CHƯƠNG 3: Một số kỹ thuật sử dụng trong chọn giống cây trồng
3.1 Chiết tách, đánh giá độ sạch DNA 3.2 Phương pháp PCR 3.3 Điện di 3.4. Giải trình tự DNA
3.1. Chiết tách và đánh giá độ sạnh DNA
• Để thu nhận DNA tinh sạch cần loại bỏ thành phần
tạp nhiễm, quan trọng nhất là protein
• Tách chiết DNA dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phân tử khác nhau (nulceic acid/protein)
• Thu được DNA ở trạng thái nguyên vẹn tối đa, không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học hay hóa học
• DNA tách chiết được dùng trong phân tích di truyền
trong
- Khoa học: DNA sử dụng trong rất nhiều ứng dụng, vd
đưa DNA vào tế bào cho mục đích chẩn đoán;
- Y học: là ứng dụng phổ biến: vd đánh giá độc tính
của sinh sinh vật, xác định nguồn gây bệnh;
- Nghiên cứu tội phạm: cần phục hồi DNA
Các bước
Có rất nhiều phương pháp tách chiết khác nhau, tất cả các phương pháp gồm:
• B1: Phá màng tế bào, màng nhân
• B2: Loại protein và các tạp chất khác
• B3: Thu hồi nucleic acid
• Sự lựa chọn các phương pháp dựa trên nhiều yếu tố: A. Hàm lượng và khối lượng của DNA B. Yêu cầu về độ tinh sạch của DNA cho ứng dụng C. Thời gian và chi phí
Nguyên tắc
• Tách DNA khỏi các thành phần tế bào khác như
proteins, lipids, RNA….
• Trách làm đứt gãy đoạn dài DNA từ tác động cơ học
hoặc các enzyme
• Bất hoạt các enzyme trong TB (DNase enzymes) và ngăn chặn tác động làm ngắn/đứt gãy lên DNA là bước quan trọng trong tinh sạch DNA. DNases có thể được bất hoạt bằng sử dụng nhiệt hoặc các chất hóa trị/chelating agents.
Tách chiết DNA
Các bước • Phá màng tế bào, màng
nhân
• Loại bỏ các tạp chất gồm Proteins RNA Các phân tử đa lượng khác • Kết tủa và thu hồi DNA
B1. Phá vỡ màng tế bào, màng nhân
Nghiền tế bào, mô trong một hỗn hơp chất tẩy (SDS) và proteinase để phá vỡ màng tế bào, màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA - Chất tẩy là chất lưỡng cực, sẽ kết hợp với portein màng và các
phân từ phospholipid làm vỡ cấu trúc màng
- Chất tẩy ion hóa có tác dụng phá màng mạnh, chất tẩy không ion
hóa có tác dụng phá màng nhẹ hơn
B2. Loại bỏ các tạp chất
• DNA được tách bỏ khỏi protein và các tạp chất
sau khi nghiền mẫu. Phương pháp tách bỏ:
a) Dùng hợp chất hữu cơ b) Các loại muối
a) Loại bỏ bằng hợp chất hữu cơ
chloroform:isoamyl. Lắc mẫu trong dung dịch để biến tính protein đồng thời không hòa tan nucleic acid.
• Thông thường dùng phenol:chloroform hoặc
• Khi có phenol, 3 lớp hình thành sau khi ly tâm: DNA nổi ở trên (aqueous phase), protein sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha phenol:chloroform. Thu hồi nucleic acid trong pha nước
b) Loại bỏ bằng muối
• Ở nồng độ muối cao, protein bị mất nước, mất tính
hòa tain và kết tủa
• Thường sử dụng NaCl, KCH3CO2, NH4CH3CO2. • Protein kế tủa được loại bỏ bằng cách ly tâm • DNA nổi ở lớp trên
B3: Kết tủa và thu hồi DNA
- Nhằm thu nhận nucleic acid dưới dạng cô đặc để bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme và khi cần có thể hòa lại trong nước theo nồng độ mong muốn;
- Kết tủa DNA: + dùng Ethanol tuyệt đối hoặc isopropanol + Các sợi DNA có thể được vớt bằng que hoặc khi ly tâm, DNA kết tủa ở đáy - Rửa DNA bằng 70% ethanol để loại bỏ các muối và isopropanol
Tách chiết ADN
Cối và chày
Đĩa nghiền sứ
Lấy mẫu lá
Ngày nay, tách chiết ADN tự động
“Geno-Grinder” – máy tách chiết ADN số lượng nhiều
Đánh giá kết quả tách chiết và độ tinh sạch
• Nguyên tắc: Phương pháp đo quang phổ dựa vào sự hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260nm của các base Purine và Pyrimidine, độ hấp thụ này tỷ lệ với nồng độ DNA.
