Hội thảo khoa học và Công nghệ thực phẩm 2018
ẢNH HƯỞNG CỦA KĨ THUẬT VI GÓI ĐẾN KHẢ NĂNG SỐNG CỦA
VI KHUẨN LACTOBACILUS ACIDOPHILUS TRONG ĐIỀU KIỆN TIÊU
HÓA NHÂN TẠO
Lê Thị Hạnh Quyên*, Trương Đức Thắng, Liêu Mỹ Đông
Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm Thành phố Hồ Chí Minh
*Email: hanhquyen999.ql@gmail.com
Ngày nhận bài: 07/7/2018 ; Ngày chấp nhận đăng: 12/7/2018
TÓM TẮT
Mục đích của nghiên cứu này là kiểm tra ảnh hưởng của các kỹ thuật vi gói khác nhau (nén đùn
và nhũ hóa) đến kích thước hạt chế phẩm vi gói, hiệu suất vi gói và khả năng tồn tại của Lactobacillus
acidophilus trong điều kiện tiêu hóa nhân tạo. Kết quả cho thấy, vi gói bằng kĩ thuật nhũ hóa tạo ra
chế phẩm có kích thước nhỏ hơn nén đùn 161µm, kĩ thuật nén đùn giúp nâng cao hiệu suất vi gói
98.38±0.11%. Trong khi ảnh hưởng của kĩ thuật vi gói đến chế phẩm ủ trong điều kiện tiêu hóa nhân
tạo cũng được kiểm tra. Cả hai phương pháp vi gói, cung cấp bảo vệ tốt cho L. acidophilus so với tế
bào tự do khi ủ trong dạ dày và muối mật nhân tạo. Sau 2 giờ ủ với dịch dạ dày nhân tạo số lượng tế
bào còn lại với kĩ thuật nén đùn và nhũ hóa lần lượng là lần lượt là 2.98÷3.85 log CFU/g và 2.09÷3.18
log CFU/g, với muối mật nhân tạo lượng tế bào còn lại sau 4 giờ ủ cho kĩ thuật nén đùn và nhũ hóa lần
lượt là 8.99÷9.11 log CFU/g và 8.08÷8.11 log CFU/g. Nghiên cứu cho thấy, kĩ thuật nhũ hóa với
sodium alginate bao phủ bởi skim milk vừa tạo chế phẩm có kích nhỏ vừa đảm bảo khả năng sống của
L. acidophilus.
Từ khóa: vi gói, tiêu hóa nhân tạo, probiotic, nhũ hóa, nén đùn
1. GIỚI THIỆU
Probiotic là vi sinh vật sống có lợi cho sức khỏe vật chủ khi được dùng với số lượng thích hợp
[1]. Để mang lại lợi ích sức khỏe thì nồng độ probiotic trong sản phẩm phải đạt trên 106-107 log CFU /
g (ml) tại thời điểm tiêu thụ và có thể tồn tại trong quá trình tiêu hóa [1, 2]. Vi khuẩn axit lactic (LAB)
là các vi khuẩn probiotic quan trọng liên quan đến đường tiêu hóa của con người [2]. Tuy nhiên khả
năng tồn tại của chúng có thể bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ, pH thấp, các chất phụ gia thực phẩm khi
được ứng dụng vào sản phẩm, độc tính của oxy và hydro peroxide [3]. Để nâng cao khả năng sống của
LAB trong thời gian lưu trữ và tiêu hóa phương pháp vi gói đã được phát triển và công nhận là an
toàn, kỹ thuật giúp tách probiotic ra khỏi môi trường do đó làm tăng sức đề kháng đối với các điều
kiện sản xuất, cải thiện khả năng tồn tại trong suốt quá trình bảo quản và điều kiện khắc nghiệt của
đường tiêu hóa [4]. Sodium alginate với tính chất tạo gel khi có mặt của canxi và là vật liệu rẻ tiền,
không độc hại nên được sử dụng rộng rãi cho kĩ thuật nén đùn và nhũ hóa, được chiết xuất từ tảo biển
bao gồm liên kết 1,4 b-D-mannuronic và a-L-guluronic [5, 6]. Các nghiên cứu trước đây cho thấy cả
hai kĩ thuật vi gói này đều cho khả năng bảo vệ tốt vi khuẩn probiotic trong điều kiện bất lợi [7, 8].
