Bài giảng : Phân tích công cụ part 9

Chia sẻ: Ajfak Ajlfhal | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:18

Thêm vào BST

Báo xấu

206
lượt xem 79
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tham khảo tài liệu 'bài giảng : phân tích công cụ part 9', khoa học tự nhiên, hoá học phục vụ nhu cầu học tập, nghiên cứu và làm việc hiệu quả

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng : Phân tích công cụ part 9

t Ri = t Ri − t M ' Nhưng vì VRi = VRi − VM ' và Nên ta có: t Ri = t M (1 + ki ) (9.5 e) VRi = VM (1 + ki ) (9.5 f) Hai công th c 9.5e và 9.5f cho ta bi t m i quan h gi a th i gian lưu và h s dung tích c a m t ch t tan I trong m t h s c ký. 9.3.5 H s ch n l c (Seletivity Factor) H s dung tích ch m i cho ta bi t kh năng b lưu gi c a môt ch t trên c t tách, nhưng chưa cho ta bi t hai ch t khi qua c t tách chúng có ư c tách ra không. c trưng cho v n này, ngư i ta dùng h s ch n l c α và nó ư c xác nh ho c theo ki' (h s dung tích) ho c theo K (h s phân b ), t c là: ' KA K rA / B = α = hay α = A (9.6a) ' KB KB ' ' Trong ó K A , K B là h s dung tích c a ch t A và ch t B; còn KA, KB là h (t R − t M ) s phân b . Nhưng như trên chúng ta ã bi t: t Ri = t M (1 + ki' ) hay ki' = tM (t R ( A) − t M ) Nên ta cũng có: α = (9.6b) (t R ( B ) − t M ) nh ư c giá tr α Như v y t bi u s c ký ta xác nh ư c tRi, tM và xác c a hai ch t A và B và n u: α = 1 : không có s tách s c ký α ≠ 1 : có s tách s c ký và n u tA>tB và α khác 1 càng l n. thì s tách c a hai ch t A và B càng rõ rang, t c là hai pic s c ký tách bi t nhau hoàn toàn. Song cũng t công th c 1.6a, n u bi t h s dung tích ki' hay h s phân b K c a hai ch t oán ư c α . A và B, thì chúng ta cũng có th d 9.3.6 Chi u cao c a ĩa, s ĩa N u c t s c ký có dài là L, và H là chi u cao c a m t ĩa lý thuy t c a c t tách thì t ng s ĩa lý thuy t N c a m t c t s c lý s là: L N= (9.7a) H Nhưng theo lý thuy t ĩa và quy lu t Gaoxo chi u cao m t ĩa lý thuy t c a c t s c ký là: 146
σ2 H= ((9.7b) L trong ó σ là l ch chu n. M t khác: L.W σ= (9.7c) 4t R L.W 2 H= Do ó (9.7d) 16.(t R ) 2 2 t  N = 16. R  (9.7e) W  Như v y t bi u s c ký ch t tan I, sau khi o t R và W chúng ta có th d dàng tính ư c s ĩa lý thuy t N c a m t c t tách. 9.3.7. phân gi i phân gi i là i lư ng cho ta bi t kh năng tách c a 2 pic s c ký c a 2 ch t k nhau như th nào. N u hai ch t A và B có pic s c ký như hình 9.5 thì ta có phân gi i RS c a nó là: ∆Z 2∆Z RA / B = = (9.8a) (WA / 2 + WB / 2) (WA + WB ) 2(t R ( A) − t R ( B ) ) ' ' Hay là: RA / B = (9.8b) (WA + WB ) Trong ó WA, WB là áy c a các pic s c ký. M t cách g n úng, ây có th xêm (WA+WB) ≈ 2WA, do ó ta có giá tr ca phân gi i R là: t A − tB ' ' RA / B = (9.8c) WA Nhưng như trên chúng ta ã bi t theo tR. Do ó ta l i có: 1 (α − 1) ' kA RA / B = ⋅ ⋅ ⋅N (9.8d) α (1 + k A ) ' 4 147
