PHÂN TÍCH VSV
CAÙC PHÖÔNG PHAÙP PHAÂN TÍCH
ÑÒNH LÖÔÏNG VI SINH VAÄT
I. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP - Dùng để xác định các loại vi sinh vật đơn bào có kích thước lớn: nấm men, tảo đơn bào, bào tử mốc
- Quy trình cho phép xác định nhanh chóng số lượng vi sinh vật
-Không phân biệt được tế bào sống và chết
-Không phân biệt được các tế bào vi sinh vật và hạt vật thể
-Hạn chế đối với huyền phù có mật độ thấp
Buồng đếm vi sinh vật
I. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP
Đếm trực tiếp bằng buồng đềm hồng cầu
I. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP Đếm trực tiếp bằng buồng đềm hồng cầu trên kính hiển vi
Đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu
Pha loãng mẫu cần đếm sao cho trong mỗi ô nhỏ của buồng đếm có khoảng 5 - 10 tế bào
Cách đếm tế bào trong buồng đếm
I. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP 1. Đếm trực tiếp bằng buồng đềm hồng cầu
Quy trình:
- Pha loãng mẫu (5-10 tế bào/ô nhỏ)
- Nạp mẫu vào buồng đếm
- Đếm số lượng tế bào hiện diện trong 5 ô lớn
Tính mật độ:
Mật độ tế bào: N/ml = 0,25a x 106 tế bào/ml
a: trung bình cộng số lượng tế bào trong 5 ô lớn
II. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC - Dùng để xác định các loại vi sinh vật sống trong mẫu
- Độ nhạy cao, định lượng vi sinh vật ở mật độ thấp
- Có thể định lượng các vi sinh vật kích thước nhỏ, di động
Chuẩn bị dịch pha loãng mẫu
Không sử dụng nước cất và nước muối sinh lý để pha loãng mẫu thực phẩm
Các dung dịch pha loãng mẫu
(cid:1) Saline peptone water (SPW)
NaCl
8,5g
Peptone
1,0g
Nước cất vừa đủ
1 lít
• Buffered peptone water (BPW)
NaCl
5g
Peptone
10g
Nước cất vừa đủ
1 lít
Chuẩn bị các chuỗi pha loãng mẫu
Đối với các mẫu rắn hay bán lỏng:
10g mẫu + 90ml dung dịch pha loãng => độ pha loãng 101
Film
Các bước tiếp theo tương tự như pha loãng mẫu lỏng
pha loãng mẫu lỏng theo dãy thập phân
II. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC
Quy trình:
- Pha loãng
mẫu (25-250
khuẩn lạc/đĩa)
- Tạo hộp đổ
- Nuôi ủ, đếm
số lượng
Cấy mẫu vào môi trường
-Phương pháp cấy bề mặt - Phương pháp đổ đĩa
Phương pháp đổ đĩa
• Chuẩn bị đĩa petri vô trùng • Môi trường được chuẩn bị - hấp khử trùng
và được bảo quản mát ở 45oC trong bể điều nhiệt
• Hút 1ml mẫu vào đĩa trống (chọn nồng độ
thích hợp)
• Đổ vào đĩa đã cấy 10 – 15ml môi trường,
lắc đều
• Để nguội môi trường
Phương pháp đổ đĩa
Ưu điểm Cấy được thể tích mẫu lớn (1ml)
Xác định được các VSV cần dinh dưỡng tiếp xúc
từ nhiều phía
Cho phép đếm được mật độ VSV cao, khoảng
150-300 khuẩn lạc Nhược điểm
Không định lượng được những VSV quá nhạy
nhiệt
Không xác định được hình dạng khuẩn lạc nhất
định
Khó làm thuần một dòng VSV
Phương pháp cấy bề mặt
• Môi trường phải được chuẩn bị trên
đĩa trước 1-2 ngày để khô mặt
• Phương pháp
Film
- Cấy 0.1 – 0,3ml vào đĩa môi trường - Trải đều trên mặt bằng que trang tam giác - Để ở nhiệt độ phòng 15-20 phút cho khô mặt
Phương pháp cấy bề mặt
Ưu điểm
- Định lượng được các VSV nhạy nhiệt - Có thể nhận dạng đựơc dạng khuẩn lạc đặc trưng - Dễ dàng làm thuần chủng VSV mục tiêu
Nhược điểm
- Chỉ cấy đựơc thể tích mẫu nhỏ
Các thiết bị hỗ trợ đếm khuẩn lạc
Bút đếm khuẩn lạc
Các thiết bị hỗ trợ đếm khuẩn lạc
Máy đếm khuẩn lạc
Máy đếm khuẩn lạc tự động
II. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC
C
N
ghayCFU
ml
CFU (
/
/
)
=
(
)
∑ ... ++
ivdn
i
vdn 1 1
Tính kết quả:
Vôùi :
N: soá teá baøo (ñôn vò hình thaønh khuaån laïc) vi khuaån trong 1g hay 1ml maãu. ΣC: Toång soá khuaån laïc ñeám ñöôïc treân caùc hoäp petri ñaõ choïn ni : Soá hoäp petri caáy taïi ñoä pha loaõng thöù i di: heä soá pha loaõng töông öùng. v: theå tích dòch maãu (ml) caáy vaøo trong moãi ñóa
Ñònh löôïng toång vi sinh vaät hieáu khí
10 g mẫu + 90 g Salin Pepton Watter
Đồng nhất bằng stomacher / 30 giây
Dung dịch 10 -1
Pha lõang 10-2, 10-3, 10-4,..
