tỉ lệ phế liệu: nước cất là 1:3

+ Khuấy trộn đều dịch thuỷ phân sau mỗi nửa giờ.

Các yếu tố biến đổi cần tối ưu:

Các yếu tố biến đổi cần tối ưu bao gồm ba yếu tố: nhiệt độ, nồng độ enzyme

protease Tegalase R660L và thời gian thuỷ phân. Dựa vào các phân tích kết quả ở

mục 3.3, điều kiện biên của từng yếu tố được đề nghị theo bảng 3.3

Bảng 3.2: Khoảng biến thiên của các yếu tố cần tối ưu

khi thuỷ phân đầu tôm

Yếu tố cần tối ưu Ký hiệu Khoảng biến thiên

Nồng độ (%) C 5 - 11

Nhiệt độ (oC) T 45 -65

Thời gian thuỷ phân (giờ) Tg 0 - 12

3.4.2. Xác định chỉ tiêu tối ưu của quá trình thuỷ phân

Quá trình thuỷ phân phế liệu tôm được thực hiện với mục đích thu nhận bột

carotenoprotein, thực chất là thu nhận astaxanthin và protein. Trong phế liệu đầu

tôm, các astaxanthin thường không tồn tại riêng lẻ mà nằm trong phức với protein,

khi protein bị thuỷ phân dưới tác dụng của enzyme, các peptide mạch ngắn và acid

amin tự do được giải phóng ra, từ đó, astaxanthin bị kéo ra khỏi mạng lưới bao bọc

61

và hoà tan vào dịch thuỷ phân. Hàm lượng acid amin và peptide càng cao cũng

tương ứng hàm lượng astaxanthin càng cao, tuy nhiên, khi quá trình thuỷ phân diễn

ra sâu sắc thì phức chất carotenoprotein càng bị phá vỡ, giải phóng astaxanthin ở

dạng tự do nên chúng dễ bị oxy hoá.

Như vậy, quá trình thuỷ phân nhằm tới mục đích là thu nhận tối đa lượng

astaxanthin AsP  max và acid amin AP  max, trong đó chỉ số được chú ý đến

nhiều nhất là AsP (astaxanthin) vì chính chất này mang lại hiệu quả kinh tế cao cho

sản phẩm hơn.

3.4.3. Thiết lập phương trình hồi qui của hàm lượng acid amin AP và xác

định nhiệt dộ và thời gian tối ưu của quá trình thuỷ phân thu nhận

carotenoprotein.

Các số liệu sử dụng để thiết lập phương trình hòi qui AP là các số liệu thu

được về ảnh hưởng của nhiệt độ, nồng độ và thời gian đến hàm lượng acid amin AP

trong bột carotenoprotein thu được đã trình bày ở mục 3.3. Số liệu sử dụng thoả

mãn điều kiện là nằm trong khoảng biến thiên đã xác định. Trong nghiên cứu này sử

dụng phần mềm JMP để xử lý số liệu, đưa ra phương trình hồi qui cho hàm mục

tiêu AP.

3.4.3.1 Thiết lập phương trình hồi qui và phân tích ảnh hưởng của nồng

độ, nhiệt độ và thời gian tới thu hồi hàm lượng acid amin

Tương tự phương trình hồi qui 3.1, phương trình hồi qui của hàm lượng acid

amin với 2 yếu tố là nồng độ và thời gian là phương trình đa biến bậc hai. Phân tích hồi qui đa biến bậc hai với hai biến độc lập C, T, C2, T2 và tương tác đôi C*T (Bảng

3.14 Phụ lục B) cho kết quả phương trình hồi qui dạng:

AP= 4,2864796 + 0,2946429*T + 0,5160714*Tg + 0,0723214*T*Tg –

0,730102*T2 -1,394388*Tg2 (3.1)

Giá trị p= 0,0087 trong phân tích ANOVA của phương trình này nhỏ hơn

0,01 chứng tỏ tồn tại mối quan hệ tương tác giữa hai yếu tố nhiệt độ và thời gian ở mức độ tin cậy 99%, R2= 0,95, chứng tỏ phương trình có thể giải thích cho 95%

62

trường hợp thực nghiệm. Tuy nhiên, giá trị p= 0,6808 của biến T*Tg lớn hơn 0,1,

chứng tỏ chúng không ảnh hưởng mang tính chất thống kê ở độ tin cậy bằng hoặc

lớn hơn 90%, vì vậy nó cần loại bỏ. Phương trình 3.1 có thể được viết thành:

AP= 4,2864796 + 0,2946429*T + 0,5160714*Tg – 0,730102*T2 –

1,394388*Tg2 (3.2)

Từ phương trình 3.4, cho ta thấy hệ số của biến T là dương (0,2946429), điều

này cho thấy khi nhiệt độ tăng, giá trị hàm mục tiêu cũng tăng lên. Các hệ số của các biến trong phương trình hồi qui 3.4 cho thấy hệ số của biến T2 là âm, tuy nhiên,

bản thân nó mang giá trị rất lớn, do đó không thể kết luận gì về việc tăng giảm hàm

lượng acid amin. Vì vậy, ta cần vẽ bề mặt đáp ứng của hàm mục tiêu AP phụ thuộc

vào nhiệt độ và thời gian.

Bề mặt đáp ứng của hàm AP ở nồng độ enzyme C= 5% được biểu diễn ở

hình 3.23, thể hiện sự phụ thuộc của hàm AP vào nhiệt độ thủy phân và thời gian

thủy phân. Thông qua bề mặt đáp ứng, ta có thể xác định được nhiệt độ thủy phân

để hàm mục tiêu AP đạt giá trị cao nhất. Giá trị nhiệt độ thủy phân tối ưu được thể hiện ở bề mặt đáp ứng là 570C.

Như vậy, điều kiện có thể sử dụng để thủy phân đầu tôm nhằm thu được

nhiều acid amin là: thời gian thủy phân là 7 giờ và nhiệt độ là 570C.

63

Hình 3.23. Bề mặt đáp ứng của hàm AP ở nồng độ C= 5%

AP – Hàm lượng acid amin (mg/g), C – Nồng độ enzyme(%),

Tg – Thời gian (giờ)

64

3.4.3.2. Thiết lập phương trình hồi qui và phân tích ảnh hưởng của nhiệt

độ và thời gian tới thu hồi astaxanthin.

