Vai trò của real-time PCR trong chẩn đoán các tác nhân gây nhiễm khuẩn hô hấp dưới
Phạm Hùng Vân*
*Chủ Tịch Hội Vi Sinh Lâm Sàng TP. HCM Chủ Tịch Chi Hội SHPT Y Khoa Việt Nam Trưởng Đơn Vị Vi Sinh – SHPT Lâm Sàng BV. NTP
Quệt MŨI SAU Phát hiện virus
QUYỆT HỌNG Không ý nghĩa
CẤY DNT
ĐÀM hay BỆNH PHẨM CÓ ĐÀM
Màng não
CẤY MÁU
Máu
Màng phổi
DỊCH MÀNG PHỔI
Thách thức trong cấy đàm
Phải bắt được vi khuẩn gây bệnh từ mẫu tạp nhiễm, do vậy phải lấy đúng bệnh phẩm đàm và phải đánh giá để chọn đúng vi khuẩn gây bệnh mọc trên mặt thạch phân lập
Có nhiều loại
là vi khuẩn gây bệnh là khó mọc, do vậy phải cấy ngay và có đủ các loại môi trường cần thiết
Lấy đúng bệnh phẩm đàm
Phải hướng dẫn bệnh nhân lấy đàm, Phải có phương tiện và phương pháp lấy đàm khi bệnh nhân không thể khạc đàm Phải
lấy đàm ngay khi chẩn đoán và
trước khi dùng kháng sinh
Phải đánh giá đại thể mẫu đàm rước khi
gửi mẫu đi đến phòng xét nghiệm.
?
?
?
?
Chọn đúng vi khuẩn gây bệnh
Nguyên tắc chọn VK gây bệnh
Ưu tiên 1: Chọn vi khuẩn phù hợp với hình ảnh vi khuẩn thấy trong vùng bạch cầu của phết nhuộm Gram mẫu đàm Ưu tiên 2: Chọn vi khuẩn ưu thế (định
lượng hay bán định lượng
Lưu ý: Vi khuẩn có số lượng nhiều nhưng cũng có thể không phải là vi khuẩn gây bệnh mà chỉ là VK quần cư, vi khuẩn thường trú hầu họng (Streptococci tiêu huyết α)
Song cầu Gram [-] giống M. catarrhalis
Song cầu Gram [+] giống S. pneumoniae
Trực khuẩn Gram [-] nhỏ giống H. influenzae
Trực khuẩn Gram [-] nhỏ giống H. influenzae
LÝ DO NUÔI CẤY THẤT BẠI
S. pneumoniae, H. influenzae là chủ yếu nhưng không dễ nuôi cấy, đòi hỏi các môi trường phân lập ít có sẵn Bệnh phẩm ít được cấy ngay Bệnh nhân dùng kháng sinh trước Mẫu không tin cậy do lẫn nước bọt (tạp
khuẩn hầu họng)
Không biết cách đánh giá kết quả nuôi cấy
để chọn đúng VK gây bệnh
Cấy máu Thách thức trong cấy máu
Cấy máu là phương tiện tốt nhất xác định tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi (CAP), tuy nhiên không phải tất cả mọi trường hợp CAP đều cấy máu [+] (Tối đa chỉ 14-16%)
Coi chừng ngoại nhiễm trong cấy máu. Kết quả [+] trong 24 giờ, hay cả 2 chai cấy cùng [+] một loại VK thường ít khi là ngoại nhiễm. Kết quả cấy máu phải kịp thời, muống vậy phải dùng phương tiện thích hợp và phải có qui trình trả kết quả nhanh
Phát hiện tác nhân bằng kỹ thuật miễn dịch
Phát hiện kháng nguyên hòa tan VK gây bệnh (S. pneumoniae, L. pneumophila) trong nước tiểu. Độ nhạy thấp
Phát hiện kháng nguyên trong mẫu đàm, quyệt mũi sau bằng ELISA, MDHQ: Phát hiện tác nhân virus, VKKĐH. Độ nhạy thấp Huyết thanh học tìm kháng thể đặc hiệu phát hiện tác nhân virus, VKKĐH: Nếu là IgG thì phải huyết thanh kép cách 10 ngày; nếu là IgM thì phải có giá trị cắt và tùy thuộc chất lượng kit
Phát hiện tác nhân vi sinh gây ARI GIẢI PHÁP NÀO PHÙ HỢP?
