27
5. ĐỊNH LƢỢNG ADIPONECTIN
diponectin là một polypeptid gồm 244 axit amin. diponectin chủ yếu được
tổng hợp bởi các tế bào mỡ. Mức độ diponectin thấp liên quan chặt chẽ với sự đề
kháng insulin và hội chứng chuyển hóa, cũng như tăng nguy cơ đái tháo đường type 2
và bệnh tim mạch.
I. NGUYÊN LÝ
Dùng kỹ thuật ELIS để định lượng diponectin trong nuôi cấy tế bào, huyết
thanh và huyết tương người
Dựa vào tính đặc hiệu của kháng nguyên - kháng thể theo phương pháp
sandwich: các giếng được phủ kháng thể đặc hiệu cho diponectin người. Standard,
mẫu và Biotin-kháng thể được thêm vào, diponectin trong mẫu kết hợp với kháng
thể phủ trên giếng và Biotin-kháng thể mới được thêm vào. Sau khi rửa đi các Biotin-
kháng thể không kết hợp, thì HRP- Avidin liên hợp được thêm vào. Tiếp theo, sau khi
các giếng được rửa lần hai, cơ chất TMB được thêm vào giếng. Sau đó, dung dịch
ngừng phản ứng thêm vào sẽ chuyển dung dịch phản ứng từ màu xanh sang màu
vàng, đậm độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ diponectin trong mẫu, được đo ở bước
sóng 450 nm.
II. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
Bác sĩ, cử nhân, kỹ thuật viên được đào tạo với máy Evolis Twin Plus
2. Phƣơng tiện, hóa chất
- Máy phân tích ELIS (có thể Evolis Twin Plus)
- Thuốc thử được cung cấp của hãng DRG (Đức) (EI -4820)
+ Đĩa phản ứng (96 giếng)
+ HRP- Avidin liên hợp
+ Chuẩn: 2 lọ (dạng đông khô)
+ Cơ chất TMB
+ Biotin-kháng thể diponectin
+ Dung dịch rửa
+ Dung dịch pha loãng
+ Dung dịch ngừng phản ứng
28
Trong đó: HRP- vidin là vidin liên kết với HRP (Horseradish Peroxidase). TMB:
3,3’,5,5’ tetramethyl-benzidine.
- Thuốc thử và dụng cụ cần nhưng không được cung cấp
+ Pipet chính xác
+ Các tube
+ Đầu côn pipet dùng một lần
+ Nước cất
+ Control level 1 và 2.
3. Ngƣời bệnh
Người bệnh không cần nhịn đói hay yêu cầu gì.
4. Phiếu xét nghiệm
Phiếu xét nghiệm theo mẫu bệnh viện và Bộ Y tế quy định, có ghi đầy đủ thông tin
người bệnh.
III. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
1. Lấy bệnh phẩm
Sử dụng huyết thanh, huyết tương, dung dịch nổi trong nuôi cấy tế bào
- Huyết tương:
+ Thu thập huyết tương bằng cách sử dụng một phần mười thế tích natri citrat 0,1M
như một chất chống đông. Ly tâm mẫu với 3000 vòng trong 10 phút.
+ Pha loãng mẫu huyết tương với dung dịch pha loãng theo tỉ lệ 1:1000. Nên thực
hiện pha loãng theo hai bước, ví dụ:
B1: Pha loãng 1:100 (5 mẫu + 495 dung dịch pha loãng)
B2: Pha loãng 1:10 (100 mẫu đã pha loãng + 900 dung dịch pha loãng).
+ Không sử dụng máu đục, máu vỡ hồng cầu.
+ Mẫu chưa pha loãng có thể được lưu trữ ở -200C hoặc thấp hơn. Chỉ rã đông một
lần
- Huyết thanh:
+ Sau khi hình thành cục máu đông, ly tâm mẫu với 3000 vòng trong 10 phút.
+ Pha loãng mẫu huyết thanh với dung dịch pha loãng theo tỉ lệ 1:1000. Nên thực hiện
pha loãng theo hai bước như trên.
+ Mẫu chưa pha loãng có thể được lưu trữ ở -200C hoặc thấp hơn, ổn định được 3
tháng. Chỉ rã đông một lần.