Tuy nhiên, đánh giá so sánh hai kỹ thuật này vẫn chưa được công bố đầy đủ. Trong nghiên cứu này,
Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 được vi gói bằng kĩ thuật nén đùn và nhũ hóa, với sodium
alginate làm chất mang chính. Chế phẩm vi gói từ hai kĩ thuật này được đánh giá so sánh kích thước,
17
Lê Thị Hạnh Quyên, Trương Đức Thắng, Liêu Mỹ Đông
hiệu suất vi gói và tỷ lệ sống của L. acidophilus trong dịch dạ dày nhân tạo (SGF) và muối mật nhân
tạo (SIF).
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 Chuẩn bị chủng vi khuẩn
Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 được thu bằng cách ly tâm ở 5000 vòng / phút từ 500 ml
dung dịch trong 22 giờ nuôi cấy. Các tế bào sau đó được sử dụng trong quá trình vi gói cho các bước
tiếp theo.
2.2. Chế phẩm vi gói của L. acidophilus
2.2.1. Vi gói bằng kĩ thuật nén đùn
Vi gói bằng kĩ thuật nén đùn (EM) được mô tả theo phương pháp của Nazzaro (2009) đã được
chỉnh sửa: thực hiện với 10ml dung dịch (sodium alginate 2.5% hoặc sodium alginate 2.5% và skim
milk (SM) 0.5%) và 1ml tế bào vi sinh vật. Hỗn hợp được tiêm qua kim tiêm vô trùng đường kính
trong là 0.813mm vào 50ml dung dịch CaCl2 0,05 M được làm cứng lại trong 30 phút. Sau đó rửa
bằng dung dịch NaCl 0,9% vô trùng và được ngâm trong dung dịch skim milk 0,5% (nếu là viên nang
được sản xuất theo chất mang sodium alginate phủ skim milk) chế phẩm vi gói sau đó được thu nhận
bảo quản ở 40C [9]. Chế phẩm vi gói được kiểm tra kích thước hạt trung bình bằng thước kẹp điện thử.
2.2.2. Vi gói bằng kĩ thuật nhũ hóa
Vi gói bằng kĩ thuật nhũ hóa (IM) được thực hiện theo phương pháp của Rodriquez-LLimos và
cộng sự (2003) đã được chỉnh sửa: 10 ml tế bào vi sinh vật cho vào cốc thủy tinh vô trùng dung tích
500ml chứa 40 ml sodium alginate 2.5% (hoặc 40ml dung dịch sodium alginate 2.5% và skim milk
0.5%). Thêm 200 mL dầu và 4 ml tween 80 vào cốc, sau đó đem khuấy trên máy khuấy từ 500 vòng/
phút trong 15 phút để thu được hệ nhũ tương nước/dầu. Thêm từ từ 160µl axit axetic vào cốc và khuấy
thêm 5 phút. Vi nang sau khi hình thành được rửa bằng dung dịch NaCl 0,9% vô trùng, tiếp tục ngâm
trong dung dịch skim milk 0,5% (trên máy khuấy từ với tốc độ 100 vòng / phút trong 10 phút nếu là
viên nang được sản xuất theo chất mang sodium alginate phủ skim milk). Các chế phẩm vi gói sau đó
được thu nhận và bảo quản ở 40C [10]. Chế phẩm vi gói được kiểm tra kích thước trung bình bằng
máy HORIBA LA-920.
