Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sản xuất chế phẩm NPV (Nucleo polyhedrosis virus) trên ký chủ sâu khoang (Spodoptera litura)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM VIỆN KHOA HỌC ỨNG DỤNG HUTECH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG

ĐẾN SẢN XUẤT CHẾ PHẨM NPV (NUCLEO

POLYHEDROSIS VIRUS) TRÊN KÝ CHỦ SÂU

KHOANG (SPODOPTERA LITURA)

Ngành Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

: T.S NGUYỄN THỊ HAI

Giảng viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện: NGUYỄN HIỀN LONG 1411100061 MSSV: Lớp: 14DSH01

Thành phố Hồ Chí Minh, 2018

LỜI CAM ĐOAN

Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của chúng tôi dưới sự hướng dẫn

của Tiến sĩ Nguyễn Thị Hai Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH của trường Đại học

Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Những kết quả này hoàn toàn không sao chép từ các nghiên cứu khoa học khác

dưới bất kỳ hình thức nào.

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 07 năm 2018

Nguyễn Hiền Long

Sinh viên thực hiện

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, chúng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình chúng em. Cảm ơn bố mẹ

đã nuôi nấng và tạo điều kiện cho chúng em học tập để chúng em có thành quả như

Trong suốt khoảng thời gian học tại trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí

Minh, chúng em đã được các Thầy Cô trong Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH hết lòng

hướng dẫn, giúp đỡ chúng em trong quá trình học tập tại trường, cũng như trong quá trình

thực hiện đồ án. Chúng em xin chân thành cám ơn đến Thầy Cô, nhờ có Thầy Cô đã trang bị kiến thức cho chúng em để có thể thực hiện đồ án này. Chúng em cũng

ngày hôm nay.

xin cảm ơn Thầy Cô trong phòng thí nghiệm và các bạn cùng khóa đã quan tâm, giúp

đỡ và tạo điều kiện để chúng em hoàn thành đồ án tốt nghiệp. Đặc biệt, chúng em xin chân thành cảm ơn Tiến sĩ Nguyễn Thị Hai đã tận tình

hướng dẫn, chỉ bảo chúng em trong suốt quá trình thực hiện đồ án. Cuối cùng, chúng em xin cảm ơn các Thầy Cô trong hội đồng Phản Biện đã

dành thời gian đọc và nhận xét đồ án tốt nghiệp này. Chúng em xin gửi đến Thầy Cô

lời chúc sức khỏe trân trọng nhất.

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 07 năm 2018

Nguyễn Hiền Long

Sinh viên thực hiện

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1

1. Tính cấp thiết của đề tài ......................................................................................... 1

2. Mục đích nghiên cứu .............................................................................................. 1

3. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................... 1

4. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 2

CHƯƠNG I ..................................................................................................................... 3 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................................. 3

1.1.1 Đặc điểm hình thái của sâu khoang ......................................................................... 3 1.1.2 Tập tính sống và quy luật phát sinh gây hại ............................................................ 4 1.1.3 Mức độ gây hại ........................................................................................................ 6

1.1 Giới thiệu về sâu khoang Spodoptera litura ........................................................ 3

1.2.1 Biện pháp canh tác, kỹ thuật ................................................................................... 6 1.2.2 Biện pháp sinh học .................................................................................................. 6

1.2 Các biện pháp phòng trừ sâu khoang ................................................................. 6

1.3.1 Giới thiệu chung ...................................................................................................... 7 1.3.2 Đặc điểm hình thái của NPV ................................................................................... 9 1.3.3 Cơ chế diệt sâu của NPV ...................................................................................... 11 1.3.4 Hiệu lực diệt sâu của NPV .................................................................................. 113 1.3.5 Ưu điểm và nhược điểm của NPV ....................................................................... 14 1.3.5.1 Ưu điểm của chế phẩm NPV ............................................................................. 14 1.3.5.1 Nhược điểm của chế phẩm NPV ....................................................................... 15

1.3. Giới thiệu về Nucleo Polyhedrosis Virus ............................................................ 7

1.4.1 Các nghiên cứu ngoài nước .................................................................................. 15 1.4.2 Các nghiên cứu trong nước .................................................................................. 17

1.4 Các nghiên cứu sử dụng NPV để trừ sâu khoang .......................................... 135

1.5.1 Nồng độ lây nhiễm ............................................................................................... 18 1.5.2 Tuổi sâu ................................................................................................................ 19 1.5.3 Thời gian thu hoạch sâu chết ................................................................................ 19

1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sản xuất chế phẩm NPV ...................................... 18

1.6 Quy trình sản xuất chế phẩm NPV .................................................................. 20

1.7 Các sản phẩm NPV trên thị trường ................................................................. 22

CHƯƠNG II ................................................................................................................ 23 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 23

2.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................................ 23 2.1.2 Vật liệu ................................................................................................................. 23 2.1.3 Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm ........................................................................... 23 2.1.3.1 Hóa chất ............................................................................................................. 23 2.1.3.2 Dụng cụ ............................................................................................................. 23

2.1 Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu ........................................................................ 23

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu ............................................................. 24

2.2.1 Ảnh hưởng của tuổi sâu và nồng độ lây nhiễm đến sản lượng NPV ............. 24 2.2.1.1 Chuẩn bị dịch huyền phù NPV .......................................................................... 25 2.2.1.2 Chuẩn bị nguồn sâu ký chủ ............................................................................... 26 2.2.1.3 Các nghiệm thức bố trí ...................................................................................... 28 2.2.2 Ảnh hưởng của dịch thô và dịch ly tâm sử dụng lây nhiễm đến sự nhân lên của virus trong cơ thể sâu ........................................................................................... 30 2.2.2.1 Chuẩn bị nguồn sâu ký chủ ............................................................................... 31 2.2.2.2 Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí ................................................................. 33 2.2.3 Ảnh hướng của thời gian lây nhiễm sâu đến sản lượng NPV ........................ 35 2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu ................................................................................. 36 CHƯƠNG III ............................................................................................................... 37 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................................... 37

3.1.1 Đánh giá hiệu lực diệt sâu (%) của các nồng độ trên sâu 7 ngày tuổi, 9 ngày tuổi và 11 ngày tuổi .............................................................................................................. 37 3.1.2 Đánh giá sản lượng NPV thu được trên tổng số sâu chết ở các độ tuổi và các nồng độ lây nhiễm .................................................................................................................. 39

3.1 Ảnh hưởng của tuổi sâu và nồng độ lây nhiễm đến sản lượng NPV ............. 37

3.2 Ảnh hưởng của dịch thô và dịch ly tâm sử dụng lây nhiễm đến sự nhân lên

3.2.1 Đánh giá hiệu lực diệt sâu (%) của dịch thô và dịch ly tâm................................. 41 3.2.2 Khối lượng sâu chết (g/sâu) ở công thức dịch thô và dịch ly tâm ....................... 42 3.2.3 Tổng vi sinh vật hiếu khí có trong thức ăn sau khi nhiễm 01 ngày ..................... 43 3.2.4 Đánh giá sản lượng virus có trong mỗi sâu chết (PIB/sâu chết) giữa công thức dịch thô và dịch ly tâm .......................................................................................................... 44

của virus trong cơ thể sâu ....................................................................................... 41

3.3 Ảnh hướng của thời gian lây nhiễm sâu đến sản lượng NPV ........................ 44

3.3.1 Đánh giá hiệu lực diệt sâu (%) của các công thức sau 6h, 12h, 24h, 48h, 96h lây nhiễm ............................................................................................................................. 44 3.3.2 Khối lượng sâu chết (g) và sản lượng virus (PIB/sâu chết) ở các công thức sau 6h, 12h, 24h, 48h, 96h lây nhiễm…………………………………………………………..46 CHƯƠNG IV ............................................................................................................... 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................... 48

4.1 Kết luận ............................................................................................................... 48

4.2 Kiến nghị ............................................................................................................. 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 49 Tài liệu Tiếng Việt ....................................................................................................... 49 Tài liệu Tiếng Anh ....................................................................................................... 49 Tài liệu Internet ........................................................................................................... 56 PHỤ LỤC 1 .................................................................................................................. 57 DANH MỤC HÌNH ẢNH ........................................................................................... 57

Công thức 1 – Dịch thô .............................................................................................. 57

Công thức 2 – Dịch ly tâm ......................................................................................... 58

Công thức 3 – Đối chứng ........................................................................................... 58

Sâu chết ở công thức ảnh hưởng về thời gian…………………………………...…....62

Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí ......................................................................... 59

PHỤ LỤC 2 .................................................................................................................. 63 SỐ LIỆU THÔ ............................................................................................................. 63

1.1 Hiệu lực diệt sâu…………………………………………….……………….……..63 1.2 Sản lượng virus thu được trên tổng số sâu chết…………………………………….67

1. Ảnh hưởng của tuổi sâu và nồng độ lây nhiễm ................................................. 63

2.1 Số sâu chết ............................................................................................................... 68 2.2 Khối lượng sâu ở các công thức ............................................................................. 701 2.3 Sản lượng virus ở các công thức ............................................................................. 73

2. Ảnh hưởng của dịch thời gian lây nhiễm ........................................................... 68

3. Ảnh hưởng của dịch ly tâm và dịch thô ............................................................. 75

3.1 Số sâu chết ở công thức dịch thô và dịch ly tâm ..................................................... 75 3.2 Khối lượng sâu chết ở công thức dịch thô và dịch ly tâm....................................... 76 3.3 Sản lượng virus ở công thức dịch thô và dịch ly tâm .............................................. 77 3.4 Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí ở công thức dịch thô và dịch ly tâm ............. 77 PHỤ LỤC 3 .................................................................................................................. 78 XỬ LÝ SỐ LIỆU ......................................................................................................... 78

1. Hiệu lực diệt sâu sau 8 ngày lây nhiễm của các nồng độ ở sâu 7, 9, 11 ngày tuổi . 78

2. Sản lượng NPV thu được trên tổng số sâu chết ở các độ tuổi và các nồng độ lây

nhiễm.......................................................................................................................... 79

3. Hiệu lực diệt sâu (%) của dịch thô và dịch ly tâm ................................................. 80

4. Khối lượng (g) sâu chết ở công thức dịch thô và dịch ly tâm ............................... 86

5. Sản lượng virus (PIB/sâu chết) ở công thức dịch thô và dịch ly tâm .................... 86

6. Tổng vi sinh vật hiếu khí sau khi nhiễm 1 ngày .....................................................87 7. Hiệu lực diệt sâu ở công thức sau 6h, 12h, 24h, 48h, 96h ......................................88 8. Khối lượng (g) sâu chết ở công thức sau 6h, 12h, 24h, 48h, 96h ...........................91 9. Sản lượng virus (PIB/sâu chết) ở công thức sau 6h, 12h, 24h, 48h, 96h ...............92

