Bài giảng Vi sinh thực phẩm: Chương 1

ƯƠ

CH

NG 1

Ị

CÁC PH

NG PHÁP XÁC Đ NH VI Ự

ƯƠ Ậ

Ẩ

SINH V T TRONG TH C PH M

ƯƠ CH NG 1

Ộ Ố ƯƠ

Ị

M T S PH

NG PHÁP XÁC Đ NH

VI SINH V TẬ

ƯỜ

Ấ I. 1. HÓA CH T VÀ MÔI TR

NG PHÂN

TÍCH VI SINH V TẬ

ể ệ ậ ườ Trong phân tích, ki m nghi m vi sinh v t, môi tr ng

ệ ậ ệ ầ c n cho vi c tăng sinh, phân l p, phân bi t, nhân

ề ả ấ ậ ố ị ả gi ng, c y chuy n, b o qu n, đ nh danh vi sinh v t…

ườ ứ ầ ầ ầ Môi tr ề ủ ng c n ch a đ y đ các thành ph n v

ồ ượ ạ ngu n carbon, đ m, khoáng và vi l ng … và có các

ệ ợ đi u ki n lý hóa thích h p ề

ƯỜ

Ấ

Ạ PHÂN LO I MÔI TR

NG NUÔI C Y VSV

ồ ố * Theo ngu n g c

ự T nhiên

ổ ợ T ng h p

ợ ổ Bán t ng h p

ậ ạ * Theo tr ng thái v t lý

ỏ

L ng (Brothe) R nắ

ắ ỏ Bán l ng (bán r n)

ƯỜ

Ấ

Ạ PHÂN LO I MÔI TR

NG NUÔI C Y VSV

ụ * Theo m c đích

ườ ề Môi tr ng ti n tăng sinh

ườ Môi tr ng tăng sinh

ườ ọ ọ Môi tr ng ch n l c

ườ ệ Môi tr ng phân bi t

ườ ử Môi tr ệ ng th nghi m sinh hóa

PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG

ự

• Môi tr ườ ẩ

ng t ị ế ế pha ch – Ch n b nguyên li u: Cân, đong thành ph n ầ ệ – Pha ch : Hòa tan, b sung agar (môi tr ườ ổ ng

ỉ

ụ ụ

0C/30p)

ấ r n)ắ – L cọ – Đi u ch nh pH ề – Phân ph i vào d ng c ố – H p kh trùng (121 ử

• Môi trường đông khô: Được sử dụng phổ biến trong các phòng kiểm

nghiệm vi sinh – Cân lượng môi trường – Bổ sung nước (theo tỷ lệ), hòa tan – Phân phối vào dụng cụ chứa – Hấp khử trùng (1210C/15’)

Note: Thông thường môi trường được pha chế có

giá trị pH thích hợp, không cần phải hiệu chỉnh pH sau khi được pha chế .

ẩ ươ ườ ọ Vi khu n gram d ng trên môi tr ng ch n

ọ l c CAN (Colistan Nalidixic Acid Agar )

ườ ọ S. epidermidis và S. aureus trên môi tr ng ch n

ệ ọ l c – phân bi t Mannitol Salt Agar (MSA)

ườ ể Môi tr ả ng ki m tra kh năng sinh Indol

ườ ườ ả ả Môi tr Môi tr ng ki m tra kh năng lên men Dextrose ng ki m tra kh năng lên men Dextrose ể ể

(Glucose) (Glucose)

Ể

Ỹ Ẫ

Ậ Ấ Ả

Ậ Ẫ

Ự

Ẫ I.2. K THU T L Y M U, V N CHUY N Ả M U VÀ B O QU N M U TH C PH MẨ

Ế

Ạ

Ự

Ẫ

Ấ K HO CH L Y M U TH C PH MẨ ế ầ

ế ố ộ ế ẫ ạ ấ t c n có các y u t M t k ho ch l y m u chi ti sau:

ử

ượ ằ ả ậ c phép n m trong kho ng lân c n gi ớ i

(cid:0) ạ n, c, m, M n: s m u th ố ẫ c: s m u đ ố ẫ c (cid:0) M)

ậ ộ ả ấ

ậ ộ ậ ả h n (m m: kho ng ch p nh n (m t đ vi sinh M; ấ

(cid:0) ườ thông th ng 10 x m M

ề ổ ứ ụ ẩ ố ượ Ví d : Tiêu chu n v t ng s vsv trong sp tr ng đ c

thanh trùng Pasteur: n=5, c=2, m= 5.104, M= 106

CFU/25g

ế ạ ộ K ho ch 2 thu c tính

ỉ Ch nêu ra m

ế ấ ả ẫ N u t t c các m u ẫ (cid:0) m ho c ặ (cid:0) c m u trong n

ử ậ ẫ ấ m u th >m: Ch p nh n lô hàng

ử ế ẫ ẫ ố ừ N u >c m u trong s n m u th >m: t ố ch i lô

hàng

ế ạ ộ K ho ch 3 thu c tính

ặ ả Đ t ra c m và M

ỉ ườ ả ưỡ ủ Ch tiêu “m” th ng ph n ánh ng ng trên c a

GMP

ấ ỉ ớ ạ Ch tiêu “M” đánh d u gi i h n trên (nguy

ể hi m/không ch p nh n.

