Chương VII ĐẠI CƯƠNG VỀ SẮC KÝ

Chia sẻ: Nguyenthanh Binh | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:19

Thêm vào BST

Báo xấu

1.186
lượt xem 323
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Phương pháp sắc ký được phát triển vào năm 1903 do nhà thực vật hoc người Nga Michael C.Txvet.Ông thực sự là người đầu tiên có công tìm ra phương pháp, giải quyết vấn đề tách các chất có tính chất giống nhau theo một cơ chế độc đáo, hoàn toàn khác với phương pháp tách đã từng có trước đây, tuy nhiên phát hiện này đã bị lãng quên nhiều năm.

Chủ đề:

Bình luận(1) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Chương VII ĐẠI CƯƠNG VỀ SẮC KÝ

Chương VII ĐẠI CƯƠNG VỀ SẮC KÝ Phần I: CƠ SỞ LÝ THUYẾT VÀI NÉT LỊCH SỬ: I. Phương pháp sắc ký được phát triển vào năm 1903 do nhà th ực vật hoc người Nga Michael C.Txvet.Ông thực sự là người đầu tiên có công tìm ra phương pháp, giải quyết vấn đề tách các chất có tính chất giống nhau theo một cơ chế độc đáo, hoàn toàn khác với phương pháp tách đã từng có trước đây, tuy nhiên phát hiện này đã bị lãng quên nhiều năm. Năm 1941, Martin và Synge đã phát triển sắc ký phân b ố trên giấy và đưa ra lý thuyết đĩa để giải thích các quá trình sắc ký, các tác gi ả đã ứng dụng để tách các ancaloit từ các cây thuốc phục vụ cho chế tạo dược phẩm. Do có công trong việc phát triển lý thuyết của phương pháp cho nên năm 1952 hai ông được nhận giải thưởng Nobel về hoá học. Cũng từ năm 1952 những máy sắc ký mới ra đời tỏ ra có ưu th ế do có hiệu quả tách rất cao. Cột mao quản và các detectơ sau này được cải tiến tăng độ phân giải và độ nhạy của phương pháp người ta có thể phân tích được các chất có hàm lượng nhỏ cở ppm và ppb. Từ đây phương pháp được phát triển nhanh, ứng dụng được nhiều trong thực tế. Về sắc ký lỏng một kỹ thuật mới được phát hiện từ năm 1970 làm tăng hiệu quả tách đó là sắc ký lỏng hiệu năng cao (high performance lipuid chromatography- HPLC): Chất nhồi cột được cải tiến, máy tính và thiết bị vào bổ trợ được đưa vào, tăng cường khả năng của phương pháp. Ngày nay kỹ thuật ghép nối giữa sắc ký và các ph ương pháp khác được áp dụng. Đó là kỹ thuật ghép nối giữa sắc ký và kh ối phổ ( GC-MS, GC-MS) sắc ký và cộng hưởng hạt nhân, sắc ký đa chiều, s ắc ký đi ện mao quản(CEC)... Phương pháp có độ chính xác và độ nh ạy rất cao, phân tích được nhiều đối tượng phức tạp hơn. PHÂN LOẠI – NGUYÊN TẮC: II. 1) Định nghĩa: Sắc ký là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục các cấu tử ch ất phân tích trên hai pha: một pha thường đứng yên có khả năng hấp thụ chất phân tích gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển qua pha tĩnh gọi lạ pha động; do các cấu tử chất phân tích có ái lực khác nhau v ới pha tĩnh, chúng di chuy ển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau. 2) Phân loại các phương pháp tách sắc ký 2.1) Phân loại theo hệ pha Phương pháp đầu tiên được nhiều người quan tâm, đây là phương pháp phân loại đơn giản theo hệ pha tức là ch ất phân tích phân b ố gi ữa hai pha là gì? Sơ đồ phân loại các phương pháp sắc ký 158
hệ pha Cơ chế 2.2) Phân loại theo cơ chế tách: a) sắc ký hấp thụ: Sắc khí hấp thụ là phương pháp dựa trên cơ sở phân bố ch ất phân tích giữa pha tĩnh và pha động nhờ tương tác phân tử thông qua các trung tâm hấp thụ. Pha tĩnh là các chất rắn hoặc lỏng có di ện tích b ề m ặt l ớn, bền vững về mặt hoá học. Chúng hấp thụ chất phân tích trên bề mặt của chúng ở các mức độ khác nhau khi cho pha động chứa chất phân tích ti ếp xúa với chúng. Tuỳ thuộc lực liên kết giữa pha tĩnh và t ừng c ấu t ử ch ất phân tích có trong pha động, khi cho pha động đi qua pha tĩnh chúng s ẽ di chuyển với tốc độ khác nhau. b) Sắc ký phân bố lỏng - lỏng Sự phân biệt giữa sắc ký phân bố lỏng-lỏng và sự phân bố thông thường là ở chỗ sắc ký phân bố lỏng - lỏng còn được gọi là sắc ký chiết, pha tĩnh là chất lỏng pha động cũng là ch ất lỏng, sự phân b ố ch ất phân tích giữa hai pha lỏng giống như quá trình chiết, còn sự phân bố nói chung là s ự phân chia chất phân tích vào hai pha không cần xét tới lỏng hay rắn. Điểm khác nhau cơ bản giữa sắc ký phân bố lỏng - lỏng và sắc ký hấp phụ là ở chỗ: sắc ký phân bố lỏng- lỏng có đường đẳng nhiệt tuy ến tính ở khoảng nhiệt độ lớn, phương pháp có độ nhạy cao nhưng có nhược điểm là pha tĩnh không được bền vững, hiện tương trôi mất pha tĩnh làm cho độ lặp lại bị giảm. c) Sắc ký ion ( trao đổi ion) Pha tĩnh thường là pha rắn có khả năng trao đổi ion của nó với các chất phân tích trong pha động.Chất có khả năng trao đổi cation g ọi là cationit, còn chất có khả năng trao đổi anion gọi lá anionit. L ực liên k ết ch ủ 159