Cấy 1ml/petri – 3 độ pha loãng liên tiếp – 2 petri/độ pha lõang
Cho 15-20 ml PCA/petri. Lắc đều
Ñònh löôïng toång vi sinh vaät hieáu khí
Để đông đặc
Lật ngược đĩa, ủ ấm 30±1oC/ 72±6h
Khuẩn lạc
Chọn đĩa có 25 – 250 khuẩn lạc (cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1) đếm
Tổng VSV hiếu khí/g (TPC)
N
TPC =
n1V1F1 + ….+ niViFi
N: Tổng KL; n: số đĩa cho mỗi nồng độ
V: Thể tích cấy (=1) ; F: độ pha lõang
III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC
- Định lượng vi sinh vật có mật độ thấp
- Định lượng thông qua số lượng khuẩn lạc hoặc theo phương pháp MPN
III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC
- Kích thước lỗ lọc: 0,45 µm hoặc 0,2 µm
- Thường dùng màng lọc kỵ nước, in các ô vuông ngăn cản sự mọc lan của khuẩn lạc
III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC
Bộ lọc và màng lọc vô trùng
III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC
III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC
Phương pháp màng lọc
• Kích thước lỗ lọc 0,47µm hay 0,22µm • Đường kính và hình dạng màng lọc phụ
thực vào đường kính phễu lọc
• Đường kính màng thường là 45mm
Thiết bị lọc nhiều phễu
VSV
Phương pháp lọc VSV
• Phễu lọc, giá đỡ màng lọc phải được
vô trùng sau mỗi lần lọc
• Mật độ VSV trong dịch lọc thích hợp:
<150 khuẩn lạc/màng • Thể tích dịch lọc trong 1 lần: 50 -
100ml
• Nếu thể tích dịch lọc nhỏ hơn thì phải pha loãng bằng dd pha loãng hay nước cất vô trùng
Phương pháp màng lọc
• Ưu điểm –Xác định được mật độ VSV cụ
thể trong một thể tích mẫu lớn: 10ml, 100ml …
• Nhược điểm –Không thích hợp cho việc phân tích
các mẫu thực phẩm rắn
Khuẩn lạc vsv mọc trên màng
1A 1B 2A 2B
2C 1C 1D
E. coli trên môi trường ID Coli agar
2C . Coliforms trên môi trường ID Coli agar
III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC
Quy trình:
- Khử trùng dụng cụ lọc
- Lọc chân không
- Nuôi cấy màng lọc trên môi trường dinh dưỡng
- Đếm số lượng khuẩn lạc trên đĩa petri
Tính mật độ:
MPN = N x ln(N/N - x)
Với: N: Tổng số các ô vuông
x: số ô có khuẩn lạc mọc
III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC
III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC
III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC
III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC
III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC
III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC
Vi khuẩn phát triển trên màng lọc
IV. PHƯƠNG PHÁP DÙNG PETRIFILM - Kỹ thuật dùng kiểm tra tổng vi khuẩn hiếu khí, coliform, coliform phân, nấm mốc, nấm men
- Kỹ thuật dễ thao tác
- Tiết kiệm không gian ủ, bảo quản, thời hạn sử dụng lâu
- Không cần hấp khử trùng môi trường
IV. PHƯƠNG PHÁP DÙNG PETRIFILM
IV. PHƯƠNG PHÁP MPN (MOST PROBABLE NUMBER) - Đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu
- Là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau
- Kết quả định tính: sinh hơi, đổi màu, hoá đục của môi trường nuôi cấy → dương tính
- Độ chính xác phụ thuộc vào số ống nghiệm lặp lại ở mỗi độ pha loãng (3 hoặc 5 lần)
- Phương pháp dùng định lượng mọi nhóm vi sinh vật nuôi trên môi trường chọn lọc, cho kết quả biểu kiến.
