ThS. Vũ Bích Ngọc – vbngoc@hcmus.edu.vn
Nơi lưu trữ các dòng tế bào và mô người hoặc động vật
Được sử dụng để tạo ra các sản phẩm sinh học/ công nghệ sinh học
Tế bào được kiểm soát chặt chẽ về chất lượng và Znh an toàn
Đời sống
Lão hoá
Bệnh tật
…
Thẩm mỹ
Nghiên cứu
…
Tiết kiệm vật tư nuôi cấy
Lưu giữ dòng tế bào trong thời gian dài
Tạo các chế phẩm sinh học/công nghệ sinh học
2002
15/02/2009
27/4/2010
Bệnh viện Truyền máu huyết học TP.HCM
Ngân hàng tế bào gốc MekoStem
Trung tâm Tế bào gốc Viện Huyết học-‐ Truyền máu TW
Ngân hàng tế bào tại Việt Nam
Thành viên chính thức của Hiệp hội Ngân hàng máu dây rốn Châu Á-‐Thái Bình Dương
Các nguồn tế bào/mô đông lạnh
Tế bào : tế bào máu, tinh trùng , phôi , tế bào gốc…..
http://www.thirdeyehealth.com/cornea.html
http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Embryo,_8_cells.jpg
http://www.heartsupplement.com/ http://www.the-fitness-motivator.com/achilles-tendonitis.html http://www.techsupportforum.com/relaxation-room/offline/148518-bigger-game.html
http://health.howstuffworks.com/sunscreen1.htm http://www.stem-cell-blog.com/ http://encarta.msn.com/media_461516398/two_human_sperm_cells.html
Mô : mạch máu, da, gân, giác mạc…
Tế bào từ máu dây rốn
Tế bào từ màng lót dây rốn
Tế bào từ mô mỡ
Máu ngoại vi
…
Được tạo thành từ một dòng duy nhất
Được sản xuất theo sêu chuẩn quy định (21CFR 610)
Đại diện cho tế bào dự trữ trong điều kiện đông lạnh trong thời gian dài
Bảo tồn các đặc điểm
Tránh nhiễm và suy thoái
21CFR 610 GENERAL BIOLOGICAL PRODUCTS STANDARDS
• Subpart A-‐-‐Release Requirements
§ 610.1 -‐ Tests prior to release required for each lot. § 610.2 -‐ Requests for samples and protocols; official release.
• Subpart B-‐-‐General Provisions
§ 610.9 -‐ Equivalent methods and processes. § 610.10 -‐ Potency. § 610.11 -‐ General safety. § 610.11a -‐ Inacsvated influenza vaccine, general safety test. § 610.12 -‐ Sterility. § 610.13 -‐ Purity. § 610.14 -‐ Idensty. § 610.15 -‐ Consstuent materials. § 610.16 -‐ Total solids in serums. § 610.17 -‐ Permissible combinasons. § 610.18 -‐ Cultures.
• Subpart C-‐-‐Standard PreparaVons and Limits of Potency
§ 610.20 -‐ Standard preparasons. § 610.21 -‐ Limits of potency.
21CFR 610 GENERAL BIOLOGICAL PRODUCTS STANDARDS
• Subpart D-‐-‐Mycoplasma
• Subpart F-‐-‐DaVng Period LimitaVons § 610.50 -‐ Date of manufacture. § 610.53 -‐ Dasng periods for licensed biological products.
§ 610.30 -‐ Test for Mycoplasma. • Subpart E-‐-‐TesVng Requirements for Communicable Disease Agents § 610.40 -‐ Test requirements. § 610.41 -‐ Donor deferral. § 610.42 -‐ Restricsons on use for further manufacture of medical devices. § 610.44 -‐ Use of reference panels by manufacturers of test kits. § 610.46 -‐ Human immunodeficiency virus (HIV) "lookback" requirements. § 610.47 -‐ Hepasss C virus (HCV) "lookback" requirements. § 610.48 -‐ Hepasss C virus (HCV) "lookback" requirements based on review of historical tessng records.
• Subpart G-‐-‐Labeling Standards § 610.60 -‐ Container label. § 610.61 -‐ Package label. § 610.62 -‐ Proper name; package label; legible type. § 610.63 -‐ Divided manufacturing responsibility to be shown. § 610.64 -‐ Name and address of distributor. § 610.65 -‐ Products for export. § 610.67 -‐ Bar code label requirements. § 610.68 -‐ Excepsons or alternasves to labeling requirements for biological products held by the Strategic Nasonal Stockpile.
CBER/FDA: các điểm cần xem xét về đặc Znh tế bào
CBER/FDA: Các điểm cần xem xét về sản xuất và kiểm định European Pharmacopeia (EP)
US Pharmacopeia (USP)
Japanese Pharmacopeia (JP)
Tính đồng nhất
Độ snh khiết
Kiểm tra dòng tế bào
Ổn định di truyền
Đảm bảo chất lượng tạo thành từ ngân hàng tế bào chủ đến tế bào sản phẩm
Máu cuống rốn được trữ trong Nito lỏng (-‐1960C) Máu cuống rốn được thu nhận vào túi chứa máu
Cuống rồn nối với em bé được thu nhận cùng nhau thai
Kiểm tra và phân Zch máu. Tế bào hồng cầu được loại bỏ khỏi máu
Máu cuống rốn được chuyển lại túi chứa máu
Túi chứa máu được vận chuyển về khu lưu trữ sản phẩm
Chuẩn bị tế bào trước đông lạnh
Kiểm tra dòng tế bào về sự ổn định và nhiễm.