Và cũng giống như phương trình hồi qui của hàm lượng astaxanthin phụ

thuộc vào nồng độvà thời gian, phương trình hồi qui của hàm lượng astaxanthin phụ

thuộc vào nhiệt độ và thời gian cũng là phương trình bậc hai. Phân tích hồi qui đa biến bậc hai với hai biến độc lập C, Tg, C2, Tg2 và tương tác đôi C*Tg (Bảng 3.15

Phụ lục B) cho kết quả phương trình hồi qui dạng:

AsP= 14,527371 – 1,6879*T – 0,622733*Tg – 0,0273*T*Tg – 2,631143*T2 (3.3) – 3,699343*Tg2

Giá trị p= 0,0008 của phương trình này nhỏ hơn 0,01, chứng tỏ rằng, quan hệ giữa hai yếu tố này ở mức tin cậy 99%. Bên cạnh đó, giá trị R2= 0,99, điều này cho

thấy, phương trình này đúng cho 99% trường hợp thực nghiệm. Tuy nhiên, giá trị

p= 0,9216 của biến T*Tg lớn hơn 0,1, điều này chứng tỏ nó không ảnh hưởng hàm

mục tiêu về mặt thống kê ở mức độ tin cậy bằng hoặc lớn hơn 90%, vì vậy cần loại

bỏ chúng khỏi phương trình. Phương trình hồi qui được viếc viết lại như sau:

AsP= 14,527371 – 1,6879*T – 0,622733*Tg – 2,631143*T2 – 3,699343*Tg2

(3.4)

Các hệ số của các biến trong phương trình 3.4 đều mang dấu âm, nên không

thể thấy được sự thay đổi giá trị của hàm AsP khi thay đổi các yếu tố thời gian và

nhiệt độ. VÌ vậy, ta cần vẽ bề mặt đáp ứng hàm mục tiêu AsP phụ thuộc vào nhiệt

độ và thời gian.

Theo như bề mặt đáp ứng được thể hiện ở hình 3.24, khoảng nhiệt độ tối ưu được cho thấy là từ 50 đến 550C, và nhiệt độ tối ưu được khuyến khích sử dụng trong thủy phân là 52,50C. Và thời gian thủy phân tối ưu được trình bày ở bề mặt

đáp ứng trên cho thấy thời gian thủy phân tối ưu là 6 giờ.

65

Hình 3.24. Bề mặt đáp ứng của hàm AsP ở nồng độ enzyme C= 5%

AsP – Hàm lượng astaxanthin (µg/g), T – Nhiệt độ(0C),

Tg – Thời gian (giờ)

Như vậy điều kiện thủy phân thích hợp để thu hồi nhiều astaxanthin nhất là

thời gian thủy phân là 6 giờ và nhiệt độ là 52.5oC.

66

Bảng 3.3. Thông số nhiệt độ và thời gian tối ưu của quá trình thu nhận bột

carotenoprotein

Yếu tố AP AsP

Nhiệt độ 570C 52,50C

Thời gian 7 giờ 6 giờ

Như đã phân tích ở phần trên, việc thu nhận carotenoprotein nhằm vào hai

mục tiêu là hàm lượng acid amin đạt tối đa AP →max và hàm lượng astaxanthin đạt

cực đại AsP → max, trong đó hàm mục tiêu AsP được chú trọng nhiều hơn, vì chất

màu này mang giá trị kinh tế cao hơn, và sự lựa chọn thông số tối ưu cũng tuân theo

nguyên tắc này. Một điều thật sự đáng chú ý đó là sự khác nhau của các thông số để

đạt được hai mục tiêu acid amin và astaxanthin là không khác nhau đáng kể, cũng

có nghĩa là thông số thủy phân tối ưu để thu nhận astaxanthin cao nhất được chọn

thì đó cũng là điều kiện rất tốt, gần như tối ưu để giá trị hàm lượng acid amin cũng

cao xấp xỉ giá trị tốt nhất. Từ những lập luận trên và bảng 3.4, cùng với phân tích ở

mục 3.3, kết luận được đưa ra là, các thông số nhiệt độ và thời gian tối ưu của quá

trình thủy phân phế liệu đầu tôm thu nhận bột carotenoprotein sẽ là: nhiệt độ thủy phân: 55 ± 2,5oC, thời gian: 6 giờ và nồng độ enzyme khuyến khích sử dụng: 7 -

10%.

3.5. Sơ bộ đánh giá về chất lượng của bột nhão carotenopotein thu nhận

từ phế liệu đầu tôm theo thông số tối ưu và đánh giá kết quả thu astaxanthin với

các nghiên cứu tách chiết astaxanthin bằng các tác nhân khác.

Mô tả cảm quan của bột nhão carotenoprotein: hạt bột mịn, màu đỏ cam tươi

sáng, thơm mùi thịt tôm nấu chín. Như vậy, những đánh giá cảm quan của bột nhão

carotenoprotein có vẻ tốt cho mục đích thực phẩm. Bột không những giàu acid amin

mà còn chứa astaxanthin, một chất chống oxy hóa hữu hiệu từ nguồn gốc thiên

nhiên đang được quan tâm, bởi nó mang lại lợi ích cho vật nuôi cũng như con

người.

67

Bảng 3.4: Thành phần hóa học trong bột carotenoprotein

82,14 ± 0.59 Độ ẩm (%)

89,78 ± 0,53 Astaxanthin (µg/g)

Trong nước và trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu trong việc tách chiết

astaxanthin từ phế liệu tôm sú bằng các tác nhân khác nhau như: dung môi hữu,

dung môi vô cơ và dầu cọ. Những tác nhân này cho kết quả hiệu suất thu hồi

astaxanthin cũng như carotenoid rất cao.

Với nghiên cứu tách chiết carotenoprotein từ đầu tôm bằng việc sử dụng tác

nhân là acid hữu cơ và acid vô cơ của tác giả Phạm Đan Phượng cho thấy, hàm

lượng astaxanthin thu được 473,9 ppm và hàm lượng protein là 57,8% với điều

kiện thủy phân là 1 giờ thủy phân với HCl 2% và sau đó tiếp tục thủy phân với

HCCOH 4% thêm 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Còn trong nghiên cứu này, kết quả hàm

lượng astaxanthin thu được cao nhất chỉ ở mức 14,709 ppm và hàm lượng protein

chỉ ở mức 15,31%. Kết quả này quá thấp khi so sánh với kết quả của nghiên cứu của

tác giả Phạm Đan Phượng với tác nhân là acid HCl và HCOOH.

Bên cạnh đó, khi so sánh với kết quả của nghiên cứu thu nhận carotenoid từ

phế liệu tôm bằng dung môi hữu cơ của tác giả N.M Sachindre cũng cho thấy kết

quả thu được trong nghiên cứu này vẫn còn quá thấp. Cụ thể như sau, bằng việc sử

dụng hỗn hợp 50:50 isopropyl acetone và hexane hàm lượng astaxanthin thu được

cao nhất là 43,9 µg/g, kết quả này cao hơn 29,191µg/g so với hàm lượng

astaxanthin trong bột carotenoprotein thu được bằng tác nhân thủy phân bằng

enzyme protease Tegalase.

Và kết quả hàm lượng astaxanthin thu được trong nghiên cứu này tiếp tục

thấp hơn khi được so sánh với kết quả thu được bằng tác nhân là dầu cọ trong

nghiên cứu của tác giả Akdes Dewi, cũng như tác nhân tách chiết là dầu đậu phộng

trong nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Hoa. Hàm lượng astaxanthin trong bột

carotenoprotein thu được bởi việc thủy phân bằng enzyme protease Tegalase thấp

68

hơn 117,034µg/g khi so với hàm lượng astaxanthin cao nhất trong nghiên cứu tách

chiết bằng dầu cọ, và thấp hơn 11,871 µg/g khi so với nghiên cứu của tác giả Đinh

Thị Hoa.

