Bài giảng Công nghệ sinh học thực phẩm: Chương 6 - ThS. Phạm Hồng Hiếu

MỘT SỐ KỸ THUẬT KiỂM TRA HIÊN ĐẠI

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

Kỹ thuật ELISA?

 Là kỹ thuật dùng để phát hiện các phân tử

đặc trưng trong mẫu (e.g. proteins & carbohydrates, vi khuẩn, virus, độc tố...)

 Là công nghệ của lĩnh vực miễn dịch: sử

dụng kháng thể (antibodies).

 Dùng để định tính và định lượng mẫu.

 Rất nhạy.

 Được ứng dụng nhiều trong y học và thực

phẩm

Là

Fab fragments

với

Fc fragments

Antibodies những  Proteins được tiết tế bào B- ra bởi lymphocytes (bạch cầu) ở động vật có xương sống.  Có khả năng phát hiện và liên kết kháng nguyên (antigens)

IgG molecule

Các bước cơ bản của phương pháp ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

1. Antigen được hấp thu trên bề mặt plastic (‘sorbent’). 2. Antigen được nhận biết bởi các antibody đặc trưng

(‘immuno’).

3. Antibody được nhận diện bởi antibody (‘immuno’) thứ 2

có gắn với enzyme (‘enzyme-linked’).

4. Phản ứng cơ chất với enzym được thực hiện (thường

tạo hợp chất màu)

Màu của sản phẩm= đo được sự hiện diện của antigen

Substrate

Coloured product

Secondary antibody

Different antigens in sample

Primary antibody

Botrytis cinerea

conidiophore

Chuẩn bị mẫu

Add 2ml PBS Place half a raspberry in tube

Break up tissue with glass rod Filter into new tube using muslin

Coating the wells

 Nhỏ 1 giọt mẫu vào giếng (well)

 Giữ yên trong khoảng 10 phút để mẫu hấp thu vào bề mặt plastic.

Thêm kháng thể (primary antibody)

 Thêm vào khoảng 4 giọt primary antibody (mouse monoclonal) vào mỗi giếng

Sản xuất kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibody)

Inject mouse with antigen

Obtain Mouse spleen B-lymphocytes

Grow mouse myeloma (tumour) cells in culture

Fuse B-lymphocytes with myeloma cells

Antibody-producing hybridoma cells

B-lymphocyte and myeloma mixture

Unlimited supply of antibody specific for single epitope

Keep clone producing antibody which best detects antigen

Select fused and reproducing hybridoma cells via growth medium

Screen hybridomas for antibody production

Make clones from individual antibody- producing cells

Sản xuât kháng thể thứ hai

(Secondary antibody)

Mouse serum injected into a different species, e.g. rabbit, goat.

Polyclonal antibodies which can recognise any mouse antibody

Animal makes various antibodies against the different antigens in serum

Select anti-mouse antibodies from plasma

Take blood from animal

Thêm vào kháng thể thứ 2 secondary antibody

 Được liên kết với enzyme horseradish peroxidase.

 Thêm vào 4 giọt secondary antibody (anti- mouse polyclonal) vào mỗi giếng

 Để yên trong khoảng 20 phút.

8. Observe colour development

1. Add antigen

7. Add substrate for enzyme

2. Wash with PBST

6. Wash with PBST

4. Wash with PBST

3. Add primary antibody

5. Add secondary antibody

Ứng dụng ELISA

 Phát hiện bệnh ở người, động vật và thực

vật.

 Phát hiện các tác nhân gây dị ứng trong

thực phẩm.

 Phát hiện các hormones, kháng sinh trong

thực phẩm.

 Phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm

PCR

real-time PCR và PCR là một kỹ thuật hoàn toàn mở do vậy chúng ta có khả năng không phải bị lệ thuộc vào các hãng sản xuất kit ở nước ngoài, nhờ vậy giá thành sẽ rẽ

KHÁI NIỆM KHÁI NIỆM

• PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction

• PCR là Phản ứng chuỗi trùng hợp hay gọi là "phản ứng

khuếch đại gen".

• PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm

khuyếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không

cần sử dụng các sinh vật sống như E. coli hay nấm men.

• PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học

phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di

truyền, nhận dạng, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách

dòng gene, và xác định huyết thống

LỊCH SỬSỬ LỊCH

Phương pháp căn bản chạy PCR được Kary

Mullis phát minh, ông đã đoạt giải Nobel về

Hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu

này, chỉ sau 7 năm khi ông đưa ra ý tưởng. Ý

kiến của Mullis là phát triển một quy trình mà

DNA có thể nhân lên nhiều lần một cách nhân

tạo qua nhiều chu kỳ sao chép bởi enzyme DNA

polymerase

NGHIỆM PCRPCR

THỰC NGHIỆM THỰC • PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác

định được một phần. Đó có thể là một gen đơn, hay một phần

của gen.

• PCR cần rất nhiều thành phần.

- DNA mẫu (template) chứa mảnh DNA cần khuếch đại

- Cặp mồi (primer),

- DNA-polymerase enzym xúc tác cho việc nhân lên của DNA.

- Nucleotides (ví dụ dNTP) là nguyên liệu cho DNA-polymerase

để xây dựng DNA mới.

- Dung dịch đệm, cung cấp môi trường hóa học cho DNA-

polymerase

NGHIỆM PCR THỰC NGHIỆM PCR THỰC

Chu kỳ nhiệt: Đây là máy đun

nóng và làm nguội trong ống

phản ứng ở nhiệt độ chính xác

cho mỗi phản ứng. Để ngăn ngừa

sự bay hơi của hỗn hợp phản

ứng, phần nắp đậy của máy PCR

cũng được đun nóng, trường hợp

lượng dung dịch phản ứng quá ít,

người ta cho một lớp dầu (natural

PCR machine

oil) lên trên bề mặt hỗn hợp phản

ứng.

Nguyên tắc PCR

DNA đích

4

1

1 Biến tính (94oC )

2

2 Bắt cặp (55-65o C)

3

5’ 3’

3’ 5’

3 Kéo dài (72o C)

n

2n

1. Đoạn mồi

Mồi là những đoạn ngắn, sợi DNA nhân tạo

– không quá 50 (thường 18-25) nucleotides

(vì DNA thường là sợi đôi, chiều dài của nó

được xác định bằng số lượng cặp base

(bp); chiều dài của sợi đơn DNA được đo

bằng base hay nucleotides)

Mồi Taq polymerase dNTP PCR buffer + MgCl2 DNA đích (Template)

PCR MIX

2. Quy trình

Quy trình PCR gồm 20 đến 45 chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm 3

bước:

- Nhiệt độ tăng lên 94-96°C để tách hai sợi DNA ra. Bước này gọi

là biến tính, nó phá vỡ cầu nối hydrogen nối 2 sợi DNA.

- Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống để mồi

có thể gắn vào sợi DNA đơn. Bước này gọi là gắn mồi.

- Cuối cùng, DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống. Nó bắt đầu

bám vào và hoạt động dọc theo sợi DNA. Bước này gọi là kéo

dài

30X-40X 94oC/15s-1min 55-65oC/15s-1min 72oC/30s-3min

Phát hiện  qua kích thước (điện di)  hay qua trình tự (lai)

Real-time PCR chạy PCR và đồng thời phát hiện sản phẩm khuếch đại

Ct curve

Standard curve

Melt curve

Camera

Laser or UV

Thiết bị Real-time PCR

Primers Taq polymerase dNTP PCR buffer + MgCl2 Chất phát huỳnh quang

Target DNA (Template)

Real-time PCR MIX

Real-time PCR mix

PCR có đặc hiệu không?

PCR đặc hiệu tương đương nuôi cấy

Ñònh danh döïa vaøo kieåu hình sinh vaät hoùa hoïc bieåu hieän töø caùc kieåu gen

Xaùc ñònh döïa vaøo kích thöôùc ñoaïn gen hay moät trình töï ñaëc hieäu cuûa ñoaïn gen

Nuoâi caáy PCR

Các bước trong xét nghiệm PCR phát hiện tác nhân vi sinh vật

Mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử

Tách chiết nucleic acid

Chạy PCR

Phát hiện sản phẩm PCR và phân tích kết quả

Một xét nghiệm PCR định tính chuẩn mực

Một xét nghiệm qPCR định lượng chuẩn mực

Một xét nghiệm qPCR định lượng chuẩn mực

Những ứngứng dụng Những

dụng củacủa PCRPCR

• Vân tay di truyền

• Kiểm tra huyết thống

• Chuẩn đoán bệnh di truyền

• Tách dòng gen

• Gây đột biến điểm

• Phân tích mẫu DNA cổ

• Xác định gen của các đột biến

• So sánh mức độ biểu hiện của gen