yếu giữa chất phân tích và pha tĩnh chủ yếu là liên kết tĩnh điện , ph ụ thuộc nhiều vào điện tích của ion chất phân tích, pH của dung dịch và bán kýnh hidrat hoá của các ion chất phân tích. Ví dụ: ph ản ứng trao đổi ion gi ữa cationit acid mạnh và Ca2+ có thể viết như sau: 2R-SO 3H + 2+ + Ca = (R-SO3)Ca + 2H phản ứng của anionit bazơ mạnh với Cl- : R-N(CH3)3OH + Cl- = R-N(CH3)3Cl + OH- d) Sắc ký rây phân tử (sắc ký loại cở) Pha tĩnh là các chất rắn có diện tích bề mặt lớn, xốp, có nh ững đường đi trong lòng chất rắn, còn gọi là mao quản có kých thước cở phân tử. Các phân tử chất phân tích có thể thấm vào ch ất đó ở m ức đ ộ khác nhau tuỳ theo kých thước của chúng. Các chất phân tích có kých th ước l ớn không thể đi vào sâu vào pha tĩnh được, sẽ bị rửa giải nhanh còn các phân t ử ch ất phân tích có kých thước nhỏ phân bố sâu vào pha tĩnh sẽ bị rửa giải chậm. Thứ tự rửa giải là các chất có kich thước nhỏ đi ra sau và ngược lại. Thời gian lưu của các chất tỷ lệ nghịch với kých thước phân tử của chúng. Tuy nhiên chất phân tích có thể có tương tác khác với pha tĩnh. Nh ư v ậy m ột phép sắc ký có thể tách theo một hay nhiều cơ chế khác nhau mà chúng ta không xét ở đây. 2.3) Phân loại theo cách hình thành sắc đồ a) Phân tích tiền lưu Các cấu tử A, B, C có ái lực với pha tĩnh là A < B< C. Cho h ỗn h ợp chất phân tích liên tục đi qua cột, chất phân tích có ái lực v ới pha tĩnh th ấp nhất đi trước, tiếp theo là chất có ái lực yếu hơn. Tuy nhiên do chúng ta cho liên tục chất phân tích vào nên đi sau A là A + B và A+B+C. Chỉ có một phần chất tinh khiết A đi trước nồng độ C B B A t. V A A Sắc đồ phân tích tiền lưu b) Phân tích thế đẩy Trong sắc ký này, chúng ta cũng nạp lượng nhỏ hỗn hợp chất phân tích A, B, C vào cột sau đó cho chất D là ch ất đẩy liên t ục đi qua c ột. Ái l ực hấp thụ là A
nồng độ A D t,V B C Sắc đồ phân tích thế đẩy c) Phân tích rửa giải: Đưa một lượng nhỏ mẫu bao gồm các chất A, B, C vào cột sau đó dùng chất E có ái lực hấp thụ với pha tĩnh yếu nhất để rửa giải liên tục. Cả A, B, C, E đều tan tốt trong pha động . Th ứ t ự ái l ực h ấp th ụ là E
giúp cho sự di chuyển các chất phân tích dọc theo chiều dài cột với tốc độ khác nhau. Chúng ta thường nói chất phân tích phân bố gi ữa hai pha, tuy nhiên đây la cân bằng động chất phân tích luôn thay đổi pha liên k ết (tr ừ một số trường hợp đặc biệt nó chỉ ở một pha trong suôt quá trình phân tích) vấn đề là tại sao chất phân tích được giữ trong pha tĩnh? Hơn n ữa ba thành phần này tương tác như thế nào với nhau, bằng các lực liên kết nào mà k ết quả các chất phân tích lại phân bố vào pha tĩnh ở mức độ khác nhau? Câu trả là do bản chất các của các thành phân trong hệ sắc ký. Ch ất phân tích có thể là ion, phân tử trung hoá hay chất phân cực, đối tượng liên kết của nó cũng có thể là ion, phân tử, chất phân cực. Như vậy tuy thuộc vào độ l ớn của điện tích kich thước phân tử, độ phân cực mà chúng t ương tác v ới nhau theo các lực liên kết khác nhau.Người ta chia các lực liên kết thành bốn loại: 3.1) Lực liên kết ion Trên bề mặt pha tĩnh có các trung tâm hoạt động là ion. Đó là các phần tử có khả năng phân ly tạo thành các ion, tạo nên trung tâm ho ạt đ ộng ion chung tham gia liên kết với các ion chất phân tích trong dung dịch theo lực tương tác tĩnh điện gọi là liên kết ion. Để giữ các anion chất phân tích trong dung dịch pha tĩnh cần có các trung tâm cation trên bề mặt, và ngược lại để giữ các cation chất phân tích trong dung dịch pha tĩnh cần có các ctrung tâm anion cũng tương tự, pha động cũng có các trung tâm hoạt động là các ion, chúng tham gia tương tác với