• Nồng độ DNA có thể xác định bằng độ hấp thụ đo bằng máy quang phổ và so với đồ thị chuẩn của nông độ DNA đã biết trước
• Đo độ hấp thụ của DNA ở bước sóng 260nm & 280nm được
1.7 – 1.9
dùng để xác định độ tinh sạch của DNA - Độ tinh sạch DNA: A260/A280 ratio: - Nồng độ DNA (μg/ml): A260 X 50 - Tổng số DNA: Nồng độ DNA X Tổng thể tích DNA
Spectrophotometer/Máy đo quang phổ
Độ tinh sạch của DNA
Kiểm tra DNA đứt gãy
Chạy điện di trên agarose gel: DNA chất lượng tốt
sẽ dịch chuyển và cho vạch như phân tử khối lượng lớn, với ít hoặc không có vệt mờ.
DNA hấp thụ ánh sáng UV ở bước sóng 260 &280 nm & protein hấp thụ UV ở 280 nm. Mẫu DNA có tỷ lệ 260/280 là 1.8 thì nhìn chung không bị lẫn tạp protein.
Mẫu DNA bị lẫn tạp sẽ có tỷ lệ 260/280 < 1.8
3.2 Phương pháp PCR
• Khái niệm:
PCR = Polymerase chain reaction = chuỗi phản ứng trùng hợp
- PCR là kỹ thuật nhằm nhân bản phân tử ADN hoặc đoạn ADN nhất định, lặp đi lặp lại qua nhiều chu kì trong ống nghiệm cho đến khi thu được một khối lượng mong muốn
• Nguyên lý
Ôn tập: Cấu trúc ADN
Đơn phân: nucleotit
Chuỗi polynucleotit
• Axit nucleic cấu tạo theo nguyên tắc đa phân tử mà
đơn phân là nucleotit
- Nucleotit do 3 phân tử liên kết với nhau tạo thành:
(1) axit phootphoric (H3PO4);
(2) đường pentô (đường có 5; nguyên tử C) – có 2 loại đường: C5H10O5 (riboza) và C5H10O4 (deoxyriboza)
(3) bazơ nitơ: có 5 loại chính: Adenine (A), Thymine
(T), Guanine (G), Cystosine (C/X), Uracil (U)
• Trong chuỗi polynucleotit – mạch đơn: các nucleotit
nối với nhau bằng liên kết phôtphodieste
- Nguyên tử C3 của đường pentô ở nucleotit này nối
với gốc phôtphat của nucleotit liền kề
- Ở mỗi chuỗi, một đầu có nhóm –P nối với C5 là tự do, còn đầu kia có nhóm –OH nối với C3 là tự do, nên quy ước chiều của chuỗi là 5’P -- 3’OH, viết tắt là 5’-- 3’
- Các bazơ nitơ được xem là tự do vì không tham gia vào liên kết trong chuỗi
ADN: 2 chuỗi xoắn kép gồm 2 mạch polynucleotit xoắn đều quanh một trục theo chiều từ trái sáng phải (xoắn phải) - 1 vòng xoắn: 10 cặp nucleotit, dài 34 Ăngstrong; đường kính 20 Ăngstrong - Liên kết giữa 2 mạch đơn bằng liên kết hyđrô: A – T (2 liên kết hyđrô); G – X (3 liên kết hyđrô)
• Tái bản ADN trong cơ thể sinh vật:
Bài toán
• Làm sao để phát hiện và nhận biết một đoạn
gen cụ thể trong bộ gen?