ế ấ ả ậ ấ t c các m u

N u t ử ằ ậ ẫ (cid:0) m ho c ặ (cid:0) c m u trong n ẫ (cid:0) M: Ch p nh n lô ấ ả

ẫ m u th n m trong kho ng >m và hàng

ế ẫ ả ẫ N u >c m u trong n m u th n m trong kho ng

ố ộ ử ằ ừ ẫ >M: T ch i lô hàng >m và (cid:0) M Ho c có m t m u ặ

ự ế ấ ẫ ạ ọ L a ch n k ho ch l y m u

ố ượ ế ạ ộ K ho ch 2 thu c tính: Đ i t ng vsv quan tâm

ượ ự ẩ không đ c phép có trong th c ph m;

ự ế ế ạ ẩ ộ ộ K ho ch 3 thu c tính: N u cho th c ph m m t

ộ ơ ị ể ấ ị ố ượ s l ng nh t đ nh vsv trong m t đ n v th tích.

KẾ HOẠCH THU MẪU THỰC PHẨM

M u:ẫ

ả

ạ

ể

ề

Ph i mang tính

đ i di n

ờ ệ (nhi u th i đi m, vi trí) ử ụ

ế

ẫ Đ/v m u tp đã bi

t: s d ng que bông vô trùng

ệ

ề ặ

ấ ị

ắ

ứ

ậ

ạ

quét 1 di n tích b m t nh t đ nh or c t lát 23mm) ễ vi sinh v t ngo i lai (ch a

Tránh s t p nhi m ự ạ

ẫ

ằ

ự

ắ

ệ ộ ơ ấ

ẫ

ờ

t đ , n i l y m u,

m u trong các bình b ng nh a có n p vô trùng) Ghi chú m uẫ : th i gian, nhi ậ

ươ

ể

ệ

ng ti n v n chuy n, …

ph

ố ượ

ầ

S l

ẫ ng m u c n l yấ 1

ể

ấ

ẫ

ờ

Th i đi m l y m u

ể

ơ ấ N i l y m uẫ

ỉ Ch tiêu VSV ki m tra

Qui mô nhỏ

Qui mô v aừ

Qui mô l n ớ

ị

CSGM trâu bò

1 3 4 6

ướ

VKHK TS Enterobacteriaceae Salmonella

7 12

ậ

ướ c khi Sau khi khám th t, tr ế ị ụ ơ đ a thân th t đi tiêu th /s ch ẫ ạ ặ ho c tr c khi làm l nh, m u ượ c thu th p trong vòng 30 đ phút.

ướ

ị

c khi ụ ơ

CSGM l nợ

1 3 4 6

ướ

VKHK TS Enterobacteriaceae Salmonella

7 12

ậ

ế ẫ ạ c khi làm l nh, m u c thu th p trong vòng 30

ị Sau khi khám th t, tr đ a thân th t đi tiêu th /s ch ặ ho c tr ượ đ phút.

ướ

ị

c khi ụ ơ

1 3 4 6

ướ

CSGM ừ c u, dê, chó, ng aự

VKHK TS Enterobacteriaceae Salmonella

7 12

ậ

ế ẫ ạ c khi làm l nh, m u c thu th p trong vòng 30

ị Sau khi khám th t, tr đ a thân th t đi tiêu th /s ch ặ ho c tr ượ đ phút.

ươ ẫ Ph ị ấ ng pháp l y m u th t

ố ượ

ầ

S l

ẫ ng m u c n l yấ 1

ể

ấ

ẫ

ờ

Th i đi m l y m u

ể

ơ ấ N i l y m uẫ

ỉ Ch tiêu VSV ki m tra

Qui mô nhỏ

Qui mô v aừ

Qui mô l n ớ

CSGM gia c mầ 2

1 3

7 12

4 6

VKHK TS Enterobacteriaceae Salmonella Campylobacter

ị ư Sau khi đ a thân th t đi làm ờ ả ấ ạ (c trong l nh ít nh t 1,5 gi ặ ạ kho làm l nh chúng ho c sau ị ạ i trên dây) khi treo thân th t l ư ướ ặ c khi đ a đi tiêu ho c tr ế ụ ơ th /s ch . ọ

ầ ế

ạ

ơ ở C s pha ế ơ ọ l c/s ch

ặ ậ

ẫ

1 3

7 12

ị

4 6

ế ặ

VKHK TS E.coli Salmonella VSV khác khi yêu c uầ

ắ ươ Sau khi l c x ng, b t đ u làm l nh ho c đông l nh ti p theo, thu th p m u là các ế ị ơ ọ mi ng th t pha l c, th t s ch ướ ị ho c th t xay tr c khi bao gói ặ chân không ho c bao gói kín.

