Bài giảng Sản xuất vaccin

Sản xuất vaccin

Yêu cầu :

1. Phân biệt được các loại vaccin.

2. Nêu qui trình cơ bản để sản xuất vaccin vi khuẩn

3. Nêu qui trình cơ bản để sản xuất vaccin virus

Lịch sử

Bệnh đậu mùa

Chủng đậu

• China/India 1% so với 25% chết

• Miễn dịch kéo dài

• UK: 1700’s

• China 1950

• Pakistan/Afghanistan/Ethiopia 1970

Lịch sử

Bệnh đậu mùa

• Jenner 1796 : Đậu bò/Đậu lợn

Vaccination

Edward Jenner (1749-l823)

• 1800’s Tiêm phòng phổ cập cho trẻ em

• 1930’s Ca tự nhiên cuối cùng ở Anh

• 1940’s Ca tự nhiên cuối cùng ở Mỹ

• 1958 chương trình WHO

• 10/1977: Ca cuối cùng (Somalia)

Vaccin

• Thành công trong quá khứ

• Triển vọng cho tương lai

Định nghĩa

Vaccin là chế phẩm chứa kháng nguyên của một hoặc nhiều loại vi sinh vật, dùng để gây miễn dịch chủ động dự phòng

Vaccin lý tưởng

 Sinh miễn dịch

Bắt chước nhiễm tự nhiên

 Cho sự bảo vệ kéo dài

Khoảng cách giữa các liều xa

 Không gây tác dụng phụ nghiêm trọng

 Ổn định

Phân loại vaccin

Phân loại vaccin truyền thống Vaccin bất hoạt (vaccin chết) Vaccin sống giảm hoạt lực Vaccin độc tố Vaccin dưới đơn vị

Một số vaccin mới

Vaccin idiotyp Vaccin liên hợp Vaccin vector tái tổ hợp Vaccin DNA Vaccin tổng hợp

Phân loại vaccin

Vaccin bất hoạt (vaccin chết)

Chứa các vi sinh vật độc đã được làm chết bằng các chất hóa học hoặc nhiệt độ, do đó không còn sinh sôi trong chủ thể được nữa

Ưu: nói chung an toàn, nhưng không phải là tuyệt đối

Các nội độc tố bề mặt trên vaccin ho gà bất hoạt đôi khi cảm ứng các đáp ứng DTH và virus cúm có gắn với các phản ứng tương tự

Nhược:

. Thường ít hiệu quả hơn vaccin sống giảm độc lực . Chỉ có khá năng cảm ứng miễn dịch thể dịch vì mầm bệnh chết không thể đi vào tế bào chủ  không tác dụng nếu là nhiễm nội bào . Cần nhiều liều hơn để cho bảo vệ lâu dài

Ví dụ vaccin chống lại cúm, tả, ho gà, dại, dịch hạch, viêm gan A và vaccin bại liệt Salk

Phân loại vaccin

Vaccin sống giảm hoạt lực

chứa các vi sinh vật sống được làm suy yếu độc lực hoặc vi sinh vật gần giống nhưng ít nguy hiểm hơn( BCG)

Ưu: Kích thích kháng nguyên liên tục đủ lâu để sản xuất tế

bào nhớ  tạo đáp ứng miễn dịch bền

Nhược

có thể chuyển lại thành dạng gây bệnh

Ví dụ

vaccin chống lại sốt vàng da, sởi, rubella, quai bị và vaccin bại liệt Sabin, BCG

Phân loại vaccin

Vaccin độc tố

chứa các độc tố đã bất hoạt không còn gây bệnh

Ví dụ

các vaccin độc tố uốn ván và bạch hầu, vaccin độc tố Crotalis atrox chống lại rắn chuông cắn dùng cho chó

Phân loại vaccin

Vaccin dưới đơn vị Chứa một phần nhỏ của tác nhân gây bệnh sản xuất từ vi sinh vật an toàn hoặc tế bào nuôi cấy để gây ra đáp ứng miễn dịch. Bằng cách này, có thể tránh được các độc tố mạnh, hoặc loại bỏ được các vật liệu mơ hồ hoặc đáp ứng miễn dịch lấn át