Hình 9.5. phân gi i c a hai ch t tan A và B 1 (α − 1) Hay: RA / B = ⋅ ⋅ N ef (9.8e) α 4 T công th c này, t ưc phân gi i RA / B nh t nh theo yêu c u, và ' ' các giá tr k , k , ta có th tính ư c s ĩa t i thi u N cho m t c t s c ký, sau ó A B L tìm chi u dài L c a c t theo công th c: N = . H 9.3.8. N ng c a ch t theo pic s c ký N u ch t phân tích I trong m u có n ng là C0, th tích m u ư c n p vào c t s c ký là Vsi, thì lư ng m u qi ã ư c n p vào là: qi = Vsi ⋅ C0 (9.9a) và trong quá trình tách, ch t I s ư c r a gi i ra kh i c t tách, t i nh c a pic s c ký s có n ng là: qi Ci (max) = (9.9b) σ v .( 2π )1/ 2 ng th i trong quá trình s c ký, nó ã b pha loãng ra m t s l n là: 148
Vsi Dl = (9.9c) σ v .(2π )1/ 2 Gía tr Dl luôn l n hơn 1, và n u Dl càng l n, thì giá tr Ci (max) càng gi m. pha loãng Dl ph thu c vào: - Chi u dài c a ư ng d n trong h th ng HPLC (t c là t van bơm m u n flowcell c a detector). Do ó mu n gi m Dl thì ư ng d n ph i ng n. - Tc c a pha ng. 9.3.9 Quan h gi a chi u dày ĩa và t c c a pha ng (H-u) Chi u cao c a ĩa và t c dich chuy n c a ĩa (u) có liên quan ch t ch v i nhau. M i quan h này ư c ch ra b i phương trình Van Deemter: B H = A+ + C1u + C2u +C 3 u (9.10a) Trong ó: u A = 2λdp là h ng s c a ch t nh i c t (pha tĩnh), nên A ph thu c vào ư ng kính dp c a pha tĩnh. Nó là h p ph n chính quy t nh chi u cao c a ĩa H; B = 2γDi và là h ng s , Di là t c khu ch tán c a ch t tan trong pha ng. Vì th B là y u t nh hư ng c a pha ng n H, nó là y u t th 2 óng góp áng k cho H. Các giá tr c a C1, C2, C3 là như sau: { } C1 = 2 / 3 ki' /(1 + ki' ) 2 .dl / Ds (9.10b) [ ] C2 = q1. (ki' ) 2 /(1 + ki' ) 2 .(d 2 ) 2 / Di (9.10c) C3 = q2 (dp) 2 / Di (9.10d) Trong ó: d1, q1, q2 là các h ng s ; DS là khu ch tán ch t tan trong pha tĩnh và nó là nh hư ng c a pha tĩnh n chi u cao H. Trong th c t c a phân tích s c ký, C2.u và C3.u r t nh (dư i 5% c a H), vì th ta có th vi t phương trình Van Deemter như sau: B H = A+ + C1.u (9.10e). Và m i quan h H – u ư c bi u di n như trong hình 9.6 u 149
Hình 9.6. Quan h gi a H và u ( ư ng cong Van Deemter) ây u0 là t c t i ưu nh t c a h s c ký, và t c u0 này chi u cao H là nh nh t, có nghĩa s ĩa N trong c t s c ký là l n nh t. - N u uu0 chi u cao H cũng tăng theo u Do ó trong phân tích chúng ta c g ng ch n t c ch y Fm c a pha ng qua c t sao cho giá tr u g n b ng u0 ho c b ng u0 là i u lý tư ng nh t có hi u qu tách cao nh t. Vì th mu n tìm ư c t c pha ng phù h p ta ph i xây d ng ư ng cong H – u, qua các giá tr th c nghi m nh ng t c ch y Fm khác nhau, r i tính theo công th c: L u= ' t Ri Và H theo công th c: L.W 2 H= 16.(t Ri ) 2 ' Sau ó t các c p giá tr c a u và H ta s d ng ư c ư ng cong Van Deemter, r i tìm u t ư ng cong này, sau ó suy ra Fm. 150
Tóm l i m t s thông s c trưng cơ b n cho quá trình s c ký chúng ta có th xem trong b ng 9.2 dư i ây. B ng 9.2. Tóm t t các i lư ng c trưng c a s c ký Important Derived Quantities and Relationships Name Calculation of Devired Relationship to Other Quantities Quantities Linear mobile phase L u= velocity tM VM = t M F Volume of mobile phase (t R − t M ) Capacity factor KVS k' = k' = tM VM Partition coefficient k 'VM CS K= K= CM VS (t R ) B − t M Selectivity fartor ' kB K B α= α= = (t R ) A − t M ' kA K A 2((t R ) B − (t R ) A ) Resolution  α − 1  k B  ' N RS =   RS =   α  1 + k B  W A + WB ' 4   Number of plates 2 2 2  1 + kB  α t  ' N = 16 R  ' N = 16 R  2  k   α −1  S W   B