Bài giảng Polymerase Chain Reaction - Nguyễn Vũ Phong

Chia sẻ: Sơn Tùng | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

83
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài giảng "Polymerase Chain Reaction" cung cấp cho người học các kiến thức: Taq polymerase, Enzyme bền nhiệt có hoạt tính sửa sai, thiết kế primer, ứng dụng, những vấn đề cần quan tâm, các loại PCR cải biến – tăng độ nhạy, quantitative PCR,... Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng Polymerase Chain Reaction - Nguyễn Vũ Phong

Polymerase Chain Reaction Tp. Hồ Chí Minh 24-9-2014
Taq polymerase • DNA polymerase chịu nhiệt, dễ tinh sạch bằng nhiệt • Tổng hợp DNA theo chiều 5’  3’ • Exonuclease 5’  3’ • Tổng hợp 50 – 60 nu/s
Taq polymerase • Không có hoạt tính sửa sai (proof-reading) – Tổng hợp sai 1/10.000 nu – Tạo sản phẩm PCR sai trình tự • Sản phẩm dài 2 – 4 kb • Bền nhiệt: 40 phút/95 oC, • Gắn thêm adenine (A) ở đầu 3’ của sản phẩm – Có ích khi tạo dòng bằng TA kit
Enzyme bền nhiệt có hoạt tính sửa sai • Tli : Thermococcus litoralis – Bền ở 95 oC. Giữ hoạt tính sau 1h ở 95 oC • Pfu: Pyrococcus furiosus
Thiết kế primer • Chiều dài – Ngắn: dễ bắt cặp  không chuyên biệt – Dài : Khó bắt cặp  chuyên biệt – 20 – 30 nu • Bắt cặp sai (mismatches) – Đầu 3’ của primer phải bắt cặp hoàn toàn với nu trên khuôn mẫu, thường sử dụng C/G (why ?) – Đầu 5’ của primer không cần bắt cặp hoàn toàn với khuôn mẫu  chèn trình tự nhận biết của RE
Thiết kế primer • Nhiệt độ nóng chảy (Tm) – 2 mồi có nhiệt độ nóng chảy tương tự nhau  thành phần ATGC tương đương nhau • Cấu trúc thứ cấp nội tại – Tránh tự bắt cặp • Primer dimer: primer bắt cặp với nhau
Thiết kế primer • Primer dimer: primer bắt cặp với nhau
Thiết kế primer • Tránh thiết kế primer từ trình tự amino acid  why? • Tránh thiết kế primer từ các trình tự nucleotid hoặc amino acid liên quan – Tránh tự bắt cặp ( sử dụng trong cloning gene tương đồng) • Primer dimer: primer bắt cặp với nhau
Ứng dụng 1. Giải trình tự DNA 2. Chẩn đoán - Xác định tính trạng di truyền - Phát hiện sinh vật gây bệnh - Phát hiện chất gây nhiễm thực phẩm 3. Pháp y 4. Đa dạng di truyền quần thể 5. Khảo cổ học và tiến hóa
Cần quan tâm • Kích thước sản phẩm – Hỗn hợp enzyme (+ 1 proof-reading) sẽ tăng kích thước sản phẩm khoảng 10 kb. (Long-rang PCR) – Cần kéo dài thời gian cho long-rang PCR – Tuổi mẫu (chất lượng mẫu) tỉ lệ nghịch với kích thước khuếch đại của sản phẩm. • Khuếch đại sản phẩm sai trình tự – Primer bắt cặp khuếch đại đoạn không mong muốn (không đặc hiệu, nồng độ muối, nhiệt độ,…) – Sử dụng primer đặc hiệu, tăng nhiệt độ bắt cặp, tăng Mg ion
Cần quan tâm • Nhiễm lẫn – Vật dụng, thao tác, tác nhân sinh học trong phòng thí nghiệm – Thao tác cẩn thận, giữ sạch nơi thí nghiệm • Sản phẩm không đồng nhất – Mẫu không đồng nhất, đến từ nhiều nguồn khác nhau hoặc bị suy thoái (degradation) – Hiệu quả của enzyme polymerase
Các loại PCR cải biến – tăng độ nhạy • Hot-start PCR – Giảm sự bắt cặp không đặc hiệu của primer  giảm khuếch đại sản phẩm không mong muốn. – Cho enzyme polymerase vào dung dịch khi đạt nhiệt độ bắt cặp tối thích. – Bọc enzyme hoặc muối Mg bằng sáp – Sử dụng antibody bất hoạt enzyme giai đoạn đầu.
Các loại PCR cải biến – tăng độ nhạy • Touch-down PCR – Giảm sự bắt cặp không đặc hiệu của primer  giảm khuếch đại sản phẩm không mong muốn. – Nhiệt độ bắt cặp ban đầu cao tránh bắt cặp không đặc hiệu xảy ra, sau đó sẽ giảm đến nhiệt độ bắt cặp tối thích
Các loại PCR cải biến – tăng độ nhạy • Nested-PCR Tăng độ chuyên biệt.
Hard- copies
Hard-copies
Hard- copies
Inverse PCR