31
ĐỊNH LƢỢNG ALDOSTEROL
ldosteron là hormon tuyến vỏ thượng thận tăng sự tái hấp thu Natri ở “ống”
thận dẫn tới việc bài tiết Kali, điều chỉnh lượng máu tuần hoàn. Sản sinh thừa và bài
tiết thường xuyên (mạn) ldosteron sẽ dẫn tới chứng tăng huyết áp. Đo mức độ
ldosteron trong huyết thanh cùng với rennin huyết thanh có thể được dùng để phân
biệt giữa ldosteronism tiên phát và thứ phát.
I. NGUYÊN LÝ
- Aldosteron được định lượng bằng kỹ thuật ELISA .
- Mẫu bệnh phẩm (huyết thanh) được thêm vào các giếng đã được tráng bằng kháng thể
kháng Aldosteron và ủ trong dung dịch đệm 30 phút ở nhiệt độ phòng. Nếu
Aldosteron trong mẫu bệnh phẩm, sẽ kết hợp với các kháng thể có trong giếng. Giếng
được rửa để loại bỏ mẫu dư và kháng thể kháng Aldosteron gắn peroxidase được thêm
vào sẽ tạo phức liên kết enzyme và kháng thể kẹp giữa là phân tử Aldosteron.
- Sau khi ủ ở nhiệt độ phòng 30 phút, các giếng được rửa để loại bỏ các thành phần dư
thừa. Cơ chất TMB được thêm vào ủ tiếp dung dịch phản ứng ở nhiệt độ phòng trong
20 phút để chuyển thành màu xanh da trời. Tiến hành đọc phản ứng ở bước sóng 450
nm.
- Nồng độ Aldosteron tỷ lệ với độ đậm của màu xanh trong giếng
II. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
Người thực hiện xét nghiệm có trình độ phù hợp.
2. Phƣơng tiện, hóa chất
- Pipettes thể tích 50, 100, 150 và 300 microL
- Đầu pipet dùng 1 lần
- Nước cất hoặc nước khử Ion
- 3.2 N HCL và 3,2 N NaOH (dùng cho xét nghiệm nước tiểu)
- Ống thủy tinh hay Polypropylene (dùng cho xét nghiệm nước tiểu)
- Nước rửa
- Máy lắc đĩa
- Máy đọc đĩa giếng với kính lọc 450nm và OD > 3.0 hoặc cao hơn
2.1. Các chất được cung cấp
- Đĩa chứa Kháng thể kháng-Aldosteron từ thỏ:
+ Thành phần: 1 dĩa chứa 96 (12x8) giếng trong túi nắp kéo, có chứa chất hút ẩm
+ Lưu trữ: 2-8C
+ Ổn định: 12 tháng hoặc xem hướng dẫn trên bao bì
- Aldosterone-Biotin: Avidin-Horse Radish Peroxidase (HRP) Conjugate Concentrate –
X50:
32
+ Thành phần: Aldosterone-Biotin và Avidin-Horse Radish Peroxidase (HRP)
Conjugate Concentrate trong dung dịch đệm gốc protein không chứa thủy ngân
+ Thể tích: 300 microL/lọ
+ Lưu trữ: 2-8C
+ Ổn định: 12 tháng hoặc xem hướng dẫn trên bao bì
+ Chuẩn bị: Pha loãng Aldosterone-Biotin và Avidin-HRP Concentrate 1:50 trong
dung dịch đệm xét nghiệm trước khi dùng. Nếu dùng hết đĩa thì pha 240 microL
HRP trong 12 ml dung dịch đệm xét nghiệm. Đổ bỏ phần thừa nếu có
- Aldosteron Chất chuẩn-Có sẵn:
+ Thành phần: 6 lọ chứa ldosterone trong dung dịch đệm gốc protein không chứa
thủy ngân
Calibrator
Concentration
Volume/Vial
Calibrator A
0 pg/ml
2.0 ml
Calibrator B
20 pg/ml
0.5 ml
Calibrator C
80 pg/ml
0.5 ml
Calibrator D
300 pg/ml
0.5 ml
Calibrator E
800 pg/ml
0.5 ml
Calibrator F
2000 pg/ml
0.5 ml
+ Lưu trữ: 2 – 8C
+ Ổn định: 12 tháng hoặc xem hướng dẫn trên bao bì. Khi mở ra thì phải dùng
trong vòng 14 ngày hoặc lưu trữ đông lạnh. Tránh đông và rã đông nhiều lần
- Chất chứng: Có sẵn:
+ Thành phần: 02 lọ chứa Aldosterone trong dung dịch đệm gốc protein không
chứa thủy ngân. Tham khảo nhãn lọ để biết giới hạn sử dụng
+ Thể tích: 0.5 mL/lọ
+ Lưu trữ: 2-80C
+ Ổn định: 12 tháng hoặc xem hướng dẫn trên bao bì. Khi mở ra thì phải dùng
trong vòng 14 ngày hoặc lưu trữ đông lạnh. Tránh đông và rã đông nhiều lần
- Wash Buffer Concentrate – X10:
+ Thành phần: 01 chai chứa dung dịch đệm không thủy ngân và chứa chất tẩy
non-ionic.