ể

ả

ạ ờ ẫ ấ

ặ

ạ ấ Cho 1 kho l nh l y ị ẫ ạ i 5 5 đ n v m u t ị v trí.

ư ạ VKHK a l nh Enterobacteriaceae Salmonella

ơ ở ả C s b o ả qu n (Kho l nh)ạ

ạ ộ ạ

ữ

ể

ạ Trong kho l nh, t i th i đi m ị ẫ ả b o qu n m u. M u l y là th t ạ ạ i 5 l nh ho c l nh đông t đi m: 4 góc và 1 gi a. G p l i là 1 m u.ẫ

ả ạ ẩ : Các s n ph m l nh đông

ồ Lau c n phía ngoài PE

ặ Đ t vào khay tráng men đã vô trùng

ư ể ồ ự nhiên (T

Đ a vào bu ng vô trùng đ rã đông t phòng); 250C (18h); 450C (15 phút)

ẫ ồ ộ : M u đ h p

ế ể ạ ộ ồ ở ị Ki m tra h p có b ph ng, bi n d ng, h …

ằ ồ Lau chùi b ng c n bên ngoài

ể ể ư Đ a vào phòng vô trùng đ ki m

ủ Các sp bao bì, nylon, th y tinh …

ủ ể ộ Ki m tra đ kín c a bao bì

ồ Lau c n phía ngoài

ể ể ư Đ a vào phòng vô trùng đ ki m

Ậ

Ả

Ẩ

Ự

Ẩ

ậ

Ể V N CHUY N VÀ B O QU N M U TH C PH M ể :

Trong quá trình v n chuy n

0C cho đ n khi phân

ả ượ ả ở ả ế ẫ M u ph i đ c b o qu n 20

tích (040C)

ả ẫ ệ

ươ ậ M u ph i xét nghi m trong vòng 36h (6h) Vi sinh v t có th b t n th ể ị ổ ng nên trong

ườ ầ ạ ợ ề nhi u tr ng h p c n giai đo n tăng sinh.

Ị Ẫ

Ự

Ẩ

CHU N B M U TH C PH M

ả ẫ ướ Gi i đông m u tr c khi phân tích

. Đk vô trùng (250C trong 18h, 450C trong 15

ế ợ ắ ộ ả ể ẫ ố ứ phút k t h p l c bình ch a m u đ tăng t c đ gi i

ấ ệ ộ ẫ ồ đông và đ ng nh t nhi t đ trong m u)

ẫ ấ ồ Đ ng nh t m u

ẫ ắ ẫ ỏ ắ ỹ . Đk vô trùng, m u l ng (l c k ), m u r n

(stomacher)

Cân m uẫ

ố . Đk vô trùng, sai s cho phép ± 0,1g

ị ị ượ . Đ nh tính: 10g; đ nh l ng: 25g

Stomacher

ặ SP đ c hoàn toàn :

ố ứ nghi n nát trong c i s vô

→ẫ 10g(25g) m u → ứ ẵ ề Erlen có ch a s n bi th y tinh và 90ml

ấ

ố ể ấ ướ ị ặ ầ ẫ c mu i sinh lý hút ph n d ch đ c y m u,

ủ trùng ướ (225ml) n c c t vô trùng ho c n → ắ ề ắ l c đ u, l ng c n ộ đ pha loãng 10 → ặ 1 (102)

ừ ặ ừ ỏ : Các sp v a đ c v a l ng

→ ẫ ả ướ c)

ề

ắ ặ ỏ c i nh vô → ề Erlen ể ắ ề l c đ u, đ l ng c n

ủ ể ấ ầ ố ẫ Cân 100g m u (c cái l n n → ị trùng, nghi n cân 10g (d ch nghi n) → (90ml NMSL + bi th y tinh) → ẫ ị hút ph n d ch đ c y m u.

ỏ : Sp l ng hoàn toàn

ặ

ử ụ ứ ế ễ ẫ ự S d ng tr c ti p m u ho c pha loãng tùy ẩ ộ theo m c đ nhi m b n.

