Xác định biofilm trong viêm amiđan mạn tính ở trẻ em

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> XÁC ĐỊNH BIOFILM TRONG VIÊM AMIĐAN MẠN TÍNH Ở TRẺ EM<br /> Nhan Trừng Sơn* Phú Quốc Việt**<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: Xác định tỷ lệ màng sinh học biofilm trong amiđan mạn tính bằng phương pháp nhuộm HE và soi<br /> qua kính hiển vi quét SEM, tìm mối tương quan giữa việc dùng kháng sinh, thời gian viêm amiđan với việc phát<br /> hiện ra biofilm.<br /> Phương pháp thực hiện: Cắt ngang mô tả trên 70 bệnh nhi có chỉ định cắt amiđan tại BV Nhi Đồng 1.<br /> Kết quả: Bằng phương pháp nhuộm HE: số bệnh nhân phát hiện ra màng sinh học biofilm là 38 (54,3%),<br /> không phát hiện ra biofilm là 32 (45,7%). Bằng phương pháp SEM: số bệnh nhân phát hiện ra biofilm là 30<br /> (42,86%), không phát hiện ra biofilm là 40 (57,14%), không thấy sự liên quan giữa tổng thời gian bệnh của bệnh<br /> nhân với việc tạo màng biofilm, cũng như sự liên quan giữa việc dùng kháng sinh quá ngắn ngày, hay dài ngày<br /> với việc tạo ra biofilm của vi khuẩn.<br /> Kết luận: Phương pháp nhuộm HE và phương pháp soi bằng SEM là 2 phương pháp rất triển vọng để xác<br /> định biofilm. Phương pháp nhuộm HE là phương pháp dễ thực hiện tại cơ sở, giá thành thấp, nhưng hiệu quả<br /> trong việc xác định biofilm. Phương pháp soi bằng kính hiển vi điện tử quét đòi hỏi mẫu phải được xử lý kỹ trước<br /> khi đi soi, mẫu cần vận chuyển đến trung tâm có máy SEM để soi, giá thành khá cao, nhưng đây cũng là phương<br /> tiện rất tốt để xác định biofilm.<br /> Từ khóa: Màng sinh học, viêm amiđan.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> THE PRESENCE OF BACTERIAL BIOFILM IN CHRONIC TONSILLITIS IN CHILDREN<br /> Nhan Trung Son, Phu Quoc Viet * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 - Supplement of No 1 - 2013: 29 - 33<br /> Background: The presence of bacterial biofilms in inflamed tonsils may explain the chronicity and recurrent<br /> characteristic of tonsillitis.<br /> Objective: To assess biofilm rate in chronic tonsilitis by Hematoxyllin- Eosin (HE) staining and by<br /> Scanning Electron Microscopy (SEM), and to clarify if there are relations among using antibiotics, tonsillitis time<br /> and biofilm detection.<br /> Methods: Cross-sectional study on 70 paediatric patients undergone tonsillectomy at Children 1 Hospital.<br /> Results: Biofilms were identified in 38 patients (54.3%) by using HE method and in 30 (42.86%) patients<br /> by using SEM method. There was neither relation between tosillitis time and biofilm forming nor relation between<br /> using antibiotics (short-term (from 1to 5 days) or long-term (from 6-10 days)) and biofilm forming.<br /> Conclusion: HE and SEM are two potential methods for detecting biofilms. HE is a low-cost method,<br /> effective to detect biofilm and easy to apply at hospital. SEM is a high-cost method. It requires careful prepararion<br /> samples before scanning and transportation to SEM center.<br /> Từ khóa: Biofilm, tonsillitis.