+ Thể tích: 50 mL/chai
+ Lưu trữ: 2-80C
+ Ổn định: 12 tháng hoặc xem hướng dẫn trên bao bì.
+ Chuẩn bị: Pha loảng 1:10 trong nước cất hoặc nước khử Ion. Nếu dùng hết đĩa
thì pha 50ml trong 450ml nước
- Assay Buffer – Có sẵn:
33
+ Thành phần: 01 lọ chứa dung dịch đệm gốc protein không thủy ngân.
+ Thể tích: 15 ml/lọ
+ Lưu trữ: 2-80C
+ Ổn định: 12 tháng hoặc xem hướng dẫn trên bao bì.
- Đệm TMB – Có sẵn:
+ Thành phần: 01 chai chứa Tetramethylbenzidine và Hydrogen Peroxide trong
Non-DMF hoặc DMSO chứa dd đệm.
+ Thể tích: 16 ml/chai
+ Lưu trữ: 2-80C
+ Ổn định: 12 tháng hoặc xem hướng dẫn trên bao bì.
- Dung dịch ngừng – Có sẵn:
+ Thành phần: 01 chai chứa 1M Sµlfuric Acid.
+ Thể tích: 6 ml/chai
+ Lưu trữ: 2-80C
+ Ổn định: 12 tháng hoặc xem hướng dẫn trên bao bì.
3. Ngƣời bệnh
Cần được tư vấn về mục đích xét nghiệm:
- Để chẩn đoán tình trạng cường Aldosteron tiên phát hay thứ phát.
- Để đánh giá sản xuất Aldosteron thượng thận.
- Để chẩn đoán phân biệt các rối loạn nước và điện giải.
4.Phiếu xét nghiệm
Phiếu xét nghiệm cần ghi đầy đủ thông tin về tên, tuổi, giới tính, khoa phòng, chẩn
đoán của người bệnh và ghi rõ chỉ định xét nghiệm.
III. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
- Xử lý mẫu:
- Huyết thanh: không cần
- Nước tiểu: Thủy phân, Trung hòa và Pha loãng
- Tất cả các chất cần phải đạt nhiệt độ phòng trước khi dùng. Mẫu bệnh, mẫu chứng,
mẫu chuẩn phải được xét nghiệm 2 lần. Khi một quy trình bắt đầu thì phải thực hiện
các bước hoàn chỉnh, không được ngừng lại.
- Chuẩn bị dung dịch conjugate và dung dịch rửa
- Tháo những dải số trên đĩa vi giếng. Dán miệng túi và cất những phần chưa dùng
vào tủ đông
- Dùng pipet hút 50 µl mỗi mẫu bệnh (huyết thanh hoặc nước tiểu), mẫu chuẩn, mẫu
chứng đưa vào giếng tương ứng, làm 2 lần.
- Dùng pipet hút 100 µl dung dịch conjugate cho vào mỗi giếng (nên dùng pipet loại
đa kênh)
- Ủ trên máy lắc đĩa (200 vòng/phút) trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng.