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

NPV: Nucleopolyhedrosis virus PIB: Polyhedral inclusion body SL: Spodoptera litura CT: Công thức ĐC: Đối chứng

LT: Ly tâm CLT: Chưa ly tâm

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Spodoptera litura .............................................................................................. 3 Hình 1.2 Vòng đời sâu khoang ........................................................................................ 4 Hình 1.3 Cấu tạo của Nucleo Polyhedrosis Virus ........................................................... 8 Hình 1.4 Cơ chế diệt sâu của virus NPV vào côn trùng ............................................... 12 Hình 1.5 Chu trình sống của virus côn trùng................................................................ 12 Hình 1.6 Biểu hiện của sâu chết do NPV. .................................................................... 13 Hình 1.7 Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm virus trừ sâu .................................. 20 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tuổi sâu và nồng độ lây nhiễm đến sản lượng NPV ........................................................................ 24 Hình 2.2 Sơ đồ các bước tinh sạch dịch NPV .............................................................. 25 Hình 2.3 Nguồn sâu làm thí nghiệm ............................................................................. 26 Hình 2.4 Thức ăn nhân tạo ........................................................................................... 27 Hình 2.5 Quy trình nuôi sâu phòng thí nghiệm ............................................................ 27 Hình 2.6 Bố trí thí nghiệm ............................................................................................ 28 Hình 2.7 Quy trình tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của dịch thô và dịch ly tâm sử dụng lây nhiễm đến sự nhân lên của virus ........................................................ 30 Hình 2.8 Quy trình nuôi sâu phòng thí nghiệm ............................................................ 31 Hình 2.9 Sâu tuổi 4 ....................................................................................................... 32 Hình 2.10 (A) CT1-Dịch thô; (B) CT2-Dịch ly tâm; (C) CT3-Đối chứng .................. 33 Hình 2.11 Quy trình định lượng vi sinh vật hiếu khí ................................................... 34 Hình 2.12 Sơ đồ quy trình tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm sâu đến sản lượng NPV ...................................................................................... 35 Hình 3.1 Biểu đồ thể hiện hiệu lực diệt sâu (%) ở công thức dịch thô, dịch ly tâm .... 42 Hình 3.2 Biểu đồ thể hiện hiệu lực diệt sâu (%) ở công thức 6h, 12h, 24h, 48h, 96h .. 45

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng tuổi sâu và nồng độ lây nhiễm ........................ 29 Bảng 3.1 Hiệu lực diệt sâu (%) của các nồng độ NPV trên sâu 7 ngày tuổi, 9 ngày tuổi, 11 ngày tuổi ................................................................................................................... 37 Bảng 3.2 Sản lượng NPV thu được ở các độ tuổi và nồng độ nhiễm ........................... 39 Bảng 3.3 Hiệu lực diệt sâu (%) của dịch thô và dịch ly tâm ........................................ 41 Bảng 3.4 Khối lượng sâu chết nhiễm NPV của dịch thô và dịch ly tâm ...................... 42 Bảng 3.5 Kết quả định lượng vi sinh vật hiếu khí sau 01 ngày nhiễm giữa các công thức dịch thô và dịch ly tâm .......................................................................................... 43 Bảng 3.6 Sản lượng virus có trong mỗi sâu ở công thức dịch thô và dịch ly tâm ........ 44 Bảng 3.7 Hiệu lực diệt sâu (%) ở các công thức sau 6h, 12h, 24h, 48h, 96h lây nhiễm 44 Bảng 3.8 Khối lượng sâu chết (g) và sản lượng virus PIB/sâu chết ơ các công thức sau 6h, 12h, 24h, 48h, 96h lây nhiễm .................................................................................. 46

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Sâu khoang S.litura là loài sâu ăn tạp, gây hại trên nhiều loài cây trồng (Matsuura

and Naito 1997; Sahayaraj and Paulraj 1998). Các nghiên cứu cho biết, sâu khoang đã

kháng lại với nhiều loại thuốc trừ sâu hóa học dẫn đến sự bùng phát thành dịch và sự thất

bại của biện pháp quản lý loài sâu hại này (Ahmad et al. 2007, Hong Tong et al, 2013).

Biện pháp sinh học đã được quan tâm và sử dụng để quản lý sâu khoang ăn tạp, trong đó

có virus côn trùng thuộc họ Baculovirus. Nucleopolyhedrosis thuộc họ Baculovirus đã

được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu do khả năng gây chết sâu cao nhưng lại an toàn đối với thiên địch và và các sinh vật khác bao gồm động vật có vú và thực vật (Tohnishi et

al., 2005; Shaurub et al., 2014; Nasution et. al., 2015). Vì vậy, NPV (Nucleo Polyhedrosis

Virus), được khuyến cáo sử dụng trong hệ thống phòng trừ tổng hợp.

Tại trường đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, SLNPV (NPV Spodoptera

litura) đã được phân lập và đã được chứng minh có hiệu quả cao đối với sâu khoang ăn tạp

(Nguyễn Thị Hai và Nguyễn Hoài Hương, 2015). Việc sản xuất NPV trên sâu ký chủ bước

đầu đã được thực hiện nhưng vẫn còn nhiều vấn đề tồn tại (Nguyễn Thị Hai và cộng sự,

2014). Trên cơ sở đó, nhóm sinh viên tiến hành đề tài “Nghiên cứu các yếu tố ảnh

hưởng đến sản xuất NPV (Nucleo polyhedrosis virus) trên ký chủ sâu khoang

Spodoptera litura”. 2. Mục đích nghiên cứu Xác định tuổi sâu, nồng độ lây nhiễm và thời gian lây nhiễm, loại dịch gốc lây

nhiễm để sản xuất SLNPV. 3. Mục tiêu nghiên cứu

Đưa ra được tuổi sâu và nồng độ lây nhiễm phù hợp để sản xuất NPV

Đưa ra được thời gian phơi nhiễm sâu đạt tỷ lệ chết cao.

Xác định được loại dịch giống để nhân virus.

4. Nội dung nghiên cứu

Khảo sát ảnh hưởng của tuổi sâu và liều lượng nhiễm đến sản lượng NPV.

Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm sâu đến hiệu lực gây chết và sản

lượng NPV. Khảo sát ảnh hưởng của dịch thô và dịch ly tâm sử dụng lây nhiễm đến sự nhân

lên của virus trong cơ thể sâu.

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về sâu khoang Spodoptera litura

Tên khoa học: Spodoptera litura

Tên thường gọi: Sâu khoang, Sâu bông, Sâu thuốc lá, Sâu bông Ai Cập,.. Họ: Noctuidae

Bộ: Lepidoptera

Hình 1.1 Spodoptera litura (Ahmad cheraghian, 2014)

1.1.1 Đặc điểm hình thái của sâu khoang

Trứng có hình cầu, kích thước khoảng 0,35-0,45mm. Trứng được đẻ thành ổ, từ

20-350 trứng mỗi ổ. Thông thường mỗi ổ trứng được bao phủ bằng lông tơ từ bụng con

cái, có màu trắng kem tới nâu nhạt; lớp lông tơ này thường rất rõ ràng, nhưng đôi khi

chỉ có một ít xuất hiện trên ổ trứng. Bề mặt trứng có những đường khía dọc từ đỉnh

trứng xuống đến đáy và bị cắt ngang bởi những đường khía ngang tạo thành những ô

Sâu non mới nở có màu xanh sáng, dài khoảng 1mm, đầu to đen bóng. Sâu non đẫy

sức có màu xám tro đến nâu đen, vạch lưng màu vàng ở đốt bụng thứ nhất có khoang đen to nên được gọi là sâu khoang. Sâu có 5- 6 tuổi, đẫy sức trước khi hóa nhộng dài 38-50 mm. Sâu làm nhộng trong đất (Hill, 1975; USDA, 1982; CABI,2009).

nhỏ (Pearson, 1958; CABI, 2009).

Nhộng dài từ 15-22mm, có màu xanh nõn chuối, rất mềm ngay khi mới được

hình thành, sau đó chuyển dần sang màu vàng xanh, cuối cùng có màu nâu, thân cứng

dần và có màu nâu đỏ. Khi sắp vũ hoá, nhộng có màu nâu đen, các đốt cuối của nhộng

có thể cử động được. Mép trước đốt bụng thứ 4 và vòng quanh mép trước đốt bụng thứ

5-7 có nhiều chấm lõm, cuối bụng có một đôi gai ngắn (USDA, 1982; CABI, 2009). Trưởng thành có chiều dài thân khoảng 14-18 mm, sải cánh rộng từ 35-45mm.

Cánh trước màu nâu vàng, giữa cánh có vân trắng, cánh sau màu trắng óng ánh. Ngực và bụng màu màu nâu nhạt với những chùm lông trên bề mặt lưng (Hill, 1975; USDA, 1982). 1.1.2 Tập tính sống và quy luật phát sinh gây hại

Vòng đời của sâu khoang được ghi nhận như sau:

Thời gian trứng: 2-6 ngày;

Sâu non có 6 tuổi: 12-37 ngày;

Tiền nhộng: 1-4 ngày;

Nhộng: 4-14 ngày;

Trưởng thành: 5-8 ngày;

Vòng đời trung bình của sâu khoang từ 25-48 ngày

Hình 1.2 Vòng đời sâu khoang

(http://tiennong.vn/w79/sau-khoang-sau-an-tap-hai-rau-dau-spodoptera-litura.aspx).

Hai đến năm ngày sau khi vũ hóa, trưởng thành cái bắt đầu đẻ trứng, một trưởng

thành cái đẻ từ 50 đến 300 trứng theo từng ổ ở mặt dưới của lá (ký chủ). Trứng nở

trong ba đến bốn ngày (Chari và Patel, 1983). Một trưởng thành cái có thể đẻ là 1.500 đến 2.500 trứng trong khoảng sáu đến tám ngày. Cây thầu dầu là loại vật chủ được ưa

chuộng nhất cho các con cái đẻ trứng (Chari và Patel, 1983). Các cánh đồng mới được

Sâu khoang thường trải qua 6 tuổi. Sâu tuổi 1 đến tuổi 3 không lẩn trốn ánh sáng.

Sâu từ tuổi 4 đến tuổi 6 chui xuống đất, có hiện tượng lẫn trốn ánh sáng nên ban ngày

thường ẩn nấp ở những chỗ kín trên mặt đất, hoặc chui xuống những khe nhỏ ở dưới mặt đất và đến tối thì chui lên để gây hại. Khi sâu đủ sức thì chui xuống đất hoá nhộng,

tưới nước cũng rất hấp dẫn đối với những con cái đẻ trứng.

trước khi hoá nhộng nó làm một cái kén bằng đất có hình bầu dục rồi chui vào đó hoá

Nhộng thường vũ hoá vào buổi chiều mát và vào lúc chập tối, sau khi vũ hoá vài

giờ, trưởng thành có thể bắt đầu giao phối và vào đêm hôm sau thì bắt đầu đẻ trứng. Tuổi

thọ trung bình của trưởng thành cái là 8,3 ngày và có thể đẻ được 2.673 trứng. Tuổi thọ

trung bình của trưởng thành đực là 10,4 ngày (Yamanaka và cộng sự, 1975; Ahmed và

cộng sự, 1979). Theo Yamanaka và cộng sự. (1975), trung bình một trưởng thành cái có

thể đẻ được 2000 – 2600 quả, thời gian đẻ trong trong khoảng 5 ngày ở 25°C (77°C).