chất phân tích và pha t ỉnh. Chúng có khả năng phân li trong dung dịch tạo thành các cation và anion. Thí dụ khi rửa giải các ion kim loại trên cột cationit, ta có thể dùng pha động là dung dịch HCl loãng. Các phương pháp sắc ký thường gặp có sự tham gia của các liên kết ion gọi là sắc ký ion, sắc ký cặp ion. 3.2) Lực phân cực Trong phân tử chất phân tích, chất rửa giải trong pha động cũng như các phân tử trên bề mặt pha tĩnh có các trung tâm phân c ực, chúng có th ể là các lưỡng cực điện cố định, cũng có thể là các lưỡng cực điện do c ảm ứng. Các trung tâm phân cực của chất này liên kết với trung tâm phân cực c ủa chất khác bằng lực liên kết phân cực. Sự phân cực trong các phân tử đôi khi rất nhỏ và sự chênh lệch về độ phân cực cũng rất nhỏ. Tuy nhiên, sự chênh lệch này là yếu tố quan trọng để có độ bền liên kết khác nhau, đó là điều cần thiết để phân chia chúng trong các phép tách sắc ký. Thí dụ: các Cresol (o-, m-,p- cresol) chỉ khác nhau về v ị trí nhóm CH 3- trong phân tử. Chính sự khác nhau về vị trí này làm cho mật đ ộ electron trong phân tử cresol khác nhau tạo nên một sự khác biệt nh ỏ về độ phân cực, từ đó lực liên kết với pha tĩnh khác nhau. Là nguyên nhân chênh l ệch thời gian lưu trong quá trình sắc ký 3.3) Lực Van- de- Van (lực phân tán) Lực này có bản chất điện, tuy nhiên không hề có cực điện trong mạng lưới phân tử, cũng không liên quan tới phân tử lưỡng cực hay cố định. Tương tác phân tán điển hình là mạch hidrocacbon nó là tương tác phân tử . 162
Thí dụ n-heptan là chất lỏng chứ không phải là chất khí s ự t ương tác giữa các phân tử n-heptan là lực phân tán đủ lớn để giữ chất này ở trạng thái lỏng. Để tách các hidrocacbon người ta dùng hidrocacbon khác làm pha tĩnh. 3.4) Lực tương tác đặc biệt Lực tương tác đặc biệt là lực tương tác tạo thành do các liên kết hydro, liên kết cho nhận mà có.Sự hình thành liên kết giữ nguyên tử hidro và các nguyên tử có độ âm điện cao như O, N, F... g ọi là liên k ết hidro. Khi tham gia liên kết, các electron còn gọi là đám mây electron chuy ển d ịch sang nguyên tử có độ âm điện lớn hơn. Như vậy các nguyên tử có độ âm điện cao hơn, liên kết hidro càng bền chặt. 4)Sự tương tác giữa ba thành phần trong hệ sắc ký, tối ưu hoá h ệ sắc ký Khi nạp chất phân tích vào hệ sắc ký, nó được phân bố gi ữa hai pha, pha tĩnh và pha động, tuỳ theo lực liên kết giữ từng pha với chất phân tích mà chúng có thời gian ở pha nào nhiều hơn. Nh ư vậy th ực ch ất là ba thành phần trong hệ sắc ký tương tác với nhau, pha tĩnh, pha động, và chất phân tích. Ta xét từng thành phần và quan hệ của chúng. Pha tĩnh phài lưu giữ được chất phân tích, tuy nhiên đ ể tách được các chất, nó không được giữ quá chặt chất phân tích để có điều kiện phân bố vào pha động và sau đó, ở một thời điểm khác, nó lại bị hấp thụ vào pha tĩnh. Các chất phân tích có tính chất càng giồng nhau sự phân bố càng ph ải lặp đi lặp lại nhiều lần, ở đây ta muốn nói đến số l ần phân b ố đ ạt cân bằng hay số đĩa lí thuyết phải đủ lớn để tách có hiệu quả, do đó các vấn đề vật liệu làm pha tĩnh, chiều dài cột tách và cách n ạp c ột cũng c ần đ ược quan tâm. Ngày nay ta có thể sử dụng những cột có sẵn trên thị trường nhưng đôi khi, cùng một loại pha tĩnh, các hãng khác nhau có th ể t ạo đ ược các sản phẩm với tính chất khác nhau. Vấn đề tiếp theo là pha động và cách vận hành tức là tóc độ pha động, nhiệt độ, lượng mẫu đưa vào cột, tái sinh cột...Pha động ph ải hoà tan dược chất phân tích, tuy nhiên thành phần pha động phải phù hợp sao cho chất phân tích không bị giữ quá lâu ở pha động để nó có thể liên kết trở lại với pha tĩnh. Sự tương tác giữa pha động và pha tĩnh cũng là vấn đề cần bàn. Pha động không được làm ảnh hưởng tới pha tĩnh, không làm thay đổi tính chất hoá lý của pha tĩnh. Pha động không được liên kết với pha tĩnh một cách quá bền vững để tạo điều kiện cho các chất phân tích có thể phân bố vào pha tĩnh được. Ngoài ra tốc độ pha động, nhiệt độ hệ trong đó có nhiệt độ của từng bộ phận riêng, đặc biệt là trong sắc ký khí phải được quan tâm kh ống chế một cách chặt chẽ. Để làm sáng tỏ vấn đề trên ta lấy một ví dụ tách các ion kim lo ại M + bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion. Pha tĩnh là cationit axit mạnh, nhóm trao đổi là R-SO3H: Pha động là dung dịch đệm có chất rửa giải là H +. Sự tương tác của ba đại lượng trên được miêu tả bằng hình sau: 163