34
- Rửa giếng 3 lần bằng 300 µl nước rửa đệm đã pha loãng cho mỗi giếng và nắp chặt
đĩa lại bằng giấy hút ẩm để bảo đảm đĩa khô
- Dùng pipet hút 150 µl chất nền TMB cho vào mỗi giếng cùng một khoảng thời gian
như nhau
- Ủ trên máy lắc đĩa từ 10-15 phút ở nhiệt độ phòng (hoặc cho tới khi Calibraror
đạt màu xanh biển đậm)
- Hút 50 µl dd dừng cho mỗi giếng cùng khoảng thời gian như trong bước 7
- Đọc đĩa trên máy đọc ở 450 nm trong 20 phút sau khi thêm dung dịch ngừng vào
(Trình tự và thời gian thực hiện xét nghiệm theo bộ kit của công ty DRG
Internaltional, Inc., Mỹ)
IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Tính toán mật độ quang của mỗi mẫu chuẩn làm 2 lần
- Vẽ đường chuẩn trên giấy “semi-log” với trục Y là mật độ quang và trục X là nồng
độ chất chuẩn.
- Tính toán mật độ quang của mẫu
- Đọc giá trị của mẫu huyết thanh trực tiếp từ đường cong chuẩn. Nếu kết quả cao hơn
2000pg/ml thì phải pha loãng chất chuẩn ở tỉ lệ không quá 8 lần, khi đó giá trị đo
được phải nhân với hệ số pha loãng.
- Đọc giá trị của mẫu nước tiểu trực tiếp từ đường cong chuẩn và nhân với hệ số 60
từ. Kế tiếp, nhân với lượng nước tiểu trong vòng 24 giờ thu thập được (lít). Cuối cùng
chia với 1000 để đạt được giá trị µg/24 giờ. Nếu kết quả lớn hơn 2000 pg/ml, pha
loãng chất chuẩn nhưng không quá 2 lần, kết quả nhân lại với hệ số pha loãng.
- Nồng độ ldosteron thay đổi trong các trường hợp:
Bệnh
ldosteron huyết thanh
Renin huyết tương
Aldosteronism tiên phát
Cao
Thấp
ldosteronism thứ phát
Cao
Cao
V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
1. Lƣu ý và cảnh báo
- Mẫu kiểm tra ở cả mức độ cao và thấp và bệnh phẩm huyết thanh phải cùng tiến
hành mỗi lần để đánh giá độ tin cậy của kết quả.
- Phải dùng nước cất hoặc nước đã khử Ion để pha loãng
- Phải đeo găng tay khi làm thí nghiệm
- Tất cả mẫu phải được để ổn định ở nhiệt độ phòng trước khi dùng. Tránh việc đông và
tan đông mẫu lập lại
- Đường chuẩn phải được thiết lập cho mỗi lần chạy
35
- Tránh bọt khí trong giếng (Microwell) sẽ ảnh hưởng tới mật độ quang học (ODs). Cẩn
thận loại bỏ bọt khí trước khi đọc mẫu.
- Dung dịch nền (TMB) rất nhạy sáng và phải duy trì độ trong khi lưu trữ thích hợp.
Khi dung dịch có màu xanh thì có nghĩa là dung dịch bị nhiễm bẩn, không ổn định và
sẽ không được dung.
- Khi pha chế dung dịch nền và dung dịch dừng phản ứng, không được dùng pipet do
nguy cơ tiếp xúc với kim loại
- Các chất và dung dịch thừa sau thí nghiệm phải được xem như là chất thải độc hại và
phải tiêu hủy theo quy định.
2. Hạn chế
- Tất cả các tác chất được cân chỉnh dùng để xác định trực tiếp ldosteron trong huyết
thanh và nước tiểu người. Bộ kit này không dùng cho các mẫu vật khác của người
hoặc động vật
- Không dùng huyết thanh bảo quản không đúng, huyết thanh bị tán huyết và các vấn
đề khác
- Bất kỳ mẫu hay huyết thanh chứng chứa “azide” hoặc “thimerosal” đều không tương
thích với kit này
- Chỉ có Chất chuẩn mới có thể dùng để pha loãng mẫu huyết thanh hoặc nước tiểu.
Dùng các tác chất khác có thể làm kết quả sai lệch.