Từ việc so sánh bên trên, cho thấy với các tác nhân acid hữu cơ, acid vô cơ,

dầu cọ và dầu đậu phộng mang lại hiệu quả thu là hồi astaxanthin cao hơn việc sử

dụng enzyme protease Tegalase.Tuy nhiên, với các tác nhân trích ly hóa học thì sản

phẩm thu hồi được không thể dùng làm thực phẩm cho người, và với các tác nhân là

dầu cọ và dầu đậu phộng thì không thu hồi được protein, là một thành phần dinh

dưỡng và giàu có trong phế liệu đầu tôm. Bên cạnh đó, việc tách chiết astaxanthin

bằng phương pháp trích ly sẽ thu được astaxanthin ở dạng tự do, vì vậy chúng dễ bị

oxy hóa, không bền.

69

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

Điểm pI của protein trong phế liệu đầu tôm sú P.monodon dùng trong nghiên

cứu này là 4,5.

Điều kiện tối ưu của quá trình thủy phân phế liệu đầu tôm sú P.monodon

bằng enzyme protease Tegalase là: nồng độ enzyme là 8% (30UI), nhiệt độ thủy phân là 52,50C, thời gian thủy phân là 6 giờ để thu được hàm lượng astaxnathin là

16,6 µg/g phế liệu và hàm lượng acid amin là 3,4mg/g phế liệu đầu tôm.

4.2. Kiến nghị

Trong đề tài này chỉ tiến hành thủy phân phế liệu đầu tôm sú P.monodon

bằng enzyme protease Tegalase R660L với sự bổ sung nước cất để đánh giá hàm

lượng acid amin có trong dịch thủy phân và hàm lượng astaxanthin trong bột nhão

carotenoprotein. Do thời gian thực hiện nghiên cứu có hạn nên nhiều mục tiêu còn

chưa thực hiện được. VÌ vậy, một số kiến nghị được đưa ra như sau:

Nghiên cứu tỉ lệ bổ sung EDTA vào phế liệu đầu tôm để tăng hiệu quả thủy

phân.

Xác định mức độ thủy phân khi sử dụng enzyme protease Tegalase R660L

để đánh giá hiệu quả thủy phân.

Nghiên cứu phương pháp sấy để thu hồi bột carotenoprotein ở dạng khô nhằm

kéo dài thời gian bảo quản và điều kiện bảo quản đơn giản, dễ dàng ứng dụng vào

trong mỹ phẩm và thực phẩm

Nghiên cứu kết hợp hai loại enzyme protease để thủy phân phế liệu đầu tôm

nhằm tăng hiệu quả thu hồi astaxanthin, acid amin và peptide mạch ngắn.

Nghiên cứu kết hợp enzyme protease và enzyme lipase để thủy phân phế liệu

đầu tôm để dễ dàng tách nước nhằm thu được nhiều bột carotenoprotein với hàm

lượng astaxanthin cao.

Nghiên cứu tỉ lệ chitosan bổ sung vào dịch nhằm hỗ trợ việc tủa

carotenoprotein để giảm thời gian lắng.

70

Xác định các thành phần hóa học có trong bột carotenoprotein nhằm

đánh giá chất lượng bột để xem xét khả năng ứng dụng vào mỹ phẩm, thực

phẩm,…

Đánh giá thành phần acid amin có trong bột carotenprotein thu được từ quá

trình thủy phân phế liệu đầu tôm từ tôm sú được nuôi trồng tại Cà Mau, và so sánh

với các thành phần có trong bột carotenoprotein thu được bằng việc thủy phân phế

liệu đầu tôm từ tôm sú được nuôi trồng tại vùng khác.

71

Phế liệu đầu tôm

Cắt nhỏ 1- 2cm

Nâng nhiệt lên nhiệt độ thuỷ phân (550C)

Bổ sung nước cất

Bổ sung enzyme Protease 8%

Thuỷ phân trong thời gian 6 giờ

Lọc qua vải thô

Kết tủa bằng HCl10% ở các giá trị pH= 4,5

Ly tâm 4.000 vòng/phút, 40 phút

Bột nhão carotenoptrotein

Hình 4.1. Quy trình thu nhận bột nahxo carotenoprotein

72

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

[1] Tổng quan ngành thủy sản Việt Nam, Hiệp hội chế biến và xuất khẩu thủy sản Việt

Nam.

http://vasep.com.vn/1192/OneContent/tong-quan-nganh.htm

[2] Chiết rút chế phẩm đạm giàu carotenoid từ đầu tôm thẻ chân trắng, Phạm Thị Đan

Phượng, Trần Thị Luyến. Tạp chí Khoa học – Công nghệ thuỷ sản số 1/2013.

[3] Nguyễn Trọng Cẩn (1998), Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản nông nghiệp,

Tp.Hồ Chí Minh.

[4] Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản Đại học quốc gia,

Tp.Hồ Chí Minh.

[5] ThS.Trần Thị Ngọc Mai và TS. Nguyễn Ngọc Hồng, Enzyme, Hoá sinh, Đại học

Công nghệ Tp.HCM,107 - 155

[6] Hoàng Yến (2015), Astaxanthin trong nuôi tôm, Theo tạp chí thuỷ sản Việt Nam,

15/12/2015.

[7] Lê Thị Thuỳ Nga (2012), Tối ưu hoá quá trình trích ly astaxanthin từ vỏ tôm bằng

dầu thực vật, Đề tài nghiên cứu khoa học, Đại học Bà Rịa – Vũng Tàu.

[8] Phạm Thị Đa Phượng, Nguyễn Công Minh, Nguyễn Thị Như Thường, Ngyễn Văn

Hoà, Anil Kumar Anal, Trang Sĩ Trung (2016), Trích carotenoprotein từ đầu tôm sử

dụng acid vô cơ và acid hữu cơ.

[9] Phạm Thị Đan Phượng, Tách chiết và thu nhận phế phẩm carotenoprotein từ phế

liệu tôm và ứng dụng,Tạp chí Khoa học – Công nghệ thuỷ sản số 4/2015,142 – 150.

[10] Phạm Thị Đan Phượng, Trần Thị Luyến, Chiết rút chế phẩm đạm giàu carotenoid

từ đầu tôm thẻ chân trắng, Tạp chí Khoa học – Công nghệ thuỷ sản số 1/2013.

[11] ThS.Ds. Nguyễn Hồng Khánh, Chất chống oxy hóa astaxanthin - Những điều

cần biết, Tổng hội y học Việt Nam – Viện y học ứng dụng Việt Nam, 24/52016.

73

[12] TS. Nguyễn Lệ Hà, Nghiên cứu tách chiết và ứng dụng enzyme protease từ tôm sú

Penaeus monodon vào chế biến thuỷ sản, Luận án Tiến sĩ kỹ thuật, Đại học Nha Trang.