ỹ

ẫ ố ướ ấ L c k bình ch a m u, hút 10ml m u cho vào ệ t c mu i sinh lý ti

ộ ắ ứ ẫ ướ ẵ Erlen có s n 90ml n c c t hay n trùng (đ pha loãng 10 1)

ố ơ ướ

ị ướ ế ầ ố Dung d ch pha loãng: T t h n nên dùng n 0,1%; n c pepton c mu i sinh lý (0,85%), trong buffer n u c n.

Ử

Ệ I. 3. TH NGHI M SINH HÓA

ậ

ỹ

ậ Trong k thu t phân tích vi sinh v t

ị

Đ nh danh vi sinh v t

ự ậ : d a vào

ể

ặ

Các đ c đi m v

ề ki u hình

ư

ượ

ự

ở

đ

ệ c th c hi n b i các

ủ

Các p/ sinh hóa ậ ch ng vi sinh v t

ư

ể ự

ệ

Các p/

sinh hóa có th th c hi n theo 3 cách

:

ố

ề Truy n th ng

B KITộ

ế ị ự ộ

Thi

t b t

đ ng

Ố

Ề

TRUY N TH NG

ử

ệ

ả Th nghi m kh năng lên men

ườ ưở ể ở ồ ộ ng theo con đ ng

•Xác đ nh kh năng s d ng m t ngu n carbon ị ử ụ ả ấ ị nh t đ nh b i vsv đ tăng tr lên men

ạ ả ơ

2) t o thành làm gi m ườ

→ ổ ượ •Sp (r pH môi tr ữ u, acid h u c , CO ườ thay đ i màu môi tr ng ng

ượ ẩ ằ ố ổ c b y b ng ng durham làm n i

ạ • CO2 t o ra đ ng.ố

ử

ệ

ả Th nghi m kh năng lên men

ử ụ ỏ ng s d ng: Phenol Red broth base: đ (pH

• Môi tr → 7,4) ườ vàng (pH 6,8)

ể ị

ộ ộ ườ ng ru t): E.coli, Klebsiella,

• Dùng đ đ nh danh các vsv thu c h ọ Enterobacteriacea (vk đ Staphylococcus (+); Corynebacterium ()

ử ệ ả Th nghi m kh năng oxy hóa – lên men

(TN Hugh –Leifson)

ị ấ ồ

ườ ơ ng c n cung c p ngu n ng là

ượ •Xác đ nh vi sinh v t d d ầ ậ ị ưỡ ấ ữ ướ ạ i d ng ch t h u c , th carbon d ử ụ carbonhydrate. Vsv s d ng CBH này làm ngu n ườ năng l ồ ấ ng lên men hay hô h p ng theo con đ

ườ ườ ng t o môi tr ng có tính

• Quá trình lên men th ạ ấ ơ acid cao h n quá trình hô h p.

ườ ị ỉ ng Hugh Leifson có ch th pH là

• Môi tr bromothymol blue (pH = 6.0: vàng; pH= 7,6: xanh d ng)

ươ

ử ệ •Th nghi m Hugh – Leifson

ố ệ ượ ủ c ph

ố ườ ề ặ ỏ ứ 2 ng nghi m ch a mt hughLeifson; 1 ng đ ng. paraffin l ng vô trùng trên b m t môi tr

ấ ủ C y đâm sâu vsv, 2448h trong cùng đk

•Sau p/ :ư

ề ừ ị ề ặ trên b m t và

ủ ầ Lên men: c 2 ng b oxh đ u t ả ố ph n sâu c a mt

ấ ố ị

ủ ế ố ở ị ố ề ặ ề ừ trên b m t xu ng ầ ỉ ph n

Hô h p: ng k khí b oxh đ u t ị ầ ph n sâu c a mt; ng hi u khí ch b acid hóa đáy

ử ệ Th nghi m HughLeifson

ử

ệ

Th nghi m Bile Esculin

ệ ậ ự ủ ả

• Phân bi t vi sinh v t d a trên kh năng th y phân ế liên k t glucoside trong esculin thành esculentin và glucose

ư ớ ố ắ ạ ứ ợ v i mu i s t t o ph c h p màu nâu

• Esculentin p/ hay đen

• MT: Aesculin Medium hay Edwards

ứ ổ • Sau p/ : hóa nâu hay đen (+); ko đ i màu ()

ử ệ Th nghi m Bile Escusin

ử ệ ế ả ưỡ Th nghi m kh năng bi n d ng citrate

ượ ử ụ ấ ồ c s d ng làm ngu n carbon duy nh t

• Citrate đ ủ c a vsv.

ế ưỡ ổ ỳ ườ • Sp bi n d ng citrate thay đ i tu vào pH môi tr ng

ề pH ki m: acetate và formate

pH trung tính: acetate và CO2

pH acid: acetoin và lactate

ứ ấ ỉ

ụ

ị pH trung tính có màu xanh l c, pH ươ ề •Mt Simmons citrate ch a ch t ch th màu ở Bromothymol blue ki m có màu xanh d ng (pH>7,6).

