TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế
Tập 23, Số 2 (2023)
145
ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA CAO CHIẾT TRÁI NHÀU
(Morinda citrifolia L.) LÊN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA TẾ BÀO 3D NUÔI CẤY
Nguyễn Thị Tâm*, Đặng Thị Kiều Dưỡng, Nguyễn Bình Linh Chi
Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế
*Email: nguyentam181000@gmail.com
Ngày nhận bài: 24/4/2023; ngày hoàn thành phản biện: 26/4/2023; ngày duyệt đăng: 4/12/2023
TÓM TẮT
Cao chiết methanol trái Nhàu (Morinda citrifolia L.) ức chế đáng kể việc sản xuất
NO mà không ảnh hưởng đến khả năng sống của tế bào. Cao chiết trái Nhàu (M.
citrifolia L.) đã được chứng minh là có tác dụng làm giảm yếu tố hoại tử khối u-
alpha của các cytokine tiền viêm. Những kết quả này đã chứng tỏ tác dụng chống
viêm của cao chiết trái Nhàu có liên quan đến việc giảm biểu hiện của các chất
trung gian gây viêm và hỗ trợ tăng trưởng nuôi cấy tế bào 3D. Mục tiêu của nghiên
cứu này nhằm đánh giá ảnh hưởng của cao chiết trái Nhàu lên sự sinh trưởng của
tế bào 3D nuôi cấy. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy nguyên bào sợi
(NBS) tăng sinh tốt sau 15 ngày nuôi cấy lên vật liệu 3D có bổ sung 120 μg/ml cao
chiết trái Nhàu (M. citrifolia L.).
Từ khóa: Morinda citrifolia L., tế bào 3D, trái Nhàu.
1. MỞ ĐẦU
Không giống như nuôi tế bào đơn lớp 2D, nuôi tế bào 3D là mô hình ngày càng
được sử dụng rộng rãi nhờ những tính năng mới, mô phỏng các quá trình phức tạp
được quan sát trong cơ thể như tín hiệu tế bào, hóa học, hình học, thể hiện chính xác
hơn môi trường vi mô thực tế, các tế bào sau đó có thể phát triển trong cơ thể. Nuôi tế
bào thu nhỏ 3D là xu hướng mới trong nghiên cứu y sinh, giúp các tế bào cùng loại và
khác loại tương tác với nhau, tái sắp xếp tương tác đồng điệu để hình thành cấu trúc
giống với mô thật. Hydrogel là scaffold 3D có khả năng tự hỗ trợ, trương nở, dễ dàng
khuếch tán và gắn các tế bào. Các vật liệu khác như kim loại, thủy tinh, gốm sứ cũng
được làm scaffold và dùng để kiểm soát các đặc tính bề mặt cấu trúc và hóa học của
chúng.
Chất nền ngoại bào được cấu tạo chủ yếu từ các sợi glicoprotein kết hợp với các
chất vô cơ và hữu cơ khác nhau, giúp liên kết và thu nhận thông tin giữa các tế bào.
Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết trái nhàu (Morinda citrifolia L.) lên sự sinh trưởng của tế bào …
146
Collagen là chất nền ngoại bào quan trọng nhất với khả năng tạo thành hệ scaffold hỗ
trợ tế bào về mặt cơ học. Một số protein quan trọng khác trong thành phần của chất
nền ngoại bào như laminin, fibronectin, prexonine, epigallocatechin gallate (EGCG) có
hoạt tính chống oxy hóa và có hàm lượng cao trong trái Nhàu (M. citrifolia L.) được sử
dụng làm giá thể cho tế bào phát triển. Trái Nhàu có hoạt tính sinh học đa dạng, là chất
trung gian trong việc điều chỉnh tốc độ phân bào thông qua việc truyền tín hiệu nội
bào, điều hòa và tiếp nhận tín hiệu, tăng tốc độ tái tạo mô, điều hòa miễn dịch. Nhằm
sử dụng trái Nhàu cho thử nghiệm kích thích các protein gắn kết tạo chất nền ngoại
bào tổng hợp trong nuôi tế bào 3D cho kỹ thuật y sinh. Do tính mới của nó, kỹ thuật
này chưa được hiểu đầy đủ, việc phát triển ứng dụng để cải thiện việc nuôi tế bào 3D
có thể mở ra một kỹ thuật nuôi mới thể hiện sự phong phú về tính ứng dụng của trái
Nhàu.