chất phân tích M+ Pha tĩnh Pha động R-SO3- H+ Sự tương tác của 3 đại lượng chủ yếu trong hệ sắc ký Pha tĩnh (RSO3) có khả năng hấp thụ chất phân tích theo phản ứng sau: R-SO-3 +M+ R-SO3M * Mặt khác chất rửa giải trong pha động cũng t ương tác v ới pha tĩnh theo phản ứng R-SO3- + H+ R-SO3H ** Ion kim loại M cần liên kết với pha tĩnh ở một mức độ không quá bền + vững, phản ứng hấp thụ ở đây là phản ứng thuận nghịch. Cân bằng phân bố là cân bằng động và hợp chất R-SO 3M có liên kết bền vững sao cho M + dễ dàng đi vào pha động. Đến lượt H+, không được liên kết bền vững với R- SO3-, nói một cách khác là nồng độ H+ không quá cao sao cho phản ứng ** xảy ra thuận nghịch. Mặt khác tương tác giữa M + và H+ là tương tác phủ định nhau, cạnh ranh nhau. Chính H+ là yếu tố cạnh tranh để cho phản ứng ** xảy ra. Như vậy vai trò của nồng độ chất rửa giải,(H +) ở đây rất quan trọng nó có giá trị phù hợp sao cho hiệu quả tách tốt nhất. Phương pháp đưa thêm chất tạo phức vào pha động cũng thường được áp dụng trong sắc ký trao đổi ion. III. MỘT SỐ ĐẠI LƯỢNG DÙNG TRONG SẮC KÝ 1) Hệ số phân bố KD và cách xác định Cấu tử A phân bố giửa pha động và tĩnh khi cân bằng được thiết lập As Am (1) hệ số phân bố được định nghĩa là tỉ số của nồng chất phân tích giữa hai pha [ A] m DK = [ A] s (2) Trong đó : [Am ] là nồng độ chất phân tích trong pha động [As ] là nồng độ chất phân tích trong pha tĩnh Cân bằng phân bố trong pha khí gọi là cân bằng động đó là cân b ằng giữa lỏng - lỏng, khí-lỏng, rắn-lỏng. Giả sử chất phân tích được phân bố ở phần nào đó của cột, đĩa thứ n. Nhưng do pha động di chuy ển, ch ất phân tích lại đi xuống đĩa thứ (n+1) và ở đây lại thiết lập cân bằng mới của cả đĩa thứ n và n+1. Để cân bằng thiết lập nhanh một yêu cầu rất cần thiết là lớp pha tĩnh phải mỏng, hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha tĩnh lớn hơn h ệ số khuếch tán trong pha động. Hệ số phân bố K D có thể được xác định theo phương pháp tính bằng cách đo nồng độ chất phân tích trong pha động và 164
nồng độ chất phân tích trong pha tĩnh sau khi đã đạt cân bằng. Một cách gần ( M − M 1 ) .V đúng KD được xác định theo công thức sau: K D = (3) M 1.m Trong đó: M là lượng chất ban đầu tính bằng mg M1 là lượng chất phân tích còn lại sau khi tiếp xúc mg V là thể tích pha động ml M là lượng chât hấp thụ, gam 2) Sự liên hệ giữa tốc độ di chuyển của chất phân tích và KD Chất phân tích A muốn di chuyển được phải ở pha động. Gọi f A là [ A] m .Vm fA = phần thời gian A ở pha động: (4) [ A] m .Vm + [ A] s .[ V ] s 1 fA = VS chia cả tử và mẩu cho [A]m . Vm ta có: (5) 1+ KD 1 fA = Vm 1+ f A Hay (6) Trong đó k A là hệ số dung tích.Tốc độ tuyến tính của cấu tử A trong pha động là: uA = u.fA = u / (1+fA) (7) U là tốc độ tuyến tính của pha động (cm/s). Từ biểu thức (6) và (7) ta có nhận xét: Khi DK hoặc fA càng lớn ; thời gian chất phân tích trong pha động càng ít, nói cách khác là chất phân tích di chuy ển càng ch ậm, ng ược l ại khi fA càng nhỏ, chất phân tích di chuyển càng nhanh. 3) Thời gian lưu tR, thời gian lưu hiệu chỉnh tR’ Thời gian lưu t R là thời gian lúc bắt đầu bơm mẫu vào đầu cột tới khi pic đạt giá trị cực đại. L L(1 + k A ) (8) t= = R uA u L/u là thời gian mà cấu tử không lưu giữ trên cột còn gọi là thời gian chết (9)  Vs  t RA = t m 1 + K D .  = t m (1 + k A )  Vm    thời gian lưu hiệu chỉnh tR’ là thời gian lưu không tính thời gian chết t R VR' " (10) t R A = t R A − t m = t m k = >k = = ' ' tm Vm 4) Thể tích lưu Vm, thể tích lưu hiệu chỉnh Thể tích lưu VR là thể tích của dung dịch rửa giải từ khi bắt đầu bơm mẫu vào cột cho đến khi pic đạt cực đại. Gọi F là t ốc đ ộ ch ảy c ủa pha động ml/phút,thể tích lưu VR được tính theo công thức:VRA = tRAF; Vm = tmF VRA = Vm(1 + k’) (11) Thể tích lưu hiệu chỉnh VR’ là thể tích lưu đã loại đi thể tích trống của cột VR’ = VR – Vm = VmkA’ = KDAVS Thể tích lưu riêng Vg là thể tích riêng cho cấu tử, là thể tích dung dịch rửa giải để rửa chất phân tích trong một đơn vị trọng lượng hay th ể tích của pha tĩnh 165