Sâu khoang phá nhiều loại cây nên có mặt quanh năm trên đồng ruộng. Sâu cắn phá

mạnh vào lúc sáng sớm nhưng khi có ánh nắng, sâu chui xuống dưới tán lá để ẩn nắp.

Chiều mát sâu bắt đầu hoạt động trở lại và phá hại suốt đêm. Sâu vừa nở sẽ gặm vỏ trứng

và sống tập trung 1-2 ngày, nếu bị động sâu sẽ bò ra phân tán nhiều chỗ hoặc nhả tơ buông

mình xuống đất. Sâu tuổi 1-2 chỉ ăn gặm phần diệp lục của lá và chừa lại lớp biểu bì trắng,

từ tuổi 3 trở đi sâu ăn phá mạnh cắn thủng lá và gân lá. Ở tuổi lớn khi thiếu thức ăn, sâu

còn tập tính ăn thịt lẫn nhau và không những ăn phá lá cây mà còn ăn trụi cả thân, cành,

trái non. Sâu non phát triển thích hợp ở nhiệt độ và ẩm độ cao. Khi làm nhộng, sâu chui

nhộng. (Chari và Patel, 1983).

xuống đất làm thành một khoang và nằm yên trong đó hóa nhộng (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004)

1.1.3 Mức độ gây hại

Sâu khoang ăn tạp (Spodoptera litura) là loài sâu hại nguy hiểm cho nền nông

nghiệp của nhiều nước ở châu Á, châu Phi và vùng Thái Bình Dương. Loài sâu này ăn

tạp và gây hại cho hơn 150 loài cây trồng khác nhau và là loài sâu hại chính trên các

loài cây trồng có giá trị kinh tế như bông, đậu nành, cà chua, thuốc lá, bắp, khoai tây và

các loài cây rau ăn lá (Hill, 1993 ; Rao et al, 1993). Sâu khoang phân bố khắp nơi trên

thế giới và gây hại nặng cho nhiều nước nhiệt đới như: Ấn Độ, Pakistans, Banglades,

Srilanca, Indonesia, Philippin, Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Úc, Hawaii, các

nước Đông Nam Á (Hill, 1993; Singh and Jalali, 1997). Các biện pháp phòng trừ sâu khoang Biện pháp canh tác, kỹ thuật

Vệ sinh đồng ruộng trước và sau khi trồng, cày ải phơi đất, phơi và xử lý thuốc

trừ sâu hoặc cho ruộng ngập nước 2-3 ngày để diệt nhộng, sâu non có trong đất. Phải thường xuyên đi thăm ruộng để kịp thời phát hiện sâu, ngắt bỏ ổ trứng hoặc

tiêu diệt sâu non mới nở khi chưa phân tán đi xa. 1.2.2 Biện pháp sinh học

Hạn chế phun thuốc để bảo tồn các loài thiên địch thường xuất hiện trên ruộng.

Nhiều tác nhân sinh học đã được sử dụng để trừ sâu khoang ăn tạp như: các loại nấm

côn trùng Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Paecilomyces fumosorosea

Ngài sâu khoang có khuynh hướng thích mùi chua ngọt và ánh sáng đèn, do đó có

thể dùng bẫy bả chua ngọt để thu hút bướm khi chúng phát triển rộ. Bả chua ngọt gồm 4

phần giấm + 1 phần mật + 1 phần rượu + 1 phần nước. Sau đó đem bả mồi vào chậu rồi

đặt ở ngoài ruộng vào buổi tối nơi thoáng gió có độ cao 1m so với mặt đất. Dùng bẫy

pheromone để dự báo trước sự đẻ trứng của sâu ăn tạp. Hàng ngày theo dõi dự báo sự

(Asi et al, 2013), vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Agsaoay, 1998).

phát triển của sâu qua bẫy pheromone, thường xuyên ngắt bỏ ổ trứng và diệt ấu trùng trên những ruộng dẫn dụ.

Dùng hoa hướng dương hay các loài cây có thể dẫn dụ sâu ăn tạp trồng xung

quanh ruộng canh tác để dễ dàng tiêu diệt. Dùng sản phẩm sinh học có nguồn gốc nấm, vi khuẩn khi có những dấu hiệu cắn

Các loại chế phẩm vi sinh: thuốc có nguồn gốc từ Bt như V-BT; Biocin 8000 SC,

phá lá đầu tiên. Thông thường 10 ngày sau phải phun thuốc lại.

Dipel 32 WP hoặc thuốc thảo mộc như Rotenone hoặc Neem. Có thể dùng thuốc gốc

Cúc tổng hợp như Karate 2.5 EC, SecSaigon 5 EC… /. các loại thuốc có hoạt chất

Nucleo Polyhedrosis Virus (NPV) thuộc nhóm Baculovirus, là virus ký sinh trong

nhân tế bào chủ và có thể vùi hình đa diện. Nucleo Polyhedrosis Virus (NPV) là virus có

thể bao hàm (một tập hợp các hạt virus hay còn gọi là virion và được bao bọc bởi một lớp

vỏ protein) hình đa diện còn gọi là PIB (Polyhedral inclusion body). Virus nhân lên và tạo

các thể bọc trong nhân của tế bào vật chủ. Thể bao hàm của NPV có kích thước từ 0,15 -

15µm bên trong chứa nhiều hạt virus (virion) có vỏ bọc. Loại virus này có thể gây hại trên

400 loài côn trùng và lây bệnh rất mạnh với nhiều loại côn trùng thuộc bộ cánh vảy

Lepidoptera, tập trung ở 2 họ chủ yếu ngài đêm Noctuidae, ngài sáng Pyralidae. Ngoài ra

Emamectin; Lufenuron hay hỗn hợp (Chlorantraniliprole + Abamectin)… Giới thiệu về Nucleo Polyhedrosis Virus Giới thiệu chung

chúng còn gây chết trên các bộ khác như bộ cánh màng (31 loài), bộ 2 cánh (27 loài)

(Grzywacz et al, 2005).

Hình 1.3 Cấu tạo của Nucleo Polyhedrosis Virus (Jean Adams, 2012)

(A) Các hạt Baculovirus, hay được gọi là thể vùi (PIBs). (B) Mặt cắt ngang của PIB.

(C) Sơ đồ mặt cắt đa diện hoặc mặt cắt PIB hiển thị nhiều nucleocapsids bên trong mỗi

virion, các virion được bao bọc bởi lớp vỏ protein.

NPV có tính chuyên hóa rất cao. Thông thường, NPV của loài sâu nào chỉ ký sinh

và gây chết loài sâu đó (chuyên tính cho từng loài, theo FAO, 2003). Chỉ có một số có phổ

ký chủ tương đối rộng như AcMNPVgây nhiễm hơn 30 loài thuộc 10 họ của bộ cánh vảy,

Anagrapha falcifera NPV gây nhiễm 31 loài thuộc 10 họ của cánh vảy Lepidoptera và

MbMNPV gây nhiễm 32 loài thuộc bộ cánh vảy (Gröner, 1986; Doyle et al., 1990,

Hostetter and Puttler, 1991). NPV của sâu thuộc chi Helicoverpa có thể gây chết 5 loài

sâu thuộc chi này Khả năng phòng trừ sâu khoang của chế phẩm NPV: Kinh nghiệm của các nước

trên thế giới cho thấy, việc sử dụng bừa bãi thuốc hóa học đã không thể quản lý được

sự bùng phát và gây hại của các loài sâu bộ cánh vảy nói chung và sâu khoang nói

riêng. Các nghiên cứu cho thấy, sâu khoang ăn tạp đã kháng lại với nhiều loại thuốc trừ

sâu hóa học thuộc nhóm Carbamate, lân hữu cơ và Pyrethroid (Venkateswarlu và cộng

sự, 2005). Nhiều biện pháp thay thế mang tính thân thiện với môi trường đã được sử dụng.

Trong số đó, NPV được coi là tác nhân hứa hẹn nhất và cho kết quả tương đương với

thuốc hóa học (Rober et al, 1991; Ravishanka and Venkatesha, 2010; Hochberg, 1991;

Gitanjali et al, 1994; Vinay, 1997). Virus côn trùng đặc biệt là NPV có hiệu quả cao

đối với các loài sâu bộ cánh vảy như sâu xanh Helicoverpa armigera, sâu khoang

Spodoptera litura, sâu xanh da láng Spodoptera exigua (Vinod Kumari and Singh,

2009). Các nghiên cứu chỉ ra rằng, sâu khoang ăn tạp rất mẫn cảm với NPV và NPV

này đã được sử dụng rộng rãi như một loại thuốc trừ sâu khoang ở nhiều quốc gia trên

thế giới (Jayaraj et al, 1980, Ravishanka and Venkatesha, 2010). 1.3.2 Đặc điểm hình thái của NPV

NPV có cấu trúc hình học, 5 - 6 đến 20 cạnh với nhiều nhóm virus khác nhau.

Các axit nucleic (ADN, ARN) gồm dạng sợi đơn và sợi đôi. Theo Nguyễn Thị Như Quỳnh (2014), NPV có cấu tạo gồm: vỏ ngoài, vỏ

capsid, và lõi acid nucleic.