Tiếng Anh

[13] A.Cano – Lopez,B.K. Simpson, and N.F. Haard, Extraction of carotenprotein from

shrimp process wastes with the aid of trysin from atlantic cod.

[14] Akdes Dewi Handayani, Deparrment of Chemical Engineering, Widya Mandala

Surabaya Catholic University, Kalijudan 37, Surabaya 60114, Indonesia, Extraction of

astaxanthin from giant tiger (Penaeus monodon) shrimp waste using palm oil: Studies

of extraction kinetics and thermodynamic.

[15] Berhard, K., “Synthetic astaxanthin. The route of carotenoid from research to

commercialization”, In: “Carotenoids: Chemistry and Biology” N,I, Krinsky et al,

(editors), Plenum Press, New York, 1990,pp, 337 – 363.

[16] Cheesman D.F., Lee W.L. & Zagalsky P.F. (1967), “Carotenoprotein in

invertebrate”, Biol, Rev, 42, 131 – 160.

[17] Higuera – Ciapara et al., 2006.

[18] Journal of Fisheries science and Technology – No3 – 2016.

[19] Klomaklao S., Benjakul S., Viessanguan W., Kishimura H., and Simpson B.K.,

(2009), “Extraction of carotenoprotein from black tiger shrimp shells with the aid of

bluefish trysin” J.Food Biochem.33:201 – 217.

[20] Li et al.,2011, An economic assessment of astaxanthin production by large scale

cultivation of Haematococcus pluvialis, 29, 11 – 12/2011, 568 – 574.

[21] Miki W., (1991), “Biological function and activities of animal carotenoids”, Pure

& Appl. Chem., 63: 141 – 146.

[22] N.M.Sachidra, N.Bhaskar, N.S Mahendrakar (2005), Recovery of carotenoids

from shrimp waste in organic solvents, Deparrtment of Meat, Fish and Poultry

Technology, Central Food Technological Research Insritute, Mysore 570013, India.

[23] Natalia Mezzomoand Sndra R.S. Ferreira (2016), Review article Carotenoids

Functionality, Sources, and Processing by Supercritical Technology: A review.

74

[24] R.Armenta – Lospez, I.Guerrero L., and S.Huerta (2002), Astaxanthin extraction

from shrimp waste by lactic fermentation and enzymatic hydrolysis of carotenprotein

complex,Journal of food science, 67, 2002

[25] Seung H.L, Seung K.R., Ki H.P & Kwang R.Y. (1999), “Effective extration of

astaxanthin pigment from shrimp using preteolytic enzymes”, Biotechnol. Bioprocess

Eng. 4 (3), 199 – 204.

[26] Sirima Takeungwongtrakul, Soottawat Benjakul, Aran H-kittikun, Food

Chemistry, 2012. Lipids from cephalothorax and hepatopancreas of Pacific white

shrimp (Litopenaeus vannamei): Compositions and deterioration as affected by iced

storage. 134, 2066 – 2074.

[27] The biochemistry of natural pigment – G.Britton – 1983.

[28] Wade et al.2005; Tume et al., 2009, Effect of background colour on the

distribution of astaxanthin in black tiger prawn (Penaeus monodon): Effective method

for improvement of cooked colour, 11/2009, 129 – 135.

[29] Wang (2007), On the relative efficiency of two- vs. one-stage production of

astaxanthin by the green alga Haematococcus pluvialis.

[30] Zagalsky P.F (1984), “Invertebate Carotenoiprotein” In Methods in Enzymology

(pp. 216 – 247). New York, NY: Academic Press.Sowmya and Sachindra, 2012,

Senphan et al ,2014.

75

PHỤ LỤC A

PHƯƠNG PHÁP DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU

1. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease (phương pháp Anson

cải tiến)

1.1. Nguyên tắc: Dùng protein “casein” làm cơ chất xúc tác định hoạt tính

phân giải protein của enzyme protease trên cơ sở định lượng sản phẩm

tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin. Dựa

vào đồ thị chuẩn để tính lượng Tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm

thuỷ phân dưới tác dụng của enzyme.

1.2. Dụng cụ và hóa chất

1.2.1. Dụng cụ

Ống nghiệm

Pipet 1ml,2ml,3ml,5ml,10ml

Máy quangphoor

Becher 50ml, 250ml, 500ml

Bình tia

1.2.2. Hoá chất

Dung dịch HCl 0.2N

Dung dịch NaOH 0.5N

Dung dịch Trichloracetic 5%

Dung dịch Tyrosin chuẩn 1mM/l trong dung dịch HCl0.2N

Thuốc thử Folin

1.3. Xây dựng đường chuẩn tyrosine

Các bước dựng đường chuẩn tyrosin

1

Ống nghiệm Dung dịch hóa chất 0 1 2 3 4 5 6

Dung dịch Tyrosin chuấn 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1 (ml)

Nồng độ tyrosin tương 0 0.02 0.04 0.08 0.12 0.16 0.2 ứng (µmol/ml)

Dung dịch HCl 0.2N (ml) 5 4 4.9 4.8 4.6 4.4 4.2

Dung dịch NaOH 0.5N (ml) 10 10 10 10 10 10 10

Thuốc thử Folin 3 3 3 3 3 3 3 (ml)

Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sống 660nm

Đường chuẩn Tyrosine

0.6

y = 2.5341x + 0.015 R² = 0.9994

0.5

0.4

D O

0.3

0.2

0.1

0

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

Nồng độ tyrosine (μmol/ml)

Hình 1. Hàm lượng tyrosin theo mật độ quang

1.4. . Phương pháp tiến hành

Lấy 6 ống nghiệm sạch, khô, tiến hành làm 3 óng thử thật,3 ống thử không

Các bước chuẩn bị mẫu enzyme để đo hoạt tính

2

Ống nghiệm Dung dịch hóa chất Thử thật Thử không

5 Dung dịch casein 1% (ml) 5

0 Dung dịch TCA 5% 10

1 1

Dung dịch enzyme mẫu (ml) Lắcđều và giữ ở 35.5oC trong 20 phút

Dung dịch TCA 5% (ml) 10 0

Để yên 30 phút, lọc lấy dịch trong

Lấy 2 ống nghiệm mới khác, cho vào ống thứ nhất 5ml dịch lọc của ống thử

thật và cho vào ống thứ hai 5ml dịch lọc của ống thử không.

Tiếp tục thêm vào mỗi ống 10ml NaOH 0.5N và 3ml folin, lắc mạnh, sau 10

phút đo oD ở bước song 660nm. Tính OD= ODTT -ODTK, sau đó dựa vào đồ thị

chuẩn suy ra được số µM tyrosin.

1.5. Tính kết quả

Định nghĩa đơn vị Anson: một đơn vị Anson là lượng enzym tối thiểu trong điều kiện thí nghiệm (35,50C: pH 7,6 …) thủy phân Casein trong 1 phút tạo thành sản

phẩm hòa tan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở bước

sóng 660nm tương ứng với 1µM Tyrosin trong đường chuẩn.