ư ụ ươ • Sau p/ : mt có màu xanh l c (); xanh d ng (+)

ườ ấ ỉ ị ng Simmons citrate agar có ch t ch th màu

Môi tr bromothymol blue.

ả ứ ụ ươ ng (+) Sau ph n ng: Xanh l c (); xanh d

ử

ế

ệ

ả

ưỡ

Th nghi m kh năng bi n d

ng malonate

ườ ứ Môi tr ng manolate broth có ch a bromothymol bue

ư ụ ươ Sau p/ : Xanh l c (); xanh d ng (+)

ử ệ Th nghi m catalase

ệ ậ ị ế ậ • Phân bi t vi sinh v t hi u khí và vi sinh v t k khí

ả

• VSV hi u khí có enzyme catalase có kh năng phân gi ế i Hả 2O2 H→ 2O và O2

• Thí nghi m: ệ

→ ữ ạ ọ ố l nh) ỏ nh 1 gi t sinh kh i vsv

t Họ lên 1 gi H2O2 30% (gi 2O2

ủ ọ Bacillus, Micrococcus, S i b t (+):

Staphylococcus

ấ ọ ệ Không xu t hi n b t khí (): Clostridium,

Streptococcus

ử

ệ Th nghi m catalase

ử ệ Th nghi m decarboxylase

ị ạ ườ ạ ẩ ộ

ự ạ

→ ư ả • Phân lo i và đ nh danh các lo i vi khu n đ ng ru t ả ứ d a trên lo i enzyme decarboxylase xúc tác ph n ng ườ ng phân gi ặ i 1 a.a đ c tr ng tăng pH môi tr CO→

ạ • Có 3 lo i enzyme: ODC, LDC và ADC (ADH)

ườ ứ ỉ

• Môi tr ị ng Decarboxylase basal medium ch a ch th ạ bromocrezol purple và 1 lo i a.a (ornithin, lysin, arginin)

ư • Sau p/ : Vàng (), tím (+)

ử

ệ

Th nghi m decarboxylase

ử ệ Th nghi m coagulase

ị t

ả ầ

ế ụ ế ươ ạ •Đ nh danh Staphylococcus, loài này có kh năng ti ế ế các thành ph n huy t enzyme coagulase làm k t t ố ươ ng t o kh i đông huy t t t ng

ệ ượ ế ươ ự ệ ớ c th c hi n v i huy t t ỏ ng th hay

ử ườ ạ •Th nghi m đ ng i d ng đông khô

ệ ế ố • Ti n hành trên phi n kính/ ng nghi m ế

ư ả •Sau p/ (kho ng 4 phút)

ư ệ ế ấ Xu t hi n đám ng ng k t: +

ư ư ế Ko có p/ ng ng k t:

ử

ệ

Th nghi m Coagulase

ử ệ Th nghi m urease

ủ ủ ố ố

ị ị ệ ệ ạ ạ Proteus Proteus •Xác đ nh kh năng t o enzyme urease c a 1 s vsv, Xác đ nh kh năng t o enzyme urease c a 1 s vsv, ặ ặ đ c bi đ c bi ả ả t là nhóm t là nhóm

3 và

ả i ure thành NH

→ tăng pH môi tr ư phân gi •Enzyme này xúc tác p/ ườ ng CO2

ườ ỏ

ng l ng Rustigian Stuart’s Urea broth hay mt ỉ ị ỏ ứ ặ •Môi tr đ c Christensen Urea ch a ch th đ phenol

ư ổ ỏ • Sau p/ : không đ i màu (màu vàng cam): ; đ tím:+

ử

ệ Th nghi m urease

++++

ử ệ Th nghi m genlatinase

ế ả ả t enzyme genlatinase phân gi i

• Đánh giá kh năng ti genlatine thành polypeptide và a.a

ườ ượ ổ ấ ng nuôi c y vsv đ

ấ

ế ủ • Môi tr c b sung gelnatine ổ ặ ho c nuôi c y vsv trên mt gelatine có b sung 510ml trichloacetic acid TCA là k t t a gelatine.

• Sau p/ :ứ

Ố ệ ạ ả ị ng nghi m th ch nghiêng b tan ch y: +

ổ ạ Không thay đ i tr ng thái:

ủ * Ch ng vsv: Aeromonas hydrophyla (+); E.coli ()

ử ệ Th nghi m gelatinase

ử ệ ả Th nghi m kh năng sinh H

2S

ị ỳ i các a.a ch a l u hu nh

ả ứ ư H→ 2S nh enzyme ờ

•Xác đ nh kh năng phân gi ả (cystein, cystin, methionin) desulfuahydrase

ạ ế ủ ỉ ị

ườ ắ ớ • H2S t o k t t a màu đen v i ch th sulfide (Fe II, Fe III, ứ amonium sulfate s t …) ch a trong môi tr n.