Vỏ ngoài: là một lớp màng nhầy ngoài cùng có tính chất là protein và gọi là protein ngoài. Protein ngoài mang trính kháng nguyên và có tác dụng kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể vật chủ. Vỏ capsid: Vỏ capsid nằm kế tiếp bên trong lớp vỏ ngoài và được ngăn cách với

lớp vỏ ngoài bởi một lớp keo dính. Protein cấu tạo nên vỏ Capsid được gọi là protein

trong. Protein trong mang tính kháng nguyên làm tăng khả năng gây bệnh của virus. Genom: Genom của virus NPV là một phân tử DNA gồm 2 mạch xoắn kép

(DNAds). Khi nhiễm vào tế bào vật chủ virus tuồn lõi DNA vào tế bào vật chủ, DNA

của virus sử dụng năng lượng, nguyên liệu và riboxom của tế bào vật chủ để tổng hợp

nên protein và quá trình nhân lên của DNA. Mặt khác khi tế bào bị nhiễm virus, DNA

của vi rút sinh ra men azenaza ức chế DNA của tế bào chủ và phân giải tạo thành các

để tạo thành thể virus mới.

nucleotit tự do. Sau khi tổng hợp đủ các thành phần như vỏ, DNA (lõi...), virus tiến hành lắp ráp

Theo Phạm Thị Thùy (2004), virus thuộc nhóm này có dạng hình que, kích thước

từ 40 - 70 nm x 250 - 400 nm, bên ngoài là một lớp vỏ có cấu tạo từ lipoprotein bao quanh

một lớp protein nằm trong lõi DNA (Nucleocapsid), trong có chứa các virion, các virion

bao gồm 11 - 25 polypeptide. Trong số polypeptide đó thì có khoảng 4 - 11 polypeptide

được kết hợp với nucleocapsid và số polypeptide còn lại kết hợp với capside. DNA ở dạng

sợi vòng gồm hai sợi, với trọng lượng phân tử từ 50 - 10 x 10

các virion được bao quanh

được bao bọc bởi một lớp vỏ, nucleocapsid là một phức hợp gồm DNA và protein (gọi

bởi một tinh thể protein và được gọi là thể vùi. Kelly (1985) cho rằng, virus có dạng hình que có một hoặc nhiều nucleocapsid

tắt là Deoxyribo Nucleo Protein - DNP) và chúng cũng được bao quanh bởi một lớp vỏ

capsid (bên trong lớp vỏ capsid này chỉ có một hoặc nhiều nucleocapsid), nếu là một

nucleocapsid thì gọi là NPVs Nucleocapsid đơn, nếu có nhiều nucleocapsid trong vỏ

capsid thì gọi là NPVs Nucleocapsid – Multiple Cấu tạo của nucleocapsid: nucleocapsid có dạng hình que, dáng hơi cong,

đường kính 40 nm, dài 350 nm, có màng bọc bên ngoài (capsid). Nucleocapsid bao

gồm hai loại protein, đó là một lõi DNP protein và màng capsid protein và từ 3 - 8

polypeptid nhỏ (Summer, M.D et al, 1978). Cấu tạo của thể virus: thể virus hình gậy gồm các nucleocapsid được bao bọc,

mỗi vỏ bao có thể có một hoặc nhiều nucleocapsid, có loại có tới 30 nucleocapsid. Lớp

vỏ bao gồm có lipid, trong vỏ còn có 8 - 10 polypeptid (Harrap, K.A., 1972., Kelly,

Cấu tạo của khối đa diện (Polyhedra): Theo Crook, N.E. et al (1982) thì polyhedra

là những khối kết tinh lớn, kích thước từ 1 - 4 µm, có dạng hình vuông hoặc gần như hình

cầu, bên trong có chứa nhiều hạt virus, có khi lên tới 100 hạt, bao quanh các virus

đó là mạng lưới kết tinh hình mắt cáo. Polyhedra còn bao gồm nhiều polypeptide. Protein

polyhedron có trọng lượng phân tử thay đổi từ 27.000 - 34.000 million , phụ thuộc vào loại

virus (Bergold, G.H., 1963 Harrap, K.A., 1972). Polyhedral có đặc điểm là ổn định

D.C., 1982, 1985).

ở pH trung tính. pH kiềm 9,5 trở lên sẽ làm nó bị hòa tan (Faust, R.M. et al , 1966).

Minon, F. et al (1979) còn cho biết polyhedra hoàn thiện được một lớp vỏ có hình thái

Khi sâu non ăn thức ăn vào ruột có chứa virus (NPV) lẫn với thức ăn, các thể bao

hàm (PIB) của virus sẽ đi vào ruột giữa của côn trùng và sẽ bị phân giải dưới tác động của

điều kiện môi trường kiềm (pH 9 – 11). Các thể bao hàm sẽ bị hòa tan để giải phóng ra các

virion. Các virion này đi vào các tế bào ruột giữa. Ở đây, chúng sử dụng bộ máy của tế bào

vật chủ thực hiện quá trình sao chép, phiên mã và tạo ra các virion mới. Từ đó, các virion

mới này sẽ tiếp tục tấn công sang các tế bào khác của cơ thể như huyết tương, ống tiêu

hóa, biểu bì. Trong các tế bào này, xảy ra quá trình hình thành lớp vỏ protein, bao bọc các

virion để tạo thành hàng triệu các thể bao hàm (PIB) và cũng là lúc toàn bộ cơ thể sau đã

bị phá hủy và sâu non bị chết. Các thể bao hàm giải phóng ra bên ngoài để lây nhiễm cho

các tế bào khác (Kalmakoff và Ward, 2003). Những côn trùng còn sống sót vẫn tiếp tục bị

ảnh hưởng trong giai đoạn nhộng (nhộng bị thối, ngài vũ hóa bị biến dạng). Nếu ngài vũ

hóa được thì ở giai đoạn trưởng thành (khả năng đẻ trứng sẽ giảm) và ảnh hưởng tới các

thế hệ sau. Nguồn virus tồn động trong tự nhiên lại lây nhiễm cho các thế hệ mới. Trên cơ

sở khoa học này, virus gây bệnh cho côn trùng ngày càng được chú ý nghiên cứu và được

riêng biệt vây quanh, chức năng của lớp vỏ này chưa được xác định. 1.3.3 Cơ chế diệt sâu của NPV

coi là một trong những nhân tố có triển vọng trong phương pháp sinh học để phòng

chống sâu hại cho cây trồng (Nguyễn Thị Như Quỳnh, 2014).

Hình 1.4 Cơ chế diệt sâu của virus NPV vào côn

trùng (Kalmakoff và Ward, 2003).

Hình 1.5 Chu trình sống của virus côn trùng (Jim McNeil. 2010)

Sâu non không có biểu hiện gì rõ rệt và không thay đổi về thức ăn. Sau 5-7 ngày

các đốt thân sưng phồng lên, căng mộng nước. Cơ thể sâu chuyển sang màu trắng đục, da

bở, dễ bị vỡ. Trước khi chết sâu thường leo lên ngọn cây, bám chân vào cành cây, trút

đầu xuống đất. Dịch chiết trắng chảy ra ngoài và sâu chết (hiện tượng sâu chết treo). Dịch trắng tiếp tục chảy (Phạm Thị Thùy, 2010).

Hình 1.6 Biểu hiện của sâu chết do NPV.

(Nguồn: https://sinhhoc247.com/virus-gay-benh-va-ung-dung-cua-virus-trong-thuc- tien-a5088.html).

1.3.4 Hiệu lực diệt sâu của NPV

Phụ thuộc vào điều kiện bảo quản chế phẩm. Mẫu NPV được lưu trữ trong điều

kiện lạnh, có thể duy trì hiệu quả của nó lên đến 8 tháng (100%), và đến tháng thứ

mười, có một sự suy giảm nhẹ (97,50%) nhưng nó không đáng kể, trong khi mẫu NPV

được lưu trữ trong nồi đất và ở nhiệt độ phòng (cả trong chai màu hổ phách và chai

thủy tinh) hiệu quả được duy trì lên đến 4 tháng và sau đó độc lực bắt đầu giảm do tăng

Sự thay đổi trong pH của huyền phù virus được lưu trữ trong điều kiện lạnh là rất

chậm từ axit đến bình thường (5-7) pH như chống lại kiềm ở điều kiện môi trường xung

quanh. Chủ yếu là do sự tăng trưởng của các vi khuẩn khác và điều kiện ấm, dẫn đến giảm

độc lực của các cơ quan virus. Nhiều nhà khoa học đã báo cáo rằng virus có thể

hoạt tính của vi khuẩn.

C mà không bị mất độc lực. Độc lực hiệu

được bảo quản trong hơn 10 năm ở mức 4 quả nhất khi pH trung tính và giảm khi pH cao. Độc lực của virus phụ thuộc vào chất lượng của virus, điều kiện bảo quản và

thời gian lưu trữ, nhiệt độ và độ pH của sản phẩm. Các nghiên cứu đều chỉ ra rằng NPV có hiệu lực gây chết rất cao trên sâu

khoang. Sâu càng nhỏ mức độ mẫn cảm càng cao (Boucias et al, 1980; Bucher and

Turnck, 1983; Smith and Vlak, 1988; Mohammad et al, 2002). Giá trị LC50 NPV trên

7 10

sâu khoang từ tuổi 1 đến tuổi 4 được ghi nhận tương ứng là 3,2 x 10 ; 1,1 x 10 ; 1,3 x

7 PIB/ml (Mahammad et al, 2002).

và 4,7 x 10

1.3.5 Ưu điểm và nhược điểm của NPV

Hiệu lực diệt sâu của NPV tương đương như thuốc hóa học. Ngoài chỉ tiêu về hiệu

lực diệt sâu, nuclear polyhedrosis được sử dụng rộng rãi là do chúng rất an toàn với môi

trường. Theo Szewczyk và cộng sự (2009), Baculovirus nói chung và NPV nói riêng chỉ

gây bệnh cho duy nhất ngành chân đốt mà không làm ảnh hưởng đến động vật có xương

sống, cây trồng và các vi sinh vật khác. Vì tính chuyên hóa cao nên NPV không gây độc

cho các loài thiên địch, các động vật máu nóng và con người (Ignoffo, 1997; Monobrullah

et al, 2000). Mặt khác, các loài thiên địch không những không bị hại bởi NPV mà chúng

còn có vai trò phát tán NPV trong quần thể sâu hại, góp phần quan trọng trong việc phát

triển dịch bệnh cho sâu hại trên đồng (Trang và cộng sự, 2003) Do NPV không độc đối với

các loài côn trùng có ích và các sinh vật khác, bao gồm động vật có vú và cây trồng

(Groner, 1986; Payne,1986; Carbonell, 1987) nên chúng được sử dụng trong chương trình

phòng trừ tổng hợp sâu hại cây trồng (Monobrullah và Nagata, 2000). Mặt khác, việc sử

dụng NPV để trừ sâu trên các loại cây trồng không để lại dư lượng độc hại (toxic residue) trong nông sản, cho phép nông dân có thể xử lý sâu hại bằng NPV trước khi thu hoạch một thời gian ngắn (Monobrullah và Nagata, 2000).

1.3.5.1 Ưu điểm của chế phẩm NPV

Phạm Văn Ty và Vũ Nguyên Thành (2007) cho biết BaculoNPV rất thuận lợi khi

sản xuất chế phẩm thương mại vì thường có thể đạt nồng độ cao trong mô của ấu trùng.

Chế phẩm có thể duy trì hoạt tính trong thời gian rất dài (10-15 năm) ngoài cơ thể côn trùng.