Ưu:

. Ít tác dụng phụ hơn vaccin cổ điển . An toàn hơn

Ví dụ

vaccin Haemophilus influenza type b, vaccin chống lại HBV chỉ chứa các protein bề mặt của virus vaccin tiểu phần giống virus chống lại HPV chứa protein capsid chính của virus

Phân loại vaccin

Một số vaccin mới

Vaccin idiotyp

Vaccin liên hợp

Vaccin vector tái tổ hợp

Vaccin DNA

Vaccin tổng hợp

Phân loại vaccin

Vaccin kháng-idiotyp

KT2

KT1

chứa kháng thể kháng idiotyp

KN

Anti-idiotype

Iditotype

Phân loại vaccin

Vaccin kháng-idiotyp

Virus

epitop

Kháng thể

Kháng thể có vị trí gắn của epitop

Phân loại vaccin

Vaccin idiotyp (tt)

Kháng thể kháng- idiotyp

Tạo kháng thể kháng lại kháng thể idiotyp

kháng thể

Kháng thể kháng- idiotyp bắt chước epitop

Phân loại vaccin

Vaccin idiotyp (tt)

Dùng kháng thể kháng-idiotyp làm vaccin

Dùng như vaccin Kháng thể kháng-idiotype

Gắn và trung hòa virus

Kháng thể kháng-kháng-idiotyp

Kháng thể cho kháng thể kháng-idiotyp

Phân loại vaccin

Vaccin liên hợp

Vaccin polysacchride

Vỏ ngoài polysacchrid là KN không phụ thuộc T- cell, tạo miễn dịch yếu ở trẻ nhỏ, không tạo hoặc ít trí nhớ miễn dịch, ảnh hưởng nhắc lại kém  liên kết các polysacchrid này với protein (độc tố)  KN protein

. Vaccin chống viêm phổi do phế cầu chứa 23 loại polysaccharide từ nang của 23 chủng St. pneumoniae

. Vaccin Haemophilus influenzae type B

Phân loại vaccin

Vaccin vector tái tổ hợp

Là kết hợp sinh lý của một vi sinh vật và DNA của vi sinh vật khác, để chống lại các bệnh có quá trình nhiễm phức tạp.

Ví dụ

Vaccin phòng một số bệnh do virus được làm bằng cách tái tổ hợp biến chủng virus đậu bò với các gen vô hại của virus gây bệnh,

Giá mang Mycobacterium bovis (chủng BCG)

Phân loại vaccin

Vaccin tái tổ hợp dùng giá mang là virus đậu bò

Virus đậu bò thuộc họ Orthopoxvirus Sinh sản trong nhiều vật chủ

Virus ADN gồm 150-200 gen , ADN xoắn kép có 187.000 cặp nucleotid bao bọc bởi vỏ lipid

Loại trừ một phần hệ gen của virus đậu bò  không còn đặc tính gây bệnh nào nữa

Phân loại vaccin

Vaccin tái tổ hợp dùng giá mang là virus đậu bò

Tạo virus tái tổ hợp

• ADN mã hóa các kháng nguyên virus gây bệnh được phân lập và biến đổi để gen thể hiện được trong ADN của virus đậu bò  Ghép với ADN của virus đậu bò

 gen mã hóa ngưng kết hồng cầu tố của virus cúm

 kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B

 glycoprotein của virus herpes thông thường, virus dại, virus Epstein-Barr, virus HIV, virus gây viêm đường tiêu hóa dễ lây..…

• Làm vaccin đa giá gồm 20 loại KN virus khác nhau

Phân loại vaccin

Vaccin tái tổ hợp dùng giá mang là virus đậu bò

Ưu điểm

• Vaccin virus đậu bò có tác dụng miễn dịch

kéo dài do ổn định về mặt di truyền

• Có thể dùng bằng nhiều đường  chủng trên qui mô lớn các gia súc gia cầm, động vật hoang dại

