MỒI PCR/ PCR PRIMER
Vũ Thị Thúy Hằng
Nội dung
1. Khái niệm
2. Nguyên tắc chung trong thiết kế mồi
3. Một số phần mềm trong thiết kế mồi
1
PCR: công nghệ làm thay đổi thế giới
The Polymerase Chain Reaction (PCR) làm cuộc cách mạng trong khoa
học sự sống vì cho phép nhân bản một số lượng lớn DNA một cách thuận tiện, hiệu quả, và có độ cậy
Được phát minh năm 1983 bởi Kary Mullis, dành giải Nobel năm 1993
Kỹ thuật PCR được sử dụng rộng rãi khi phát hiện ra Taq polymerase,
một DNA polymerase trong vi khuẩn Thermus aquaticus, bền với nhiệt.
Nguyên liệu chính dùng trong PCR:
- DNA nucleotides: thành phần hình thành nên đoạn DNA mới
- DNA khuôn: trình tự/đoạn DNA muốn nhân bản
- Primers/Mồi: đoạn DNA mạch đơn gồm 16--50 nucleotide bắt cặp bổ sung với một vùng ngắn ở 2 đầu của đoạn DNA khuôn
- DNA polymerase: enzyme bền với nhiệt độ dùng để tổng hợp đoạn DNA mới
Mồi – quyết định thành công của phản ứng PCR
Đặc hiệu/ Chuyên biệt?
Gắn với DNA khuôn
2
1. Khái niệm
Mồi là đoạn nucletotit ngắn, bắt cặp bổ sung với đầu 5’ hay 3’
Thiết kế mồi là tạo ra một đoạn trình tự nucleotit ngắn sử dụng trong nhân bản một vùng đặc hiệu của DNA. Mồi được thiết kế dựa vào 2 vùng trình tự đã biết nằm ở 2 đầu đoạn gen cần nhân bản
Mồi thiết kế được dùng để :
của DNA mạch khuôn
- Tìm gen mới
- Xây dựng công cụ để nhận biết, phân biệt
3
- Tối ưu sản phẩm PCR
2. Nguyên tắc chung khi thiết kế mồi
Trước khi thiết kế mồi – Đừng phát minh lại bánh xe!
4
Trước khi thiết kế mồi – Tìm kiếm và sử dụng đúng nguồn thông tin!
Mồi thiết kế dùng để làm gì? Nhân bản DNA nói chung? Phát hiện sự khác nhau ở cấp độ từng nucleotide/SNPs? Nghiên cứu về Methylation (nhóm methyl gắn vào và làm DNA
thay đổi chức năng)
Trong PCR để định lượng được DNA nhân bản (Real-time PCR) Làm mồi dò cho microarray? Cho nhiều PCR trong cùng một phản ứng (sử dụng nhiều mồi)
Bắt đầu từ đâu?
Trình tự DNA mạch đơn/ Trình tự protein? Nhiều file trình tự DNA/protein? Ngân hàng gen (GenBank ID/Gene ID/Gene Symbol/rsSNP ID?
Sau đó, xem xét một số lựa chọn!
Hầu hết các mồi có thể được thiết kế từ một số phần mềm khác nhau
Cách tiếp cận Tiêu chí thiết kế và mặc định (Designing criteria and default
Các phần mềm khác nhau có thể cho kết quả khác nhau, chủ yếu về:
Tính toàn diện Tính năng sử dụng Tốc độ
settings)
5
Xem xét đến lựa chọn thứ 2 khi: Bạn mới lần đầu thiết kế Bạn không có nhiều sự tự tin trong lựa chọn kết quả
Những nguyên tắc chung trong thiết kế mồi
Khi thiết kế mồi phải xem xét đến các yếu tố:
Chiều dài của mồi và của đoạn nhân bản
Nhiệt độ chảy
Nhiệt độ gắn mồi
Tính đặc hiệu/chuyên biệt và tránh tương đồng chéo
Hàm lượng GC; trình tự chạy và trình tự lặp
Tránh tương tác giữa mồi – mồi hình thành cấu trúc bậc 2
Chiều dài của mồi và đoạn nhân bản
Chiều dài mồi quyết định tính đặc hiệu và ảnh hưởng lớn đến nhiệt
độ gắn mồi: Quá ngắn: tính đặc hiệu kém, dẫn đến nhân bản cả các đoạn không
đặc hiệu
Quá dài: giảm hiệu quả gắn với DNA khuôn ở nhiệt độ gắn mồi bình
thường do tăng xác suất hình thành cấu trúc bậc hai.