1.3.5.1 Nhược điểm của chế phẩm NPV

Chế phẩm NPV rất khó bảo quản. Ngoài ra, so với thuốc hóa học thì hiệu lực trừ

sâu của NPV chậm hơn nhiều. Do NPV rất đặc hiệu đối với ký chủ, mà thường trên cùng một mùa vụ có nhiều

loài dịch hại cùng xuất hiện, sẽ rất tốn kém nếu phải dùng mỗi loại thuốc cho một loài

dịch hại riêng biệt. Hơn nữa việc sản xuất chế phẩm NPV cũng khó khăn hơn thuốc

hóa học vì NPV phải được nuôi từ cơ thể sống, chúng không thể phát triển trong môi

trường nhân tạo do đó giá thành sản phẩm sẽ tăng lên. Vì là tác nhân sinh học nên NPV dễ bị mất tác dụng khi điều kiện ngoài đồng

không thích hợp (nhiệt độ, độ ẩm,…) do đó việc sử dụng chúng không thuận lợi bằng

thuốc hóa học (Phạm Thị Thùy, 2004). NPV có thể sản xuất bằng phương pháp invivo và invitro. Tuy nhiên, NPV được

thương mại hóa hiện nay trên thế giới chủ yếu được sản xuất bằng phương pháp invivo

vì tính hiệu quả kinh tế (Tuan S.J. W.L. Chen, và S.S. Kao. 1998; Monobrullah M et al,

2000; FAO, 2011). Trong đó, NPV của các loài thuộc chi Spodoptera được sử dụng

nhiều nhất trên phạm vi toàn thế giới (Monobrullah, M.; Nagata, M., 2000). Nhiều chế

phẩm đã được thương mại hóa để trừ sâu khoang ăn tạp là SOMSTAR TM–SL,

SpodopterinTM, Spodoptera litura NPV, sử dụng trên rau, cà chua, bắp, bông vải

(Giupta và cộng sự, 2005). 1.4 Các nghiên cứu sử dụng NPV để trừ sâu khoang 1.4.1 Các nghiên cứu ngoài nước

Hiệu lực diệt sâu khoang ăn tạp của các chủng NPV: Các nghiên cứu đều chỉ

ra rằng NPV có hiệu lực gây chết rất cao trên sâu khoang. Sâu càng nhỏ mức độ mẫn

cảm càng cao (Boucias et al, 1980; Bucher và Turnck, 1983; Smith và Vlak, 1988;

Mohammad et al, 2002). Giá trị LC50 của NPV trên sâu khoang từ tuổi 1 đến tuổi 4 7 được ghi nhận tương ứng là 3,2x10 ; 1,1x10 ; 1,3x10 PIB/ml (Mahammad và 4,7x10

được khi dùng sâu 7, 8, 9 và 10 ngày tuổi để sản xuất NPV, Monobrullah và Nagata (2000) cho biết, sản lượng NPV cao nhất khi sử dụng sâu 9 ngày tuổi (trọng lượng 125 – 155mg) để nhiễm NPV. Sản lượng NPV cao nhất được cho biết là 3,91x10

et al, 2002). Nghiên cứu, sản xuất Nucleopolyhedrosis NPV: So sánh sản lượng NPV đạt

6 PIB/sâu.

PIB/sâu

với lượng nhiễm là 4,8 x 10

Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sản xuất NPV: Các tác giả cho rằng,

NPV bị ảnh hưởng rất rõ bởi yếu tố nhiệt độ. Mohammad (2002), Sajap et al (2007) cho

biết, tỷ lệ sâu chết tăng khi tăng nhiệt độ nuôi ủ sâu và giá trị LT50 thì ngược lại. Giá trị

C tăng 4 lần so với khi nuôi ở nhiệt độ 30

C (Mohammad,

LT50 khi nhiễm sâu ở 20 2002). Cũng theo tác giả này, điều kiện thích hợp tối thiểu để sản xuất invitro NPV trên

0 C.

sâu khoang là 30 Nghiên cứu tăng cường hiệu lực diệt sâu của NPV: Tiêu chí để tạo chế phẩm

NPV trừ sâu là kéo dài hoạt lực cũng như sự bền vững của NPV trên đồng (Jones et al ,

1997). Việc tạo chế phẩm có thể cải thiện đáng kể hiệu quả của NPV. Các chất phụ gia

cho vào NPV nhằm kích thích sự ăn của sâu ký chủ hoặc tăng cường hiệu lực gây chết

Để tăng hiệu lực trừ sâu và rút ngắn thời gian ủ bệnh do NPV, các tác giả đã phối

trộn NPV với nhiều sản phẩm khác như: thuốc trừ sâu, chế phẩm Neem, acid boric, rỉ đường…. Rabindra và cộng sự (1997) cho biết phối hợp NPV (liều lượng 5 x 10 PIB/ml) + mật đường (1%) + dịch chiết neem (0,1%) cho hiệu quả diệt sâu khoang tăng

hơn so với không trộn. Tuy nhiên, tác giả cho biết, nếu không bổ sung rỉ đường thì sự phối

hợp này không có hiệu quả. Tương tự như vậy, Baskaran và cộng sự (1999) cho biết, phối

trộn NPV (2 X 10

PIB/ml) với dầu neem 1% và dịch chiết bánh dầu neem 5%

của NPV ( Bell và Kanavel , 1975; Burges và Jones , 1998).

cũng làm tăng hiệu quả diệt sâu của NPV. Các tác giả thống nhất rằng, việc bổ sung dịch

chiết neem vào chế phẩm NPV làm cho sâu khoang chết nhanh hơn so với không bổ sung

và quan trọng hơn cả là làm giảm được tác động của neem đối với các loài thiên địch. Seon-Gon Kim và ctv (2001) cho biết, phối trộn nồng độ 1x10

PIB/ml với

NeemAZA-T/S nồng độ 200 ppm có giá trị LT50 và LT90 là 1,94 ngày và 8,33 ngày. Hiệu

lực diệt sâu của Spodoptera litura NPV (SLNPV) nồng độ 1x10

PIB/ml với NeemAZA-

T/S nồng độ 75–200 ppm cho kết quả diệt sâu chết 100% sau 9 ngày thí nghiệm.

1.4.2 Các nghiên cứu trong nước

NPV được ghi nhận là một trong những loài thiên địch xuất hiện khá phổ biến

trên đồng ruộng ở Việt Nam (Nguyễn Văn Cảm và cộng sự, 1992; Nguyễn Thị Hai,

Nghiên cứu NPV có hiệu lực trừ sâu tương đương hoặc cao hơn so với thuốc hóa

học (Phạm Hữu Nhượng và CTV, 2005; Hoàng Thị Việt và cộng sự,1999, 2000; Ngô Trung Sơn, 2001; Nguyễn Thị Hai, 2004; Phạm Văn Lầm, 2004; Nguyễn Văn Tuất, 2004).

Bằng phương pháp thu thập, tuyển chọn và khai thác khả năng phòng trừ sinh học

của các chủng Nucleopolyhedrosis NPV (NPV), nhóm tác giả Nguyễn Thị Hai, Nguyễn Hoài Hương (2016) đã phân lập được 2 chủng NPV phòng trừ sâu khoang ăn tạp (Spodoptera litura) hại rau, đậu tại TP.HCM.

1996). Sâu khoang trên lạc có tỷ lệ chết NPV khá cao, có khi lên tới 50 – 60% (Phạm Văn Lầm, 2004).

Nghiên cứu sản xuất chế phẩm NPV-Spl (Nucleo Polyhedrosis Virus) từ tế bào

gốc sâu khoang để phòng trừ sâu hại cây trồng nông nghiệp (Nguyễn Thị Như Quỳnh,

2014). Một số NPV đã được thương mại hóa để trừ sâu ở Việt Nam (Lê Quang Quyến

et al, 2002; Nguyễn Văn Tuất, 2004). NPV trừ sâu khoang đã được tiến hành tại Viện

Bảo vệ Thực vật (Nguyễn Văn Tuất, 2004). Thử nghiệm trên đồng ruộng cho biết, Sử

dụng chế phẩm NPV, V-Bt trừ sâu xanh, sâu khoang hại lạc cho hiệu quả 76-77%.

được phân lập tại trường Đại học Cần Thơ. Kết quả cho biết, độ hữu hiệu của 2 dòng

Tại các tỉnh phía Nam, gần đây các chủng NPV sâu khoang cũng được trường

NPV thu thập tại Trà Vinh và An Giang đối với sâu khoang ăn tạp cho hiệu quả trên

90% sau 9 ngày xử lý (Trần Văn Hai, 2010). Đánh giá hoạt lực trừ sâu của NPV trên sâu khoang, Tran Thi Kieu Trang et al

(2002) cho biết, sâu 2 ngày tuổi mẫn cảm gấp 1.500.000 lần so với sâu 8 ngày tuổi.

Nghiên cứu sử dụng các chất lọc tia cực tím trên HaNPV, Ngô Trung Sơn (2001) cho

biết, sữa lọc béo, than hoạt tính và rỉ đường có khả năng giảm được tác hại của tia cực

tím. Theo tác giả, nếu phơi HaNPV ngoài nắng 1 giờ, hiệu lực diệt sâu xanh của chúng

chỉ còn 37%, song nếu dịch HaNPV có trộn 3% sữa lọc béo thì hiệu lực diệt sâu vẫn

Sản lượng tối đa của virus có liên quan chặt chẽ đến tuổi sâu và nồng độ lây nhiễm

virus. Tổng số virus được sinh ra tương quan thuận với trọng lượng sâu đem đi nhiễm

(Jones, 2000). Mối tương quan giữa nồng độ nhiễm và sản lượng virus đã được nhiều tác

giả nghiên cứu (Shapiro, 1986) với nhiều phương pháp khác nhau. Nếu nhiễm với nồng độ

thể vùi cao, virus sẽ gây hại cho các cơ quan nội tạng và gây chết sâu trước khi virus nhân

lên đủ nhiều. Trái lại, nếu nhiễm với nồng độ quá thấp, thì sản lượng virus sẽ không tối ưu

bởi vì sâu vào nhộng. Để xác định nồng độ lây nhiễm thích hợp cho từng loài sâu, người ta

phải xác định giá trị LC50, LC90 cho từng tuổi sâu. Giá trị LC50 và LC90 sẽ giúp xác định

được nồng độ lây nhiễm thích hợp cho từng tuổi sâu. Giá trị LC50, LC90 thay đổi tùy thuộc

vào từng tuổi sâu, từng loài sâu và từng chủng NPV tương ứng.

còn 81%, còn trộn 3% than hiệu tính thì hiệu lực của HaNPV cũng còn 50%. 1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sản xuất chế phẩm NPV 1.5.1 Nồng độ lây nhiễm

Bên cạnh đó, độ sạch của dịch nhiễm ban đầu đóng vai trò rất quan trọng trong

quy trình sản xuất virus. Theo FAO 2011, sử dụng dịch không ly tâm khi nhiễm cho

sâu, chỉ có 10% sâu chết do NPV và 90% sâu chết do các tác nhân lây nhiễm khác. Vì

vậy, các tác giả khuyến cáo nên sử dụng dịch ly tâm để nhiễm virus (Grzywacz et al. 2011)

1.5.2 Tuổi sâu

Thông thường nếu nhiễm sâu tuổi quá nhỏ chúng sẽ chết nhanh trước khi cơ thể

đạt sinh khối tối đa nhưng nếu nhiễm sâu càng lớn thì khả năng kháng với virus càng

cao (Briese, 1986) và cả hai trường hợp đều đạt sản lượng không cao. Thông thường,

người ta thường nhiễm sâu vào thời điểm trước khi lột xác sang tuổi cuối 2 ngày (O‘Reilly et al., 1994). Xác định tuổi sâu xanh (Helicoverpa armigera) thích hợp nhất để nhiễm H.armigera NPV (HearNPV), Gupta et al. (2007) đã làm thí nghiệm nhiễm

sâu với nồng độ 1 x 10 PIB/sâu cho sâu 5,7,8,9,10 và 11 ngày tuổi. Sản lượng virus đạt

cao nhất khi ở công thức nhiễm sâu 7 và 8 ngày tuổi. Sâu càng nhỏ lượng virus/sâu

càng thấp hơn có ý nghĩa so với sâu tuổi lớn. Sâu càng lớn tỷ lệ vào nhộng càng cao.