- Có rất nhiều đoạn gen khác nhau trong bộ
gene không cần phát hiện
- Số lượng đoạn gen cần phát hiện rất nhỏ
moles ~ 1.8 x 1010
bản sao
• VD Để thấy được đoạn gen trên gel, cần có 10 ng DNA Nếu đoạn gen dài 500bp thì: 10 ng ~ 3.03 x 10-14 Nghĩa là: để thấy được đoạn gene từ 100 tế bào ban đầu, cần phải nhân bản lên 180 triệu lần !!!!
• Nguyên lý PCR:
- Dựa trên cơ sở khả năng tái bản phân tử ADN ở ngoài cơ thể sinh vật
- Để tái bản, phân tử ADN cần enzyme ADN- polymerase, các nucleotit tự do trong môi trường (A, T, G, C) (dNTPs), MgCl2, đoạn nucleotit mồi
PCR: Polymerase chain reaciton – chuỗi phản ứng trùng hợp
- ADN polymerase: là enzyme sử dụng trong phản ứng - Chuỗi phản ứng (chain): vì sản phẩm của chu kì phản ứng trước
được sử dụng cho chu kì phản ứng sau
Các bước trong phản ứng PCR
1X
30-40X
1X
94ºC 94ºC 3 min 1 min
72ºC 1 min
3
.
4ºC
55ºC 45 sec 1. Tháo xoắn Khởi đầu: tháo xoắn DNA
K é o d à
2. Gắn mồi
i
m ạ c h D N A
∞
• B1: Tháo chuỗi xoắn kép
(Denaturation)
- 94-96oC - Chuỗi xoắn kép thành đoạn mạch đơn DNA • B2: Gắn mồi (Annealing) - 50-65oC - Các mồi gắn vào mạch khuôn
• B3: Kéo dài mạch DNA - 72oC Các nucleotit được gắn vào mạch mới
• B1: Nâng nhiệt độ lên 95oC: ở nhiệt đô này, tất cả các mạch
xoắn kép của DNA mẫu được tách ra thành mạch đơn
• B2: Hạ nhiệt độ phản ứng xuống 50-60oC. Ở nhiệt độ này, 2 đoạn của mồi (primer) sẽ được cặp đôi với 2 sợi DNA. Đoạn primer xuôi sẽ theo hướng 5’-3’ của sợi DNA mới; còn mồi ngược sẽ cặp đôi với sợi DNA kia cũng theo hướng 5’-3’;
• B3: Nâng nhiệt độ lên 72oC. Ở nhiệt độ này, DNA Taq
polymerase hoạt động để kéo dài các mạch DNA. Nguyên liệu là 4 loại dNTP (deoxyribonucleoside triphosphates)
Một chu kì (cycle) gồm 3 giai đoạn trên được lặp lại từ 30-40 lần.
Các thành phần chính trong phản ứng PCR
• Mạch khuôn DNA (0.5 - 50 ng) • 2 Mồi (0.1 – 2.0 μM) • 4 loại deoxyribonucleotit triphosphates: dNTP’s (20 –250
μM)
• Enzyme DNA polymerase: ổn định với nhiệt độ (0.5 – 2.5
đơn vị/1μl )
• MgCl2 (1 – 5 mM) • Dung dịch đệm (Buffer)
Dung dịch đệm
Mồi
dNTPs
A C T G
KCL (10 – 50 mM) Tris-HCl (10 mM, pH 8.3) NaCl2 (có thể có)
Taq polymerase
• Nước
Mạch khuôn DNA
+ +
MgCl2
Các thành phần (tiếp)
• Nước: môi trường hoạt động cho các thành phần còn
lại
• Dung dịch đệm: Ổn định DNA polymerase, DNA và
các nucleotide • Mạch khuôn DNA: - chứa vùng cần nhân bản - Không cần tinh sạch - Không chứa chất ức chế DNA polymerase
• Mồi:
- Là đoạn DNA mạch đơn, có chiều dài 15 – 30 nucleotide
- Đặc hiệu cho 2 đầu đoạn gen, gồm mồi xuôi và mồi
ngược
- Cần biết nhiệt độ nóng chảy (Tm): nhiệt độ này phụ
thuộc vào chiều dài mồi, thành phần G C…
- Nhiệt độ nóng chảy:
(Tm) = [(2 x (A+T)) +(4 x (G+C))]ºC • Nếu tỷ lệ GC < 50%, nhiệt độ gắn mồi thấp hơn Tm
5ºC
• Nếu tỷ lệ G C ≥ 50%, nhiệt độ gắn mồi = Tm