VI SINH TRUYỀN THỐNG (nuôi cấy)
Không nhạy, không đầy đủ
HUYẾT THANH (kháng thể đặc hiệu)
Không hữu dụng (IgG), kém đặc hiệu (IgM) HOÁ MIỄN DỊCH (kháng nguyên đặc hiệu)
Độ nhạy kém
REAL-TIME PCR (trình tự NA đặc hiệu)
Độ nhạy cao, đặc hiệu cao
Nguyên tắc PCR cơ sở của độ nhạy tuyệt vời
ADN đích
4
1
1 Biến tính (94o C)
2
2 Bắt cặp (55-65o C)
3
3 Kéo dài (72o C)
Taq polymerase
n
PCR là nuôi cấy đoạn gen cơ sở của độ đặc hiệu không khác nuôi cấy
Ñònh danh döïa vaøo kieåu hình sinh vaät hoùa hoïc bieåu hieän töø caùc kieåu gen
Xaùc ñònh döïa vaøo kích thöôùc ñoaïn gen hay moät trình töï ñaëc hieäu cuûa ñoaïn gen
Nuoâi caáy PCR
Real-time PCR Chạy PCR đồng thời phát hiện kết quả
Ct curve
Standard curve
Melt curve
“Streamline” Real-time PCR
CÁC BỆNH PHẨM KHÁC NHAU (Máu, mô, đàm, mủ, dịch cơ thể)
TÁCH CHIẾT DNA/RNA NKDNARNAprep-MAGBEAD Một bộ thuốc thử cho DNA và RNA Chỉ 5 bước thực hiện Độ nhạy gấp 100 lần thủ công Tương thích cho KingFisher
Các thiết bị KingFisher tách chiết DNA/RNA
REAL-TIME PCR/RTPCR NKReal-time PCR/RTPCR kit
Chọn lựa tuỳ tác nhân Chứng nội kiểm soát chất lượng Cùng một chương trình real-time Tương thích nhiều máy real-time
Các thiết bị Real-time PCR
PCR so với nuôi cấy phát hiện các tác nhân vi khuẩn
PCR Nuôi cấy Pos Neg
S. pneumoniae Pos Neg 5 43 3 201
H. Influenzae Pos Neg 5 62 0 185
M. catarrhalis Pos Neg 4 8 6 234
Takahashi et al. BMC Infectious Diseases 2013, 13:296
Tỷ lệ phát hiện tác nhân gây bệnh ĐỊNH LƯỢNG >105/ml
124 bệnh nhân VPCĐ nhập viện. 1/14-4/14 tại khoa hô hấp bv. NTP
64.5%
Trần thị Thanh Vy (2013). Luận văn ThS. vi sinh.
Tác nhân chính gây bệnh ĐỊNH LƯỢNG CAO NHẤT VÀ >105/ml
Parainfluenzavirus 1 1%
Parainfluenzavirus 3 1%
Influenzavirus A 1% B. pertussis 4%
Respiratory Syncitial Virus 1%
Chlamydia 13%
VKKĐH 38%
S. pneumoniae 39%
Mycoplasma 21%
H. influenzae 14%
M. catarrhalis 5%
Trần thị Thanh Vy (2013). Luận văn ThS. vi sinh.
Tỷ lệ phối hợp VK không điển hình với tác nhân gây bệnh chính là S. pnemoniae và H. influenzae
Nnghiên cứu trên 124 trường hợp viêm phổi cộng đồng nhập viện tại BV. NTP
45.45
29.03
S. pneumoniae (N=30)
H. influenzae (N=11)
Trần thị Thanh Vy (2013). Luận văn ThS. vi sinh.