Plate height L H= N Retention time 2 16 RS H  α  (1 + k B )3 2 ' (t R ) B =   u  α − 1  (k B ) 2 ' 9.4. Detector c a s c ký Detector là m t b ph n r t quan tr ng trong h th ng máy s c ký. Nó ghi nh n s tách x y ra trong c t s c ký. Vì th , n u nó ghi nh n không trung th c thì chúng ta s không hi u úng ư c s tách s c ký. M i lo i detector ghi nh n ch t phân tích theo nh ng c trưng hóa lý nh t nh, ví d như: 1. S h p th b c x UV, VIS 2. huỳnh quang c a ch t phân tích 151
3. S thay i dòng i n, i n th , dn in 4. d n nhi t 5. S bi n thiên chi t su t, v.v… M c dù có nhi u l ai khác nhau, nhưng yêu c u chung c a m t detector dùng trong máy s c ký ph i có: phát hiên ch t phân tích, thư ng là 10-8-10-15 g/g, và nh y Có nh y cao hơn thì càng t t. Ph i n nh, ph i l p l i t t các giá tr o, b n v ng theo th i gian, m b o phép o t chính xác cao. Có vùng tuy n r ng, thư ng 103 n 104. r ng (kho ng 4000C). Yêu c u này là do Vùng làm vi c kho ng nhi t GC. Th i gian áp tuy n ph i ng n, nh y c m k p th i v i các qua trình x y ra c a s tách trong c t s c ký. Có tính linh ho t cao và s d ng d dàng, ch n các tham s o cho các yêu c u phân tích khác nhau. Thích h p ư c cho nhi u lo i nhóm ch t theo dõi ư c nhưng h n h p m u có thành ph n ph c t p. Trong quá trình phát hi n nó không làm nh hư ng hay làm sai n ng ch t phân tích, hay nh hư ng c u trúc c a ch t. Detector nào th a mãn t t các yêu c u ó ư c g i là lý tư ng. T t nhiên trong th c t s th a mãn hoàn toàn cao là khó. Tùy lo i m u tách mà yêu c u nào ư c t lên hàng u. Có nhi u k thu t s c ký khác nhau và cũng có nhi u cách phân chia và phân lo i, song cách phân lo i theo b n ch t chính c a quá trình s c ký trong c t tách hi n nay ư c s d ng nhi u hơn và h p lý hơn. Theo cách phân lo i này chúng ta có 4 lo i s c ký: S c ký khí: là lo i s c ký s tách các ch t x y ra tr ng thái khí. S c ký l ng: là lo i s c ký s tách c a các ch t x y ra th l ng. Pha ng là ch t l ng. Trong nhóm s c ký này l i ư c chia thành: s c ký h p ph pha thư ng, s c ký h p ph pha ngư c, s c ký trao i ion, s c ký phân b , s c ký rây phân t . Trong nhóm s c ký l ng, l i có s c ký l ng áp su t th p (c i n) và s c ký l ng áp su t cao (HPLC). 152
S c ký gi y: là lo i s c ký s tách x y ra trên n n, gi y s c ký nguyên li u tách (pha tĩnh). S c ký l p m ng: là lo i s c ký mà s tách c a ch t x y ra trên l p màng m ng silica hay oxit nhôm có tính ch t s c ký, nó là pha tĩnh. Trên ây là cơ s lý thuy t chung c a s c ký, song trong giáo trình này chúng ta ch nghiên c u i sâu vào hai lo i s c ký u tiên. ó là s c ký l ng cao áp (HPLC) và s c ký khí (GC) . 9.5. PHƯƠNG PHÁP S C KÝ L NG 9.5.1. Nguyên t c c a s c ký l ng S c ký l ng là quá trình tách m t h n h p các ch t trong c t tách s c ký tr ng thái l ng. Vì th các ch t m u phân tích ph i hòa tan trong m t ch t l ng nào ó, thư ng là pha ng c a quá trình s c ký. Nó thư ng thích h p cho c các ch t có nhi t sôi cao cũng như th p (tr các ch t i u ki n thư ng là khí). S c ký l ng có hai lo i: S c ký l ng áp su t thư ng (c i n) S c ký l ng áp su t cao – HPLC. Chúng u gi ng nhau pha ng là ch t l ng, có th là m