VRA = K DA = Vg (12) VS 5) Hệ số tách α (còn gọi là hệ số lưu giữ tương đối) Hệ số tách α là đại lượng đánh giá khả năng tách hai chất bằng phương pháp sắc ký. Nó phụ thuộc vào hệ số phân bố của chúng và tỷ số của hệ số phân bố của hai chất: một chất phân tích A và một chất khác B hoặc một chất chuẩn. Điều kiện để hai chất tách khỏi nhau là α ≠ 1 k K DA α= = A' ≠ 1 (13) K§DB kB Nói một cách khác hệ số phân bố của hai chất A và B giữa pha tĩnh và pha động phải khác nhau. Mặt khác tỷ số thể tích lưu của hai ch ất, t’ RA/ t’RB cũng chính là tỷ số của hệ số phân bố. k t' V' K DA α= = A' = RA = RA Vậy có thể tóm tắt là: (14) ' ' K§ DB kB t RB VRB 6) sắc đồ. Sắc đồ là sự biểu diễn sự phụ thuộc diện tích (S) hoặc chi ều cao (h) tín hiệu đo được có thể là độ hấp thụ quang,cũng có thể là độ dẫn điện hoặc là tần số xung điện ...liên quan chặt chẽ tới nồng độ chất phân tích có trong mẫu và thời gian. Các tín hiệu này được gọi là “ pic” sắc ký.Để tính toán hàm lượng chất phân tích, tính diện tích pic sắc ký là chính xác nhất.Ngày nay hầu hết các máy hiện đại đều được trang bị các thi ết b ị tÍnh diện tích của pic sắc ký một cách tự động t RB .VRB S, h ' ' t RB ,VRB t RA ,VRA ' ' t ¶ RA , VRA tm Sắc đồ hai cấu tử A&B t ,V t0 WB ¦ WA 7) Đĩa lý thuyết a) Khái niệm đĩa lý thuyết: Đĩa lý thuyết là phần nào đó của cột mà ở đó cân bằng đ ược thi ết lập. Theo quan niệm của Martin và Synge, cân bằng được thiết lập nhanh chóng, tức thời. Tuy nhiên điều này gặp khó khăn khi gi ải thích hi ện t ượng giãn rộng vùng mẫu, hiện tương pic sắc ký không cân đối. Amundson và Lapidus và sau đó là Van Deemter cho rằng đĩa được cân bằng khi đạt cân bằng chuyển khối lượng chất tan từ pha động vào pha tĩnh và ng ược l ại và tác giả đã đưa ra thuyết tốc độ. 166
Xác định số đĩa lý thuyết thực nghiệm Như vậy có thể nói rằng phần nhỏ của cột gọi là đĩa lý thuy ết khi đạt được cân bằng phân bố chất phân tích. Gọi n là số đĩa lý thuyết, σ là độ lệch chuẩn; σ ~ n . Đối với cột sắc ký n càng lớn pic càng hẹp, thời gian lưu tỷ lệ với số đĩa lý thuy ết n, t R ~ n, 2 tR n W t  mặt khác w = 4 σ hay σ = nên ta có thể vết: σ = hay n =  R  σ  n 4 số đĩa lý thuyết có thể viết lại là: (14) b) Đĩa lý thuyết có tính thời gian không lưu giữ, nef ( t −tm ) 2 16 ' 2 16 2 2 2 ( R) =16 R = = 2 tm k ' nef t 2 w W W 2 k2 k2 tR (15) nef = 16 = n. w2 ( 1 + k ) 2 (1+ k ) 2 Vì từ (8) ta có tm= tR/(1+k’). Chiều cao đĩa lý thuyết hiệu lực được tính: L Hf = nf (16) từ (15) và (16) ta có: (17) (1 +k ' ) 2 w2 L = =H H ef 16 ( t R − m ) 2 2 k' t 8) Độ phân giải và cách làm tăng độ phân giải: a) Độ phân giải Độ phân giải nói lên mức độ tách c ấu t ủ kh ỏi nhau trong m ột phép tách sắc ký. Hai cấu tử A và B được tách khỏi nhau càng triệt để, độ phân giải càng cao. Độ phân giải được đánh giá qua các đại lượng đặc trưng là: thời gian lưu, tRA, tRB và rộng pic WA, WB. Độ phân giải R được tính theo công thức: 2( t RB − t RA ) R= + W A 167WB
(18) Trong đó: tRB – tRA= ΔtR là sự chênh lệch thời gian lưu(cũng có thể dùng th ể tích lưu VRA- VRB)của hai cấu tử A và B. Đại lượng này được so sánh với tổng bán chiều rộng pic, đo bằng giây hoặc mililít, nói lên kh ả năng tách của cột. Khi tăng chiều dài cột, số đĩa lý thuyết tăng: t R ~ n, chiều rộng pic tỷ lệ với n n Vì vậy R~ hay R~ L n b) Cách làm tăng độ phân giải Cách thứ nhất: Dựa trên sự thay đổi cấu trúc cột. Trong phương pháp này có các biện pháp: Tăng chiều dài cột, sử dụng chất nh ồi có kých thước hạt nhỏ hơn, đồng đều hơn, thay đổi pha tĩnh và cuối cùng là giảm đường kinh cột Cách thứ hai: Dưa trên cách vận hành cột: đó là tôi ưu hoá tôc đ ộ pha động, giảm lượng mẫu, giảm nhiệt độ cột (GC) và cuối cùng là thay đổi thành phần pha động (LC) 9) Thuyết tốc độ, phương trình Van Deemter Thuyết được các tác giả Lapidus và Amundsion đưa ra năm 1952, sau này được Van Deemter phát triển. Theo thuyết này các yếu t ố: đường kýnh h ạt nh ồi, k ỷ thu ật n ạp c ột và các yếu tố tốc độ của pha động, hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động và pha tĩnh ảnh hưởng rất nhiều tới sự giản rộng vùng ch ất phân tích hay độ rộng của pic trong sắc đồ. Đại lượng đặc trưng cho đ ộ giản rộng của vùng chất phân tích là chiều cao đĩa lý thuyết H, được hình thành do ba thành phần H1,H2, H3. H = H1+H2+H3 (19) H1 là đại lượng khuếch tán xoáy, đặc trưng cho s ự đồng đ ều c ủa cột nhồi, đường kýnh của hạt nhồi, khả năng nạp cột H1 = 2λdp (20) Trong đó λ là hệ số nạp cột, nếu nạp cột tốt thì λ= 1,5; dp là kýnh hạt nhồi H 2 là đại lượng khuếch tán theo chiều dọc. Nó được hình thành do s ự khuếch tán của chất phân tích về hai đầu của cột, ph ụ thuộc vào tốc độ của pha động, hệ số khuếch tán của chất phất phân tích trong pha động, đường đi của chất phân tích, được biểu diển bằng phương trình: H2 = B/u trong đó B= 2γDm Là đại lượng đặc trưng cho hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động và hệ số đường đi của nó. Trong điều kiện nạp cột tốt, đ ường đi của chất phân tích không quá khúc khuỷu, γ = 1; Dm là hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động, như vậy H2 có thể viết lại là: H2 = 2γDm/u (21) H3 là đại lượng đặc trưng cho quá trình chuyển khối lượng là y ếu tố phụ thuộc vào tốc độ hấp thụ và giải hấp. Quá trình này phụ thu ộc vào c ả pha động và pha tĩnh, vì vậy H3 có thể viết: H3= (CS - Cm)u (22) 168
Trong đó Cs là hệ số dặc trưng cho quá trình chuyển khối lượng của chất phân tích trong pha tĩnh, phụ thuộc vào pha tĩnh, nó có giá tr ị nh ỏ khi t ốc đ ộ Cs= K.df2/Ds dòng F≥1ml/phút, Cs ≈0 (23) Trong đó: K- hệ số Ds- hệ số khuếch tán chất phân tích trong pha tĩnh df2- chiều dày pha tĩnh H Cu H min B u A utu u , cm / s Đường cong Van Deemter Cm là hằng số chuyển khối của chất phân tích trong pha động, phụ thuộc vào pha động, được xác định theo biểu thức: Cm = βdp2/Dm (24) β là hệ số thực nghiệm có giá trị từ 0,5- 1 Dm là hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động. Tổng hợp lại H có biểu thức tổng quát là: H = 2λdp + 2γDm/u + (Kdf2/Ds + βdf2/Dm)/u (25) Phương trình trên được viết tắt là: H = A+B/u +Cu (26) Trong thực tế có thể tính gần đúng H= 3-4dp Để xét cực tiểu chiều cao của đĩa lý thuy ết lấy đạo hàm c ủa ph ương Van Deemter ta có: H’= -B/u2 +C trình B tại cực tiểu H’=0 => utư = C Phần 2: BÀI TẬP Bài 1 Tính số đĩa lý thuyết hiệu lực nef và Hef của hệ sắc ký có tính chất sau: t R = 280s; t R = 300s; WA = 14s; WB = 15s. Thời gian chết là tm=10s, cột có A B chiều dài là 3,2m. Giải: Theo lý thuyết ta có số đĩa lý thuyết hiệu lực nef là: k '2 n= ; với k’ là tỷ số dung tích. ( k '+1) 2 169
2 t −t M  =16  R nef  W  2  280  nA = 16  ÷ = 6400  14  2  300  nB = 16  ÷ = 6400  15  Từ đó ta có:  t − t   280 − 10  k'= R M  =  = 27; Đối với pic A:  tM   10  2  27  nef A = 6400  ÷ = 5951, 07  27 + 1   t − t   300 − 10  k'= R M  =  = 29; Đối với pic B:  tM   10  2  29  nef B = 6400  ÷ = 5980, 4  29 + 1  300 Vậy, nef = 5065, 7 ; H ef = 5965, 7 = 0, 053 . Bài 2: Trên sắc ký đồ người ta thu được 3 pic ở 0,84 phút và 10,60 phút và 11,08 phút tương ứng với các hợp chất A,B và C. Hợp chất A không lưu giữ bởi pha tĩnh lỏng. Các pic của các hợp chất B và C có dạng đường Gauss có chiều rộng tương ứng 0,56 và 0,59 phút. Độ cao sắc ký bằng 28,3cm. . 1. Tính số đĩa lý thuyết (n) của cột sắc ký và chiều cao đĩa lý thuyết (H) của pic B,C. 2. Tính giá trị trung bình T và σ của cột. 3. Tính chỉ số lưu giữ của chất B,C. 4. Thể tích của chất lỏng được giữ trên bề mặt của chất mang của cột bằng 12,3ml. Thể tích của pha động bằng 17,6ml. Hãy tính hệ số phân bố B,C. Giải: 1. Tính n và H: + Đối với pic B: 2 2 t   10, 60  nB = 16  RB ÷ = 16  ÷ = 5733  WB   0,56  + Đối với pic C 2 2 t   11, 08  nC = 16  RC ÷ = 16  ÷ = 5643  WC   0,59  Vậy số đĩa lý thuyết của cột tương đương 5688 đĩa lý thuyết. + Chiều cao đĩa lý thuyết: L 28,3 = 4,975.10−3 (cm) H= = n 5688 170