• Không khó bảo quản vaccin

Phân loại vaccin

Vaccin ADN

• 1796 Jenner: virus động vật • 1800’s Pasteur: virus suy yếu • 1996 vaccin AND

Vaccin thế hệ thứ 3

Phân loại vaccin

Vaccin ADN

Gene cho KN

Tế bào cơ

plasmid

Tế bào cơ biểu hiện protein – tạo kháng thể

Cytotoxic T Lymphocyte (CTL)

Đáp ứng CTL

Phân loại vaccin

Vaccin ADN

• Plasmid dễ sản xuất lượng lớn

• ADN rất ổn định

• ADN đề kháng với nhiệt độ  tiện bảo quản và vận chuyển

• Trình tự ADN dễ biến đổi trong phòng thí nghiệm  Ta có thể đối phó với các thay đổi của tác nhân nhiễm

• Bằng cách dùng plasmid trong vaccin để mã hóa cho tổng hợp kháng nguyên, protein kháng nguyên được sản xuất được biến đổi hậu dịch mã theo cùng cách với protein của virus chống lại sự phòng vệ khi đi vào  Tạo kháng nguyên tốt hơn là protein tinh khiết

Phân loại vaccin

Vaccin ADN

• Có thể sản xuất vaccin phổ rộng nếu dùng hỗn hợp plasmid mã hóa cho nhiều đoạn protein từ một hay nhiều loại virus

• Plasmid không sao chép và chỉ mã hóa các protein quan tâm

• Không có thành phần protein nên sẽ không có đáp ứng miễn dịch chống lại vector

• Cách trình diện này của kháng nguyên  Đáp ứng CTL trực tiếp chống lại bất cứ kháng nguyên nào của mầm bệnh. Đáp ứng CTL cũng phòng vệ các bệnh gây bởi các tác nhân nội bào bắt buộc (ví dụ M. tuberculosis)

Phân loại vaccin

Vaccin ADN

Các vấn đề có thể:

• Sự tích hợp plasmid vào bộ gen chủ có thể gây đột biến chèn

• Cảm ứng đáp ứng tự miễn (ví dụ các kháng thể kháng-ADN mầm bệnh)

• Cảm ứng dung nạp miễn dịch (ví dụ nơi biểu hiện kháng nguyên trong chủ thể có thể có đáp ứng không đặc hiệu với kháng nguyên đó)

Phân loại vaccin

Vaccin ADN

Các vaccin ADN gây sinh sôi tế bào nhiễm virus

Cho:

• Đáp ứng miễn dịch phổ rộng

• Đáp ứng CTL kéo dài

Ưu điểm của vaccin ADN cho cúm:

Đáp ứng CTL có thể chống lại protein nội sinh

Ở chuột vaccin ADN nucleoprotein có hiệu quả chống lại nhiều virus có hemagglutinin khác nhau

Phân loại vaccin

Vaccin tổng hợp

Chứa các peptid, các carbohydrat hoặc các kháng nguyên tổng hợp phần chính hoặc toàn phần

(cid:0) Vaccin peptid tổng hợp vi khuẩn

Trung hòa độc tố Vaccin peptid tổng hợp độc tố bạch hầu và tả

(cid:0) Vaccin peptid tổng hợp virus

Các vùng không biến đổi Các vaccin peptid tổng hợp cho các protein và glycoprotein HIV đang được phát triển

(cid:0) Vaccin peptid tổng hợp ký sinh trùng

vaccin peptid tổng hợp cho các epitop bào tử ký sinh trùng sốt rét

Phân loại vaccin

Một số tên phân loại vaccin khác

(cid:0) Vaccin hấp phụ: Vaccin DPT được hấp phụ trên “giá đỡ” gel nhôm hydroxyt.

(cid:0) Vaccin khác chủng: Vaccin có tác dụng chống lại vi sinh vật khác với loài dùng để chế nó. Ví dụ: vaccin từ đậu bò để phòng đậu người.

(cid:0) Vaccin đa giá: Vaccin chứa các kháng nguyên bảo vệ của nhiều chủng thuộc về một loài vi khuẩn gây bệnh. Ví dụ: TAB.