ườ ử ệ • Môi tr ng th nghi m: KIA, TSI, SIM, PIA, BSA

ệ ệ ấ ấ ấ

• Sau nuôi c y: Xu t hi n màu đen (+), ko xu t hi n màu ()

• VSV: E.coli (+), Klebsiella (), Proteus mirabilis ()

Thöû nghieäm khaû naêng sinh H2S

ử ệ ả Th nghi m kh năng sinh indol

ị ủ ể ả

•Xác đ nh kh năng chuy n hóa các sp trung gian c a quá trình oxy hóa thành indol.

ượ ờ ứ ớ ố ị c xác đ nh nh p/

v i thu c p ứ ạ ỏ • Indol đ dimethylaminobanzaldehide t o ph c quinon co màu đ

ướ ử ố ệ c trypton, MIU, SIM; thu c th là

• MT th nghi m: n ử Kovacs và Erlich

ư ề ặ ệ ớ ấ ỏ : xu t hi n l p màu đ trên b m t mt (+), màu

• Sau p/ vàng ()

• VSV: E.coli (+), Klebsiella (), Serratia marcescen (), Proteus rettgeri (+)

ử

ệ

ả Th nghi m kh năng sinh idol

ử

ệ

ả Th nghi m kh năng sinh idol

ử ệ Th nghi m KIA, TSI

ườ ờ ể ử ệ ồ ng KIA, TSI s d ng đ ng th i đ th nghi m

ử ụ

2S.

•Môi tr ử ụ ồ ả kh năng s d ng các ngu n carbon khác nhau ả (glucose và lactose) và kh năng sinh H

ứ ấ ỉ ị

•KIA ch a 1%lactose, 0,1% glucose, ch t ch th Phenol red; TSI có thêm 1% succrose

•Trên mt KIA:

ề ặ ầ ỏ glucose (+): B m t có màu đ , ph n sâu màu vàng

ả ề ặ ề ầ

glucose, lactose: c b m t và ph n sâu đ u có màu vàng

ạ ế ứ H2S: có màu đen trong th ch và có v t n t

sS nh Naờ

ườ ng và

2SO3 trong tp môi tr ắ

2S nh Amonium citrat s t.

ậ ờ ử Th nghi m H ế nh n bi ệ t H

ử

ệ Th nghi m KIA, TSI

ử ử ệ Th nghi m nitrase (kh nitrate)

ử ụ ể ả

• Đánh giá kh năng s d ng enzyme nitratase đ kh ử nitrate thành nitrite và các sp khác

ạ ẽ ượ ế ờ ậ c nh n bi

• Nitrit t o thành s đ ớ ả ứ t nh ph n ng v i sulphanilamide và Nnapthylenediamide hydrochloride ở ấ ồ ứ pH acid cho ph c ch t màu h ng

• Mt nitrate broth, sodium nitrate

ư ử ố : khi thêm thu c th vào và acid hóa môi

• Sau p/ ngườ tr

ồ Màu h ng: +

ấ ồ ệ Không xu t hi n màu h ng:

ử ệ Th nghi m nitratase

ử ệ Th nghi m oxidase

ự ệ ủ ệ ị

•Nh m xác đ nh s hi n di n c a h enzyme oxidase ệ ở ằ vsv

ạ ượ ử ệ ố

ự ệ ủ

→ ệ indolphenol có màu xanh

• Ho t tính oxidase đ ờ c phát hi n nh thu c th p ế phenylenediamin, n u có s hi n di n c a enzyme, ử ị thu c th b oxy hóa d ố ngươ

ườ ng th nghi m: nutrient aga; l y 1 ít sinh

ấ ố ử ẩ

• Môi tr ử ệ ấ ọ ấ ố ặ kh i đ t trên 1 t m gi y l c có t m thu c th p phenylenediamin

ử ệ ươ ổ • Sau th nghi m: Xanh d ng (+); không đ i màu ()

ử

ệ Th nghi m oxidase

ử ệ Th nghi m ONPG

ị βgalactosidase tham gia

ở •Xác đ nh ho t tính enzyme ạ vào quá trình lên men lactose vsv.