<br /> <br /> * Bộ môn Tai Mũi Họng, Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch<br /> ** Khoa Tai Mũi Họng, Bệnh viện Nhi Đồng 1<br /> Tác giả liên lạc: Ths. Phú Quốc Việt<br /> ĐT: 0989818652<br /> Email: bstheviet@gmail.com<br /> <br /> Chuyên Đề Tai Mũi Họng – Mắt<br /> <br /> 29<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Amiđan là một tổ chức bạch huyết của vòng<br /> bạch huyết Waldeyer ở ngã tư đường ăn đường<br /> thở. Sự tiếp xúc thường xuyên với môi trường<br /> bên ngoài của họng là điều kiện làm cho vi<br /> khuẩn dễ tấn công vùng này. Chính vòng bạch<br /> huyết Waldeyer là một pháo đài chống lại sự tấn<br /> công này thông qua chức năng miễn dịch của nó.<br /> Viêm amiđan là một thuật ngữ được chỉ đến<br /> viêm amiđan khẩu cái. Đây là bệnh lý thường<br /> gặp trong lâm sàng các chuyên khoa Nội Nhi nói<br /> chung và chuyên khoa Tai Mũi Họng Nhi nói<br /> riêng ở Việt Nam và trên toàn thế giới. Tại Việt<br /> Nam, theo niên giám thống kê của Bộ Y tế năm<br /> 2002, trong các bệnh mắc cao nhất trên toàn<br /> quốc, viêm họng và viêm amiđan cấp đứng hàng<br /> thứ 2 (251,39 trường hợp mắc trên 100.000 dân).<br /> Theo thống kê của bệnh viện Tai Mũi Họng TP.<br /> HCM năm 2007, viêm amiđan chiếm 21% trong<br /> các bệnh Tai Mũi Họng.<br /> Từ lâu, các vi khuẩn gây bệnh trong viêm<br /> amiđan mạn tính đã được xác định bởi các tác<br /> giả trong và ngoài nuớc. Việc sử dụng kháng<br /> sinh hợp lý trong các trường hợp viêm amiđan<br /> mạn tính song viêm amiđan vẫn tái đi tái lại, vì<br /> vậy chúng tôi cho rằng có khả năng vi khuẩn đã<br /> hình thành biofilm để chống lại tác dụng của<br /> kháng sinh và sự đề kháng của ký chủ.<br /> Vì vậy, chúng tôi mạnh dạn tiến hành thực<br /> hiện nghiên cứu đề tài: “Xác định biofilm trong<br /> viêm amiđan mạn tính ở trẻ em bằng phương<br /> pháp nhuộm Hematoxylin - Eosin (HE) và soi<br /> qua kính hiển vi điện tử quét Scanning Electron<br /> Microscope (SEM)”.<br /> <br /> TỔNG QUAN TÀI LIỆU<br /> Biofilm là một tập hợp các tế bào vi sinh vật<br /> kết hợp với nhau và bám trên bề mặt Những tổ<br /> chức có biofilm thường khác so với những tổ<br /> chức tương tự trong việc giải mã gen, đề kháng<br /> kháng sinh và đề kháng hệ thống miễn dịch của<br /> con người(1,3).<br /> <br /> 30<br /> <br /> Chúng tôi cho rằng việc sử dụng kháng sinh<br /> lâu dài nhưng không đạt hiểu quả có khả năng<br /> do vi khuẩn kháng kháng sinh qua cơ chế tạo<br /> màng biofilm, nên chúng tôi đi sau vào việc xác<br /> định màng biofilm ở bề mặt mô amiđan. Trước<br /> đây, đã có nhiều nghiên cứu về màng biofilm<br /> trên mô amiđan:<br /> Khalid (2008) nghiên cứu trên 76 trường hợp<br /> trẻ em có độ tuổi trung bình là 5,7 tuổi bị viêm<br /> amiđan và VA thì 46 trường hợp tìm thấy<br /> biofilm của vi khuẩn bằng phương pháp soi qua<br /> kính điện tử quét (SEM) (chiếm 61%). Trong 26<br /> bệnh nhi phải cắt amiđan và nạo VA vì tình<br /> trạng nhiễm trùng mạn tính thì có 22 trường hợp<br /> tìm thấy biofilm (85%).<br /> Richard (2008) nghiên cứu trên 19 bệnh nhân<br /> bị viêm amiđan mạn tính thì có 15 bệnh nhân có<br /> biofilm (79%).<br /> Rafael Ramirez(6) nghiên cứu trên 9 bệnh<br /> nhân với tiền sử bệnh viêm amiđan tái đi tái lại<br /> cần phải cắt amiđan, mẫu mô được quan sát<br /> bằng kính hiển vi điện tử quét thông thường và<br /> kính hiện vi điện tử quét phù hợp môi trường.