• MgCl2: cần với 3 mục đích: -Ion Mg2+ tạo thành phức với dNTPs để gắn dNTPs với enzyme -Kích thích hoạt tính của Taq polymerase -Tăng sự tương hỗ giữa mồi và DNA mạch khuôn - Ổn định cấu trúc xoắn kép của DNA -Nếu quá ít: enzyme không hoạt động -Nếu quá nhiều: phản ứng kém đặc hiệu
• Enzyme DNA polymerase: - Kéo dài mạch DNA - Taq thu nhận từ Thermus acquaticus hoặc
enzyme khác tương tự
- Enzyme chịu nhiệt - Chiều tổng hợp 5’--3’
3.3 Điện di
• Mục tiêu: - Định tính: sự hiện diện, cấu hình phân tử, kích thước - Định lượng: hàm lượng tương đối so với thang hàm lượng - Chuẩn bị: thu hồi đoạn DNA (dùng tạo dòng, …) • Nguyên tắc: dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid: tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt của một điện trường nên sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. • Tính linh động của phân tử khi di chuyển trong điện trường phụ thuộc vào khối lượng phân tử và nồng độ các chất cấu thành gel. • Kiểu điện di: Agarose, điện di trong trường xung (PFGE - Pulse Field Gel Electrophoresis).
Điện di - Electrophoresis
• Chuẩn bị mẫu, gel (agarose, polyacrylamide…), bồn điện di, buffer, dung dịch điện di… • Nạp mẫu • Chạy điện di • Nhuộm gel.
Chất nhộm gel - Stain
Điện di trên gel agarose
• Gel agarose là loại gel thông dụng nhất, thường dùng để
phân tách những đoạn có kích thước 0,5-20 kb.
• Điện di theo phương nằm ngang • Độ phân giải thay đổi khi nồng độ agarose hay loại agarose
thay đổi.
• Phát hiện bằng phóng xạ tự ghi, nhuộm ethidium bromide. Chất này có khả năng gắn xen vào giữa các base của nucleic acid và sẽ phát huỳnh quang dưới tia tử ngoại.
• Ứng dụng: phát hiện 1 trình tự DNA, phân tích hỗn hợp các
trình tự DNA (Southern blot), chuẩn bị nguyên liệu
Các yếu tố ảnh hưởng điện di gel agarose
• Kích thước của phân tử Các phân tử DNA có kích thước càng lớn (khối lượng phân tử lớn) thì tốc độ dịch chuyển càng chậm. Các phân tử DNA mạch thẳng sợi đôi đi qua bản gel ở các tốc độ tỷ lệ nghịch với hàm log10 của khối lượng phân tử của chúng.
• Cấu hình của DNA: Các DNA dạng vòng đóng, vòng đứt và mạch thẳng có cùng một khối lượng phân tử sẽ dịch chuyển trên agarose gel ở các tốc độ khác nhau. DNA của các plasmid mạch vòng dịch chuyển nhanh hơn DNA của plasmid cùng loại nhưng có dạng mạch thẳng.
• Nồng độ agarose Đoạn DNA mang kích thước khác nhau dịch chuyển ở các tốc độ khác nhau qua các bản gel chứa các nồng độ agarose khác nhau.
Dạng vòng đứt
A
B
C
Dạng vòng đóng
Điện di các mẫu DNA giống nhau ở các nồng độ agarose khác nhau. A: 1%, B: 1,5% và C: 2%.
DNA mạch vòng
DNA mạch thẳng
Thiết bị điện di gel agarose
Các bước trong quá trình điện di gel agarose
Điện di Agarose gel
http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/agardna.html
Chiếu sáng UV
Điện di trên gel polyacrylamide
• Được dùng để tách các đoạn có kích thước nhỏ, dưới 1000 cặp base
• Điện di theo phương thẳng đứng
• Độ phân giải cao, phân biệt được những trình tự chỉ cách nhau 1 nucleotide.