2.3. So sánh hiệu suất vi gói giữa hai kĩ thuật
Cân 1g chế phẩm cho vào bình tam giác có nút mài đã vô trùng, thêm 9ml dung dịch đệm
photphate vào bình tam giác và lắc trên máy lắc trong 15 phút để các viên nang được phát hủy hoàn
toàn. Tiến hành kỹ thuật pha loãng và trải đĩa. Xác định số tế bào sống trên môi trường thạch MRS, ủ
ở 370C trong 48 giờ. Tiến hành tính hiệu suất vi gói sau nhũ hóa theo công thức:
2.4. So sánh ảnh hưởng của hai kĩ thuật vi gói đến khả năng sống của chế phẩm L. acidophilus
trong SGF và SIF
18
Ảnh hưởng của kĩ thuật vi gói đến khả năng sống của vi khuẩn Lactobacilus acidophilus trong điều
kiện tiêu hóa nhân tạo
Dịch dạ dày nhân tạo (SGF) bao gồm 9 g/l NaCl chứa 3g /l pepsin, pH được điều chỉnh xuống 2.5
với HCl 5.0M. Muối mật nhân tạo (SIF) bao gồm 9 g/l NaCl chứa 3ml/l muối mật pH được điều chỉnh
thành 6.5 với NaOH 5.0M. Tỷ lệ sống sót của chế phẩm vi gói L. acidophilus được đánh giá sau 2 giờ
ủ trong SGF và 4 giờ ủ trong SIF. Các mẫu chứa L. acidophilus tự do được dùng để đối chứng. Lượng
tế bào L. acidophilus sống sót trong chế phẩm vi gói được xác định bằng phương pháp trải đĩa trên
môi trường thạch MRS ủ ở 370C trong 48 giờ, tiến hành lập lại 3 lần. Kết quả được biểu diễn dưới
dạng log CFU/g.
2.5. Phân tích thống kê
Tất cả các thí nghiệm được lặp lại ba lần, và kết quả được trình bày dưới dạng trung bình ± độ
lệch chuẩn. Phân tích phương sai là thử nghiệm Duncan (p <0,05) được sử dụng để so sánh trung bình.
Tất cả các tính toán thống kê được thực hiện bằng phần mềm Microsoft Exel 2010 (Microsoft
Corporation, USA).
3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Ảnh hưởng của kĩ thuật vi gói đến kích thước chế phẩm
Hình 1 và Bảng 1 thể hiện kích thước chế phẩm vi gói. Kích thước hạt chế phẩm với EM thu
được cho cả 3 hệ chất mang trung bình 1,95 mm, IM sodium alginate kết hợp skim milk (Ca-SM) cho
kích thước hạt trung bình 311µm, sodium alginate phủ skim milk (Ca phủ SM) cho kích thước hạt
trung bình 161µm. Kỹ thuật vi gói ảnh hưởng đáng kể đến kích thước chế phẩm [2]. Nghiên cứu của
Estefanía Valero-Cases (2015) tiến hành so sánh ảnh hưởng của kĩ thuật vi gói đến chế phẩm vi gói L.
plantarum cho thấy chế phẩm EM cho kích thước hạt từ 1,86÷2,25 mm, trong khi chế phẩm IM cho
kích thước hạt trung bình thu được là 151.1 µm [2]. Kích thước hạt của chế phẩm vi gói bằng EM dễ
dàng kiểm soát và đồng đều hơn so với IM kích thước hạt trong kĩ thuật này dao động từ 25µm÷2mm
[11].
Bảng 1. Kích thước hạt trung bình của chế phẩm vi gói từ hai kĩ thuật
Kĩ thuật vi gói
Chất mang
Kích thước
trung bình
Nhũ hóa
Ca-SM
311.9235 µm
Ca phủ SM
161.5324 µm
Nén đùn
Ca, Ca-SM, Ca phủ SM
1, 95mm
Kích thước của chế phẩm vi gói EM có thể chịu ảnh hưởng bởi nồng độ Ca, đường kính của kim
tiêm, áp lực lên ống tiêm, nồng độ CaCl2. Trong nghiên cứu của Muthukumarasamy (2006) sử dụng
kiêm tiêm có đường kính 0.813mm thu được kích thước trung bình cho các chế phẩm là 2,37mm [7].