<br /> Kết quả 8/9 bệnh nhân được phát hiện có biofilm<br /> trên bề mặt amiđan.<br /> R. R. Diaz (2010)(4) 36 bệnh nhân được chọn<br /> để cắt amiđan, tuổi từ 1 đến 6 tuổi, không bệnh<br /> nhân nào sử dụng kháng sinh quá 30 ngày trước<br /> khi cắt amiđan. Mẫu amiđan được nhuộm<br /> Hematoxylin – eosin, nhuộm gram, soi kính hiển<br /> vi huỳnh quang, và soi kín h hiển vi laser cùng<br /> tiêu điểm,có 77.28% bệnh nhân có biofilm trong<br /> amiđan(4).<br /> Galli. J(5) (2007) 10 trường hợp cắt amiđan,<br /> đây là những bệnh nhân viêm amiđan và VA<br /> mạn tính, hay viêm tái hồi nhiều lần, không còn<br /> đáp ứng với kháng sinh và kháng viêm liệu<br /> pháp. Nghiên cứu này nhằm phát hiện biofilm ở<br /> mẫu mô, mẫu mô được cấy và được soi bằng<br /> kinh hiển vi điện tử quét, kết quả cho thấy có<br /> 15/15 mẫu VA và 6/10 mẫu amiđan có thấy vi<br /> khuẩn dạng hình cầu bám trên bề mặt mô và tập<br /> trung thành từng khúm nhỏ(5).<br /> <br /> Chuyên Đề Tai Mũi Họng – Mắt<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br /> Romain E. Kania (2007) khi ông so sánh hình<br /> ảnh thấy vi khuẩn và chất glycocalyx bằng kính<br /> hiển vi quét laser đồng tiêu điểm (CLSM) kết<br /> hợp với phương pháp nhuộm đôi để so sánh với<br /> kết quả bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM)<br /> trên những mẫu mô amiđan. Kết quả có 17/24<br /> (70,8%) trường hợp thí nghiệm cho thấy sự hiện<br /> diện màng sinh học vi khuẩn.<br /> Richard A. Chole(2) (2003) Nghiên cứu tháng<br /> 6/2003 trên 15 bệnh nhân bị viêm amiđan tái đi<br /> tái lại, kết quả có 11/15 trường hợp tìm thấy<br /> biofilm (73%) và 3/4 trường hợp amiđan quá<br /> phát có biofilm (75%) Bằng kính hiển vi điện tử<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG– PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU<br /> Đối tượng nghiên cứu<br /> Tiêu chuẩn chọn mẫu<br /> Tất cả các bệnh nhi từ 5 đến 15 tuổi khám tại<br /> phòng khám Tai Mũi Họng Bệnh Viện Nhi đồng<br /> I có triệu chứng viêm amiđan tái đi tái lại hơn 5<br /> lần/ năm, từ 10-2011 đến 31-07-2012.<br /> Tiêu chuẩn loại trừ<br /> Bệnh nhân có chống chỉ định cắt amiđan.<br /> Các mẫu được xác nhận bằng giải phẫu bệnh<br /> lý không phải là viêm amiđan mạn sẽ bị loại trừ.<br /> Viêm amiđan tái đi tái lại ít hơn 5 lần/ năm.<br /> <br /> Phương pháp nghiên cứu<br /> Thiết kế nghiên cứu<br /> Nghiên cứu cắt ngang mô tả.<br /> Mẫu nghiên cứu<br /> Cỡ mẫu được xác định phù hợp theo nghiên<br /> cứu mẫu nhỏ N = 70.<br /> N= C2 x<br /> <br /> Hình 1: (A) Biofilm ở amiđan (hình hoa thị)<br /> nhuộm với hematoxylin- eosin và mô viêm thâm<br /> nhiễm xung quanh (hình mũi tên), hình ảnh vật<br /> kính x400. (B) Nhìn toàn cảnh của khe hốc amiđan<br /> với biofilm (mũi tên) với nhiều nang giãn nở không<br /> có xơ hóa (hình hoa thị), xem ở vật kính x32. (C)<br /> Đáy của hốc amiđan với rất nhiều khúm vi khuẩn<br /> (hình mũi tên) và quá trình viêm mạnh mẽ, hình<br /> ảnh vật kính x100. (D) Đáy của hốc amiđan với<br /> chất á sừng (hình hoa thị) và nhiều biofilm (hình<br /> mũi tên) hình ảnh vật kính x150.