256
92. ĐỊNH LƢỢNG IgE (Immuglobulin E)
(Bằng phƣơng pháp ELISA)
I. NGUYÊN LÝ
- Định lượng IgE dựa trên pha rắn của phương pháp ELIS ; phương pháp sử dụng
kháng thể đơn dòng kháng kháng thể IgE ở đáy giếng trong pha rắn và kháng thể
kháng IgE từ dê trong dung dịch kết hợp chứa enzyme horseradish peroxidase.
- Mẫu bệnh phẩm (huyết thanh) được thêm vào các giếng đã được tráng bằng kháng
thể kháng IgE và ủ với dung dịch đệm Zero trong vòng 30 phút ở nhiệt độ phòng.
Nếu IgE hiện diện trong mẫu bệnh phẩm, sẽ kết hợp với các kháng thể có trong
giếng. Giếng được rửa để loại bỏ mẫu dư và kháng thể kháng IgE được đánh dấu
bằng peroxidase được thêm vào hình thành phức liên kết enzyme và kháng thể,
kẹp giữa là phân tử IgE.
- Sau khi ủ ở nhiệt độ phòng 30 phút, các giếng được rửa để loại bỏ các thành phần
dư thừa. Cơ chất TMB được thêm vào ủ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút để chuyển
thành màu xanh da trời dới tác dụng của peroxidase. Tiến hành đọc phản ứng ở
bước sóng 450 nm.
- Nồng độ IgE được tính trực tiếp từ độ đậm của màu xanh trong giếng
II. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
Nhân viên thực hiện xét nghiệm có trình độ phù hợp.
2. Phƣơng tiện, hóa chất
Bộ kít cung cấp
- Giếng 96 lỗ đã chứa kháng thể đơn dòng IgE
- Zero buffer
- Enzyme conjugate
- Chuẩn IgE tham chiếu mỗi ống 0.5ml chứa 0, 10, 50, 100, 400 và 800 IU/mL
của WHO
- Dung dịch hiện màu TMB
- Dung dịch ngưng phản ứng 1N HCl
Điều kiện bảo quản: 2-8oC
3. Ngƣời bệnh
Cần được tư vấn về mục đích của việc làm xét nghiệm:
- Được sử dụng như một test dị ứng: xét nghiệm kháng thể IgE và test bì là các
xét nghiệm về cơ bản có thể dùng thay thế lẫn nhau.
- Được chỉ định đối với một loạt các bệnh ký sinh trùng.
- Để chẩn đoán bệnh đa u tủy xương loại IgE.
257
4. Phiếu xét nghiệm
Phiếu xét nghiệm cần ghi đầy đủ thông tin về tên, tuổi, giới tính, khoa phòng,
chẩn đoán của người bệnh và ghi rõ chỉ định xét nghiệm.
5. Bệnh phẩm
- Lấy 3ml máu vào ống nghiệm không chống đông.
- Ly tâm, tách huyết thanh
III. CÁC BƢƠC TIẾN HÀNH
- Đặt các giếng với số lượng mẫu dự định vào khay chứa
- Cho vào các giếng thích hợp 20 µl chất chuẩn, mẫu và chứng
- Thêm 100 µl Zero buffer mỗi giếng
- Trộn đều trong vòng 30 giây
- Ủ ở nhiệt độ phòng (18-250C) trong vòng 30 phút
- Loại bỏ hỗn hợp dịch ủ bằng cách lật úp vào dụng cụ chứa nước thải
- Rửa và loại bỏ lập lại 5 lần với nước không ion
- Loại bỏ lượng nước dư còn lại trong giếng bằng cách gõ đĩa trên giấy thấm
- Thêm vào mỗi giếng 150 µl dung dịch enzyme conjugate, hoà trộn nhẹ
nhàng 10 giây
- Ủ ở nhiệt độ phòng 30 phút
- Rửa 5 lần với nước cất hoặc nước không ion
- Dùng giấy thấm để loại bỏ lượng nước còn thừa trong giếng
- Thêm vào mỗi giếng 100µl dung dịch TMB, trộn đều 10 giây
- Ủ ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng trong vòng 20 phút
- Thêm 100 µl dung dịch ngừng phản ứng vào mỗi giếng
- Trộn nhẹ nhàng 10 giây, đảm bảo màu xanh chuyển thành màu vàng hoàn
toàn
- Đọc giếng ở bước sóng 450nm trong vòng 15 phút
IV. TÍNH TOÁN KẾT QUẢ
- Kết quả được tính bằng trung bình giá trị hấp thu A450 cho mỗi chuẩn tham
chiếu, mẫu và chứng.
- Xây dựng đường cong chuẩn, vẽ đồ thị độ hấp thu của mẫu chuẩn trên trục Y
và nồng độ của chất chuẩn trên trục X, với nồng độ đường chuẩn tính bằng
IU/mL
- Dùng đường chuẩn để xác định nồng độ của IgE trong mẫu bằng cách chiếu
vào đường chuẩn.
V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Lượng IgE tổng ở người khỏe mạnh không bị dị ứng <100 IU/mL. Nồng độ IgE
tối thiểu phát hiện bằng phương pháp này ở khoảng 5.0 IU/ml
- Các giới hạn của quy trình:
258
+ Kết quả tin cậy khi nhân viên hiểu biết và thực hiện đúng theo quy trình
và có thực hành tốt phòng thí nghiệm
+ Các bước rửa rất quan trọng, ảnh hưởng lớn đến kết quả nếu rửa không
đủ và không đúng cách
+ Mẫu huyết thanh phải không bị tán huyết, không bị đục. Kết quả đạt
được nên được sử dụng chỉ như là sự tiếp hợp với các phương pháp chẩn
đoán khác và với những thông tin có sẵn cho bác sĩ.