ử ườ ệ ng th nghi m: ONPG broth ch a o

ứ ạ

• Môi tr nitrophenyl – D – galactopyranoside, sp t o thành o nitrophenol có màu vàng

• VSV: Serratia marcescens (+), Proteus rettgeri ()

ư ổ • Sau p/ : màu vàng (+); ko đ i màu ()

ử

ệ Th nghi m ONPG

ử ệ Th nghi m MR (Methyl Red)

ệ ự t vsv d a vào s khác bi

ệ t trong quá trình ừ ự s lên men

ế ố ổ

ử ổ ử ố • Phân bi ự ạ t o và duy trì các sp có tính acid t ạ glucose. VSV lên men glucose t o và duy trì các sp ế có tính acid làm đ i màu thu c th . N u sp acid ti p →ụ t c các sp trung tính: không đ i màu thu c th

ấ ỉ ị • Ch t ch th màu pH mt là methyl red

ử ệ ể ỏ

ổ • Sau th nghi m: mt chuy n màu đ (+), mt không đ i màu ()

• VSV: Proteus rettgeri (+), Serratia marcescens ()

ử

ệ

Th nghi m MR (Methyl Red)

_ + + +

ử

ệ

Th nghi m VP (VogesProskauer

)

ử ệ Th nghi m VP (Vosges Proskauer)

ệ ộ ng ru t

ượ ạ c t o ra

• Phân bi ọ ườ t các loài vk trong h đ ự ự Enterobacteriaceae, d a vào s oxh acetoin đ ừ t 2,3 butadiol thành diacetyl.

ự ị c xác đ nh d a vào p/

ượ ủ ớ ư ế ợ k t h p v i ỏ ứ ạ • Diacetyl đ guanidine c a pepton t o ph c màu đ

• MTTN: MRVP

ử ố •Thu c th : Barritt, Koblentz ch a ứ αnaphton và KOH

ư ỏ ổ • Sau p/ : màu đ (+), ko thay đ i màu ()

• VSV: E. coli (), Enterobacter cloacea (+)

ử

ệ Th nghi m cAMP

Cyclic adenosine monophosphate

(cAMP, cyclic AMP or 3'5'cyclic adenosine monophosphate)

ệ Phân bi t các nhóm Streptococcus.

ự ư ủ ố ệ CAMP th c hi n gi a nhân t

ữ ế t ra và

ạ CAMP c a βhemolysin do ủ β

ế ầ P/ Streptococcus nhóm B ti Staphylococcus aureus làm tăng ho t tính c a ỡ ồ hemolysin gây phá v h ng c u (tan huy t)

ệ ử ờ staphylococcus aureus

ủ ườ ệ ấ ng c y vuông góc cách

• Th nghi m đ ng th i ch ng ồ ử ủ và ch ng th nghi m, 2 đ nhau 2mm

ử

ệ Th nghi m CAMP

Mttn: Tryptose Blood Agar Base

ế : có vùng tan huy t (+), không có vùng tan

• Sau p/ ư huy t ()ế

• VSV: Strep. agalactiar (), Strep nhóm B (+)

ử

ệ

ộ

Th nghi m tính di đ ng

Ố

Ề

KHÔNG TRUY N TH NG

ọ 1. Ph

ươ ng pháp phát quang sinh h c ATP trong giám ệ sát v sinh

ươ 2. Ph ng pháp Elisa (Enzymelinked

ImmunoSorbent Assay)

ươ ử 3. Ph ng pháp lai phân t (Hybridization)

ươ 4. Ph ng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

ươ ộ ố 5. M t s ph ử ng pháp th nhanh khác

ậ ộ ậ ỹ K thu t phân tách và tăng m t đ

ậ ỹ K thu t màng petri (petrifilm)

ỹ ậ K thu t Redigel

ỹ ệ

ở ậ ộ ẫ K thu t đ d n đi n, tr kháng (conductance/impedance)

ượ KT đo vi l ng calorie (microcalorimetry)

ạ ứ KT đo m c phóng x

ọ 1. Ph

ươ ng pháp phát quang sinh h c ATP trong giám ệ sát v sinh

ử ấ ả ế ố ATP có m t trong t bào s ng,

ặ t c các t → nhận biết các chất sống tồn ệ

Phân t ự s phát hi n ATP tại.

- ATP được phát hiện nhờ lượng ánh sáng phát ra

thông qua sự kết hợp với 1 enzyme luciferase nhờ một máy đo ánh sáng

- Ưu điểm: nhạy (1pg ATP = 10-12g), nhanh (vài phút)

- Nhược điểm: đắt tiền, hóa chất ổn định sự phát sáng, cồng kềnh (đã có sự cải tiến để mang đi được)

Luciferase + Luciferin + ATP (cid:0)

LuciferaseLuciferin AMP + PPi

Oxyluciferin + AMP + CO2 + hv

LuciferaseLuciferin AMP + O2 (cid:0) (phát quang)

ả ứ ế ơ C ch ph n ng

ẹ ề ụ ụ D ng c qu t b m tặ

Máy đo sáng

ẹ ề ặ ụ ụ D ng c qu t b m t Clean Trace

ươ 2. Ph ng pháp Elisa (Enzymelinked

ImmunoSorbent Assay)

PP elisa

Nguyên t c: S d ng ắ ữ ế

ẽ ượ ẫ

ể ơ ủ ph lên kháng th đ n dòng kháng nguyên m c ụ ữ ạ l i c gi ể ứ ấ ề ặ ế ế

ư ắ ử ụ ế ngoài nh ng đĩa gi ng. N u có tiêu trong m u, kháng nguyên này s đ ổ trên b m t gi ng. N u b sung kháng th th c p có g n enzyme nh horseradish peroxidase….