t dung môi ơn, hay h n h p c a 2 ho c 3 dung môi theo nh ng tit l nào ó. Pha tĩnh trong sác ký l ng có th là ch t r n hay ch t l ng. Pha tĩnh r n ư c nh i vào c t t o thành c t ch t nh i có d ng c a c t s c ký. Pha tĩnh l ng ư c gi trong c t s c ký nh ch t mang trơ, nó là m t màng (l p) m ng (1-3 m bám xung quanh h t ch t mang. Lo i pha tĩnh này có dung tích nh hơn lo i pha tĩnh r n x p toàn ph n. Do tr ng thái c a pha như th nên có tên: s c ký l ng – l ng (LLC), s c ký l ng – r n (LSC). Trong th c t lo i LSC ư c s d ng nhi u hơn. V i s c ký l ng, vi c th c hi n quá trình tách s c ký có th theo hai kĩ thu t sau: Kĩ thu t gi thành ph n và t c pha ng là h ng s . Kĩ thu t gradient pha ng. ây có th gradient t ng b c (tăng ho c gi m), hay gradient liên t c thành ph n pha ng, ch n thành ph n pha ng trong quá trình tách s c ký r a gi i các ch t. Trong s c ký l ng áp su t thư ng, th i gian tách lâu, t n nhi u ch t nh i và pha ng, hi u su t tách l i kém, vi c tách các ch t không g n như s c ký l ng áp su t cao (HPLC). Nó là kĩ thu t tách c i n. Do ó ây chúng ta ch bàn n s c ký l ng áp su t cao. 153
Trong HPLC, m u ư c bơm vào c t nh m t van bơm m u, sau ó nh m t bơm cao áp bơm pha ng ch y qua c t v i m t t c xác nh t u n cu i c t tách. Qúa trình tách s c ký c a m t h n h p g m hai ch t A và B có th ư c minh h a như hình 1.1. Lúc u 2 ch t A và B cùng trong m t vùng trên c t, nhưng theo th i gian ch y s c ký hai ch t d n àn tách ra kh i nhau, n cu i c t tách 2 ch t tách thành hai vùng riêng bi t và trên s c s c ký chúng ta s thu ư c hai pic s c ký riêng bi t. Hình 9.7. Ví d v s tách s c ký hai ch t A và B. 9.5.2. Máy s c ký l ng cao áp Máy s c ký l ng cao áp là m t h th ng trang b t c hi n quá trình s c ký. Nó bao g m các b ph n cơ b n sau ây: 1. Van bơm m u (sample injection valve): Van bơm m u có ch a vòng m u v i th tích nh t nh, ví d 20, 50, hay 100 l, dùng bơm m u phân tích vào c t 154
tách. Có nhi u lo i van, nhưng lo i van 6 chi u ư c s d ng nhi u hơn, vì nó thu n l i hơn các lo i khác. 2. C t s c ký: C t s c ký HPLC làm b ng thép hay th y tinh th ch anh có v thép ch u áp su t cao. C t HPLC thư ng có kích thư c bình thư ng là 250 × 4mm; 150 × 4mm; 125 × 4mm; hay 250 × 1mm; 150 × 1mm, ho c 50 × 1mm hay 50 × 2mm. Các lo i c t có kích thư c nh hơn 5 cm (chi u dài) và 1 mm ư ng kính g i là microbore. T t nhiên chi u dài c a c t ph thu c vào c h t ch a ch t nh i. H t càng to thì c t ph i dài, mb o s ĩa lý thuy t t i thi u cho m t c t tách s c ký. Ch t nh i ư ng kính h t 5 m, c n c t dài 125-150 mm là , nhưng n u ch t nh i ư ng kính 7 – 10 mm, ph i dùng c t dài 250 – 300 mm. Ch t nh i ư ng kính 2-3 m, ch c n c t dài 3-5 cm. C t tách là m t b ph n k t qu tách c a m t h n h p ch t m u là t t hay x u, và v i m i lo i ch t m u ph i ch n m t lo i c t tách riêng cho nó. ó là lo i ch t nh i – pha tĩnh (stationary phase). 