2. Tính σ và T: σ2 ⇒ σ = n.H 2 = 5688.(4,975.10−3 ) 2 = 0,375(cm) Từ n = 2 H σ .tRB 10, 6.0,375 Ta có: TB = L = 28,3 = 0,141( phut ) σ .t 11, 08.0,375 TC = RC = = 0,147( phut ) L 28,3 0,141 + 0,147 T= = 0,144( phut ) 2 3. Chỉ số lưu giữ của chất B,C: tm 0,84 RB = = = 0, 079 Ta có: t RB 10, 6 t 0,84 RC = m = = 0, 076 t RC 11, 08 4. Hệ số phân bố B,C: Vm (1 − RB ) 17, 6(1 − 0, 079) V Ta có: RB = V + k .V ⇒ k B = = = 16, 68 m RB .VS 0, 079.12,3 m BS V (1 − RC ) 17, 6(1 − 0, 076) Vm RC = ⇒ kC = m = = 17, 40 Vm + kC .VS RC .VS 0, 076.12,3 Bài 3 Pic sắc ký của hợp chất X được phát hiện sau 15 phút sau khi đưa mẫu vào (lúc đó của hợp chất Y không được giữ bởi vật liệu của cột xuất hiện qua 1,32 phút). Pic của chất X có dạng đường phân bố Gauss với bề rộng của đáy là 24,2s. Độ dài của cột là 40,2cm. 1. Tính số đĩa lý thuyết trong cột. 2. Tính H của cột. 3. Tính T và σ của cột. 4. Tính chỉ số lưu giữ của chất X. 5. Từ phương pháp chuẩn bị đã biết rằng thể tích của chất lỏng được giữ trên bề mặt của chất mang của cột bằng 9,9ml. Thể tích của pha động bằng 12,3ml. Hãy tính hệ số phân bố X. 6. Tiêu chuẩn phân chia X và Y là bao nhiêu nếu yếu tố phân chia đối với X và Y bằng 1,011. Giải: 1. Số đĩa lý thuyết (n): 2 2 t   15.60  n X = 16 RX  = 16  = 22130 W   24,2   X 2. Tính H: L L 40,2 = 1,82.10− 3 (cm) Ta có n = ⇒H = = H n 22130 3. Tính σ và T: σ2 Từ n = 2 ⇒ σ = n.H 2 = 22130.(1,82.10− 3 )2 = 0,27(cm) H 171
σ .t 15.0,27 Ta có: T = L = 40,2 = 0,101( phut ) R 4. Chỉ số lưu giữ của chất X: t m 1,32 R= = = 0,088 Ta có: tR 15 5. Hệ số phân bố X (kX): Vm (1 − R ) 12,3(1 − 0,088) V Ta có: R = V + k .V ⇒ k X = = = 12,9 m R.VS 0,088.9,9 m S 6. Tiêu chuẩn phân chia (Rs): n 1 22130 1 Ta có: RS = (1 − ) = (1 − ) = 0,4 α 4 4 1,011 với α là yếu tố phân chia. Một hệ thống sắc ký lỏng hoạt động với các thông số sau đây: Bài 4: - Chiều dài của phần cột được nhồi pha tĩnh: 25,2 cm. - Tốc độ dòng: 0,312 ml/phút. - Thể tích pha động (Vm): 1,40 ml. - Thể tích pha tĩnh (Vs): 0,168 ml. Sau khi cho qua cột một hỗn hợp chứa 4 cấu tử A,B,C và D thu được một sắc ký đồ cung cấp các dữ kiện sau: Cấu tử Thời gian lưu giữ,phút Chiều rộng chân pic,phút Không lưu giữ bởi cột 1,2 A 4,7 0,48 B 8,8 0,92 C 12,5 1,34 D 13,8 1,44 Hãy tính: 1. Số đĩa lý thuyết đối với mỗi pic,giá trị trung bình,độ lệch chuẩn của n và chiều cao đĩa lý thuyết của cột. 2. Hệ số chứa và hệ số phân bố của từng cấu tử. 3. Độ phân giải RS, độ chọn lọc α đối với 2 cấu tử C,D. 4. Chiều dài cột nếu muốn đạt được độ phân giải 1,5 đối với 2 cấu tử C,D. Giải t 1. Sử dụng phương trình : n = 16( R ) 2 tính được số đĩa lý thuyết w A: n = 1534 B: n = 1463 C: n = 1392 D: n = 1469 ntb = 1500 L 25, 2 H= = = 0, 017cm ntb 1500 172
σ2 ⇒ σ = n.H 2 = 1500.(0, 017) 2 = 0, 66(cm) n= H2 2. Hệ số chứa và hệ số phân bố của từng cấu tử. t R − tm Áp dụng công thức k ' X = t ta tính được hệ số chứa của từng cấu m tử : k’A = 2,9 ; k’B = 6,3; k’C = 9,4 k’D = 10. KV Từ công thức k ' X = V XS ta tính được hệ số phân bố của từng cấu tử : M KA = 24; KB = 53; KC = 78; KD = 87; 3. Độ phân giải RS, độ chọn lọc α đối với 2 cấu tử C,D. 2∆t R Rs = = 0,94 wC + wD K D 87 α= = = 1,12 K C 78 4.Chiều dài cột để độ phân giải giữa các cấu tử đạt yêu cầu tối thiểu là 1,5 đối với 2 cấu tử C,D;k’ và α không thay đổi khi n và L tăng. Gọi n1,n2 là số đĩa lý thuyết của cột cũ và cột mới,ta có: Rs ,1 n1 0,94 1500 = ⇔ = ⇒ n2 = 3800 Rs ,2 1,50 n2 n2 Chiều dài cột để độ phân giải tăng lên 1,5: L2 = H.n2 = 0,017. 3800 = 65 cm. Bài 5: Cho hệ sắc ký có tính chất sau: t R = 280s; t R = 300s; WA = 14s; WB = 15s. A B Cột có chiều dài là 3,2m. Thay đổi chiều dài từ 320 cm lên 400 cm. Tính đ ộ phân giải? Giải: 400 400 t RA = 280. = 350( s ) t RB = 300. = 375( s) 320 320 2 2 2 2 t  t   280   300  nA = 16.  RA ÷ = 16  ÷ = 6400 nB = 16.  RB ÷ = 16  ÷ = 6400  14   15   WA   WB  2 t  400 n = 16.  R ÷ = 6400. = 8000 W 320 2 16.t 2 t  n = 16. R  ⇒ W = Ta có: R W n 16.(350) 2 16.(375) 2 WA = = 15, 65( s) WB = = 16, 77( s) 8000 8000 2. ( 375 − 350 ) R= = 1,54 15, 65 + 16, 77 Bài 6 Trong sắc ký khí tốc độ di chuyển của pha động có thể đo được trực tiếp, nếu đưa vào một lượng nào đó của chất tan tương tự như metan,nó 173