ĐỊNH LƯỢNG VSV BẰNG PP MPN (Most Probable Number)
(cid:2) Phương pháp MPN dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân bố VSV trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu. (cid:2)Mỗi độ pha loãng được nuôi cấy lập lại nhiều lần (3 – 10 lần) (cid:2)Các độ pha loãng được chọn lựa sao cho trong các lần lặp lại có một số lần dương tính và có một số lần âm tính. (cid:2)Số lần dương tính được ghi nhận và so sánh với bảng thống kê (cid:3) giá trị ước đoán số lượng VSV trong mẫu.
ĐỊNH LƯỢNG VSV BẰNG PP MPN
• Hai hệ thống MPN
- Hệ thống 9 ống - Hệ thống 15 ống
• Đặc điểm - Vi sinh vật mục tiêu phải có những biểu hiện đặc trưng trên môi trường nuôi cấy như
Sự tạo hơi: Coliforms … Sự đổi màu: S. aureus
- Cho phép định lượng được mật độ VSV thấp trong thể tích mẫu lớn
Hệ thống MPN/g(ml)
Hệ thống 9
ống
Hệ thống 15 ống
10ml mỗi trường
ĐỊNH LƯỢNG VSV BẰNG PP MPN
1.1 1.2 1.3 1.4 1.5
2.1 2.2 2.3 2.4 2.5
1 - Chuẩn bị các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của đối tượng VSV cần định lượng
3.1 3.2 3.3 3.4 3.5
1ml
1.1 1.2 1.3 1.4 1.5
10-1
1ml
2.1 2.2 2.3 2.4 2.5
10-2
1ml
2 - Cấy một thể tích chính xác dung dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp
3.1 3.2 3.3 3.4 3.5
10-3
1.1 1.2 1.3 1.4 1.5
3 – Đem ống nghiệm ủ ở điều kiện thích hợp
2.1 2.2 2.3 2.4 2.5
3.1 3.2 3.3 3.4 3.5
1.1 1.2 1.3 1.4 1.5
2.1 2.2 2.3 2.4 2.5
4 – Quan sát các chứng hiện biểu minh sự phát triển của vsv cần kiểm định
Sự đổi màu của môi trường
3.1 3.2 3.3 3.4 3.5
1.1 1.2 1.3 1.4 1.5
5
+
+
+
+
+
2.1 2.2 2.3 2.4 2.5
5 – Ghi nhận số ống lượng các nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng
2
+
+
3.1 3.2 3.3 3.4 3.5
1
+
5 – Tra bảng Mac Crady để suy ra mật độ VSV
5
Kết quả
Tra bảng
Số vsv: 70 MPN/g
2
1
ĐỊNH LƯỢNG VSV BẰNG PP MPN
1ml
1.1 1.2 1.3 1.4 1.5
5
1ml
10-1
2.1 2.2 2.3 2.4 2.5
10-2
Tra Bảng
1ml
2
3.1 3.2 3.3 3.4 3.5
10-3 1
Số vsv: 70 MPN/ml
IV. PHƯƠNG PHÁP MPN (MOST PROBABLE NUMBER)
Phương pháp MPN (loạt 5 ống)
Số MPN/100 ml - 3 6 9
IV. PHƯƠNG PHÁP MPN (MOST PROBABLE NUMBER) Bảng tra MPN Số lượng ống (loạt 3 ống) dương tính Số ml mẫu sử dụng 10 1 0 0 0 0 0 0 0 0 …… 3 3 3 3 3 3 3 3
0,1 0 1 2 3 … 0 1 2 3
240 460 1100 -
PHÁP MPN
(MOST PROBABLE NUMBER)
Bảng tra MPN (loạt 5 ống)
Quy trình:
IV. PHƯƠNG PHÁP MPN (MOST PROBABLE NUMBER)
- Pha loãng mẫu bậc 10,chọn 3 nồng độ liên tiếp
- Cấy vào loạt ống nghiệm (9 hoặc 15 ống) chứa môi trường chọn lọc
một lượng mẫu xác định từ 3 nồng độ đã chọn
- Nuôi ủ, xác định số ống dương tính ở 3 nhóm
- Tra bảng Mac Crady→trị số MPN (a)
Tính mật độ:
Số MPN/100ml (MPN/1g) = a x
x d
V V
2 1
Với: a: trị số tra từ bảng Mac Crady
V2: thể tích mẫu sử dụng (thường là 1)
V1: thể tích mẫu theo bảng Mac Crady ở loạt ống đầu tiên (10ml)
d: độ pha loãng ở loạt ống đầu tiên
Key xác định E.coli
Nhuộm Gram
Gram -
Gram +
Hình dạng
Hình que
Hình cầu
Test oxydase
Lên men lactose
Key xác định E.coli
Lên men lactose