Theo nhận định của Cai et al.(2014) tương tự EM, kích thước chế phẩm IM cũng có thể bị ảnh hưởng
bởi tốc độ khuấy trong quá trình đóng gói, bởi nồng độ của Ca hoặc các hợp chất khác được sử dụng
để đóng gói và bởi sự có mặt của các hạt không hòa tan CaCO3 trong dung dịch Ca, cũng trong nghiên
cứu của Cai et al.(2014) thu được kích thước hạt chế phẩm trung bình là 343 µm [8]. Trong nghiên
cứu của Song (2013) kích thước chế phẩm trung bình thu được là 151,1µm [12]. Kích thước hạt là yếu
tốt quan trọng ảnh hưởng đến giá trị cảm quan của sản phẩm khi bổ sung chế phẩm probiotic vào thực
phẩm [13]. Trong nghiên cứu này, chế phẩm vi gói được tạo bởi kỹ thuật nhũ hóa với skim milk là lớp
bao phủ cho kích thước trung bình nhỏ nhất. Điều này là do quá trình ủ với lớp bao phủ giúp các hạt vi
bao tách rời nhau.
19
Lê Thị Hạnh Quyên, Trương Đức Thắng, Liêu Mỹ Đông
(a)
(b)
Hình 1. Kích thước hạt chế phẩm vi gói với IM bằng Ca-SM (a), Ca phủ SM (b)
3.2. Ảnh hưởng của kĩ thuật vi gói đến hiệu suất vi gói
Trong nghiên cứu này kĩ thuật EM cho hiệu suất vi gói tốt hơn so với IM điển hình hiệu suất vi
gói tốt nhất của kĩ thuật EM là 98.38±0.10% trong khi đó kĩ thuật IM là 93.86±0.11% thể hiện ở Hình
2.
Hình 2. Hiệu suất vi gói của IM và EM, mỗi thanh đại diện trung bình ± SD của ba thí nghiệm độc lập (n = 3),
a-e khác nhau đại diện cho sự khác biệt đáng kể (p <0,05) cho mỗi thí nghiệm
Trong các nghiên cứu trước đây cho thấy, hiệu suất vi gói bị tác động bởi kĩ thuật vi gói điển hình
trong nghiên cứu của Maria (2014) khi sử dụng pectin làm chất mang nhũ hóa và phủ ngoài bởi whey
protein vi gói chủng L. acidophilus LA hiệu suất vi gói đạt được là 91.6± 0.24% [14]. Nghiên cứu của
Yun Zhang (2014) sử dụng pectin làm chất mang để vi gói Lactobacillus salivarius NRRL B-30514
bằng phương pháp nhũ hóa hiệu suất vi gói đạt 90% [15]. Tương tự nghiên cứu của Marluci P. Silva
(2016) vi gói Lactobacillus paracasei BGP-1 sử dụng phương pháp nén đùn với chất mang là Ca cho
hiệu suất vi gói đạt đến 93% [16]. Hiệu suất vi gói vi khuẩn probiotic có ý nghĩa quan trọng, hiệu suất
vi gói cao giúp giảm tỉ lệ chế phẩm cần phối trộn vào sản phẩm. Nghiên cứu này cho thấy hiệu suất vi
gói bằng kĩ thuật nén đùn hiệu quả hơn so với kĩ thuật nhũ hóa và việc bao phủ chế phẩm bởi chất
mang skim milk đã ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất vi gói.
3.3. Ảnh hưởng của kĩ thuật vi gói đến khả năng sống của L. acidophilus trong SGF và SIF
Khả năng sống của L. acidophilus dạng chế phẩm vi gói và tự do sau khi ủ trong SGF 2 giờ và
SIF 4 giờ được thể hiện lần lượt ở Hình 3 và 4. Có sự khác biệt đáng kể (p<0.05) giữa tế bào tự do và
tế bào vi gói.