Hđ Protease =

Với: Hđ Protease : hoạt độ enzym protease (UI/g)

V : tổng thể tích hỗn hợp trong ống thử thật hoặc ống thử không (ml)

v : thể tích dịch lọc đem phân tích (ml)

t : thời gian thủy phân (phút)

3

m : khối lượng mẫu enzym đem đi xác định hoạt tính (g)

L: độ pha loãng enzym

µM Tyrosin: lượng µM Tyrosin trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn

2. Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford

Trong các phương pháp xác định hàm lượng protein thì đây là phương pháp có

độ nhạy cao, có thể xác định tới 1g, hoá chất đơn giản ít tốn thời gian. Một ưu

điểm lớn của phương pháp này là ít bị cản trở bởi các hoá chất sử dụng trong nghiên

cứu protein, nhất là amoniumsulfate.

2.1. Nguyên tắc

Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc

nhuộm Coomassie Brillant Blue khi tạo phức hợp với protein. Trong dung dịch

mang tính acid khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm ở dạng màu đỏ có bước

sóng hấp thu cực đại là 465 nm và khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm chuyển

sang dạng màu xanh dương và hấp thu cực đại ở mức cực đại ở bước sóng 595 nm.

Độ hấp thu ở bước sóng 596 nm có liên hệ một cách trực tiếp với nồng độ protein.

Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung

dịch protein chuẩn đã biết được nồng độ. Sau khi cho dung dịch protein vào thuốc

nhuộm màu, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1giờ. Tiến hành đo dung dịch

bằng máy quang phổ kế (Spectrophotometer) ta được ODx, độ hấp thụ sẽ tỷ lệ với

lượng protein trong mẫu. Thực hiện một đối chứng với HCl (ODo). Lấy giá trị OD

= ODX – ODO. Lượng protein trong mẫu dung dịch đo được xác định bằng cách dựa

vào đường chuẩn từ giá trị OD ở trục tung, từ đó suy ra giá trị nồng độ protein

tương ứng trên trục hoành.

2.2. Hoá chất

 Dung dịch albumine 0.1%.

 Nước cất

 Dung dịch thuốc thử Bradford: thành phần thuốc thử trong 100 ml như sau

4

o Coomassie Brilliant Blue: 0.001g.

o Ethanol tuyệt đối: 4.7 g.

o Phosphoric acid: 85%.

Phẩm màu Coomassie Brilliant Blue được hoà tan trong ethnol trong một chai

đựng màu tối có nắp, bổ sung phosphoric acid và chỉnh tới 100 ml bằng nước cất. Lắc đều và giữ lạnh dưới 4oC.

2.3. Tiến hành

 Dựng đường chuẩn albumine

Pha loãng dung dịch albumine thành các nồng độ khác nhau: 0, 10, 20, 30, 40,

50, 60, 70, 80, 90, 100 g/ml.

Bảng 1.1. Dựng đường chuẩn albumine

Đối Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 chứng

Nồng độ 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 (g/ml)

Dung dịch

albumin 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

chuẩn (l)

Nước cất (l) 1000 990 980 970 960 950 940 930 920 910

Thuốc thử 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Bradford (ml)

5

Đường chuẩn albumin

0.9

0.8

y = 0.0067x + 0.2565 R² = 0.9924

0.7

0.6

D O

0.5

0.4

i

ị r t á G

0.3

0.2

0.1

0

0

10

20

70

80

90

40

50

30 60 Nồng độ Albumin μg/ml

Hình 2. Đường chuẩn albumin

Ống số 0 tương ứng với ống đối chứng chứa nước cất. Tất cả các ống sau khi

pha đúng nồng độ, để khoảng 20 phút.

Tiến hành đo mật độ quang của dung dịch ở bước sóng 595 nm.

 Dựng đường chuẩn.

Định lượng protein trong mẫu thí nghiệm

Lấy 1ml mẫu thí nghiệm cho vào ống nghiệm, thêm vào 2 ml thuốc thử Bradford.

Đem đo mật độ quang ở bước sóng 595 nm.

Từ đó suy ra hàm lượng protein có trong mẫu thí nghiệm.

Mẫu được pha loãng sao cho mật độ quang đo được trong khoảng đường chuẩn.

2.4. Tính toán kết quả

Từ phương trình đường chuẩn và mật độ quang của mẫu khoả sát ta suy ra hàm

lượng protein của mẫu là X (g/ml) có trong m (g) nguyên liệu.

Vậy lượng protein có trong 1 gam nguyên liệu là:

Hàm lượng protein (mg/g) =

X 1000. m

3. Phương pháp Tolasa đo hàm lượng astaxanthin.

Mẫu tôm (hoặc bột carotenoprotein) được chiết ba lần bằng acetone với tỉ lệ mẫu:

acetone bằng 1:5. Để tách các thành phần tan trong nước, dịch chiết acetone được

6

bổ sung hexane với tỉ lệ gấp 4 lần mẫu và đưa vào phễu chiết, thêm 0.5g NaCl,

Na2SO4và thêm 20ml nước cất, lắc nhẹ phễu chiết và để yên trong bóng tối đến khi

2 pha tách hoàn toàn. Lớp hexane phía trên được tách ra và định mức lên 10ml, đo

độ hấp thụ ở bước song 470nm trên thiết bị đo UV – Vis. Hàm lượng astaxanthin

được xác định dựa vào đường chuẩn astaxanthin 0.5µmol/ml.

Đường chuẩn astaxanthin

1.4

1.2

y = 0.0055x - 0.1213 R² = 0.996

1

D O

0.8

i

0.6

ị r t á G

0.4

0.2

0

0

50

100

200

250

300

150 Hàm lượng astaxanthin μg/ml

Hình 3. Đường chuẩn astaxanthin

4. Xác định hàm lượng chất béo (TCVN 4331 : 2001)

4.1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng chất béo trong thức ăn

chăn nuôi.

Phương pháp này áp dụng đối với thức ăn chăn nuôi trừ hạt có dầu và khô dầu.

Theo phương pháp này, người ta phân biệt hai nhóm thức ăn gia súc. Những sản

phẩm thuộc nhóm B cần thủy phân trước khi chiết chất béo.

Nhóm B:

7

- Thức ăn hoàn toàn có nguồn gốc từ động vật bao gồm cả các sản phẩm từ sữa;

- Thức ăn hoàn toàn có nguồn gốc từ thực vật do vậy không thể chiết chất béo mà

không qua quá trình thủy phân; đặc biệt là gluten, nấm men, protein của đậu tương và

khoai tây, và những thức ăn đã qua xử lý nhiệt;

- Thức ăn hỗn hợp gồm những sản phẩm chứa ít nhất 20 % chất béo.

Nhóm A:

- Những thức ăn gia súc không thuộc nhóm B.