Tế bào được nuôi lại để đảm bảo ở pha log của tăng trưởng.
Dán nhãn cryotubes với tên dòng tế bào, số lượng tế bào/lọ, ngày, MCB
Xác định tỉ lệ tế bào sống chết
Môi trường đông lạnh
Ø Môi trường cơ bản: DMEM, IMDM, RPMI, …. Ø Huyết thanh Ø Kháng sinh Ø Chất bảo quản: glycerol, DMSO
4oC ——> 2 giờ
-40oC ——> Một vài ngày
-80oC ——> Một vài tháng
-196oC à một vài thế kỷ
Nhiệt độ thấp có khả năng "làm chậm thời gian" hoặc thậm chí dừng lại thời gian” sinh học.
Đông lạnh tế bào
Thu tế bào đơn
Bổ sung từ từ (nhỏ giọt) môi trường đông lạnh chứa DMSO nồng độ 10% vào ống chứa tế bào sao cho mật độ tế bào từ 106 đến 107 tế bào/vial
Làm lạnh tế bào từ từ
Lưu giữ tế bào ở nhiệt độ -‐80 đến -‐1960C
Chất bảo quản đông lạnh (CPA) --là chất được dùng để bảo
quản mô/tế bào khỏi các tổn
thương do đông lạnh
Thu nhận và chọn lọc nguồn Thêm chất bảo quản đông lạnh (CPAs) Đông lạnh mẫu, thường từ -80
(tổn thương do tạo đá ).
Các bước cơ bản cho bảo quản đông lạnh mô/tế bào
hoặc -120oC
VD: glycerol, DMSO……
và bảo quản trong thời gian dài
http://www.agr.kuleuven.ac.be/dtp/tro/cost871/Home.htm
http://blog.bioethics.net/cryopreservation.jpg
liquid nitrogen (-196oC),
Chuẩn hoá thời gian hạ nhiệt
You hurt me.
Nếu quy trình đông lạnh quá chậm
Tế bào sẽ mất nhiều nước
Thể Zch tế bào trở nên quá nhỏ
Tế bào sẽ bị tổn thương nghiêm trọng
Optimal
Optimal
Nếu đông lạnh quá nhanh, tế bào mất rất ít nước
nước được giữ trong tế bào trở thành snh thể đá,
thể Zch tê sbafo có thể không đổi, thậm chí lớn hơn
Tế bào chịu tổn thương nghiêm trọng do sự tạo đá nội bào
Why it’s me?
Thời gian đông lạnh phù hợp, tế bào giữ được điều kiện tốt nhất cho sự sống sót
I am Lucky. Optimal
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/9/93/Cryopreservation.jpg http://www.scq.ubc.ca/a-cold-greeting-an-introduction-to-cryobiology/
Bảo quản đông lạnh
Đông lạnh
Bổ sung CPA
Kiểm soát tốc độ Vận chuyển của nước
Kiểm soát 2 tiêu chí
Kết quả đông lạnh tốt nhất
Cách tiếp cận hiệu quả để tối ưu hoá bảo quản đông lanh
2 tiêu chí: (1) sự tạo tinh thể đá và (2)thay đổi thể tích tế bào
JSPS Science Dialogue, 2009 cryonics organization today
American Cryonics Society
Monthly Status Update June 1, 2009 Total Members: 797 Human Patients in Cryostasis: 93 Human Tissue/DNA Samples in Cryostasis: 157 Pets in Cryostasis: 60 (ペット ) Pet Tissue/DNA Samples in Cryostasis: 31
http://www.cryonics.org/
Rã đông tế bào
Các tế bào cần được làm tan nhanh chóng và sau đó pha loãng từ từ vào môi trường tăng trưởng.
Chuyển một ống tế bào 1ml vào ống ly tâm 15 ml. Thêm từ từ (nhỏ giọt) 10ml môi trương ấm.
DMSO có thể gây độc cho tế bào à nên thay môi trường nhanh.
Có thể thay DMSO bằng glycerol
Các bước cần thiết để rã đông mô/tế bào và chuẩn bị cho sử dụng lâm sàng
Lấy mẫu đông lạnh khỏi bình chứa nito lỏng Làm ấm tế bào đông lạnh trong bể ổn nhiệt Loại bỏ CPA khỏi mẫu đông lạnh Ứng dụng lâm sàng
37oC Water Bath
Trường hợp không nên lưu trữ
đã từng mắc bệnh hoặc kiểm tra dương Znh các loại virus viêm gan B, C, HIV, HTLV1.
bị bất kỳ bệnh ung thư nào, hoặc các bệnh về máu như suy tủy,...
bị các rối loạn về máu hoặc rối loạn hệ thống miễn dịch do di truyền hay do lây nhiễm.
bị các bệnh lây lan qua đường ¤nh dục trong đó có giang mai.
bị bất kỳ biến chứng hay bị mắc bệnh trong thời gian mang thai cũng như sinh nở.