Sản lượng virus đạt cao nhất của HearNPV đạt được khi nhiễm trên sâu tuổi 5 với nồng

độ nhiễm là 5 x 10 OB/sâu (Mehrvar et al., 2007). Trong khi đó, (Ziemnicka, 2008) lại

cho rằng, tuổi 4 là tuổi tối ưu để nhiễm Leucorma salicis NPV đối với sâu Leucoma

salicis. Nhiều tác giả khác lại cho rằng, nhiễm sâu tuổi 3 cho sản lượng virus cao nhất

(Li và Skinner, 2005). Vì vậy, để đạt hiệu suất tối đa, cần phải xác định tuổi sâu tương

ứng với từng nồng độ nhiễm cho từng loài sâu hại. 1.5.3 Thời gian thu hoạch sâu chết

Các kết quả nghiên cứu cho thấy rằng, trong điều kiện invivo, sản lượng virus

đạt cao nhất khi thu sâu chết (Gupta, 2007; Mehrvar et al., 2007). Thời gian thu hoạch

đóng vài trò quan trọng trong quy trình sản xuất Spodoptera littoralis NPV trong sâu

khoang S.littoralis (Grzywacz et al., 1998). Nếu thu hoạch quá sớm, hoạt tính sinh học

của virus sẽ giảm. Trái lại, nếu để các mô vỡ ra trước khi thu hoạch thì virus sẽ phát

tán ra thức ăn rất khó thu hoạch. Tốt nhất là nên thu hoạch sớm ngay sau khi sâu chết.

Các nghiên cứu cho thấy, đối với NPV gây chết sâu khoang ăn tạp, sâu vừa mới chết

cho sản lượng virus cao nhất. Ở sâu sống vào thời điểm 8 ngày sau khi sâu chết, lượng

virus cũng còn đạt

khá cao nhưng virus chưa thành thục nên hoạt tính diệt sâu không cao. Trái lại nếu để

quá muộn, da sâu vỡ ra thì lượng virus sẽ giảm đi hơn 1/2 ( Nguyễn Thị Hai, 2014). Vì

Điểm đặc trưng của virus NPV là chỉ nhân lên ở tế bào sống của ký chủ nên việc

sản xuất virus ở quy mô công nghiệp cũng khá là khó khăn. Có 2 phương pháp sản xuất

virus NPV: Sản xuất invitro trên tế bào ký chủ và Sản xuất in vivo trên sâu ký chủ. Trong đồ án này, chỉ đề cập đến quy trình sản xuất in vivo trên sâu ký chủ.

vậy, thường trong sản xuất, người ta phải thu sâu chết hàng ngày, thậm chí 2 lần/ngày. 1.6 Quy trình sản xuất chế phẩm NPV

Hình 1.7 Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm virus trừ sâu

(Nguồn: https://hoc247.net/cong-nghe-10/bai-20-ung-dung-cong-nghe-vi-sinh-

san-xuat-che-pham-bao-ve-thuc-vat-l6549.html)

Quy trình sản xuất chế phẩm NPV in vivo trên sâu ký chủ gồm 2 bước chính:

nhân nuôi số lượng lớn sâu ký chủ và nhiễm virus cho sâu ký chủ.

Nhân nuôi số lượng lớn sâu ký chủ:

Nguồn sâu giống đầu tiên được bắt từ ngoài đồng trên những cánh đồng không

phun thuốc và được nhân nuôi trong phòng. Sâu non sau khi hóa nhộng sẽ được thu nhận, xử lý rồi cho vào trong những hộp

chứa có bông ẩm. Tách riêng nhộng đực và nhộng cái để khi nhộng vũ hóa dễ thu nhận

và ghép cặp. Sau khi nhộng vũ hóa phải được ghép cặp ngay. Sau khi trưởng thành cái đẻ trứng, trứng phải được thu nhận ngay và để riêng

từng ngày. Trứng sâu thường nở vào ban đêm. Để sâu nở ra có thức ăn ngay, người ta

thường cho trứng vào hộp thức ăn trước khi sâu nở vài giờ. Sâu ký chủ được nuôi bằng thức ăn nhân tạo, bảo đảm cho chúng sinh trưởng và

phát triển bình thường. Nuôi sâu bằng thức ăn nhân tạo sẽ hạn chế được sự lây nhiễm,

tấn công của các yếu tố tự nhiên có thể gây chết sâu thông qua nguồn thức ăn tự nhiên.

Mặt khác, việc sử dụng thức ăn nhân tạo để nuôi sâu sẽ không phải thay thức ăn hằng

ngày, tiết kiệm được công lao động và chi phí khác trong quá trình sản xuất. Nhiễm virus cho sâu ký chủ: Sau khi sâu ký chủ đạt đến tuổi 3 hoặc 4 là tuổi thích hợp để sản xuất virus. Quá trình sản xuất virus trong sâu ký chủ được bắt đầu từ việc cho sâu ăn thức ăn đã bị phơi nhiễm virus (tạm gọi là nhiễm virus cho sâu ký chủ). Có thể tóm tắt quá trình này như sau: Cho dịch virus lên bề mặt thức ăn và dùng chổi lông đã khử trùng trãi đều dịch

Cho sâu ăn thức ăn đã nhiễm virus trong vòng 24h-48h ở điều kiện nhiệt độ 26

Chuyển sâu sang thức ăn mới không nhiễm virus và ủ ở nhiệt độ 26

C, theo dõi

lên bề mặt thức ăn.

o Thu sâu chết trước khi cơ thể sâu bị vỡ và cất đông lạnh ở nhiệt độ -20

hàng ngày cho đến khi sâu bị chết.

C cho

đến khi đồng nhất và lọc. Sau khi lọc ta li tâm, thêm chất phụ gia và đem đi sấy. Kiểm tra lượng virus sau

khi sấy và đóng gói sản phẩm.

1.7 Các sản phẩm NPV trên thị trường

Trên thế giới các nước có các nghiên cứu tạo ra các chế phẩm. Cụ thể như ở Nga

có chế phẩm NPV dạng bột: VIRIN Ha; VIRIN Dp,... trừ sâu xanh, sâu róm thông,... Còn ở Trung Quốc có chế phẩm sinh học kết hợp virus và vi khuẩn với hiệu quả trừ

sâu hại trên hàng vạn ha bông, cà chua,...Cũng như ở Mỹ, Úc,...dùng công nghệ tế bào

nhân nuôi virus côn trùng để sản xuất chế phẩm virus dùng trong nông-lâm nghiệp. Còn ở Việt Nam có chế phẩm dạng dịch thể trừ sâu xanh, sâu khoang,...từ đề tài

KC.08-14 (giai đoạn 1990-1995) của Viện Bảo vệ thực vật. Đề tài KHCN.02-07 (giai đoạn 1996 – 2000) do Viện Bảo vệ thực vật nghiên

cứu sử dụng chế phẩm virus đơn lẻ hoặc phối hợp trong phòng trừ dịch hại cây trồng.

Sản xuất được chế phẩm Vi-Bt dạng bột đa chức năng so với giai đoạn trước (Chu Thị

Thơm, 2006)

CHƯƠNG II

VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu

Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được tiến hành 15 tuần (03/2018-07/2018) tại Viện Khoa Học Ứng Dụng

trường ĐH Công Nghệ Tp.HCM 2.1.2 Vật liệu

Sâu khoang được bắt ngoài đồng ruộng rau muống tại đường Bùi Công Trừng, Xã Nhị Bình, Huyện Hóc Môn về nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm, cho ăn thức ăn nhân tạo đến khi sâu hóa nhộng, vũ hóa, đẻ trứng và nở sâu đến độ tuổi thích hợp thì tiến hành thí nghiệm. Nguồn NPV (Nuclear polyhedrosis virus) do phòng thí nghiệm của Viện Khoa

Học Ứng Dụng, Đại học Công Nghệ Tp.HCM cung cấp Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm

Hóa chất

BPW (Buffered Peptone Water) Men bánh mì

Cồn 70 PCA (Plate Count Agar)

Agar Ascorbic acid Cồn 90 Nước cất

Methyl paraben Nước muối sinh lý

Sorbic acid

2.1.3.2 Dụng cụ

Hộp nhựa nhỏ (18x10x6) Ống đong Giấy báo

Chén nhựa có nắp (d=5cm) Ống effendorf Kẹp inox

Kéo Ống falcon Đĩa petri

Cọ quét,.. Cân điện tử Đèn cồn

Máy xay sinh tố Cốc thủy tinh

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Ảnh hưởng của tuổi sâu và nồng độ lây nhiễm đến sản lượng NPV

Sâu chết NPV

Nghiền, lọc, ly tâm Ly tâm lần 1: 500v/10p Ly tâm lần 2: 5000/15p

Định lượng

Sâu 9 ngày tuổi Sâu 7 ngày tuổi Sâu 11 ngày tuổi Pha loãng ra các nồng độ 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109PIB/ml 102, 102,

Hiệu lực gây chết

Sản lượng NPV

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tuổi sâu

và nồng độ lây nhiễm đến sản lượng NPV

2.2.1.1 Chuẩn bị dịch huyền phù NPV

Lấy 50 sâu chết do NPV, bổ sung 50ml nước cất để ở nhiệt độ phòng 01 ngày

cho sâu rã ra rồi lọc bỏ xác sâu để lấy dịch huyền phù virus. Sau đó hút 5ml đem đi ly

tâm theo phương pháp của Karma et al. (2012). Cụ thể như sau:

Ly tâm lần đầu với 500 vòng trong 10 phút để lấy phần dịch nổi Ly tâm lần thứ hai 5000 vòng trong 15 phút lấy phần cặn lắng

Sử dụng buồng đếm hồng cầu để đếm hàm lượng thể vùi, tính lượng virus có

trong dịch huyền phù.