Real-time PCR so với nuôi cấy phát hiện tác nhân VK gây HAP
PCR [+] PCR [-]
Cấy [+] 2 0 A. baumannii
Cấy [-] 4 0
Cấy [+] 0 0 S. pneumoniae
Cấy [-] 1 0
Cấy [+] 0 0 Mycoplasma
Cấy [-] 1 0
Cấy [+] 0 0 MRSA
Cấy [-] 1 0
Đang nghiên cứu với BV NĐ1 N = 26
Tác nhân vi sinh gây viêm phổi không đáp ứng điều trị ở trẻ nhỏ
N=32
ĐỊNH LƯỢNG >105/ml
kết quả [+]
kết quả [-]
87.5%
Bùi Lê Hữu Bích Vân (2015) Luận văn Thạc Sĩ nhi Thực hiện tại BV. NĐ1
Tác nhân chính gây bệnh ĐỊNH LƯỢNG CAO NHẤT VÀ >105/ml
H. influenzae 6.25%
Không phát hiện được tác nhân 12.5%
E. coli 3.13%
K. pneumoniae 6.25%
RSV 3.13%
Para-INF3 Virus 6.25%
S. pneumoniae 50%
B. pertussis 3.13%
M. pneumoniae 9.38%
Xác định tác nhân gây bệnh ĐỊNH LƯỢNG >105/ml
12.5
NO
3.13
KLP
3.13
Eco
3.13
RSV
3.13
BP
3.13
MP
3.13
PNE+pInf3+ADV+Eco
3.13
PNE+pInf3+KLP
3.13
PNE+InfA+KLP
3.13
PNE+pINF3+KLP+Eco
3.13
PNE+pInf3
15.63
PNE+MP
34.38
PNE
3.13
HIN+PSA
3.13
HIN
So sánh real-time và nuôi cấy
Nuôi cấy
PCR
+
-
+
0
21
S. pneumoniae
-
0
11
+
1
1
H. influenzae
-
0
30
+
1
2
E. coli
-
0
29
+
2
1
K. pneumoniae
-
0
29
+
1
0
P. aeruginosa
-
0
31
Bùi Lê Hữu Bích Vân (2015); Luận văn Thạc Sĩ nhi; Thực hiện tại BV. NĐ1
Tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi thùy ở trẻ em
Trẻ em bị viêm phổi thùy Mẫu NTA tin cậy qua thang điểm Barlett Thực hiện real-time PCR phát hiện 28 tác nhân vi sinh (bao gồm 8 tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện)
Vật liệu, phương pháp và kiểm soát chất lượng real-time PCR như nghiên cứu trước
Luận văn Thạc Sĩ nhi
Thực hiện tại BV. NĐ1 (2016)
80
Vi khuẩn gây bệnh chính
69.2
70
52 trường hợp làm xét
60
55.8
nghiệm real-time PCR
50
Phát hiện được tác nhân trong 100% các trường hợp
40
Không có trường hợp nào
30
nuôi cấy [+]
20
13.5
7.7
10
3.9
3.9
0
N=36 N=29 N=7 N=4 N=2 N=2
Tác nhân gây bệnh Phân tích các trường hợp đơn và đa nhiễm
MP MP+MRSA PNE+MRSA PNE+MP PNE+MP+MR PNE+MP+HI+MR PNE+MP+HI PNE+HI+MR PNE+HI PNE TB TB+PNE+MP Tổng cộng
21 1 1 11 1 1 1 2 3 8 1 1 52
40.38 1.92 1.92 21.15 1.92 1.92 1.92 3.85 5.77 15.38 1.92 1.92 100.00
Số cas Tác nhân %
PNE: S. pneumoniae, MP: M. pneumoniae, HI: H. influenzae, MR: M. catarrhalis, MRSA: Methicillin Resistant S. aueus, TB: M. tuberculosis
NHẬN ĐỊNH
Tác nhân vi sinh chủ yếu gây CA-LRTI là S. pneumoniae, H. influenzae, M. catarrhalis... Tuy nhiên tác nhân vi khuẩn không điển hình
cũng đóng vai trò đáng kể
Tiếp cận sinh học phân tử sử dụng kỹ thuật real-time PCR là cần thiết vì giúp lâm sàng chỉ định và điều chỉnh KS bước đầu giúp điều trị thành công và tránh lạm dụng kháng sinh
Giải pháp này rất khả thi nhờ: “streamline real-time PCR”
o o Giá thành chấp nhận được (không quá 50.000USD) o Nhiều phòng thí nghiệm có real-time PCR