Chú thích – Phương pháp xác định hàm lượng dầu trong khô dầu bằng cách chiết

bằng hexan được mô tả trong ISO 734-1 [2], còn phương pháp xác định hàm lượng dầu

bằng cách chiết dietyl ete được mô tả trong TCVN 4802-89 (ISO 736 [3]). Phương

pháp xác định hàm lượng dầu trong hạt có dầu bằng cách chiết bằng hexan được mô tả

trong ISO 659 [1].

4.2. Nguyên tắc

Mẫu có hàm lượng chất béo tương đối cao (ít nhất là 200 g/kg) được chiết sơ bộ

bằng xăng nhẹ.

Những mẫu thuộc nhóm B được thủy phân bằng axit clohydric nhờ tác dụng của

nhiệt. Dung dịch được làm nguội và đem lọc. Rửa và làm khô cặn thu được sau đó

chiết bằng xăng nhẹ. Loại bỏ dung môi bằng cách chưng cất và làm khô. Đem cân phần

thu được. Những mẫu thuộc nhóm A được chiết bằng xăng nhẹ. Loại bỏ dung môi

bằng cách chưng cất và làm khô. Đem cân phần thu được.

4.3. Thuốc thử và hóa chất

Chỉ dùng những thuốc thử được công nhận dùng trong phân tích.

Nước: ít nhất phải ở mức loại 3 theo TCVN 4851 – 89 (ISO 3696).

Natri sunfat: khan.

8

Xăng nhẹ: gồm chủ yếu hydrocacbon có sáu nguyên tử cacbon, dải nhiệt độ sôi từ 40oC đến 60oC.

Chỉ số brom phải nhỏ hơn 1. Cặn bay hơi phải nhỏ hơn 20 mg/l.

Có thể thay thế bằng hexan vì cũng có cặn bay hơi nhỏ hơn 20 mg/l.

Tinh thể cacbua silic hoặccác bi thủy tinh.

Aceton.

Axit clohydric: c(HCl) = 3 mol/l.

Chất trợ lọc: ví dụ diatomit (Kieselguhr), đã được đun sôi trong axit clohydric nồng độ 6mol/l trong 30 phút, dùng nước rửa sạch axit rồi sấy khô ở 130oC.

4.4. Thiết bị, dụng cụ

Thiết bị thường dùng trong phòng thí nghiệm, bao gồm những thiết bị sau

Phễu chiết: không dính mỡ và dầu, phải rửa bằng ete.

Bộ chiết Soxhlet: có dung tích si phông khoảng 100 ml hoặc bộ chiết tuần hoàn khác.

Thiết bị đun nóng: điều chỉnh được nhiệt độ, nhưng không trực tiếp với nguồn nhiệt.

Tủ sấy.

Tủ sấy chân không.

Bình hút ẩm: chứa chất hút ẩm hiệu quả.

4.5. Lấy mẫu

Phương pháp lấy mẫu không qui định tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo ISO 6497 [4].

Mẫu gửi đến phòng thí nghiệm là mẫu phải trung thực và có tính đại diện, không bị hư

hại hoặc biến đổi thành phần trong quá trình vận chuyển và bảo quản. Trong quá trình

bảo quản mẫu giảm tối thiểu sự hư hại và sự biến đổi thành phần của mẫu.

4.6. Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6952:2001 (ISO 6498).

4.7. Cách tiến hành

4.7.1. Chọn quy trình

Nếu mẫu thử khó nghiền hoặc khó đồng nhất do hàm lượng chất béo cao (trên 200

g/kg) thì làm theo 4.7.2.

Các trường hợp khác làm theo 4.7.3

9

4.7.2. Chiết sơ bộ

Cân ít nhất 20 g (m0) mẫu thử đã chuẩn bị, chính xác đến 1 mg và trộn với 10 g

natri sunfat khan. Chuyển toàn bộ vào phễu chiết và bịt nút bông không chứa

chất béo.

Cho vài tinh thể cacbua silic vào bình khô. Nếu tiến hành kiểm tra chất lượng

chất béo tiếp theo thì sử dụng các bị thủy tinh thay cho các tinh thể cacbua silic.

Lắp bình vào bộ chiết để thu phần chiết xăng nhẹ.

Lắp phễu chiết vào bộ chiết và tiến hành chiết chất béo bằng xăng nhẹ trong 2 giờ.

Điều chỉnh thiết bị đun nóng vừa phải, nếu dùng loại chiết Soxhlet thì trong 1 giờ thực

hiện ít nhất 10 lần chiết tuần hoàn, hoặc tốc độ chảy ít nhất là 5 giọt trong 1 giây

(khoảng 10 ml/phút) nếu dùng thiết bị chiết tương tự. Pha loãng phần xăng nhẹ chiết

được trong bình đến 500 ml bằng xăng nhẹ và trộn đều.

Cân (m1) bình khô, chính xác 1 mg, có chứa vài tinh thể cacbua silic hoặc bi thủy tinh.

Dùng pipet hút 50 ml dung dịch xăng nhẹ cho vào bình này.

Đun nóng bình cho bay gần hết dung môi. Thêm vào bình 2 ml aceton, lắc đều và đun

nóng nhẹ thiết bị đun nóng (6.3) để đuổi aceton. Đuổi hết những vết aceton cuối cùng. Làm khô cặn thu được trong 10 phút trong tủ sấy ở 103oC. Làm nguội trong bình hút

ẩm và cân (m2) chính xác đến 0,1 mg. Hoặc có thể áp dụng quá trình sau:

Làm bay hết dung môi. Làm khô cặn thu được trong bình trong 1,5 giờ trong tủ sấy chân không ở 80oC. Để nguội trong bình hút ẩm và cân (m2) chính xác đến 0,1 mg.

Cho cặn chiết trong phễu chiết khô trong không khí để bay hết dung môi. Cân (m3) cặn

này chính xác đến 0,1 mg. Nghiền cặn đến khi kích thước hạt đạt 1 mm.

4.7.3. Phần mẫu thử

Cân 5 g mẫu (m4) đã chuẩn bị ở trên chính xác đến 1 mg.

Đối với mẫu thuộc nhóm B làm theo 4.7.4.

Đối với mẫu thuộc nhóm A, chuyển phần mẫu thử vào phễu chiết và đậy bằng bông

sạch không chứa chất béo. Làm theo 4.7.5.

4.7.4. Thủy phân

10

Chuyển phần mẫu thử vào cốc có mỏ dung tích 400 ml hoặc vào bình tam giác dung

tích 300 ml.

Thêm 100 ml axit clohydric và vài tinh thể cacbua silic. Đậy cốc bằng mặt kính đồng

hồ hoặc đậy bình bằng nút nhám. Đem đun nhẹ trong 1 giờ. Cứ 10 phút khuấy nhẹ một

lần để tránh hiện tượng đóng dính trên thành cốc hoặc bình.

Làm nguội ở nhiệt độ phòng và thêm một ít chất trợ lọc đủ để tránh mất chất béo trong

quá trình lọc. Lọc ướt, dùng giấy lọc kép không chứa chất béo lọc qua phễu Buchner

có gắn máy hút.