Sâu chết NPV

Nghiền, lọc

Lây phần dịch nổi

Lấy phần cặn lắng

Hình 2.2 Sơ đồ các bước tinh sạch dịch NPV

Phương pháp xác định hàm lượng thể vùi: Tiến hành dùng micropipet lấy 1ml

dịch đã ly tâm + 9ml nước muối sinh lý rồi pha loãng 2-3 lần. Kiểm tra mật độ thể vùi

trên buồng đếm hồng cầu dưới kính hiển vi. Đếm số lượng thể vùi có trong 5 ô nhỏ rồi

-3

-4

3 Thể tích 25 ô lớn = 1/10 mm

tính trung bình.

3 cm

=1/10 x 10 = 1/10

Sau đó tính hàm lượng tế bào theo công thức như sau:

ml => 1ml = 25 x 10

Hàm lượng thể vùi (PIB/ml) = A/5 x N x 25x10 = 5 x A x N x 10

Trong đó: A: tổng số thể vùi (PIB/ml) đếm lượng trong 5 ô nhỏ

hệ số pha loãng

Chuẩn bị nguồn sâu ký chủ

Sâu khoang S.litura được thu thập trên các cây trồng và đem về phòng thí

nghiệm nuôi bằng thức ăn nhân tạo để lấy sâu thế hệ F1. Sâu tuổi 7, 9, 11 ngày tuổi

được thu nhận và tiến hành thí nghiệm trong cùng một ngày.

A

B

C

Hình 2.3 Nguồn sâu làm thí nghiệm

(A) Sâu 7 ngày tuổi; (B) Sâu 9 ngày tuổi; (C) Sâu 11 ngày tuổi

Thức ăn nhân tạo bao gồm: 200g bột đậu xanh, 30g men bánh mì, 3,5g ascorbic

acid, 2,0g methyl-paraben, 1,0g sorbic acid, 2,5ml formaldehyde, 10g agar, 750ml

nước cất và 1% vitamin E. Cách chế biến thức ăn: Đậu đã được làm sạch với nước rồi phơi ráo cho vào

máy xay sinh tố xay thành bột rồi cho nước cất và các thành phần nguyên liệu: Men

bánh mì, Methyl-paraben, Sorbic acid vào máy xay sinh tố xay chung với nhau. Đun

agar với nước cho sôi rồi cho vào máy xay sinh tố xay đều rồi cho các nguyên liệu còn

lại vào xay đều. Sau đó đổ thức ăn vào hộp nhựa 18x10x6 (cm) để nguội rồi cho sâu

vào nuôi đến khi sâu hóa nhộng, vũ hóa, đẻ trứng và nở sâu đến khi sâu đủ 7, 9, 11

ngày tuổi thì tiến hành thí nghiệm. Chọn sâu ở mỗi độ tuổi có cùng kích thước, khối

lượng, tốt nhất là nên lấy sâu trong cùng một ổ trứng.

Hình 2.4 Thức ăn nhân tạo

Nuôi trên môi trường thức ăn nhân tạo theo công thức cải tiến của Ahmad et al.(2015)

Sâu thu ở ngoài đồng

Nhộng

Trưởng thành

Trứng

Sâu 7, 9, 11 ngày tuổi

Tiến hành thí nghiệm

Hình 2.5 Quy trình nuôi sâu phòng thí nghiệm

2.2.1.3 Các nghiệm thức bố trí

Thức ăn để nhiễm virus được chế biến theo công thức của Ahmad et al. (2015)

không bổ sung Formaldehyde: Đậu xanh 200g, men bánh mì 30g, Ascorbic acid 3,5g,

Lây nhiễm sâu: Lây nhiễm bề mặt bằng cách phun đều dịch trên thức ăn nhân tạo

theo phương pháp của FAO (2011) và Lawrenceet et al (2007). Cắt thức ăn thành 40

miếng đều nhau với kích thước 2,25x2 (cm) rồi dùng kẹp gắp thức ăn cho vào chén nhỏ 2

; 1x10

(d=5cm). Sâu được nhiễm với nồng độ 1x10 PIB/sâu. Thức ăn sau khi nhiễm để khô bề mặt trong 15 phút (Karma et al. 2012) rồi sau đó dùng kẹp gắp sâu nhẹ nhàng hạn chế gây tổn thương đến sâu.

Methyl-paraben 2,0g, Sorbic acid 1,0g, Agar 10g, Nước cất 750ml, 1% vitamin E

Số lượng sâu: 30 sâu/công thức, lặp lại 3 lần

Hình 2.6 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm bố trí gồm 2 yếu tố, cụ thể như sau:

; 1x10

; 1x10 Yếu tố 2: Nồng độ dịch nhiễm: 1x10 PIB/sâu và công thức đối chứng phun nước cất.

Yếu tố 1: Tuổi sâu: Sâu 7, 9, 11 ngày tuổi

Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng tuổi sâu và nồng độ lây nhiễm

Nồng độ nhiễm Ngày tuổi

(PIB/sâu) 7 9 11

1x10 x x x

1x10 Nước cất x x x x x

Sâu được lây nhiễm để trong điều kiện phòng thí nghiệm và theo dõi sâu chết

mỗi ngày. Sau khi sâu chết, tiến hành đem sâu đi cân và cho vào ống effendorf rồi

chuyển vào tủ đá. Sau 4-5 ngày, đem sâu ra nghiền, lọc, ly tâm theo phương pháp của

Karma et al. (2012) rồi đếm thể vùi và tính sản lượng virus thu nhận được.

Tính toán hiệu lực diệt sâu theo công thức Abbott (1925). Hiệu lực (%)=

Sản lượng virus trên sâu nhiễm được tính theo công thức của Mehrvar et al. (2007) Sản lượng NPV (PIB/sâu chết) =

Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ sâu chết (%)

Sản lượng PIB thu được

2.2.2 Ảnh hưởng của dịch thô và dịch ly tâm sử dụng lây nhiễm đến sự nhân lên của virus trong cơ thể sâu

Sâu chết NPV

Nước

Nghiền, lọc, ly tâm Ly tâm lần 1: 500v/10p Ly tâm lần 2: 5000/15p

Định lượng

Pha loãng dịch ra nồng độ 10 PIB/ml

Dịch thô Dịch ly tâm

Sâu được nhiễm nồng độ 10 PIB/sâu

Lây nhiễm trên sâu tuổi 4

Hiệu lực gây chết

Sản lượng NPV

Hình 2.7 Quy trình tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của dịch thô và dịch ly tâm sử dụng lây nhiễm đến sự nhân lên của virus

2.2.2.1 Chuẩn bị nguồn sâu ký chủ

Sâu khoang S.litura được thu thập trên các cây trồng và đem về phòng thí

nghiệm nuôi bằng thức ăn nhân tạo để lấy sâu thế hệ F1. Sâu tuổi 4 được thu nhận và

tiến hành thí nghiệm trong cùng một ngày.

Nuôi trên môi trường thức ăn nhân tạo theo công thức cải tiến của Ahmad et al.(2015)

Sâu thu ở ngoài dồng

Nhộng

Trưởng thành

Trứng

Sâu tuổi 1

Sâu tuổi 4

Tiến hành thí nghiệm

Hình 2.8 Quy trình nuôi sâu phòng thí nghiệm

Hình 2.9 Sâu tuổi 4

Cắt thức ăn thành những miếng vuông có kích thước 2,25x2 (cm) rồi dùng kẹp

gắp từng miếng thức ăn vào chén nhựa có nắp, đường kính 5cm. Pha loãng 1ml dịch ly

tâm với 9ml nước muối sinh lý, 1ml dịch thô với 9ml nước muối sinh lý. Dùng

micropipet hút 0,1ml dịch đã pha loãng với nồng độ 10 PIB/ml, phun đều dịch lên thức

ăn cho mỗi công thức. Thức ăn sau khi nhiễm để khô bề mặt trong 15 phút (Karma et

al. 2012), dùng kẹp gắp sâu nhẹ nhàng hạn chế gây tổn thương đến sâu rồi cho vào

từng chén của mỗi công thức. Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm các công thức, mỗi công thức

nhiễm 10 sâu, lặp lại 06 lần

CT1: Dịch virus huyền phù thô CT2: Dịch virus đã ly tâm

CT3: Đối chứng nhiễm sâu với nước cất

A

B

C

Hình 2.10 (A) CT1-Dịch thô; (B) CT2-Dịch ly tâm; (C) CT3-Đối chứng

Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ sâu chết (%) Khối lượng sâu chết (%) Sản lượng PIB/sâu chết Tổng vi sinh vật hiếu khí có trong thức ăn sau 01 ngày lây nhiễm

2.2.2.2 Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí

Mẫu: Cân 10g thức ăn nhân tạo + 90ml BPW rồi đồng nhất mẫu ta được nồng độ 10-1, dùng micropipette hút 1ml mẫu đã đồng nhất pha loãng với 9ml nước muối sinh lý đã được hấp khử trùng được nồng độ 10-2, tiếp tục pha loãng ra nồng độ 10-3

Tiến hành thí nghiệm: Với các nồng độ pha loãng 10-1, 10-2 , 10-3, mỗi nồng độ

cấy 02 đĩa. Hút 1ml mẫu của mỗi nồng độ pha loãng cho vào đĩa petri rồi tiến hành đổ

15-20ml môi trường PCA vào mỗi đĩa  lắc đều  để yên  úp ngược đĩa và đem ủ 300C  Quan sát và định lượng vi sinh vật hiếu khí sau 03 ngày.