(cid:0) Vaccin hỗn hợp: Vaccin gồm nhiều kháng nguyên của các loài vi sinh vật khác nhau, để phòng nhiều bệnh nhiễm trùng. Ví dụ: DPT, Priorix.

Phương pháp sản xuất vaccin

Quy trình sản xuất vaccin điển hình PHẦN CHÍNH

ĐÓNG ỐNG

ĐÓNG GÓI

BÀO CHẾ

Kháng nguyên 1

Kháng nguyên 2

Kháng nguyên 3

Tá chất

Phương pháp sản xuất vaccin

1. Hệ thống giống

2. Sản xuất vi khuẩn và các thành phần vi khuẩn

của vaccin vi khuẩn

3. Sản xuất virus và các thành phần virus của

vaccin virus

4. Phối trộn

5. Đóng ống và làm khô

6. Kiểm soát chất lượng

Phương pháp sản xuất vaccin

1. Hệ thống giống

. Phân lập vi sinh vật thích thích hợp

. từ các nhiễm trùng ở người . thao tác và chọn lọc thêm

. Làm lô giống (seed lot)

. nhân vi sinh vật thích thích hợp lên . phân vào ống . bảo quản ở -700C hoặc đông khô

. Kiểm tra độ an toàn và hiệu quả thử lâm sàng. Khi các kết quả thử lâm sàng đạt công nhận, lô giống được dùng thường qui cho sản xuất vaccin

Phương pháp sản xuất vaccin

2. Sản xuất vi khuẩn và các thành phần vi khuẩn của vaccin vi khuẩn

Lên men

Thu vi khuẩn

Phương pháp sản xuất vaccin

Lên men vi khuẩn

- Hoạt hóa giống vi khuẩn từ -700C /đông khô

- Cấy chuyển một hoặc vài lần vào môi trường nhân

giống  đủ lượng

- Cấy chuyển giống vào môi trường lên men

khuấy liên tục, theo dõi và điều chỉnh pH và thế oxy hóa khử của môi trường suốt quá trình nuôi

- Thời gian: 1 ngày - 2 tuần

 Thu hoạch

Phương pháp sản xuất vaccin

Quá trình thu vi khuẩn

Sản phẩm lên men:

tế bào vi khuẩn, các sản phẩm chuyển hóa và môi trường cạn kiệt

Vaccin sống giảm hoạt lực

. tách vi khuẩn không độc ra . hòa vào dung môi thích hợp, có thể đông khô

Phương pháp sản xuất vaccin

Thu vi khuẩn là tác nhân gây bệnh, nguy hiểm

1 Giết chết

2 Tách

3 Phân đoạn

4 Khử độc tố

5 Hấp phụ

6 Kết hợp

Phương pháp sản xuất vaccin

Thu vi khuẩn là tác nhân gây bệnh, nguy hiểm

1. Giết chết

Dùng nhiệt và chất tẩy uế.

Bordetella pertusis làm vaccin ho gà - dùng đun nóng /hoặc formalin

Vibrio cholerae trong vaccin tả và Salmonella typhi trong vaccin thương hàn - dùng phenol

2. Tách

dùng ly tâm

Thu tế bào và hòa vào hỗn hợp muối hoặc

Thu dịch lỏng, bỏ tế bào

Phương pháp sản xuất vaccin

Thu vi khuẩn là tác nhân gây bệnh, nguy hiểm

3. Phân đoạn

. Chiết các thành phần từ tế bào hoặc từ môi trường nuôi vi khuẩn

. Tinh chế bằng dung môi thích hợp và kết tủa

. Làm khô thành bột, bảo quản và hợp nhất vào vaccin

4. Khử độc tố

chuyển độc tố của vi khuẩn thành độc tố không hại

. dùng Formalin khử độc tố của C. diphthe và C. tetani

. Tiến hành trên dịch nuôi cấy trong nồi lên men hoặc trên độc tố tinh khiết sau khi phân đoạn

Phương pháp sản xuất vaccin

Thu vi khuẩn là tác nhân gây bệnh, nguy hiểm

5. Hấp phụ

Chất hấp phụ: tá chất khoáng, nhôm hydroxid, nhôm phosphat và canxi phosphat  tăng tính kháng nguyên và giảm độc tính tại chỗ và hệ thống của vaccin.