3. Bơm cao áp Là d ng c bơm pha ng qua c t tách v i t c xác nh, ph c v quá trình r a gi i các ch t ra kh i c t s c ký. Nó ph i có n nh và l p l i cao c a tc bơm. Có bơm 1 kênh, có bơm 2 kênh song song ho c 2 kênh n i ti p, và làm vi c trong vùng áp su t t 0 – 400 bar. Nhưng bơm 2 kênh cho t c n nh hơn. 4. B gradient pha ng B này ch c n khi th c hi n kĩ thu t tách v i gradient pha ng. Nó ư c t trư c bơm cao áp, chu n b gradient pha ng v i thành ph n ph h p theo yêu c u cho bơm cao áp bơm vào c t tách. 5. Detector Là b ph n thu nh n vàn phát hi n tín hi u c a ch t phân tích, theo m t tính ch t nào ó c a nó, ví d như: S h p th quang phân t vùng UV-VIS S h p th hay phát x c a nguyên t Tính ch t phát huỳnh quang c a phân t hay nguyên t d n i n c a các ch t S bi n thiên c a dòng i n gi a 2 i n c c d n i n c a ch t S bi n thiên chi t su t c a dung d ch m u. 155
Nhưng dù lo i nào nó cũng ph i t ư c nh ng yêu c u nh t inh (xem m c 9.4 trên). Và c ng v i m i m t lo i tính ch t ó thì ta có m t lo i detector. Ví d như detector ph h p th nguyên t UV-VIS (190-1000nm), detector huỳnh quang, detector o d n c a dung d ch v.v… 6. B ph n ghi nh n k t qu Có th là: Máy t ghi (recorder), ây là trang b ư c dùng ph bi n nh t Máy intergrator. Máy printer. Hay computer v i màn video. Nh ng h máy HPLC hi n i và hoàn ch nh, hi n nay luôn có g n computer và có cài các chương trình ch y s c ký, h th ng bơm m u t ng, … Sơ kh i c a m t h th ng máy HPLC ư c mô t trong hình 9.8. B ng 9.3. Các lo i detector và tính năng c a nó Lo i detector nh y Tính năng ng d ng vùng t. tính 103 Ph UV > 1 ng ph bi n 103 Ph UV-VIS >1 ng ph bi n 104 Ph huỳnh quang >0.01 ng va 104 Chi t su t (RI) >100 ng ít dùng 104 o dn in >10 ng va 104 dn in >1 g ít dùng 104 C c ph (Amp.) >0.1 ng ít dùng 104 Ph MS >0.01ng ít (m i) 156
Hình 9.8. Sơ nguyên t c c a h máy HPLC 9.5.3. Pha tĩnh trong HPLC Pha tĩnh trong HPLC (hay còn g i là ch t nh i c t) cũng có 4 lo i, tương ng v i các lo i s c ký ó, ó là các lo i ch t nh i c a s c ký: H p ph gia thư ng (NP-HPLC) H p ph pha ngư c (RP-HPLC) Trao i ion (IE-HPLC) Phân b - s c ký chi t (P-HPLC) Rây phân t (GEL-HPLC) Tuy có 4 lo i, nhưng cũng ư c ch t o trên 3 ch t n n là silica, oxit nhôm và cao phân t h u cơ (polystyrene). Nhưng silica v n là ch y u (chi m 30%), sau ó là n n oxit nhôm. Pha tĩnh cũng có pha tĩnh r n và pha tĩnh l ng. Pha tĩnh l ng thư ng là các ch t h u cơ ư c gi trong c t tách nh các h t ch t mang trơ. Nó t o thành m t l p màng m ng xung quanh các h t ch t mang có dày 1 – 3 m. 157
Các h t ch t mang trơ là các h t silica ã ư c ho t hóa cho m t tính h p ph . Nó trơ trong quá trình s c ký. Vì th trong k thu t HPLC cũng có: S c ký l ng – l ng S c ký l ng – r n Pha tĩnh r n là các h t có hình c u hay là các m nh có ư ng kính t 3 – 10 m. Ph bi n nh t hi n nay là c 5 – 7 m. Nên silica là nguyên li u chính ch t o pha tĩnh trong HPLC. Pha tĩnh c a HPLC h p ph pha thư ng là các silica trung tính (silica tr n). Trên b m t c a nó còn ch a nhi u nhóm phân t c – OH (hình 1.3a). Nhóm này ưa nư c, và liên k t c u hidro v i các phân t nư c, làm gi m ho t tính s c ký c a pha tĩnh. Lo i này tách các ch t không phân c c và ít phân c c. Pha ng c a lo i pha tĩnh này là nh ng ch t k nư c (không ưa nư c); nghĩa là không hòa tan nư c. Ví d như CHCl3, benzene, CCl4, etylacetat, n-hexan, n-pentan, v.v… (b