Chiều dài tối ưu
18-24 bp cho PCR thông thường 30-35 bp cho nhiều PCR trong một phản ứng
Chiều dài đoạn DNA nhân bản tối ưu
300-1000 bp cho PCR thông thường, tránh > 3 kb 50-150 bp PCR để định lượng, tránh > 400 bp
6
Kẹp GC (GC clamp)
Xác suất tìm thấy 1 nucleotit A, G, C, T trong một trình tự DNA là: 1/4 (4-1)
Xác suất tìm thấy trình tự có 2 nucleotit liền nhau (vd AG) trong trình tự DNA là: 1/16 (4-2)
Xác suất tìm thấy trình tự 4 nucleotit liền nhau trong trình tự DNA là: 1/256 (4-4)
Cứ như vậy, một trình tự 16 nucleotit chỉ xuất hiện 1 lần trong tối thiểu 4-16 nucleotit, ~ 4 tỷ nucleotit, ~ genome của người hoặc ngô
Nhiệt độ chảy (Tm)
Tm là nhiệt độ tại đó 50% DNA kép tháo xoắn thành mạch đơn
Ảnh hưởng bởi độ dài mồi, thành phần nucleotide và nồng độ mồi. Ảnh hưởng bởi nồng độ muối (MgCl2) trong phản ứng PCR Tm = 2(A+T)+4(G+C).
Nhiệt độ chảy
52°C-- 60°C Tm > 65°C thường tránh do khả năng gắn mồi với cấu trúc bậc 2. Tm (75°C-- 80°C) được sử dụng để nhân bản những đoạn có hàm
lượng GC cao
Sự khác biệt về Tm giữa mồi xuôi và ngược < 5oC
7
Chiều dài mồi
Nhiệt độ gắn mồi (Ta)
Ta ảnh hưởng bởi Tm của mồi và đoạn nhân bản:
Ta là nhiệt độ tại đó mồi được gắn vào mạch DNA khuôn Ta vs. Tm
Nguyên lý chung: Ta thấp hơn 5°C so với Tm Nhiệt đô Ta cao hơn tăng tính đặc hiệu của phản ứng
tối ưu: Ta=0.3 x Tm(mồi)+0.7 x Tm(sản phẩm PCR)-25
nhưng có thể cho lượng DNA nhân bản ít hơn
Tính đặc hiệu
Chỉ có duy nhất một vị trí bắt cặp của mồi trên DNA khuôn Quyết định bởi chiều dài mồi và trình tự nucleotit Phụ thuộc vảo bản chất của đoạn DNA làm khuôn.
Tương đồng chéo
Mồi thiết kế không nhân gen khác trong phản ứng PCR. Mồi chứa nhiều trình tự lặp lại thường nhân bản cả đoạn không đặc
hiệu.
Để đảm bảo tính đặc hiệu và tránh xảy ra tương đồng chéo
BLAST trình tự của mồi PCR thiết kế với trình tự trong NCBI xem nó
có thể nhân đoạn tương đồng nào khác không?
8
Tính đặc hiệu và tránh tương đồng chéo
Hàm lượng GC; trình tự chạy và trình tự lặp
Hàm lượng G/C Tối ưu: 45-55% Thông thường G/C trong khoảng: 40-60%
Trình tự chạy
Mồi có trình tự chạy của một bazơ dài dẫn đến gắn mồi sai. VD AGCGGGGGATGGGG trình tự chạy của 'G' là 5 and 4.
Tối đa là 4 nucleotit.
Trình tự lặp
Một trình tự lặp gồm 2-nucletotit liền nhau được lặp đi lặp lại
nhiều lần. VD: ATATATAT.