Sinh trưởng trên citrate
Sinh indol
Nhận biết E. coli và Coliforms
Laáy 10g (10ml) maãu ñoàng nhaát vaøo 90ml nöôùc muoái sinh lyù, ñöôïc 10-1
Pha loaõng maãu 10-2, 10-3, 10-4…
Chuyeån 1ml dung dòch 10-2, 10-3, 10-4 vaøo 10ml canh BGBL, moãi noàng ñoä 3 oáng laëp laïi, uû 37oC, 36h
XÑ soá oáng (+) ôû moãi ñoä pha loaõng
Choïn oáng (+), caáy sang canh EC, uû 44.0 ±±±± 0.5oC trong 24-48 giôø
Choïn caùc oáng sinh hôi caáy sang Endo Maãu
Coliform
khoâng sinh hôi ñöôïc coi laø aâm tính E. coli
UÛ ôû 37.0 ±±±± 0.5oC trong 24 giôø
Choïn khuaån laïc deït, coù aùnh kim tím, ñöôøng kính khoaûng 1mm ñeå caáy sang TSA hay BHI
Quy trình phaân tích coliform vaø E. coli
UÛ ôû 37.0 ±±±± 0.5oC qua ñeâm
Caáy chuyeån vaøo caùc moâi tröôøng thöû nghieäm sinh hoaù: Canh trypton (1), MRVP (2), Simmon Citrate (1) ñeå thöû nghieäm phaùp IMViC
E. coli coù bieåu hieän sinh hoaù: Indol (+), MR (+), VP (-), Citrate (-). Moät trong soá caùc phaûn öùng treân sai laø khoâng phaûi E.coli
Keát luaän: Phaùt hieän (khoâng phaùt hieän) E.coli/g
Nhận biết E coli và Coliforms
Môi trường Brillant Green Lactose Bile Broth
+
Nhận biết E. coli và Coliforms
Môi trường E.coli broth (EC) – dương tính
+
Nhận biết E. coli và Coliforms
Môi trường Eosin Metyl Bile (EMB) – dương tính (cid:1) Coliform phân hay E.coli giả định
Nhận biết E. coli và Coliforms
Môi trường Eosin
Metyl Bile (EMB) –
dương tính (cid:1) Coliform phân
hay E.coli giả định
Nhận biết E. coli
Phản ứng IMViC
−−−−
+
Đối chứng
Phản ứng Indol dương tính (cid:1) E.coli
Nhận biết E. coli
Methyl red
Phản ứng IMViC Phản ứng methyl red (MR) dương tính (cid:1) E.coli
+
+
−−−−
Đối chứng
Nhận biết E. coli
Thuốc thử VP Thuốc thử VP
Phản ứng IMViC Phản ứng Voges-Proskauer (VP) âm tính (cid:1) E.coli
+
chứng
−−−−Đối
Đối chứng
−−−−
Đối chứng
+
−−−−
Đỏ tươi Đỏ đồng
Nhận biết E. coli
+
Đối chứng +
−−−−
Phản ứng IMViC
Môi trường Simmons Citrate âm tính (cid:1) E.coli
Nấm men và nấm mốc • Thuộc nhóm vsv dị dưỡng, có nhân thật,
rất đa dạng
Nấm Men
•Tế bào đơn tính •Sinh sản theo kiểu nảy chồi
Nấm Mốc •Tế bào dạng sợi •Sinh sản bằng bào tử hay khuẩn ty
Nấm men và nấm mốc
• Nhiệt độ thích hợp 20 – 28oC
• pH thích hợp 2 – 9, pH tối ưu 4 – 6,5
• Thuộc nhóm hiều khí bắt buộc, một số ít
thuộc nhóm vi hiếu khí
• Khi phát triển trong thực phẩm làm đổi lạ, làm hư hỏng, thay đổi màu, tạo mùi cấu trúc thực phẩm, một số loài còn sinh độc tố.
Quy trình phân tích định tính
Đồng nhất mẫu trong SDB thành độ pha loãng 10-1, ủ ở 30oC, 1 – 7 ngày
Cấy canh trường có mốc mọc lên đĩa SDA (Sabouraud Dextrose Agar) , MEA (Malt Extract Agar) hay PDA (Potato Dextrose Agar) , ủ ở 30oC trong 7 ngày.
Kết luận: có/không có nấm mốc
Phân tích tổng nấm men và nấm mốc
Đồng nhất và pha loãng thành các nồng độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 …
Trải 0,1ml mẫu lên đĩa DRBC hoặc DG18, ủ ngửa đĩa ở 25oC, 5-7 ngày
Trải 0,1ml mẫu lên đĩa MEA hoặc PDA, ủ ngửa đĩa ở 30oC, 7 ngày