ng 2.4). Pha tĩnh c a HPLC h p th pha ngư c là các silica trung tính ã ư c alkyl hóa nhóm OH trên b m t b ng các nhóm alkyl c a m ch cacbon C3, C8, C18 hay nhân phenyl. Vì th lo i ch t nh i này có b m t không phân c c. Nó thu c lo i ch t nh i k nư c (hình 9.9) . Nghĩa là nư c không nh hư ng n tính ch t b m t c a nó. Pha ng cho lo i s c ký này là nư c có hòa tan thêm các ch t h u cơ, ví d như methanol, acetonitril ư c tr n v i nư c theo t l phù h p. Hình 9.9. C u trúc c a pha tĩnh trong HPLC 158
T t nhiên các tính ch t, c trưng, c u trúc c a h t pha tĩnh u có nh hư ng n hi u qu s c ký. . Các y u t nh hư ng n hi u su t s c ký có r t nhi u, ví d như xp c a pha tĩnh, thành ph n, t c c a pha ng, … B ng 9.4. Vài ví d v pha tĩnh trong HPLC. Tên pha tĩnh Lo i nhóm th Trên n n Lo i pha ODS-Hypersil C18 Silica H p ph RP Lichrosorb RP18 C18 Silica ntr. Micropack CH C18 Silica ntr. Lichrosorb RP8 C8 Silica ntr. Zorback-ODS C18 Silica ntr. ODS-Sil X-I C18 Silica ntr. Hypersil Silica H p ph NP Partisil Silica ntr. Lichrosorb-Si60, Si100 Silica ntr. Zorbac-Sil Silica ntr. -Porasil Silica ntr. Partisil 10SCX Silica Trao i ion Lichrosorb KAT Silica ntr. Aminex-A28 Polyme h u cơ ntr. 9.5.4. Pha ng trong HPLC Pha ng trong s c ký l ng cao áp (HPLC) tùy thu c vào m i lo i ch t nh i c t khác nhau. Nó có th là m t dung môi ơn, h n h p c a 2 hay 3 dung môi tr n v i nhau theo t l phù h p. Song v i b t kỳ lo i s c ký nào thì yêu c u c a dung môi làm pha ng cũng ph i th a mãn nh ng yêu c u nh t nh như: Ph i trơ và không có tác d ng hóa h c v i pha tĩnh B n và n nh trong quá trình ch y s c ký Hòa tan t t h n h p ch t m u Phù h p v i lo i detector ã ch n phát hi n ch t phân tích 159
Trong s c ký h p ph pha thư ng (NP-HPLC), vì pha tĩnh là ch t phân c c, nên pha ng là nh ng ch t không phân c c hay ít phân c c. Ví d n-hexan, n- heptan, benzene, tetrachlocacbon, chloroform, …Nói chúng ó là các dung môi h u cơ. Các dung môi này thư ng k nư c. H s c ký này thư ng ư c s d ng tách và phân tích các h n h p hi rocacbon, các ch t h u cơ không phân c c hay ít phân c c. Trong s c ký h p ph pha ngư c (RP-HPLC), vì pha tĩnh không phân c c hay r t ít phân c c, nên pha ng phân c c. Pha ng trong lo i s c ký này u trên n n nư c c t có thêm các dung môi h u cơ tan t t trong nư c như methanol, acetonitril, izo-butanol, …Ph bi n nh t là h n h p c a (methanol + nư c) theo t l nh t nh tùy theo m i lo i h n h p m u cân s c ký. H s c ký này phù h p cho s tách s c ký c a nhi u lo i h n h p m u, như hy rocacbon, nhóm các ch t m ch vòng, h p ch t t nhiên, các phenol, các amin, amino-axit, …Ph m vi s d ng c a RP-HPLC phong phú và a d ng hơn nhi u lo i NP-HPLC. 9.5.5. S lưu gi trong c t Các ch t phân tích ư c lưu gi trong c t tách bao lâu là ư c quy t nh b i các y u t : B n ch t c a ch t phân tích, như c u trúc phân t , các nhóm th và v trí c a chúng, … B n ch t và các c trưng c a pha tĩnh trong c t tách, như c h t, x p, kích thư c l x p, … Pha ng như b n ch t c a các dung môi làm pha ng, thành ph n và t c c a pha ng, pH c a pha ng Nhi t c t tách. T t c các y u t ó nh hư ng trong nh ng m c