ử

3. Lai phân t

(Hybridization)

ạ

ự ế

ạ

ệ ộ

ả

ộ ụ ộ

ệ ộ ộ

ự

ệ ộ ừ ừ

t

t đ t ơ

ủ

Nguyên t c:ắ d a vào s bi n tính tách m ch ự ử ủ t đ nóng ch y Tm i nhi c a phân t DNA t ơ ạ thành 2 m ch đ n (pp đo đ đ c) N u gi m nhi ả ế t đ đ t ng t: không có s tái ở ạ ắ ặ i b t c p tr l N u taế ả gi m nhi ạ ặ c p c a các m ch đ n DNA:

ắ ự thì có s tái b t laiử

các phân t

ể

ặ

ử

ủ Đ c đi m c a lai phân t

ỉ ả

ự

ắ ặ ệ ố s tái b t c p ch x y ra ổ

ặ ữ

ự

ệ Đ c hi u tuy t đ i: gi a hai trình t

hoàn toàn b sung

ẫ

b sung có th là DNA, RNA d n

ế

ể ử

lai DNADNA,

ự ổ Các trình t đ n hình thành các phân t DNARNA, RNARNA

Ứ

ụ

ậ

ng d ng lai phân t

ệ ử ể đ phát hi n vi sinh v t ẩ ự trong th c ph m? ộ ố

ượ

ậ ng vi sinh v t và đ c t

ẫ

ị ườ

ng đã

ộ

Đ nh l ị S d ng m u dò (probes), trên th tr ử ụ có các b kit (clostridium botulinum – Gene trak; Escherichia coli – Genetrak; staphylococcus aureus – AccuProbe; …)

Southern blot method

Dot & slot bot method

ƯƠ

NG PHÁP PCR

4. PH (Polymerase chain reaction)

ươ

ể ổ ế ợ ạ ầ

ủ ả ng b n sao c a khuôn này thành hàng tri u b n

ự

ộ

ộ ặ ả ờ

ồ (Karl Mullis và c ng s , ệ ạ ặ

Ph ự ng pháp PCR dùng đ t ng h p DNA d a ố trên khuôn DNA ban đ u, khuy ch đ i, nhân s ệ ượ l sao nh enzyme polymerase và m t c p m i (prime) đ c hi u cho đo n DNA này 1985)

ổ ươ ng pháp PCR cho phép t ng h p r t nhanh

ừ

ợ ấ ệ t. Ðây là ệ ươ ệ ậ

ộ ố ượ ủ ộ

ng pháp hi n đ i và thu n ti n cho vi c xác ự ng vi ậ ớ ộ Ph ạ và chính xác t ng đo n DNA riêng bi ệ ạ ph ặ ủ ị đ nh s có m t c a m t gen c a m t đ i t sinh v t v i đ chính xác cao.

ệ ượ ể

ệ ầ ạ ệ ế ệ ộ

ẩ ẩ ử ụ c s d ng đ phát hi n, t o Hi n nay pp PCR đ ệ đ t bi n gen, ch n đoán b nh, phát hi n m m b nh ự có trong th c ph m …

ề ả ứ ỳ ặ ạ ố ế i n i ti p.

ỳ ồ ướ : c

ơ ạ ạ : M ch DNA tách thành m ch đ n (94

0C,

ồ ắ ặ ạ ớ

ạ ộ ổ

ợ

0C, 30s – vài phút) ề ầ ướ ặ ạ c l p l ả 6 b n sao

i nhi u l n, sau 3040 chu

Ph n ng PCR g m nhi u chu k l p l ồ ỗ M i chu k g m 3 b • Bi n tính ế 950C, 30s) • Lai: Các m i b t c p v i m ch khuôn (4070 3060s) • Kéo dài: Enzyme polymerase ho t đ ng, t ng h p DNA (72 ỳ Chu k 3 b ỳ ẽ ạ k s t o ra 10

ả ứ ượ ộ

ẩ

ướ ở Sau ph n ng PCR, DNA đ c nhu m b i ethidium ệ bromide, quan sát qua đi n di s n ph m PCR trong gel agarose và quan sat d ả i tia UV