Vaccin bạch hầu và vaccin bạch hầu/uốn ván/ho gà

6 Kết hợp

. Để tăng cảm ứng đáp ứng miễn dịch

. Polysaccharide nang của H. influenzae Type b + độc tố bạch hầu và uốn ván + protein màng ngoài của Neisseria meningitidis

Phương pháp sản xuất vaccin

3. Sản xuất virus và các thành phần virus của vaccin virus

Nuôi virus

Thu virus

Phương pháp sản xuất vaccin

Nuôi virus

. Nuôi virus trong phôi gà, vịt hoặc nuôi cấy mô

- Chọn mô thích hợp cho virus - Cần tuyệt đối vô trùng trong quá trình nuôi cấy, kiểm nghiêm ngặt động vật tuyệt đối KHÔNG được để nhiễm virus lạ vào phôi

. Trứng gà có phôi

Virus cúm tích tụ trong dịch túi niệu của trứng Virus sốt vàng da tích tụ trong hệ thống thần kinh của phôi

Nuôi cấy chìm

Phương pháp sản xuất vaccin

Thu virus

Lọc và thu dịch có chứa virus

Vaccin cúm: ly tâm dịch túi niệu  huyền trọc virus tinh khiết một phần và đậm đặc  xử lý với ete hoặc với tác nhân phá vỡ khác để cắt virus thành các thành phần của nó nếu muốn có vaccin virion hoặc kháng nguyên bề mặt.

Vaccin sốt vàng da: đồng hóa phôi gà trong nước thành bột nhuyễn chứa virus  ly tâm kết tủa hầu hết mảnh vỡ của phôi và virus sốt vàng da

Phương pháp sản xuất vaccin

Thu virus

. Không có giai đoạn bất hoạt vì hầu hết vaccin làm từ

nuôi cấy tế bào chứa virus sống suy yếu

Ngoại trừ 2 trường hợp

Vaccin virus bại liệt bất họat được bất hoạt với formalin loãng hoặc  3-propiolactone  hấp phụ và rửa

Vaccin dại được bất hoạt với  3-propiolactone  siêu lọc

. Khi hoàn tất, khối nguyên liệu được bảo quản ở nhiệt

độ -700C đến khi trộn thành vaccin cuối

6. Kiểm soát chất lượng

. Nhằm để đảm bảo về hiệu quả và độ an toàn của mỗi lô sản phẩm

. Thực hiện theo ba cách: (1) kiểm soát trong quá trình; (2) kiểm soát sản phẩm cuối và (3) yêu cầu phù hợp cho mỗi nguyên liệu sản xuất ban đầu, trung gian, sản phẩm cuối và các phương pháp xử lý. Các kết quả kiểm tra kiểm soát chất lượng luôn được ghi chi tiết.

Kiểm tra độ an toàn gồm các kiểm tra tổng quát là: (1) Độ vô trùng, (2) Không có độc tố bất thường, (3) Sự hiện diện của nhôm và calci, (4) Formalin tự do và (5) Nồng độ phenol

Phương pháp sản xuất vaccin

Ví dụ

Sản xuất vaccin vi khuẩn thương hàn

Nhân giống

Nuôi Salmonella typhi trên thạch / 18 giờ Hòa 5x108 vi khuẩn /1ml NaCl đẳng trương

Nuôi cấy

Môi trường lỏng casein Cấy giống 5%-10% V Nuôi cấy liên tục có hệ thống khuấy 180-300 vòng/1 phút Sục khí vô trùng 1lít/1phút; Thêm dung dịch glucose 40% pH 7,6-7,8

10-12h

6x1010 vi khuẩn/ 1ml

Làm bất hoạt

Trộn sinh khối với EtOH 960 lần 1- 1:4 , lần 2- 1:10

Kiểm tra độ tinh khiết và đáp ứng miễn dịch Bào chế

Đưa dung dịch về điểm đẳng điện bằng NaCl có chứa 0,25% phenol, 1ml vaccin cồn chứa 5x109 vi khuẩn. Đóng ống và đông khô ở -40  -500C Đóng gói