• Phương pháp phát hiện: DNA – phóng xạ tự ghi, xanh methylene, ethidium bromide, protein – xanh Coomassie, nhuộm nitrate bạc.
• Ứng dụng: tinh sạch các oligonucleotic tổng hợp, giải trình tự DNA, tách các trình tự DNA có kích thước gần bằng nhau, SDS-PAGE (phân tích protein)
Điện di Acrylamide gel 1
UV transilluminator
UV light
3.4. Giải trình tự gen
• Phương pháp xác định vị trí sắp xếp các nucleotid
trong phân tử DNA
• 2 phương pháp chính cho giải trình tự gen/DNA
sequencing:
A- Phương pháp hóa học - Maxam and Gilbert, 1977
- Cắt các nucleoti ở DNA bằng hóa chất đặc hiệu
- 4 hóa chất, mỗi loại cho một bazơ
- Thu được các đoạn DNA có kích thước khác nhau
- Đoạn DNA có chứa đến 500 nucleotides
B- Phương pháp sử dụng Enzyme (Sanger, 1981)
Phương pháp Maxam và Gilbert
• Nguyên tắc: dựa trên phản ứng hóa học thủy giải đặc hiệu, các DNA không tự xoắn lại với nhau, tạo thành tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước khác nhau.
• Phân tử DNA được đánh dấu đồng vị phóng xạ P32 ở đầu 5’ của mạch đơn, tạo những đoạn đánh dấu có thể phát hiện bằng hình phóng xạ.
• Xử lí hóa học đặc hiệu phân hủy đặc trưng một loại nucleotide của mạch DNA đã đánh dấu phóng xạ, tạo các đoạn oligonucleotide có chiều dài hơn kém nhau 1 nucleotide được phát hiện bằng điện di.
bằng điện di trên gel polyacriamid có thể xác định được trình tự mạch đơn.
• Kết qủa các phản ứng hóa học xử lí mạch DNA được phát hiện
5’OH
3’
5’OH
3’
P32, ATP, enzyme
P32
Bước 1: Đánh dấu phóng xạ và tách mạch đơn DNA
DNA đánh dấu P32
90oC
- Biến tính bằng nhiệt độ.
Điện di phân tách các mạch đơn
- Đánh dấu phóng xạ P32 ở đầu 5’ của mạch khuôn.
P32
Tách lấy mạch đơn
- Điện di tách lấy một mạch DNA làm mạch khuôn, dùng mạch khuôn này cho các xử lý tiếp theo.
Bước 2: Phản ứng hóa học Mạch đơn đã đánh dấu phóng xạ có thể xử lí theo 4 nhóm phản ứng: sử dụng 4 ống nghiệm để thực hiện các phản ứng hóa học đặc hiệu khác nhau, tạo các đoạn DNA cắt dài ngắn khác nhau
Ống 1
Hóa chất xử lý
Vị trí cắt
1
Dimethyl sunrfat pH 8
G
2
Piperidine formate pH2
A hoặc G
3
Hydrazine
C và T
4
Hydrazine + Nacl 1,5M
C
Các bước giải trình tự gen Maxam-Gilbert
Phương pháp Sanger
• Nguyên lý: dựa theo cơ chế tổng hợp DNA. Trong quá trình tổng hợp mạch đơn DNA bổ sung một hàm lượng nhỏ dideoxinucleotid (ddNTP).
• Do ddNTP mất cả 2 nhóm OH (carbon số 2 và 3) ngẫu
nhiên làm cho phản ứng tổng hợp DNA ngừng lại.
• Phản ứng tổng hợp DNA xảy ra trong 4 ống riêng biệt
• Kết quả thu được các sản phẩm DNA với kích thước khác nhau và được kiểm tra trên điện di. Bazơ cuối cùng của mỗi đoạn DNA được xác định
2’, 3’ dideoxy nucleotide (Không thể hình thành liên kết phosphodiester với dNTP kế tiếp)
Vật liệu: - Primer( 20 nucleotides) - DNA polymerase - DNA template - dNTP và ddNTP - Vật liệu đánh dấu - Hệ thống điện di
Bước 1: Biến tính DNA khuôn
Điện di trên gel polyacrylamid để thu các mạch đơn DNA, dùng DNA này để tiến hành các bước xử lý tiếp theo.