2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Trái Nhàu (Morinda citrifolia L.)
được thu mẫu tại đường Lê Văn Hưu,
Thuận Thành, Thành phố Huế, tỉnh Thừa
Thiên Huế, Việt Nam (Toạ độ 16.47776° B,
107.57497° Đ). Tuyển chọn các quả vừa
chín tới, nguyên vẹn và không bị sâu hại.
Hình 1: Trái Nhàu (Morinda citrifolia L.)
Tế bào thử nghiệm
Nguyên bào sợi (Fibroblast) được thu nhận từ lớp màng lót của dây rốn.
Dây rốn được thu nhận tại Khoa Sản, Bệnh viện Trung ương Huế, được sự
đồng ý của bệnh viện, bác sĩ và gia đình. Sản phụ trong độ tuổi từ 18 – 35 tuổi, âm tính
HIV, âm tính viêm gan B và các bệnh truyền nhiễm.
Vật liệu nuôi cấy 3D
Vật liệu scaffold được nung bởi các muối canxi photphat (Ca3(PO4)2) do Phòng
thí nghiệm Hóa học, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế cung cấp.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Điều chế cao chiết từ trái Nhàu
Trái Nhàu sau khi thu hái được rửa sạch, cắt nhỏ và sấy khô ở 50°C. Mẫu được
nghiền nhỏ thành dạng bột mịn. Mẫu được ngâm với methanol 96o trong 20 giờ ở nhiệt
TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế
Tập 23, Số 2 (2023)
147
độ phòng với tỷ lệ 36: 200 (g/mL). Sau khi ngâm, dịch chiết được lọc qua giấy lọc và
tiến hành cô đọng dung môi ở 40°C cho đến cao chiết có màu nâu đen sánh [14].
Thiết kế vật liệu nuôi cấy 3D
Vật liệu scaffold được nung bởi muối canxi photphat (Ca3(PO4)2) trong lò nung
Nabertherm (Đức), với điểm nóng chảy là 1670ºK (1391ºC).
Xác định thành phần các hợp chất từ cao chiết trái Nhàu bằng phương pháp
sắc ký ghép khối phổ (GC-MS)
Thành phần các hợp chất của cao chiết được xác định bằng máy sắc ký khí ghép
phối phổ GC-MS tại Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm Thừa Thiên
Huế.
Phân lập và nuôi tăng sinh nguyên bào sợi từ cuống rốn
Tiến hành theo phương pháp của Larouch và cs (2008), có cải tiến phù hợp điều
kiện phòng thí nghiệm [1].
Dây rốn được thao tác trong điều kiện vô trùng, rửa dây rốn bằng PBS kháng
sinh 5X, 1X. Loại bỏ máu dây rốn bằng 20 ml heparin và rửa lại bằng PBS 1X. Tách lớp
màng lót bên ngoài dây rốn, cắt mảnh nhỏ (2-3 mm2).
Nuôi sơ cấp: Đặt 5 mảnh mô vừa xử lý vào chai nuôi T-flask 25 cm2 với môi
trường DMEM/F12 + 10% FBS + 1% kháng sinh, tiến hành ủ ở 37℃, độ ẩm 95% và 5%
CO2. Sau 3-4 ngày thay môi trường một lần.
Nuôi thứ cấp: Khi tế bào đạt mật độ 70 – 80 % bề mặt nuôi, tách bằng trypsin
EDTA 0,25% và nuôi với mật độ 1000 tế bào/cm2.
Đánh giá khả năng làm lành vết xước bằng cao chiết trái Nhàu
Khi tế bào đạt 70 - 80%, tiến hành tạo vết xước 800 μm theo chiều rộng bằng
đầu col 5 ml. Môi trường nuôi cấy sau đó được loại bỏ ngay lập tức. Rửa chai nuôi 2
lần với PBS và thay thế bằng môi trường DMEM/F12 + 10% FBS + 1% kháng sinh.