nh t nh n hi u qu s c ký c a m t h n h p ch t và ch khi chon ư c nh ng i u ki n phù h p nh t, thì chúng ta m i thu ư c k t qu s c ký t t. 9.5.6. T i ưu hóa i u ki n s c ký T i ưu hóa các i u ki n s c ký là nghiên c u ch n l c các i u ki n s c ký phù h p nh t cho m t h n h p m u phân tích thu ư c hi u qu tách cao nh t c a s tách các ch t. Nghĩa là các ch t có trong h n h p m u ư c tách nhau hoàn toàn. Gi i quy t v n này bao g m nh ng cong vi c như sau d a theo tính ch t c a h n h p ch t m u: 1. Ch n pha tĩnh phù h p theo các tính ch t và c trưng như lo i, x p, c h t, kích thư c c t ch a pha tĩnh, … 160
2. Ch n pha ng phù h p. Nó bao g m ch n dung môi làm pha ng, thành ph n c a chúng, t c pha ng, và ch t n Ph, ch t t o ph c, n u c n cho s tách t hi u qu cao. Ví d như trong s c ký trao i ion. 3. Ch n lo i detector và các thông s c a nó phát hi n ch t phân tích v i hi u qu cao ( nh y và ch n l c cao). 4. Lư ng m u bơm vào c t tách 5. Nhi t c a c t tách trong quá trình s c ký 6. Ch gradient có c n không?, … Th c hi n nghiên c u ch n ư c các i u ki n nói trên phù h p, t c là công vi c t i ưu các i u ki n s c ký. Nghĩa là xây d ng m t quy trình tách s c ký các ch t trong m t h n hơp m u phân tích. 9.5.7. Phân tích nh tính trong HPLC Chúng ta bi t r ng trong m t (thông s c trưng) phát hi n nh tính m t ch t trong h n h p m u. Vì th nguyên t c c a phân tích nh tính theo HPLC là: Trong i u ki n s c ký ã ch n, dùng các ch t chu n xác nh th i gian lưu c a các ch t phân tích theo s c bơm m u riêng c a tưng ch t. như th ta l p ư c th i gian lưu c a m i ch t, ví d như i v i các ch t A, B, C, D,…ta có các th i gian lưu tương ng là tA, tB, tC, tD, … Do ó n khi phân tích m u chưa bi t, ta cũng bơm m u và ghi s c ca m u phân tích và n u có m t ch t có th i gian lưu trùng v i tB thì ta nói ch t chưa bi t ó là ch t B 9.5.8. Phân tích nh lư ng Nguyên t c c a phân tích nh lư ng trong HPLC là d a trên cơ s trong m t ph m vi nh t nh c a ch t phân tích thì chi u cao hay di n tích c a pic s c ký là có quan h t l thu n v i nông c a nó trong m u theo bi u th c: H = k.C (9.9a) Hay là S = k.C (9.9b) Trong ó H là chi u cao và S là di n tích c a pic s c ký c a ch t. Trong hai bi u th c này, quan h tuy n tính gi a S và C r ng hơn quan h tuy n tính gi a H và C. Còn k là h ng s c a các i u ki n th c nghi m c a quá trình s c ký. Vì th trong m t i u ki n s c ký xác nh thì nó s không i. Do ó nguyên t c c a phương pháp phân tích nh theo kĩ thu t HPLC là: Chu n b m t dãy m u chu n cùng v i các m u phân tích trong cùng m t i u ki n. 161
Ch n m t quy trình phù h p ch y s c ký dãy m u chu n và các m u phân tích. Th s c thu ư c, xác nh giá tr H (hay S) c a các ch t phân tích trong các m u và các m u phân tích tương ng. Ví d như trong b ng sau: Dãy các chu n M u phân tích Mu C1 C2 C3 C4 C5 CX1 CX2 CX3 Gía tr H H1 H2 H3 H4 H5 HX1 HX2 HX3 Gía tr S S1 S2 S3 S4 S5 SX1 SX2 SX2 - Sau ó d ng ư ng chu n H – C (hay S – C). R i t các ư ng chu n này. Và các giá tr Hx hay Sx chúng ta d dàng phát hi n ư c n ng c a ch t phân tích 9.5.9. Vài ng d ng c a HPLC Hi n nay s c ký l ng cao áp ư c áp d