Sản xuất kháng nguyên Vi (vỏ) tinh khiết từ vi khuẩn thương hàn Salmonella typhi

Nuôi cấy

Vi = virulence

Làm khô sinh khối bằng cồn

Chiết bằng nước cất (3 lần)

Tủa bằng cồn Lần 1: cồn + NaCl bão hòa Lần 2: cồn pH 3,5 – 3,8 Lần 3: cồn 46-52%

Đông khô

Bào chế Hòa kháng nguyên Vi trong NaCl đẳng trương 40 g/ml

Kháng nguyên Vi dùng ở dạng mono vaccin hoặc chung với vaccin vi khuẩn hoặc phối hợp với antigen O (= màng)

Vaccin ngừa uốn ván

Clostridium tetani

 Giống  Nuôi cấy

Môi trường lỏng casein + dịch men bia thủy phân Nuôi cấy kỵ khí

 Thu exotoxin

hấp phụ với Al(OH)3

 Làm bất hoạt

formalin

exotoxcin

anatocin

 Tinh khiết hóa

hấp phụ lại với Al(OH)3

 Kiểm tra độ tinh khiết và đáp ứng miễn dịch  Bào chế

1 ml vaccin chứa 20 đơn vị ngưng kết, pH 6,8-7,6

Sản xuất vaccin chống viêm gan B

Nguyên nhân: HBV, truyền qua đường tiêm chích, tình dục Mỹ: 200.000 người nhiễm/năm, trong đó 20.000 người mang mầm bệnh và 1/5 số này chết do xơ gan, 1/20 bị ung thư gan

1963: phát hiện kháng thể HBV trong máu bệnh nhân ưa chảy máu 1968: HBsAg

nuôi HBV trên tế bào gan - KHÓ

1970: huyết thanh người nhiễm HBV mãn

Sản xuất vaccin chống viêm gan B

Nguyên tắc: trích kháng nguyên bề mặt HBsAg của virus từ máu người bị nhiễm virus hepatitis B mãn tính Không dùng phương pháp nuôi cấy mô được đây là virus ái gan mà tế bào gan nguyên thủy lại khó nuôi cấy

Các bước chính

Máu người nhiễm viêm gan siêu vi B mãn tính

Bất hoạt bằng permalin, To và hydroxyt nhôm hoặc pepsin, urease và formalin

Tinh chế kháng nguyên

Thử độc tính và đáp ứng miễn dịch Thử độc tính trên tinh tinh / 65 tuần cho mỗi lô vaccin Thử hoạt tính kháng nguyên của vaccin trên chuột lang và chuột nhắt

LÂU NHẤT, ĐẮT TIỀN NHẤT

Sản xuất vaccin chống viêm gan B tái tổ hợp

Đi từ tế bào vi khuẩn và nấm men

• phân lập gen mã hóa HBsAg

• đưa gen này vào E. coli hoặc S. cerevisae

• sản xuất HBsAg bằng nuôi cấy vi khuẩn hoặc nấm men

• tách kháng nguyên từ tế bào 1-3 g/1ml dịch nuôi cấy

Sản xuất vaccin chống viêm gan B tái tổ hợp

Đi từ tế bào động vật

đưa gen mã hóa kháng nguyên vào tế bào động vật có vú bằng các vector như adenovirus, virus SV40 hoặc virus gây u vú ở bò

Ưu điểm • Các virus này có thể sao chép độc lập trong tế bào như những plasmid vi khuẩn • Các tế bào động vật có vú có khả năng khuyếch đại lớn các kháng nguyên: 1 ml dịch nuôi cấy cho 24 g kháng nguyên • Tỷ lệ glycozyl hóa cao, dễ tách kháng nguyên từ dịch và kháng nguyên được sản xuất liên tục

Sản xuất vaccin chống viêm gan B

Saûn xuaát vaccin choáng HBV: so saùnh pp truyeàn thoáng vaø tái tổ hợp