không được giữ bởi pha tĩnh. Trong cột mao quản có chiều dài 50m; thời gian lưu trữ của metan bằng 71,5s;còn thời gian giữ của n-heptadecan là 12,6 phút. Hãy cho biết: a. Tốc độ di chuyển của pha động bằng bao nhiêu? b. Tốc độ di chuyển của dải n-heptadecan bằng bao nhiêu? Giải a. Ta có L = 50 m = 5000 cm. TR = 71,5 s Vậy tốc độ di chuyển của pha động là: L 5000 F= = = 69,93cm / s t R 71,5 b. Đối với n-heptadecan: tR= 12,6 phút = 756 s. Vậy tốc độ di chuyển của dải là: 5000 F= = 6, 61cm / s . 756 Bài 7 Một cột sắc ký mao quản dài 30m, chạy một chất chuẩn ở hai tôc độ pha động khác nhau, cho các số liệu sau: Tốc độ (cm/s) Số đĩa lý thuyết 0,5 150 000 120 000 Xác định vận tốc tối ưu,chiều cao đĩa lý thuyết cực tiểu và số đĩa lý thuyết ở vận tốc tối ưu đó,cho A=0. Giải TN1 H1 = 3000/150000 = 0,02 cm TN2 H2 = 3000/120000 = 0,025 cm. Ta có phương trình: B 0, 02 = + 0,5C 0,5 B 0, 025 = + C 1 Giải phương trình ta được : C= 0,02 s ; B = 0,005 cm2/s. U tối ưu = (B/C)1/2 = 0,5 cm/s Hmin = 2(B.C)1/2 = 0,02 cm. Số đĩa lý thuyết ở vận tốc tối ưu là: 3000 n= = 150000 . 0, 02 Bài 8 Một cột dài 360 cm dùng để tách propan và butan bằng phương pháp sắc ký khí. Dùng thước người ta đo được khoảng cách từ lúc bơm mẫu đến đỉnh của pic sắc ký lần lượt là 152,5 mm và 415,5 mm,bề rộng chân các pic lần lượt là 13,5 mm và 33,8 mm. Tính số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết ứng với mỗi chất. Giải t Sử dụng phương trình : n = 16( R ) 2 tính được số đĩa lý thuyết w 174
n(propan) = 2042 n(butan) = 2416 L Chiều cao đĩa lý thuyết H = ta được n H(propan) = 0,176 cm H(butan) = 0,149 cm. Bài 9 Một hỗn hợp chứa metyl xiclohexan,metyl xiclohexen và toluen được tách bằng phương pháp sắc ký lỏng – khí trên cột nhồi dài 42 cm. Sắc ký đồ cung cấp thời gian lưu của chúng lần lượt là 10,1 ; 11,0 ; 13,5 và chiều rộng pic lần lượt là 0,75 ; 0,80 ; 1,05 phút. Hãy tính: 1. Số đĩa lý thuyết đối với mỗi pic, giá trị trung bình,độ lệch chuẩn của n và chiều cao đĩa lý thuyết của cột. 2. Độ phân giải giữa metyl xiclohexan và metyl xiclohexen,giữa metyl xiclohexen và toluen. Cho biết khí được sử dụng là không khí với tR(KK) = 1,2 phút (không khí được xem là cấu tử không bị lưu giữ bởi cột). 3. Hãy tính chiều dài cột để độ phân giải giữa các cấu tử đạt yêu cầu tối thiểu là 1,5. Giải Ký hiệu A : metyl xiclohexan B: metyl xiclohexen C: toluen. t 1. Sử dụng phương trình : n = 16( R ) 2 tính được số đĩa lý thuyết w A: n = 2902 B: n = 3025 C: n =2645 ntb = 2900 L 420 H= = = 0, 015cm ntb 2900 σ2 n = 2 ⇒ σ = n.H 2 = 2900.(0, 015) 2 = 0,81(cm) H 2. Độ phân giải giữa metyl xiclohexan và metyl xiclohexen,giữa metyl xiclohexen và toluen 2∆t R Rs , A− B = = 1,16 wA + wB 2∆t R Rs , B −C = = 2, 70 wA + wB 3.Chiều dài cột để độ phân giải giữa các cấu tử đạt yêu cầu tối thiểu là 1,5. Vì Rs,A-B = 2,70>1,5 nên chỉ cần tính chiều dài để độ phân giải giữa A- B đạt yêu cầu 1,5. Gọi n1,n2 là số đĩa lý thuyết của cột cũ và cột mới,ta có: 175
Rs ,1 n1 1,16 2900 = ⇔ = ⇒ n2 = 4800 Rs ,2 1,50 n2 n2 Chiều dài cột để độ phân giải tăng lên 1,5: L2 = H.n2 = 0,015. 4800 = 73 cm. Bài 10: Một phép sắc ký khí sử dụng cột dài 36 m, chạy chất chuẩn ở 3 thí nghiệm với tốc độ pha động khác nhau cho các pic có thời gian lưu và độ rộng pic như sau: Thí nghiệm u (cm/s) tR (s) w (s) 1 10 300 20 2 20 250 16 3 30 150 10 Xác định vận tốc tối ưu, số đĩa lý thuyết cho cột vận hành ở vận tốc tối ưu đó Giải : Theo phương trình Van-Deemter, muốn xác định được vận tốc tối ưu, Hmin và số đĩa lý thuyết ta cần xác định các hệ số A, B, C. Muốn vậy ta xác định số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết cho từng thí nghiệm : Ta có : L=36 m = 3600 cm 2 3600  300  H1 = = 1,00(cm) n1 = 16  = 3600 TN 1: 3600  20  2 3600  250  H2 = = 0,92(cm) n2 = 16  = 3906 TN 2: 3906  16  2 3600  150  H3 = = 1,00(cm) n3 = 16  = 3600 TN 3: 3600  10  Thay các số liệu vào phương trình trên ta có hệ phương trình sau: B 1,00 = A + + 10C (1) 10 B 0,92 = A + + 20C (2) 20 B 1,00 = A + + 30C (3) 30 Giải hệ gồm 3 phương trình (1), (2) và (3) ta được: A= 0,36 (cm), B = 4,8 (cm2/s) và C = 0,016 (s) Vận tốc tối ưu, Hmin và số đĩa lý thuyết được tính là : B 4,8 utoiuu = = = 17,32(cm / s ) C 0,016 H min = A + 2 B.C = 0,36 + 2 4,8.0,016 = 0,914(cm) L 3600 n= = = 3939 H 0,914 176