Rửa cặn bằng nước lạnh đến khi thu được lọc trung tính.

Chú ý – Nếu xuất hiện dầu hoặc mỡ trên bề mặt phần lọc, có thể dẫn đến kết quả sai.

Do vậy, phải lặp lại quy trình với phần mẫu nhỏ hơn hoặc dùng axit nồng độ cao hơn.

Cẩn thận lấy phễu lọc ra và cho giấy lọc kép cùng cặn thu được vào phễu chiết và làm khô trong tủ sấy chân không trong 60 phút ở 80oC. Lấy phễu ra và đậy bằng nút bông

không chứa chất béo.

4.7.5. Chiết

Cho vài tinh thể cacbua silic vào bình khô và cân (m5) chính xác đến 1 mg. Nếu sau đó

còn kiểm tra chất lượng chất béo thì dùng bi thủy tinh thay cho tinh thể cacbua silic.

Lắp bình vào bộ chiết để thu phần chiết xăng nhẹ.

Lắp phễu chiết vào bộ chiết và tiến hành chiết bằng xăng nhẹ trong 6 giờ. Điều chỉnh

thiết bị đun nóng vừa phải, nếu dùng loại chiết Soxhlet thì trong 1 giờ thực hiện ít nhất

10 lần chiết tuần hoàn, hoặc tốc độ chảy ít nhất là 5 giọt trong 1 giây (khoảng 10

ml/phút) nếu dùng thiết bị chiết tương tự.

Đun bình cho bay gần hết dung môi. Thêm vào bình 2 ml aceton, lắc đều và đun nóng

nhẹ trên thiết bị đun nóng để đuổi aceton. Đuổi hết những vết aceton cuối cùng. Làm khô cặn thu được trong 10 phút trong tủ sấy ở 103oC. Làm nguội trong bình hút ẩm và

cân (m6) chính xác đến 0,1 mg. Hoặc có thể áp dụng quá trình sau:

Làm bay hết dung môi. Làm khô cặn thu được trong bình trong 1,5 giờ trong tủ sấy chân không ở 80oC. Để nguội trong bình hút ẩm (6.6) và cân (m6) chính xác đến 0,1

mg.

11

4.7.6. Tính toán

4.7.6.1. Xác định khi có chiết sơ bộ 4.7.2

10(𝑚2−𝑚1)

(𝑚6−𝑚5)

𝑚3

Tính hàm lượng chất béo của mẫu thử W1(g/kg) theo công thức:

𝑚0

𝑚4

𝑚0

𝑥 𝑥 𝑥 𝑓 W1=

Trong đó

m0 là khối lượng mẫu thử cân ở 4.7.2, tính bằng gam;

m1 là khối lượng bình cùng tinh thể cacbua silic ở 4.7.2, tính bằng gam;

m2 là khối lượng bình cùng tinh thể cacbua silic và phần khô thu được từ dịch chiết

được tính bằng gam;

m3 là khối lượng phần thu được từ dịch chiết đã làm khô ở 4.7.2, tính bằng gam;

m4 là khối lượng phần mẫu thử ở 4.7.3, tính bằng gam;

m5là khối lượng bình cùng tinh thể cacbua silic ở 4.7.5, tính bằng gam;

m6 là khối lượng bình cùng tinh thể cacbua silic phần khô thu được từ dịch chiết ở

4.7.5, tính bằng gam;

f là hệ số hiệu chỉnh đơn vị (f = 1000 g/kg), tính bằng gam trên kilogam.

Biểu thị kết quả chính xác đến 1 g/kg.

4.7.6.2. Xác định khi không có chiết sơ bộ

(𝑚6−𝑚5)

Hàm lượng chất béo của mẫu thử, w2, (g/kg), được tính theo công thức:

𝑚0

x f W2=

Trong đó

m4 là khối lượng phần mẫu thử ở 9.3, tính bằng gam;

m5 là khối lượng bình cùng tinh thể cacbua silic ở 9.5, tính bằng gam;

m6 là khối lượng bình cùng tinh thể cacbua silic và phần khô thu được từ dịch chiết ở

4.7.5, tính bằng gam;

f là hệ số hiệu chỉnh đơn vị (f = 1000 g/kg), tính bằng gam trên kilogam.

Biểu thị kết quả chính xác đến 1 g/kg.

5. Xác định hàm lượng tro (TCVN 5150 : 1990)

12

5.1.Nguyên tắc

Mẫu được nung ở nhiệt độ trong khoảng từ 5000C đến 5500C để đốt cháy hết các hợp

chất hữu cơ rồi cân phần tro còn lại.

5.2. Thuốc thử và hoá chất

Chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích, nước sử dụng là nước cất đã loại khoáng

hoặc nước có chất lượng tương đương.

Hydro peroxit (H2O2) hoặc acid nitric (HNO3) đậm đặc.

5.3. Thiết bị và dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ, thông thường của phòng thí nghiệm và cụ thể như sau:

Chén nung: có nắp đậy, dung tích 30ml.

Bếp điện

Lưới amilang

Lò nung

Tủ sấy, có thể điều chỉnh nhiệt độ, chính xác đến ±100C.

Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0.001g

Bình hút ẩm

Cốc thuỷ tinh, dung tích 250ml

Phễu thuỷ tinh

Đũa thuỷ tinh

13

Giấy lọc không tro

5.4. Cách tiến hành xác định tro tổng số

Cân 10 gam đến 15 gam mẫu thử, chính xác đến 0.001g, cho vào chén nung đã biết

khối lượng. Mẫu thử được đốt từ từ trên bếp điện có lót lưới amilang cho đến khi cháy

hoàn toàn thành than đen (khi đốt không được để mẫu thử cháy thành ngọn lửa). Cho chén chứa mẫu thử vào lò nung, nâng nhiệt độ từ từ đến khoảng từ 5000C đến 5500C và

giữ ở nhiệt độ đó trong khoartng 6 giờ đến 7 giờ đến khi mẫu thử thành tro trắng. Nếu

sau thời gian trên, tro vẫn cò đen thiflaasy chén nung ra, để nguội rồi cho thêm vài giọt

hydro peroxit hoặc acid nitrit đậm đặc rồi tiếp tục nung mẫu đến khi thành tro trắng.

Tắt điện lò nung, chờ cho nhiệt độ hạ bớt thì lấy chén tro ra, cho vào bình hút ẩm, để

nguội 30 phút rồi cân, chính xác đến 0.001g. Tiếp tục nung ở nhiệt độ như trên trong

30 phút, để nguội và cân. Tiến hành nung và caancho đến khi thu được khối lượng

không đổi.