29
- Dung dịch nổi trong nuôi cấy tế bào
+ Ly tâm với 3000 vòng/ phút, trong10 phút để loại bỏ các mảnh vụn.
+ Pha loãng dung dịch nổi trong nuôi cấy tế bào với dung dịch pha loãng mẫu theo tỉ
lệ 1:10
(Ví dụ: 10 mẫu + 90 dung dịch pha loãng)
+ Lưu trữ ở -200C hoặc thấp hơn. Chỉ rã đông một lần.
2. Tiến hành kỹ thuật
2.1. Chuẩn bị thuốc thử
Đưa tất cả thuốc thử về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.
2.1.1. Dung dịch rửa:
Hòa 50 ml dung dịch rửa với 950 ml nước cất để được dung dịch 1000 ml.
Sau khi pha, ổn định 3 ngày ở nhiệt độ phòng, 2 tuần ở 80C
2.1.2. Chuẩn:
- Lọ chuẩn gốc có nồng độ 30 ng/mL
- Pha loãng nhiều lần với dung dịch pha loãng để được S4 - S1với các nồng độ tương
ứng là 15 ng/mL; 5 ng/mL; 1,67 ng/mL; 0,56 ng/mL; 0,185 ng/mL và S0 là dung dịch
pha loãng (0 ng/mL)
- Chuẩn thì không ổn định sau khi pha loãng sử dụng ngay sau khi pha loãng hoặc
làm đông nếu không sử dung trong vòng 1 giờ.
c. Biotin-kháng thể và HRP-Avidin
Votex đều, nhẹ nhàng trước khi dùng.
2.2. Tiến hành
- Tiến hành theo quy trình cài đặt trên máy tự động EVOLIS TWIN PLUS.
- Thời gian hoàn thành xét nghiệm này khoảng 255 phút
- Vẽ đường cong chuẩn trước, control đạt thì tiến hành đo mẫu.
Các bước tiến hành như sau:
+ Hút 50 μl mỗi calibrator/ QC hoặc mẫu người bệnh vào các giếng
+ Ủ 120 phút ở nhiệt độ phòng
+ Rửa các giếng 5 lần với 300 dung dịch rửa cho mỗi giếng trong một lần rửa
+ Hút 50 μl Biotin - kháng thể vào mỗi giếng
+ Ủ 60 phút ở nhiệt độ phòng
30
+ Rửa các giếng 5 lần với 300 μl dung dịch rửa cho mỗi giếng trong một lần rửa
+ Hút 50 μl HRP- vidin liên hợp vào mỗi giếng
+ Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng
+ Rửa các giếng 5 lần với 300 μl dung dịch rửa cho mỗi giếng trong một lần rửa
+ Hút 50 μl cơ chất TMB vào mỗi giếng.
+ Ủ 20 phút ở nhiệt độ phòng.
+ Hút 25 μl dung dịch ngừng phản ứng vào mỗi giếng
+ Tiến hành đo với bước sóng 450/630 nm ngay lập tức
IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Giá trị tham khảo:
Nam trưởng thành: 8000 – 10000 ng/mL (8 -10 mg/L)
Nữ trưởng thành : 10000 – 12000 ng/mL (10 - 12 mg/L)
- Ý nghĩa lâm sàng: diponectin giảm có nguy cơ bị các bệnh sau:
• Bệnh béo phì
• Xơ vữa động mạch
• Bệnh động mạch vành
• Hội chứng chuyển hóa
Bổ sung omega-3, tăng cường chất xơ trong khẩu phần hàng ngày, hoặc tập thể dục
điều độ giúp làm tăng nồng độ adiponectin.
V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
Có một số sai sót thường gặp:
- Lấy sai ống lấy lại
- Tuyệt đối không sử dụng máu vỡ hồng cầu, máu đục, máu vàng
- Mẫu máu ở người bệnh có dùng thuốc chống đông thì thời gian co cục máu lâu hơn
trước khi ly tâm (hơn 30 phút)
- Mẫu có kết quả vượt quá 15 ng/mL thì phải hòa loãng mẫu với dung dịch pha loãng.
- Những sai sót do máy thì hỏi kỹ sư để xử trí.
- Lưu ý Calibrator và QC bảo quản thật tốt để có đường cong chuẩn đạt yêu cầu.