Thêm vào môi trường nuôi các nồng độ khác nhau của cao chiết trái Nhàu.
Theo dõi sau mỗi 3 giờ liên tục trong 72 giờ. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Kích thước vết thương được theo dõi tại các thời điểm khác nhau bằng cách quan sát
dưới kính hiển vi và đánh giá mức độ di chuyển của tế bào, định lượng bằng tỷ lệ
khoảng cách 72 giờ so với 48 giờ.
Nhuộm đánh giá nhiễm sắc thể (NST) đồ
Nguyên bào sợi ở lần cấy chuyền thứ 3, trước và sau khi thử nghiệm vết xước
được nhuộm để quan sát sự ổn định của bộ NST.
Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết trái nhàu (Morinda citrifolia L.) lên sự sinh trưởng của tế bào …
148
Kỹ thuật nhuộm băng G được sử dụng để nhuộm NST ở kỳ giữa. NST ở kỳ
giữa được xử lý bằng enzyme phân giải protein và được nhuộm với Giemsa. Băng tối
là đoạn ADN giàu A, T (ngược lại với băng R), băng sáng là những đoạn giàu G, C.
Nhuộm Giemsa 15 phút và đọc tiêu bản NST trên kính hiển vi huỳnh quang với
sự hỗ trợ của phần mềm phân tích băng G.
Thống kê và xử lý số liệu
Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên và được lặp lại 3 lần. Số liệu được xử lí
thống kê bằng phần mềm Excell 2010 với mức ý nghĩa p <0,05.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả phân tích GC-MS cao chiết methanol trái Nhàu
Cao chiết methanol trái Nhàu thu được ở dạng cô đặc, có màu nâu đen, có mùi,
ở dạng cao không tan trong nước, được bảo quản ở 40C để sử dụng lâu dài. Thành
phần hóa học trong cao chiết trái Nhàu được xác định bằng phương pháp sắc ký khí
ghép khối phổ (GC-MS), kết quả được thể hiện trên sắc ký đồ Hình 2.
Hình 2: Sắc ký đồ của cao chiết methanol trái Nhàu
TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế
Tập 23, Số 2 (2023)
149
Bảng 1: Thành phần các hợp chất từ cao chiết methanol trái Nhàu
Kết quả ở Bảng 2 cho thấy 23 hợp chất đã được xác định từ cao chiết methanol
trái Nhàu, bao gồm Eugenol (21,88%), 9,12-octadecadienoic acid (19,91%), Octanoid
acid (15,40%) và một số thành phần khác như Humulene, Coumaran,
Cinnamaldehyde, Anethole, Caryophyllene, Eugenol axetat, Dextromethorphan…
Những hợp chất này thuộc nhóm alkaloids, carbohydrates, flavonoids, phenol...
Kết quả này tương tự với công bố của Sasikumar và cs (2012) về thành phần các
hợp chất từ cao chiết methanol trái Nhàu thu tại Nigeria, bao gồm Steroids, Cardiac
Glycosides, Phenol, Tannins, Terpenoids, Alkaloids, Resins, Carbohydrates,
Flavonoids, Reducing sugar, Saponins, Lipids. Nagalingam và cs (2012) khi nghiên cứu
sự hiện diện của các chất chuyển hóa thứ cấp trong cao chiết ethanol và methanol
quả M. citrifolia Ấn Độ đã phát hiện steroid, cardiac glycoside ,
phenol, tanins , terpenoids , alkaloids, carbohydrates, flavonoids, reducing sugar và
chất béo [13].
Kết quả phân tích GC-MS của cao chiết methanol trái Nhàu đã thu được các
hợp chất có giá trị trong ngành công nghiệp dược liệu và điều trị. Thành phần và hàm
lượng các hợp chất phụ thuộc vào dung môi và quy trình bào chế.
Eugenol có trong cao chiết methanol chiếm 21,88% là hợp chất có giá trị trong y
học và công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm. Hợp chất này tác động lên hệ thần kinh