20
Ảnh hưởng của kĩ thuật vi gói đến khả năng sống của vi khuẩn Lactobacilus acidophilus trong điều
kiện tiêu hóa nhân tạo
Hình 3. Ảnh hưởng của phương pháp vi gói đến khả năng sống của L. acidophilus trong SGF, mỗi thanh đại
diện trung bình ± SD của ba thí nghiệm độc lập (n = 3), a-c đại diện cho sự khác biệt đáng kể (p <0,05) cho mỗi
thí nghiệm
Ở mẫu chứa tế bào tự do, mật độ tế bào vi khuẩn giảm đáng kể và không còn tế bào nào sống sót
sau 2 giờ ủ trong môi trường SGF, trong khi đó ở mẫu chứa chế phẩm EM mật độ tế bào ban đầu là
9.05÷9.1 log CFU/g giảm còn 2.98÷3.85 log CFU/g với IM mật độ tế ban đầu là 8.98÷9.11 log CFU/g
giảm còn 2.09÷3.18 log CFU/g. Khi ủ với SIF tế bào tự do giảm còn 2.3±0.18 log CFU/g, trong khi đó
chế phẩm EM mật độ tế bào ban đầu là 8.99÷9.11 log CFU/g giảm còn 8.24÷8.56 log CFU/g, và chế
phẩm IM mật độ ban đầu là 9.01÷9.14 log CFU/g giảm còn 8.08÷8.11 log CFU/g.
Tương tự trong nghiên cứu của Marluci P. Silva (2016) sau khi ủ tế bào vi khuẩn Lactobacillus
paracasei BGP-1 trong 2 giờ với SGF mật độ tế bào còn lại sau cùng là 3.3 log CFU/g [16]. Với
nghiên cứu của Chaline Caren Coghetto (2016) mật độ tế bào Lactobacillus plantarum sau khi ủ 2 giờ
trong SGF và SIF giảm lần lượt là 2.9 log CFU/ml và 2.7 log CFU/ml [17]. Mặc dù các chế phẩm vi
gói đã cho phép sự khuếch tán của dịch tiêu hóa vào hạt làm giảm khả sống của probiotic. Tuy nhiên,
mức giảm thấp hơn mức quan sát được đối với vi sinh vật tự do, cho kết luận rằng quá trình vi gói đã
cải thiện khả năng tồn tại của các chế phẩm sinh học trong điều kiện tiêu hóa nhân tạo [18]. Bên cạnh
đó vi gói bằng EM cung cấp bảo vệ L. acidophilus tốt hơn IM, kết luận này cũng được rút ra từ nghiên
cứu của Estefanía Valero-Cases (2015) sự tồn tại của viên nang IM vi gói L. plantarum trong điều kiện
tiêu hóa nhân tạo thấp hơn EM trong thời gian lưu trữ (15 và 30 ngày) [2]. Với cả hai kĩ thuật vi gói
EM và IM chất mang Ca phủ SM cung cấp bảo vệ tốt hơn là Ca và hệ chất mang Ca-SM điều này có
thể lí giải vì nhược điểm khi vi gói với Ca tạo cấu trúc xốp ảnh hưởng đến hiệu quả bảo vệ probiotic,
việc bao phủ giúp hạn chế cấu trúc xốp này cản trợ sự khuếch tán của SGF và SIF vào trong chế phẩm
vi gói từ đó nâng cao khả năng bảo vệ tế vào vi khuẩn probiotic [19, 20].
Hình 4. Ảnh hưởng của phương pháp vi gói đến khả năng sống của L. acidophilus trong SIF, mỗi thanh đại diện
trung bình ± SD của ba thí nghiệm độc lập (n = 3), a-c đại diện cho sự khác biệt đáng kể (p <0,05) cho mỗi thí
nghiệm
21