YOMEDIA
Bài giảng Polymerase Chain Reaction - Nguyễn Vũ Phong
Chia sẻ: Sơn Tùng
| Ngày:
| Loại File: PDF
| Số trang:27
83
lượt xem
8
download
Download
Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ
Bài giảng "Polymerase Chain Reaction" cung cấp cho người học các kiến thức: Taq polymerase, Enzyme bền nhiệt có hoạt tính sửa sai, thiết kế primer, ứng dụng, những vấn đề cần quan tâm, các loại PCR cải biến – tăng độ nhạy, quantitative PCR,... Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.
AMBIENT/
Chủ đề:
Nội dung Text: Bài giảng Polymerase Chain Reaction - Nguyễn Vũ Phong
- Polymerase Chain Reaction
Tp. Hồ Chí Minh
24-9-2014
- Taq polymerase
• DNA polymerase chịu nhiệt, dễ tinh sạch bằng
nhiệt
• Tổng hợp DNA theo chiều 5’ 3’
• Exonuclease 5’ 3’
• Tổng hợp 50 – 60 nu/s
- Taq polymerase
• Không có hoạt tính sửa sai (proof-reading)
– Tổng hợp sai 1/10.000 nu
– Tạo sản phẩm PCR sai trình tự
• Sản phẩm dài 2 – 4 kb
• Bền nhiệt: 40 phút/95 oC,
• Gắn thêm adenine (A) ở đầu 3’ của sản phẩm
– Có ích khi tạo dòng bằng TA kit
- Enzyme bền nhiệt có hoạt tính sửa sai
• Tli : Thermococcus litoralis
– Bền ở 95 oC. Giữ hoạt tính sau 1h ở 95 oC
• Pfu: Pyrococcus furiosus
- Thiết kế primer
• Chiều dài
– Ngắn: dễ bắt cặp không chuyên biệt
– Dài : Khó bắt cặp chuyên biệt
– 20 – 30 nu
• Bắt cặp sai (mismatches)
– Đầu 3’ của primer phải bắt cặp hoàn toàn với nu
trên khuôn mẫu, thường sử dụng C/G (why ?)
– Đầu 5’ của primer không cần bắt cặp hoàn toàn
với khuôn mẫu chèn trình tự nhận biết của RE
- Thiết kế primer
• Nhiệt độ nóng chảy (Tm)
– 2 mồi có nhiệt độ nóng chảy tương tự nhau
thành phần ATGC tương đương nhau
• Cấu trúc thứ cấp nội tại
– Tránh tự bắt cặp
• Primer dimer: primer bắt cặp với nhau
- Thiết kế primer
• Primer dimer: primer bắt cặp với nhau
- Thiết kế primer
• Tránh thiết kế primer từ trình tự amino acid
why?
• Tránh thiết kế primer từ các trình tự nucleotid
hoặc amino acid liên quan
– Tránh tự bắt cặp
( sử dụng trong cloning gene tương đồng)
• Primer dimer: primer bắt cặp với nhau
- Ứng dụng
1. Giải trình tự DNA
2. Chẩn đoán
- Xác định tính trạng di truyền
- Phát hiện sinh vật gây bệnh
- Phát hiện chất gây nhiễm thực phẩm
3. Pháp y
4. Đa dạng di truyền quần thể
5. Khảo cổ học và tiến hóa
- Cần quan tâm
• Kích thước sản phẩm
– Hỗn hợp enzyme (+ 1 proof-reading) sẽ tăng kích thước
sản phẩm khoảng 10 kb. (Long-rang PCR)
– Cần kéo dài thời gian cho long-rang PCR
– Tuổi mẫu (chất lượng mẫu) tỉ lệ nghịch với kích thước
khuếch đại của sản phẩm.
• Khuếch đại sản phẩm sai trình tự
– Primer bắt cặp khuếch đại đoạn không mong muốn (không
đặc hiệu, nồng độ muối, nhiệt độ,…)
– Sử dụng primer đặc hiệu, tăng nhiệt độ bắt cặp, tăng Mg
ion
- Cần quan tâm
• Nhiễm lẫn
– Vật dụng, thao tác, tác nhân sinh học trong phòng
thí nghiệm
– Thao tác cẩn thận, giữ sạch nơi thí nghiệm
• Sản phẩm không đồng nhất
– Mẫu không đồng nhất, đến từ nhiều nguồn khác
nhau hoặc bị suy thoái (degradation)
– Hiệu quả của enzyme polymerase
- Các loại PCR cải biến – tăng độ nhạy
• Hot-start PCR
– Giảm sự bắt cặp không đặc hiệu của primer
giảm khuếch đại sản phẩm không mong muốn.
– Cho enzyme polymerase vào dung dịch khi đạt
nhiệt độ bắt cặp tối thích.
– Bọc enzyme hoặc muối Mg bằng sáp
– Sử dụng antibody bất hoạt enzyme giai đoạn đầu.
- Các loại PCR cải biến – tăng độ nhạy
• Touch-down PCR
– Giảm sự bắt cặp không đặc hiệu của primer
giảm khuếch đại sản phẩm không mong muốn.
– Nhiệt độ bắt cặp ban đầu cao tránh bắt cặp không
đặc hiệu xảy ra, sau đó sẽ giảm đến nhiệt độ bắt
cặp tối thích
- Các loại PCR cải biến – tăng độ nhạy
• Nested-PCR
Tăng độ chuyên
biệt.
- Hard-
copies
- Hard-copies
- Hard-
copies
- Inverse PCR
Thêm tài liệu vào bộ sưu tập có sẵn:
Báo xấu
LAVA
ERROR:connection to 10.20.1.98:9315 failed (errno=111, msg=Connection refused)
ERROR:connection to 10.20.1.98:9315 failed (errno=111, msg=Connection refused)
Đang xử lý...
Thêm vào BST
Báo xấu
