intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Bài giảng Kỹ thuật cấy chuyền và tạo dòng

Chia sẻ: Anh Bình | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:40

Thêm vào BST
Báo xấu
35
lượt xem 3
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

"Bài giảng Kỹ thuật cấy chuyền và tạo dòng" thông tin đến các bạn những kiến thức về nuôi cấy sơ cấp; nuôi cấy thứ cấp; cấy chuyền; cấy chuyền tế bào bám dính; tạo dòng, thu nhận dòng...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng Kỹ thuật cấy chuyền và tạo dòng

  1. Đại học Quốc gia TP HCM Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên Viện Tế bào gốc KỸ THUẬT CẤY CHUYỀN VÀ TẠO DÒNG
  2. CẤY CHUYỀN? Passage / Subculture
  3. CẤY CHUYỀN When the cell density (cells/cm2 substrate) reaches a level such that all Khi nào thì cần cấy chuyền? of the available substrate is occupied, or when the cell concentration (cells/mL medium) exceeds the capacity of the medium, growth ceases or is greatly reduced.
  4. CẤY CHUYỀN Khi nào thì cần cấy chuyền? Cell Confluency (source: https://www.mirusbio.com/transfectopedia/methods)
  5. NUÔI CẤY SƠ CẤP
  6. NUÔI CẤY THỨ CẤP Nuôi cấy thứ cấp là nuôi cấy tế bào được tính từ sau lần cấy chuyền đầu tiên
  7. SVF (stromal vascular fraction) trước khi được đưa vào nuôi cấy là một phức hợp gồm tế bào máu ngoại vi, MSC, tế bào tiền thân nội mô, tế bào cơ trơn, tế bào quanh mạch (pericyte), nguyên bào sợi, dưỡng bào, tế bào tiền thân tạo mỡ,… [38, 115]. Sau vài thế hệ cấy chuyền SVF trong điều kiện tiêu chuẩn, quần thể tế bào trở nên khá tương đồng của tế bào trung mô – ASC [38]. Gentile, P., et al. (2012) Siennicka, K., et al. (2016)
  8. CẤY CHUYỀN Các bước cơ bản của cấy chuyền • HÚT BỎ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY CŨ • RỬA BỀ MẶT GIÁ THỂ NUÔI (CÓ TẾ BÀO BÁM DÍNH) • TÁCH CÁC TẾ BÀO BÁM KHỎI BỀ MẶT DỤNG CỤ NUÔI • PHA LOÃNG CÁC TẾ BÀO BẰNG MÔI TRƯỜNG MỚI
  9. Subculture of Monolayer. Stages in the subculture and growth cycle of monolayer cells after trypsinization
  10. Cấy chuyền tế bào bám dính Loại bỏ môi trường khỏi bình nuôi Rửa bề mặt bình nuôi với PBS- (free Ca2+ Mg2+) Bổ sung dung dịch trypsin/EDTA (0,5- 3ml/bình) Ủ trong tủ ấm 370C Khi tế bào co tròn, nổi lên tiến hành bổ sung một lượng môi trường có chứa huyết thanh Rửa loại bỏ trypsin bằng cách ly tâm 1000- 3000 vòng/phút Tái huyền phù và pha loãng theo tỉ lệ thích hợp
  11. Expansion of Mesenchymal Stem Cells 1.Subculture cells once they have reached approximately 80% confluence and are actively proliferating. IMPORTANT: Subculture cells before reaching 100% confluency. 2.Carefully remove the medium from the 10-cm tissue culture plate containing the confluent layer of human mesenchymal stem cells. Apply 3-5 mL of Trypsin-EDTA Solution (SM-2003-C) and incubate in a 37°C incubator for 3-5 minutes. 3.Inspect the plate and ensure the complete detachment of cells by gently tapping the side of the plate with the palm of your hand. 4.Add 5 mL Mesenchymal Stem Cell Expansion Medium (SCM015 or SCM045) to the plate. 5.Gently rotate the plate to mix the cell suspension. Transfer the dissociated cells to a 15 mL conical tube. 6.Centrifuge the tube at 300 x g for 3-5 minutes to pellet the cells. 7.Discard the supernatant 8.Apply 2 mL Mesenchymal Stem Cell Expansion Medium (pre-warmed to 37°C) containing 8 ng/mL FGF-2 to the conical tube and resuspend the cells thoroughly. IMPORTANT: Do not vortex the cells. 9. Count the number of cells using a hemocytometer. 10.Plate the cells at a density of 5,000-6,000 cells per cm2 into the appropriate flasks, plates, or wells in Mesenchymal Stem Cell Expansion Medium containing 8 ng/mL FGF-2. 11.Cells can be frozen in MSC growth media plus 10% DMSO (D2650) at a density of 2X106 cells/vial.
  12. CẤY CHUYỀN Các phương pháp tách tế bào lên khỏi bề mặt dụng cụ nuôi 1. Trypsin/EDTA 2. EDTA (EthyleneDiamineTetraAcetic) 3. Scrape 4. …
  13. CẤY CHUYỀN Vai trò của trypsin/EDTA
  14. CẤY CHUYỀN Vai trò của EDTA C10H16N2O8  aminopolycarboxylic acid, colourless, water-soluble solid  able to "sequester" metal ions such as Ca2+ and Mg2+
  15. CẤY CHUYỀN Scrape Scraper
  16. CẤY CHUYỀN Các tiêu chí trong quá trình cấy chuyền 1. Density of Culture
  17. CẤY CHUYỀN Các tiêu chí trong quá trình cấy chuyền 2. Exhaustion of Medium
  18. CẤY CHUYỀN Các tiêu chí trong quá trình cấy chuyền 3. Time Since Last Subculture Ideally, a cell concentration should be found that allows for the cells to be subcultured after 7 days, with the medium being changed after 3–4 days. (Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, Sixth Edition)
  19. CẤY CHUYỀN Các tiêu chí trong quá trình cấy chuyền 4. Requirements for Other Procedures (1) cells should not be subcultured while still within the lag period (2) cells should always be taken between the middle of the log phase and the time before which they have entered the plateau phase of a previous subculture
  20. CẤY CHUYỀN Cell Concentration at Subculture As a general rule, most continuous cell lines subculture satisfactorily at a seeding concentration of between 1 × 10^4 and 5 × 10^4 cells/mL
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
583=>1