<br /> <br /> (C =1,96 ; p = 90% ; ε = 7%)<br /> <br /> Cách tiến hành nghiên cứu<br /> Thực hiện phẫu thuật cắt amiđan.<br /> Lấy mô amiđan lưu giữ trong 2 lọ formol<br /> 10%.<br /> Một lọ gửi làm giải phẫu bệnh và tìm biofilm<br /> bằng nhuộm HE.<br /> Một lọ sau khi được xử lý khô gửi Viện công<br /> nghệ Nano, mẫu sẽ được bọc platinium sau đó<br /> được đem đi chụp biofilm bằng máy SEM.<br /> Phân tích thống kê bằng phần mềm Stata/SE<br /> 10.<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> Đặc điểm của mẫu nghiên cứu<br /> Tổng số bệnh nhân 70 bệnh nhân (21 nữ<br /> (30%), 49 nam(70%)).<br /> <br /> Hình 2: Biofilm của mẫu amiđan quan sát bằng<br /> kính hiển vi điện tử quét.<br /> <br /> Chuyên Đề Tai Mũi Họng – Mắt<br /> <br /> Tuổi trung bình 92,15 tháng ± 33 (tuổi nhỏ<br /> nhất 55 tháng, tuổi lớn nhất 184 tháng).<br /> Về nơi ở: 43 bệnh nhân ở tỉnh, 27 bệnh nhân<br /> ở thành phố Hồ Chí Minh.<br /> <br /> 31<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Tổng thời gian bị viêm amiđan: 53,57<br /> tháng ± 32,9 tháng (thời gian bị viêm amiđan<br /> ngắn nhất là 15 tháng, thời gian bị amiđan dài<br /> nhất là 144 tháng).<br /> <br /> Bảng 3: Mức độ đồng thuận là để đánh giá xem HE<br /> cho kết quả giống SEM bao nhiêu phần trăm.<br /> <br /> Thời gian sử dụng kháng sinh ngắn nhất<br /> trong 1 đợt điều trị: trung bình là 2 ngày ± 1 ngày<br /> (ngắn nhất là 1 ngày, dài nhất là 5 ngày).<br /> <br /> KẾT LUẬN<br /> <br /> Thời gian sử dụng kháng sinh dài nhất trong<br /> 1 đợt trong 1 đợt điều trị: trung bình là 6 ngày ± 1<br /> ngày (ngắn nhất là 4 ngày, dài nhất là 10 ngày).<br /> Số lần viêm amiđan trung bình là: 6 lần ± 1<br /> lần (ít nhất là 5 lần, nhiều nhất là 9 lần).<br /> Bảng 1: Độ lớn amiđan.<br /> Độ amiđan<br /> Xơ teo<br /> Độ 1<br /> Độ 2<br /> Độ 3<br /> Độ 4<br /> Tổng số<br /> <br /> Nam<br /> 0<br /> 5 (10,2%)<br /> 16 (32,65%)<br /> 28 (57,14%<br /> 0<br /> 49 (100%)<br /> <br /> Nữ<br /> 0<br /> 2 (9,52%)<br /> 11 (52,38%)<br /> 8 (38,1%)<br /> 0<br /> 21 (100%)<br /> <br /> Tổng số<br /> 0<br /> 7 (10%)<br /> 27 (38,57%)<br /> 36 (51,43%)<br /> 0<br /> 70 (100%)<br /> <br /> Bằng phương pháp nhuộm HE:<br /> Số bệnh nhân phát hiện ra màng sinh học<br /> biofilm là 38<br /> Số bệnh nhân không phát hiện ra màng sinh<br /> học biofilm là 32.<br /> Bằng phương pháp SEM:<br /> Số bệnh nhân phát hiện ra màng sinh học<br /> biofilm là 30.<br /> Số bệnh nhân không phát hiện ra màng sinh<br /> học biofilm là 40.<br /> Bảng 2: Tỷ lệ phát hiện Biofilm.<br /> Phương pháp<br /> <br /> HE (+)<br /> <br /> HE (-)<br /> <br /> SEM (+)<br /> <br /> 25 (65,79%)<br /> <br /> 5 (15,63%)<br /> <br /> 30<br /> <br /> SEM (-)<br /> <br /> 13 (34,21%)<br /> <br /> 27 (84,37%)<br /> <br /> 40<br /> <br /> 38<br /> <br /> 32<br /> <br /> 70<br /> <br /> Nếu ta coi SEM là chuẩn vàng và đánh giá<br /> độ nhạy, độ đặc hiệu của HE.<br /> Tính độ nhạy của HE là 83,3% (KTC 95% và<br /> độ đặc hiệu của HE là 67,5% (KTC 95% 81,4%).<br /> Tỷ lệ đồng thuận giữa 2 phương pháp.