PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ Gas Chromatography (Analysis for individual CHO’s)

• ðường không bay hơi, do ñó cần phải chuyển hóa thành

chất bay hơi.

• Quá trình dẫn xuất hóa bằng phản ứng hóa học • Dạng dẫn xuất tạo ra: acetates, ethyl ethers, and

trimethylsilyl ethers

• Phương pháp dẫn xuất ñược lựa chọn phụ thuộc vào ñiều kiện nhiệt ñộ của GC cần thiết cho bay hơi dẫn xuất ñường.

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ

1

Reduction to Alditol (for reducing sugars)

BƯỚC: • ðường bị khử ñến alditols bằng cách sử dụng sodium

borohydride, NaBH4 (See Fig 10-7).

• Khử aldehydes và ketones ñến alcohols bậc 1 • Alditols (the alcohol form) sau ñó acetylated với acetic anhydride ñể tạo ra alditol peracetates, có thể phân tích GC (acetic acid derivatives are volatile)

Phương pháp dẫn xuất khác

Acetates • Xử lý sugar với acetyl chloride hoặc acetic anhydride –

“Reflux” khoảng 4h với sự hiện diện của dung môi hữu cơ

Methyl ethers • Xử lý sugar với either methyl iodide/silver oxide or dimethyl

sulfate/NaOH

TMS ethers • Xử lý sugars với pyridine và a methylsilyl (silica based)

media.

2

PHƯƠNG PHÁP HPLC

3

You’ve Got a Problem to Solve

I’ll get on it!

I need a quantitative separation of carbohydrates in some of our products as soon as possible.

I’ll need a separation technique.

KỸ THUẬT PHÂN TÁCH

I have two separation techniques in my lab, High Performance Liquid Chromatography and Gas Chromatography. Which should I use?

4

So sánh HPLC và GC

Tính chất bay hơi Tính phân cực

HPLC

• Phân tách cả chất phân cực và chất không phân cực

• Mẫu phải hòa tan trong pha ñộng

HPLC • Không yêu cầu bay hơi

• Mẫu phải bay hơi

GC

GC • Phân tách cả chất phân cực và chất không phân cực

So sánh HPLC và GC

10

5

So sánh HPLC và GC

Nhiệt ảnh hưởng ñến mẫu Kích thước phân tử mẫu

• Không có giới hạn trên

• Trong thực tế, ñộ hòa

HPLC

tan bị giới hạn

HPLC • Phân tích tiến hành ở nhiệt ñộ bằng hoặc thấp hơn nhiệt ñộ phòng

• Thông thường < 500 amu (Da)

• Mẫu phải chịu ñược nhiệt ñộ cao

GC GC

So sánh HPLC và GC

Chuẩn bị mẫu Lượng mẫu

• Kích thước mẫu phụ

trước

thuộc vào kích thước cột i.d.

• Mẫu nên ở trong dung

môi giống pha ñộng

HPLC HPLC • Mẫu phải ñược lọc

• Thường 1 - 5 m L

• Dung môi phải bay hơi, và thường có ñiểm sôi thấp hơn chất phân tích

GC GC

6

So sánh HPLC và GC

Cơ chế phân tách Detectors

• Phổ biến UV-Vis

• Cả pha tĩnh và pha ñộng ñều có ảnh hưởng lên kêt quả phân tách

HPLC HPLC

• Phổ biến là FID,

GC

13

GC •Pha tĩnh chỉ có chức năng vận chuyển

Phân tích các thành phần như thế nào?

5

2

3

mAU

Zorbax NH2 (4.6 x 250 mm)

4

1

70/30 Acetonitrile/Water

6

1 mL/min Detect=Refractive Index

time

14

Carbohydrates 1. fructose 2. Glucose 3. Saccharose 4. Palatinose 5. Trehalulose 6. isomaltose

7

Phân tách

Injector

Separation in based upon differential migration between the stationary and mobile phases.

Mixer

Stationary Phase - the phase which remains fixed in the column, e.g. C18, Silica

Pumps

Mobile Phase - carries the sample through the stationary phase as it moves through the column.

Column

Detector

Waste

Solvents

Injector

Chromatogram

Mixer

mAU

Pumps

time

Start Injection

Column

Detector

Solvents

31

High Performance Liquid Chromatograph

8

The Chromatogram

to - elution time of unretained peak tR- retention time - determines sample identity

tR

Area or height is proportional to the quantity of analyte.

tR mAU

to

32

time Injection

HPLC Analysis Parameters

Mobile Phases

Flow Rate Composition

Injection Volume

Column Oven Temperature

33

Wavelength Time Constant

9

Modes of High Performance Liquid Chromatography

Types of Compounds

Mode

Mobile Phase

Reversed Phase

Stationary Phase C18, C8, C4 cyano, amino

Water/Organic Modifiers

Neutrals Weak Acids Weak Bases

Ionics, Bases, Acids

C-18, C-8

Ion Pair

Water/Organic Ion-Pair Reagent

Organics

Compounds not soluble in water

Normal Phase

Silica, Amino, Cyano, Diol

Ionics Inorganic Ions

Ion Exchange

Aqueous/Buffer Counter Ion

Anion or Cation Exchange Resin

Size Exclusion

Polystyrene Silica

High Molecular Weight Compounds Polymers

Gel Filtration- Aqueous Gel Permeation- Organic

34

10

1/ SUPELCOSIL LC-NH2 Column 2/ SUPELCOGEL Columns

11

12

13