5.5. Tính toán:

Hàm lượng tro tổng số X, được biểu thị bằng phần trăm khối lượng,

(𝐺1−𝐺)𝑥 100

được tính theo công thức:

𝑚

X =

Trong đó:

G là khối lượng của chén nung, tính bằng gam (g)

G1 là khối lượng của chén nung và tro tổng số,tính bằng gam (g)

m là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g)

6. Phương pháp xác định hàm lượng protein theo phương pháp Kjeldahl

6.1. Nguyên tắc:

Mẫu được thuỷ phân với tác nhân là acid sulphuric. Nitrogen từ protein và một số phân

tử khác được biến đôi thành ammonium sulphate.Những ammoni được chưng cất thành

acid chuẩn sau khi làm nóng biến thành kiềm. Tỷ lệ nitrogen được tính toán và kết quả

biến đổi thành protein thô bằng cách nhân với hệ số.

6.2. Dụng cụ

14

Bình Kjeldahl, bình thuỷ tinh chịu nhiệt 300, 500 hoặc 800ml

Hệ thống chưng cất.

6.3. Thuốc thử

Acid sulphuric tinh khiết

Chất xúc tác: chất xúc tác được pha trộn 10g K2SO4 và 0.5g oxide hoá trị 2. Nếu sử

dụng thuỷ ngân, sodium sulphide hoặc thiosulphate phải được cho vào sau đó để phân

ly phân tử thuỷ ngân ammonium. Nếu được thì nên tranhsuwr dụng thuỷ ngân. 1000g

K2SO4, 30g CuSO4 và 30g titanium dioxide trộn lẫn vào nhau.

HCl 0.1N

Acid boric 2%

Chất chỉ thị methyl đỏ. 0.1g được hoà tan thành 18.6ml NaOH 0.02N và định mức

thành 250ml với nước cất. Hoà tan 0.016g methyl đỏ và 0.083g bromocresolgreen

trong 100 ml ethanol 96%.

NaOH 0.1N

6.4. Cách tiến hành

Cho 1g mẫu khô đã nghiền nhuyễn vào bình Kjeldahl.Thêm vào đó 20ml acid 0.1N.

Thêm vào 25ml acid sulphuric và 10g chất xúc tác. Tiếp tục gia nhiệt ít nhất 45 phút

sau đó dung dịch trở thành màu xanh trong suốt. Để nguội và pha loãng thành 100 –

200ml nước.

Cho thêm 80 – 85ml sodium hydroxide đậm đặc. Đặt erlen có thêm 25ml HCl 0.1N và

vài giọt methyl đỏ. Ngoài ra, bổ sung vào 50ml acid boric 2% bao gồm methyl đỏ. Axit

boric là trung tính của chỉ thị này và Borat ammonium kiềm được định lượng trực tiếp

với HC1 0.1N. Axit có thể có xu hướng hút trở lại vào đầu ngưng ở đầu và cuối của

chưng cất.

15

Điều này dễ dàng tránh bằng cách sử dụng một bình ngưng Allihn và bằng cách điều

chỉnh các ống vào cuối của bình ngưng để nó chỉ là chỉ dưới mức axit, và sự hút được

phá vỡ bởi sự gia tăng chất lỏng lên bình ngưng. Đo lượng axit dư thừa với NaOH

0.1N.

𝑉

𝑊

6.5. Tính toán

1000

100

% nitrogen mẫu= 14 x x 0.1 x

V= ml của acid 0.1N - ml NaOH 0.1N được sử dụng để trung hoà.

W= g mẫu

16

PHỤC LỤC B

KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM

Bảng 3.1. Kết quả khảo sát xác định điểm pI

Bảng 3.2.Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến hàm lượng acid

amin

0h 3h 6h 9h 12h

1.3 ± 0.31 2.24 ± 0.16 3.02 ± 0.44 2.78 ± 0.4 2.16 ± 0.48 5%

1.43 ± 0.17 2.77 ± 0.15 3.7 ± 0.41 3.4 ± 0.45 2.27 ± 0.42 8%

2.97 ± 0.66 3.73 ± 0.61 3.3 ± 0.43 2.7 ± 0.26 11% 2.21 ± 0.12

Bảng 3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến hàm lượng

astaxanthin

0h 3h 6h 9h 12h

1.78 ± 0.3 3.7 ± 0.62 6.34 ± 0.77 5.45 ± 1.68 5.34 ± 2.21 5%

8% 3.02 ± 1.59 4.56 ± 1.51 14.68 ± 4.01 8.85 ± 2.11 6.27 ± 1.39

11% 6.37 ± 3.87 7.01 ± 4.06 14.72 ± 2.64 10.01 ± 3.33 6.88 ± 2.65

17

Bảng 3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến hàm lượng

acid amin

0h 3h 6h 9h 12h

1.37 ± 0.3 2.3 ± 0.27 2.88 ± 0.34 2.75 ± 0.23 2.25 ± 0.41 45oC

1.39 ± 0.48 2.52 ± 0.63 3.52 ± 0.67 3.24 ± 0.7 2.88 ± 0.55 55oC

1.3 ± 0.16 2.24 ± 0.44 3.02 ± 0.4 2.78 ± 0.48 2.16 ± 0.61 65oC

Bảng 3.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến hàm lượng

astaxanthin.

0h 3h 6h 9h 12h

5.52 ± 4.19 8.58 ± 2.7 11.49 ± 2.86 7.6 ± 4.84 5.93 ± 3.74 45oC

8.48 ± 4.27 10.33 ± 4.26 12.7 ± 2.08 10.67 ± 1.34 8.2 ± 2.77 55oC

6.02 ± 1.04 7.61 ± 2.54 10.31 ± 0.26 6.84 ± 0.79 5.66 ± 0.34 65oC

18

Bảng 3.6. Phân tích ANOVA cho khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm

lượng acid amin

19

Bảng 3.7. Phân tích ANOVA cho khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng

asstaxanthin.

20

Bảng 3.8. Phân tích ANOVA cho khảo sát ảnh hưởng hoạt độ enzyme đến hàm

lượng acid amin.

21

Bảng 3.9. Phân tích ANOVA cho khảo sát ảnh hưởng hoạt độ enzyme đến hàm

lượng astaxanthin

22

Bảng 3.10. Phân tích ANOVA cho khảo sát ảnh hưởng thời gian thủy đến phân

đến hàm lượng acid amin với hoạt độ enzyme là 30UI

23

Bảng 3.11. Phân tích ANOVA cho khảo sát ảnh hưởng thời gian thủy đến phân đến hàm lượng acid amin với nhiệt độ thủy phân là 55oC

24

Bảng 3.12. Phân tích ANOVA cho khảo sát ảnh hưởng thời gian thủy phân đến

hàm lượng astaxanthin với hoạt độ enzyme là 30UI

25

Bảng 3.13. Phân tích ANOVA cho khảo sát ảnh hưởng thời gian thủy phân đến hàm lượng astaxanthin với nhiệt độ thủy phân là 55oC.

26

Bảng 3.14. Phân tích hồi qui bậc hai cho AP với các biến độc lập T, Tg và

tương tác đôi giữa chúng

27

28

Bảng 3.15. Phân tích hồi qui bậc hai cho AsP với các biến độc lập T, Tg và tương

tác đôi giữa chúng

29

30