Số trình tự lặp tối đa trong đoàn mồi thiết kế là 4
Tránh hình thành cấu trúc bậc 2 của mồi
Cấu trúc bậc 2 của mồi có thể hình thành do tương tác của bản thân mồi và giữa cặp mồi với nhau, ảnh hưởng đến bắt cặp của mồi với DNA khuôn và ảnh hưởng tới phản ứng PCR. Có thể dưới các dạng:
Kẹp tóc/Hairpins
Hình thành do tương tác của bản thân mồi: sự bắt cặp của các
nucletotit trong mồi
Tự bắt cặp/ Self-Dimer
Do tương tác giữa mồi: sự bắt cặp của các nucletotit giữa các
mồi
Bắt cặp chéo
Do sự tương tác giữa mồi xuôi và mồi ngược: sự bắt cặp của
các nucletotit giữa mồi xuôi và mồi ngược;
9
Kẹp tóc
Tự bắt cặp
Bắt cặp chéo
Kẹp GC (GC clamp)
Sự có mặt của G hoặc C trong 5 nucletotit cuối ở đầu 3’ của mồi, giúp cho sự bắt cặp đặc hiệu giữa mồi và DNA khuôn (do liên kết mạnh của G/C - 3 liên kết hydro)
Tránh có nhiều hơn >3 G hoặc C ở đầu 3’
10
GC clamp
Kết luận:
Độ dài: 18-24 bases
Tỷ lệ G/C: 40-60%
Cân đối giữa G/C và A/T (1:1) Tm cho phép gắn mồi ở nhiệt đột 55-65°C Không có sự bắt cặp của mồi tạo thành cấu trúc bậc 2
Có G hoặc C ở trong 5 nucletotit cuối đầu 3’
Một mồi tốt là mồi:
Nhiệt độ chảy tương đương nhau, không khác nhau quá 5°C
Không có sự bắt cặp chéo giữa mồi xuôi và mồi ngược
Cặp mồi xuôi và ngược cần:
3. Một số phần mềm thiết kế mồi
Việc tính toán thủ công để kiểm tra các yêu cầu trên cho mỗi đoạn mồi dự định thiết kế là rất tồn thời gian và công sức. Việc làm này trở nên dễ dàng và nhanh chóng hơn nhờ sử dụng các phần mềm thiết kế mồi như:
Oligo
Primer
PrimerQuest
Primer3Plus
PrimerZ
11
PerlPrimer
Các bước trong thiết kế mồi
1. Có trình tự của khuôn DNA
Bằng một trong các cách:
- Giải trình tự DNA/RNA của các sinh vật, từ đó thiết kế mồi theo trình tự đã giải
- Lấy trình tự nucletotit của các sinh vật trên dữ liệu NCBI rồi từ đó thiết kế mồi dựa vào phần mềm
2. Nhập thông tin về trình tự của khuôn DNA
3. Yêu cầu các thông số thiết kế mồi trong phần mềm
4. Phần mềm sẽ tính toán và cung cấp trình tự của mồi
Không
Có
Phản ứng PCR
Tìm trình tự
Thiết kế mồi
Kiểm tra
Thỏa mãn yêu cầu không?
Các phần mềm thiết kế
Giải trình tự/ NCBI/ Cơ sở dữ liệu
…điện di và kiểm tra tính đặc hiệu, phản ứng...
Dựa trên các tiêu chí về một mồi tốt: - Tm - độ dài - độ đặc hiệu - cấu trúc bậc 2 -....
12
5. Kiểm tra xem mồi có thỏa mãn các yêu cầu của mồi tốt, nếu không thì lặp lại thiết kế
General Purpose PCR Primer Design Tool– Primer3
http://simgene.com/Primer3
http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi
13
General Purpose PCR Primer Design Tool– Primer3Plus
General Purpose PCR Primer Design Tool– PrimerZ
Web Site:
http://genepipe.ncgm.sinica.edu.tw/primerz/beginDesign.do
General Purpose PCR Primer Design Tool – PerlPrimer
Web Site: http://perlprimer.sourceforge.net/index.html
PerlPrimer screenshots: http://perlprimer.sourceforge.net/screenshots.html More Info: http://www.hsls.pitt.edu/guides/genetics/obrc/dna/pcr_oligos/URL1167845497/info
14