Bước 2: Chuẩn bị cho phản ứng tổng hợp DNA
Lấy 4 ống, cho các thành phần cần thiết vào mỗi ống : mạch khuôn DNA, mồi có đánh dấu phóng xạ P32, enzyme DNA polymerase, 4 loại dNTP, dung dịch đệm thích hợp và thêm vào mỗi ống tương ứng một loại ddNTP nhất định.
Bước 3 : Thực hiện các phản ứng tổng hợp DNA
Mồi đánh dấu được sử dụng để khởi động tổng hợp DNA. 4 loại ddNTPs ngẫu nhiên kết thúc sự tổng hợp các đoạn DNA
Bước 4: Điện di kết quả, so sánh kết quả các chuỗi mạch đơn DNA được tổng hợp để xác định trình tự của mạch khuôn.
Các đoạn DNA được phân tách trên gel, chiếu đèn và chụp ảnh
Giải trình tự bằng máy tự động (Sequencer)
• Theo nguyên tắc sử dụng ddNTP của phương pháp Sanger • Trong quá trình tổng hợp DNA sử dụng mồi và dNTP đánh dấu
huỳnh quang, mỗi loại dNTP có màu khác nhau
• Máy tổng hợp mạch đơn trên cả 2 mạch khuôn,dùng phần
• Phản ứng được thực hiện trong 1 ống và tất cả các sản phẩm
mềm để xử lý kết quả.
thu được trong ống
• Các sản phẩm được phân tách theo kích cớ khi chạy điện di
Giải trình tự bằng máy tự động
• Các vạch được đánh dấu màu phụ thuộc vào
ddNTP kết thúc đoạn DNA
• Máy laser scan màu huỳnh quang gắn trên
mỗi vạch khi chạy qua và bộ phận phân tích sẽ phát hiện ra màu
Xử lý kết quả, tự động in trình tự gen
Các bước trong phản ứng giải trình tự gen
1. Sản phẩm PCR tinh sạch
2. Chuẩn bị cho các phản ứng sequencing
3. Thực hiện chu kì sequening
4. Xử lý các đoạn DNA tổng hợp
5. Đọc trình tự các nucleotit kết thúc (trình tự DNA)
Các công nghệ giải trình tự gen mới
• 2005: 454 Sequencing • 2006: Illumnia Sequencing • 2007: ABI solid Sequencing
Trình tự gen để làm gì?
• So sánh một đoạn ADN bất kỳ với các dữ liệu trong ngân hàng
gen có thể chúng ta xác định được đoạn ADN đó của sinh vật nào.
thể suy ra trình tự các axit amin tương ứng trên mạch polypeptide nếu đoạn ADN đó mã hóa
• Biết được trình tự sắp xếp các nucleotit của một đoạn ADN có
• Xác định đột biến, sự sai khác về trình tự nucleotit trong cùng
một sản phẩm gen, có ý nghĩa trong nghiên cứu tiến hóa và ứng dụng thực tiễn.
• Tạo ra các sinh vật mới mang những đặc tính mong muốn hoặc có thể chuyển gen vào các tế bào vi khuẩn, nấm men… để sản xuất sản phẩm gen theo con đường tái tổ hợp (protein, enzym, vaccine và các hợp chất có hoạt tính sinh học).
NCBI - BLAST
NCBI home page --Go to www.ncbi.nlm.nih.gov :
1) Dùng để tìm và xác định trình tự có cùng trình tự với đoạn gen đang thử nghiệm trong database
2) Xếp các trình tự tìm kiếm theo mức độ
tương đồng (E value)
3) Biểu thị sự liên kết giữa trình tự thử nghiệm
và trình tự giống trong database
Programs available for BLAST searches
Protein sequence (this is the best option) blastp--compares an amino acid query sequence against a protein sequence database tblastn--compares a protein query sequence against a nucleotide sequence database translated in all reading frames DNA sequence blastn--compares a nucleotide query sequence against a nucleotide sequence database blastx--compares a nucleotide query sequence translated in all reading frames against a protein sequence database tblastx--compares the six-frame translations of a nucleotide query sequence against the six-frame translations of a nucleotide sequence database.
