24
ĐỊNH LƢỢNG ADH
(Anti Diuretic Hormone)
I. NGUYÊN LÝ
- Định lượng ADH trong huyết tương và huyết thanh bằng phương pháp miễn dịch
enzyme (ELISA)
- Khi thực hiện kit, các giếng được tráng trước với một kháng thể đặc biệt tiết ra từ
hormone DH. Sau đó chất chuẩn hay mẫu bệnh phẩm được đưa vào cùng với
Biotin-conjugated và HRP cho mỗi giếng rồi ủ. Tiếp đó chất thử TMB thêm vào.
Chỉ những giếng có chứa ADH, biotin-conjugated kháng thể và enzyme-
conjugated Avidin sẽ làm đổi màu. Nồng độ của DH được xác định trên đồ thị vẽ
từ nồng độ mẫu đo OD với nồng độ chuẩn.
- Nồng độ chuẩn: 80 pg/ml, 40 pg/ml, 20 pg/ml, 10 pg/ml, 5pg/ml, 2.5 pg/ml, 1.25
pg/ml.
II. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
Người thực hiện xét nghiệm có trình độ phù hợp
2. Phƣơng tiện, hóa chất
2.1 Vật liệu tự chuẩn bị
- Micropipettes (10-100L/100-1000L)
- Giếng 96 lỗ
- Máy Elisa
- Máy đo quang
- Máy ủ
2.2 Hóa chất và thuốc thử trong bộ Kit của nhà cung cấp
- Wash Buffer (nồng độ 25X)
- Chất chuẩn
- Mẫu pha loãng
- Biotin-antibody pha loãng
- HRP-avidin pha loãng
- Biotin-antibody
- HRP-avidin
- Stop Solution
- Thuốc thử TMB
Điều kiện bảo quản : 2-8oC
3. Ngƣời bệnh
Người bệnh cần được tư vấn về mục đích làm xét nghiệm.
25
- Để góp phần chẩn đoán một số tình trạng bệnh lý có thể gây bài xuất bất
thường DH (Ví dụ: hội chứng tiết DH không thích hợp [SI DH]).
- Để góp phần chẩn đoán một số tình trạng bệnh lý gây mất bài xuất DH hay
gây mất đáp ứng thận đối với tác dụng của DH (Ví dụ: đái nhạt nguồn gốc
trung ương và đái nhạt nguồn gốc thận).
- Để chẩn đoán và chẩn đoán phân biệt giữa đái tháo nhạt với tình trạng đái nhiều
do căn nguyên thần kinh (psychogenic polyuria).
- Để chẩn đoán phân biệt các trường hợp giảm natri máu.
4. Phiếu xét nghiệm
Phiếu xét nghiệm cần ghi đầy đủ thông tin về tên, tuổi, giới tính, khoa phòng, chẩn
đoán của người bệnh và ghi rõ chỉ định xét nghiệm.
III. CÁC BƢƠC TIẾN HÀNH
1. Lấy bệnh phẩm
Xét nghiệm được tiến hành trên huyết tương
- Yêu cầu người bệnh nhịn ăn 10-12 giờ trước khi lấy máu xét nghiệm. Người
bệnh được yêu cầu tránh các hoạt động thể lực và bị stress trong thời gian xét
nghiệm. Lấy máu khi người bệnh ở tư thế ngồi.
- Mẫu bệnh phẩm sau khi lấy cần được bảo quản trong túi đá lạnh và được chuyển
ngay tới phòng xét nghiệm (không được để trong điều kiện nhiệt độ phòng).
2. Tiến hành kỹ thuật ADH ELISA
- Thêm 100 l chất chuẩn, Blank, mẫu bệnh phẩm vào mỗi giếng. Đậy nắp và ủ
trong 2 giờ ở 370C
- Hút bỏ chất lỏng trên bề mặt giếng. Chú ý: không rửa
- Thêm 100 l Biotin-antibody, ủ 1 giờ ở 370C
- Hút hết cơ chất rồi rửa với 200l Wash Buffer
- Lặp lại quy trình 3 lần
- Thêm 100 l HRP-avidin vào mỗi giếng, ủ 1 giờ ở 370C
- Rửa 5 lần với 200l Wash Buffer
- Thêm 90l thuốc thử TMB vào mỗi giếng, ủ 10-30phút ở 370C
- Thêm 50l dung dịch Stop Solution để ngừng phản ứng khi 4 giếng đầu tiên
chứa nồng độ chất chuẩn cao nhất đổi sang màu xanh. Nếu sự đổi màu không
xuất hiện đồng bộ, phải chắc là các các trong mỗi giếng được trộn đều.
- Đọc độ hấp thụ tại bước sóng 450nm trong 10 phút.
IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Sử dụng đường cong chuẩn để tính toán nồng độ ADH trong mẫu:
- Tạo một đường cong chuẩn bằng cách xử lý phân tích dữ liệu dùng phần mềm
máy tính thích hợp thống kê 4 tham số.
26
- Trục y: nồng độ mẫu bệnh phẩm, trục x: nồng độ chất chuẩn.
- Trung bình kết quả lặp lại của mỗi lần đo chất chuẩn, control, sample và trừ cho
trung bình mật độ quang của standard zero.
Kết luận: kết quả được biện luận để đưa ra kết luận dựa trên các trị số tham chiếu.
V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Nếu giá trị nồng độ mẫu bệnh phẩm cao hơn nồng độ chất chuẩn ở mức cao
nhất. Pha loãng mẫu với chất Standard Diluent và lặp lại quy trình.
- Khi sử dụng máy rửa tự động phải cộng thêm khoảng 30 giây sau khi thêm đệm
rửa và lắc 180 độ giữa các bước rửa sẽ làm gia tăng sự chính xác.
Để đảm bảo kết quả xác thực, nắp đậy cần phải dính sát trong quá trình