ng r t r ng rãi trong nhi u lĩnh v c khác nhau. Vì nó có nhi u ưu vi t hơn s c ký c i n, ví d như: nh y cao Kh năng tách ư c nhi u lo i h n h p ch t Tc phân tích l n Nhanh chóng cho k t qu T n ít m u Song v m t trang b so v i s c ký c i n, thì kĩ thu t HPLC c n có các trang b t ti n hơn. Các lĩnh v c ã và ang s d ng HPLC nhi u là: Công nghi p hóa h c, hóa d u Công nghi p th c ph m, nông nghi p, thu c tr sâu Y h c, lâm sàng Hóa sinh và hóa h p ch t t nhiên Công ngh dư c ph m, … 9.6. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH S C KÝ KHÍ 9.6..1 Nguyên t c S c ký khí là quá trình tách các ch t trong c t tách tr ng thái khí, ch t mang m u là ch t khí. Vì th ch có th tách ư c h n h p các ch t khí hay các ch t l ng ho c ch t r n có th d dàng hóa khí dư i 2500C, khi bơm m u vào c t 162
d ng l ng. N u là ch t r n thì ph i hòa tan trư c trong m t dung môi phù h p t o ra dung d ch m u r i m i bơm vào c t s c ký hóa khí chúng. V i các ch t 0 nhi t hóa hơi cao hơn 250 C, ph i hóa hơi trư c trong bu ng hóa hơi riêng có nhi t cao u c t s c ký, sau ó m i d n vào c t tách. T t nhiên, v i các ch t lo i này, vi c s c ký là r t ph c t p và khó khăn. Trong s c ký khí, pha tĩnh cũng là ch t r n. Nó ư c nh i y vào c t tách (c t thư ng), ho c ch là m t l p m ng bám vào thành trong c a c t s c ký (s c ký mao qu n). Còn pha ng là m t ch t khí, hay m t h n h p hai ch t khí. Ch t khí này mang m u vào c t th c hi n quá trình tách. Nó chuy n ng (hay d n vào) liên t c trong su t quá trình tách v i m t t c xác nh. V i s c ký khí, vi c th c hiên quá trình s c ký có th theo hai kĩ thu t: Gi nhi t h ng s trong su t quá trình tách. Th c hi n gradient nhi t trong quá trình tách. Khi tách m t h n h p ph c t p ch a nhi u ch t có nhi t sôi khác nhau l n, như các h p ch t t nhiên, các dư c ph m, …Qúa trình gradient nhi t là r t c n thi t vì quá trình này t o i u ki n các ch t tách ra kh i nhau. 9.6.2. Máy s c ký khí Máy s c ký khí là m t h th ng trang b th c hi n quá trình s c ký. Nó bao g m 6 ph n cơ b n: 9.6.2.1. H th ng cung c p khí cho quá trình s c ký, g m các regulator, flow meter, gas valves. H th ng này ph i c p ư c dòng khí n nh c n thi t theo yêu c u c a quy trình phân tích s c ký. 9.6.2.2 B xylanh bơm m u vào c t (sample Valve), có th bơm ư c m t lư ng m u chính xác vào c t trong vùng th tích t 5-100 l, và l p l i ư c t t. 9.6.2.3. C t tách s c ký. ây là ph n quan tr ng nh t, nó quy t nh h t qu c a s tách m t h n h p t t hay x u. ó là pha tĩnh, ch t nh i c t (packing materials). T t nhiên, i v i m i lo i s c ký, ch t nh i khác nhau v b n ch t. C t s c ký làm b ng thép, h p kim ng, có chi u dài t 3-5m, ư ng kính 2,5-4 mm. C t mao qu n làm b ng th y tinh, chi u dài t 15-100m, ư ng kính 0,25-1 mm. 9.6.2.4. H lò nung c t tách và h i n t i u khi n lò nung: có nhi m v làm nóng c t ho c theo ch nhi t không i hay ch gradient nhi t c a s tách s c ký yêu c u. 9.6.2.5. Detector: là n ph n phát hi n, nh n bi t các ch t phân tích d a theo nh ng tính ch t v t lý hóa h c nào ó, và ng v i m i m t tính ch t c a s phát hi n, ngư i ta có m t lo i detector nh t nh, ví d : 163