<br /> <br /> 32<br /> <br /> Tỷ lệ đồng thuận<br /> <br /> Hệ số Kappa<br /> <br /> P<br /> <br /> 74,29%<br /> <br /> 0,49<br /> <br /> 0,000<br /> <br /> Qua nghiên cứu về biofilm của vi khuẩn ở<br /> những bệnh nhi tại bệnh viện Nhi Đồng 1<br /> TPHCM bằng hai phương pháp nhuộm<br /> Hematoxylin – Eosin và soi bằng kính hiển vi<br /> điện tử quét, chúng tôi thu nhận được một số kết<br /> quả. Từ đó, chúng tôi có một số kết luận và đề<br /> xuất sau:<br /> Phương pháp nhuộm Hematoxylin – Eosin<br /> và phương pháp soi bằng kính vi điện tử quét là<br /> 2 phương pháp rất triển vọng để xác định màng<br /> biofilm của vi khuẩn.<br /> Phương pháp nhuộm Hematoxylin – Eosin<br /> là phương pháp dễ thực hiện tại cơ sở, giá thành<br /> thấp, nhưng hiệu quả trong việc xác định màng<br /> biofilm vi khuẩn.<br /> Phương pháp soi bằng kính hiển vi điện tử<br /> quét đòi hỏi mẫu phải được xử lý kỹ trước khi đi<br /> soi, mẫu cần vận chuyển đến trung tâm có máy<br /> SEM để soi, giá thành khá cao, nhưng đây cũng<br /> là phương tiện rất tốt để xác định màng biofilm<br /> của vi khuẩn, phương tiện này đã được sử dụng<br /> rất lâu trên thế giới và nay đã được chúng tôi sử<br /> dụng lần đầu tiên tại TPHCM để xác định màng<br /> biofilm của vi khuẩn.<br /> Hiện nay trên thế giới ít công trình nghiên về<br /> thời gian bệnh liên quan tới việc tạo ra biofilm,<br /> cũng như sự liên quan của việc dùng kháng sinh<br /> ngắn ngày, hay dài ngày trong việc tạo ra biofilm<br /> của vi khuẩn.<br /> Trong nghiên cứu của chúng tôi, chúng tôi<br /> không thấy sự liên quan giữa tổng thời gian<br /> bệnh của bệnh nhân với việc tạo màng biofilm.<br /> Chúng tôi cũng không ghi nhận được sự liên<br /> quan giữa việc dùng kháng sinh quá ngắn ngày,<br /> hay quá dài ngày trong 1 đợt điều trị viêm<br /> amiđan với việc tạo ra biofilm của vi khuẩn.<br /> <br /> Chuyên Đề Tai Mũi Họng – Mắt<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1.<br /> <br /> 2.<br /> <br /> 3.<br /> <br /> Al-Mazrou KA, Al-Khattaf AS. “Adherent biofilms in<br /> adenotonsillar diseases in children”. Arch Otolaryngol Head Neck<br /> Surg, 2008; 134(1):20-23.<br /> Chole RA, Faddis BT. “Anatomical evidence of microbial<br /> biofilms in tonsillar tissues: a possible mechanism to explain<br /> chronicity”. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 2003;129(6):634636.<br /> Costerton JW, Stewart PS, Greenberg EP. “Bacterial biofilms: a<br /> common<br /> cause<br /> of<br /> persistent<br /> infections”.<br /> Science.<br /> 1999;284(5418):1318-1322.<br /> <br /> Chuyên Đề Tai Mũi Họng – Mắt<br /> <br /> 4.<br /> <br /> 5.<br /> <br /> 6.<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Diaz RR, Picciafuoco S et al. “Relevance of biofilms in pediatric<br /> tonsillar disease”. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2011; 30:1503–<br /> 1509.<br /> Galli J, Calo L, Ardito F et al. “Biofilm formation by<br /> Haemophilus influenzae isolated from adeno-tonsil tissue<br /> samples, and its role in recurrent adenotonsillitis”. Acta<br /> Otorhinolaryngol Ital. 2007;27(3):134-8.<br /> Ramírez-Camacho<br /> R,<br /> González-Tallón<br /> AI<br /> et<br /> al.<br /> “Environmental scanning electron microscopy for biofilm<br /> detection in tonsils”. Acta Otorrinolaringol Esp. 2008;59(1):16-20.<br /> <br /> 33<br /> <br />