Hình 2.1 Quy trình định lượng vi sinh vật hiếu khí

Định lượng vi sinh vật hiếu khí theo công thức:

A (cfu/ml hoặc cfu/g) =

Trong đó: A là số tế bào (CFU) vi khuẩn trong 1ml hay 1g mẫu

C là tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn (có số khuẩn lạc

nằm trong khoảng từ 25-250 khuẩn lạc đĩa)

ni là số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i

V là thể tích mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa

fi là độ pha loãng tương ứng

2.2.3 Ảnh hướng của thời gian lây nhiễm sâu đến sản lượng NPV

Sâu chết NPV

Nước

Ly tâm lần 1: 500v/10p Ly tâm lần 2: 5000/15p

Nghiền, lọc, ly tâm

Lây nhiễm trên sâu tuổi 4

Định lượng

Sâu được nhiễm nồng độ 10 PIB/sâu

Sau 96h lây nhiễm chuyển sang thức ăn sạch

Sau 6h lây nhiễm chuyển sang thức ăn sạch Sau 12h lây nhiễm chuyển sang thức ăn sạch Sau 24h lây nhiễm chuyển sang thức ăn sạch Sau 48h lây nhiễm chuyển sang thức ăn sạch

Hiệu lực gây chết

Sản lượng NPV

Hình 2.12 Sơ đồ quy trình tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian lây

nhiễm sâu đến sản lượng NPV

Chuẩn bị sâu khoang để thí nghiệm: Sâu khoang S. litura được thu thập trên

các cây trồng và đem về phòng thí nghiệm nuôi bằng thức ăn nhân tạo để lấy sâu thế hệ

F1. Sâu tuổi 4 được thu nhận và tiến hành thí nghiệm. (Hình 2.8) Tiến hành thí nghiệm: Thức ăn được đựng trong chén nhỏ (d=5cm). Sâu được

nhiễm với nồng độ 10 PIB/sâu, phun đều dịch lên thức ăn cho mỗi công thức, ở mỗi

công thức, lượng thức ăn cho sâu ăn chỉ vừa đủ trong thời gian thí nghiệm. Thức ăn sau

khi nhiễm để khô bề mặt trong 15 phút (Karma et al. 2012), rồi dùng kẹp gắp sâu nhẹ

nhàng hạn chế gây tổn thương đến sâu rồi cho vào từng chén của mỗi công thức. Thí nghiệm được tiến hành dựa theo phương pháp của Bhutia et al (2012). Thí

CT2: Sau 6h lây nhiễm virus, chuyển sâu sang thức ăn sạch

CT3: Sau 12h lây nhiễm virus, chuyển sâu sang thức ăn sạch

CT4: Sau 24h lây nhiễm virus, chuyển sâu sang thức ăn sạch

CT5: Sau 48h lây nhiễm virus, chuyển sâu sang thức ăn sạch

CT6: Sau 96h lây nhiễm virus, chuyển sâu sang thức ăn sạch

nghiệm gồm 7 công thức Số lượng sâu: 15 sâu/công thức, lặp lại 03 lần. CT1: Đối chứng không nghiễm virus

Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ sâu chết (%) Khối

lượng sâu chết (g) Sản

lượng PIB/sâu chết

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu

Sản lượng virus trên sâu nhiễm được tính theo công thức của Mehrvar et al. (2007)

Tính toán hiệu lực diệt sâu theo công thức Abbott (1925).

Xử lý thống kê số liệu thu thập được bằng phần mềm Excel, SAS (Statistical

Analysis Systems) 9.1.3.

CHƯƠNG III

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Ảnh hưởng của tuổi sâu và nồng độ lây nhiễm đến sản lượng NPV

3.1.1. Đánh giá hiệu lực diệt sâu (%) của các nồng độ ở sâu 7 ngày tuổi, 9 ngày tuổi, 11 ngày tuổi

Cũng như sản xuất các tác nhân vi sinh vật khác, việc sản xuất NPV cũng bị ảnh

hưởng bởi nhiều yếu tố như: tuổi sâu nhiễm, nồng độ dịch nhiễm ban đầu, yếu tố môi

trường… Trong đó, tuổi sâu ký chủ dùng để nhiễm và nồng độ nhiễm tương ứng có

ảnh hưởng rất lớn đến sản lượng NPV (Mahesh Kumar et al, 2012).

Trên cơ sở của các giả (Monobrullah and Masao, 2000; Mohammad, 2001; Mahesh Kumar et al, 2012) chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên sâu 7, 9, 11 ngày tuổi 7 với nồng độ lây nhiễm biến động từ 1x10 ; 1x10 ; 1x10 ; 1x10 ; 1x10 ; 1x10 ;

PIB/sâu. Hiệu lực diệt sâu của các nồng độ được trình bày như sau

8 1x10 Bảng 3.1 Hiệu lực diệt sâu (%) của các nồng độ NPV trên sâu 7 ngày tuổi, 9 ngày

tuổi, 11 ngày tuổi

Tuổi sâu Lượng NPV lây nhiễm

ban đầu trên mỗi sâu Hiệu lực diệt sâu (%)

(PIB/sâu)

1x10 7 ngày tuổi 13,79 ijk

1x10 21,84 hi

1x10 36,78 fg

1x10 64,37 d

1x10 95,40 b

7

1x10 98,85 a

1x10 9 ngày tuổi 13,33 jk

1x10 18,89 ij

1x10 34,44 fg

1x10 47,78 e

1x10 74,44 c

7

1x10 100 a

8

1x10 100 a

1x10 11 ngày 10,34 k

1x10 19,54 ij tuổi

1x10 28,74 gh

1x10 43,68 ef

1x10 57,47 d

1x10 59,77 d

8

CV (%)

7,024

Chú thích: Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại trong cùng một hàng

1x10 79,31 c

có cùng chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ tin

2 động từ 13,79% đến 98,85%. Trong đó nồng độ nhiễm 1x10

cậy 95% Đối với sâu 7 ngày tuổi: Với nồng độ lây nhiễm thử nghiệm, tỷ lệ sâu chết biến

PIB/sâu có tỷ lệ chết thấp

nhất (13,79%) và thấp hơn có ý nghĩa so với các nồng độ còn lại. Tỷ lệ gây chết tăng

dần lên 21,84% đến 98,85% khi tăng nồng độ nhiễm từ 1x10 PIB/sâu đến

7 1x10

Đối với sâu 9 ngày tuổi: Với nồng độ lây nhiễm thử nghiệm, tỷ lệ sâu chết chỉ đạt

13,33% ở nồng độ lây nhiễm 1x10

PIB/sâu. Cũng tăng dần lên 18,89% đến 100% ứng với

nồng độ nhiễm 1x10

PIB/sâu. Tỷ lệ sâu chết sai khác không có ý nghĩa

PIB/sâu đến 1x10 7

thống kê của hai nồng độ nhiễm 1x10

PIB/sâu và 1x10

PIB/sâu đều đạt 100%.

PIB/sâu. Ở nồng độ 1x10 PIB/sâu tỷ lệ sâu chết đạt 98,85% (Bảng 3.1)

7

Như vậy, nồng độ gây chết tối ưu nhất đối lứa tuổi này là 1x10 PIB/sâu

Đối với sâu 11 ngày tuổi: Tỷ lệ chết ở sâu 11 ngày tuổi tương đối thấp so với

sâu 7 ngày tuổi và 9 ngày tuổi, chỉ đạt 10,34% với nồng độ nhiễm 1x10 PIB/sâu. Tỷ lệ

sâu chết đạt cao nhất (79,31%) ở nồng độ nhiễm 1x10 PIB/sâu. Và có sự sai khác rõ so

với tỷ lệ chết ở nồng độ 1x10 PIB/sâu. Ở sâu 11 ngày tuổi, sâu chết ít vì chỉ còn 4-6

Xét về tương tác giữa 2 yếu tố tuổi sâu và hiệu lực gây chết thì sâu 7 ngày tuổi với

nồng độ lây nhiễm là 1x10

/sâu, sâu 9 ngày tuổi với nồng độ lây nhiễm 1x10

PIB/sâu và

8 1x10

PIB/sâu cho hiệu lực diệt sâu cao nhất và tương đương nhau. Như vậy, xét trên chỉ

tiêu hiệu lực diệt sâu có thể chọn sâu 7 ngày tuổi hoặc 9 ngày tuổi để nhiễm NPV với nồng

độ lây nhiễm 1x10

PIB/sâu. Giải thích điều này, James D.Harper (1973), nồng

ngày nữa là sâu vào nhộng. Khi lượng virus trong cơ thể sâu chưa đủ để gây chết thì sâu đã vào nhộng.

độ lây nhiễm càng cao thì hiệu lực gây chết càng cao.

Tuy nhiên, trong sản xuất sinh khối NPV, tỷ lệ sâu chết chưa nói lên hết hiệu

quả của việc nhân sinh khối mà phải tính đến lượng NPV nhân lên trong sâu chết.

3.1.2 Đánh giá sản lượng NPV thu được trên tổng số sâu chết ở các độ tuổi và các nồng độ lây nhiễm

Bảng 3.2 Sản lượng NPV thu được ở các độ tuổi và nồng độ nhiễm

Lượng NPV lây Số sâu thí Số sâu chết Sản lượng NPV thu

Tuổi sâu nhiễm ban đầu trên nghiệm trung bình giữa được (PIB/tổng sô sâu

mỗi sâu (PIB/sâu) 3 lần lặp chết thu được)

1 x 10 2,63 x 10 cd 30 19,67 7 ngày

10

1 x 10 3,52 x 10 b 30 28,67 tuổi

Chú thích: Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại trong cùng một cột

có cùng chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê, độ tin

cậy 95%

Thông thường nếu nhiễm sâu tuổi quá nhỏ chúng sẽ chết nhanh trước khi cơ thể

đạt sinh khối tối đa nhưng nếu nhiễm sâu càng lớn thì khả năng kháng với virus càng

cao (Briese, 1986) và cả hai trường hợp đều đạt sản lượng không cao.

Đối với sâu 7 ngày tuổi, sản lượng NPV đạt cao nhất ở nồng độ nhiễm 1x10

sai khác không có ý nghĩa với nồng độ nhiễm 1x10

PIB/sâu, thấp nhất ở nồng độ nhiễm

PIB/sâu. Trong khi đó, số liệu này ở sâu 9 ngày tuổi đạt cao nhất ở nồng độ nhiễm

5 1x10 7 1x10

PIB/sâu và sâu 11 ngày tuổi đạt cao nhất ở nồng độ 1x10

PIB/sâu (Bảng 3.2).

Xét trong cùng tuổi sâu, sản lượng NPV còn tùy thuộc vào nồng độ dịch nhiễm. PIB/sâu và

Xét về tương tác giữa nồng độ nhiễm và tuổi sâu, sản lượng NPV thu được trên

tổng số sâu chết đạt cao nhất là 6,14x10 PIB khi nhiễm ở sâu 9 ngày tuổi với nồng độ

nhiễm 1x10 PIB/sâu. Mặc dù số sâu chết ở nồng độ 1x10 PIB/sâu tương đương với

số sâu chết ở nồng độ 1x10 PIB/sâu của sâu tuổi 9 nhưng sản lượng NPV thu được lại

thấp hơn 2.5x10 PIB/sâu có thể do sâu S.litura giai đoạn 9 ngày tuổi thì nồng độ

nhiễm 1x10 PIB/sâu là quá cao khiến sâu chết nhỏ hơn dẫn đến sản lượng NPV thu

Như vậy, xét trên chỉ tiêu hiệu lực diệt sâu và sản lượng virus thu nhận được, sâu 9

ngày tuổi với nồng độ 1x10

PIB/sâu là thích hợp để sản xuất chế phẩm NPV. Kết quả này

cũng trùng với nghiên cứu của Monobrullah and Masao, 2000 nghiên cứu trên sâu khoang

(Spodoptera litura) và sâu xanh đục quả (Helicoverpa armigera) của Gupta et al, 2007.

nhận cũng nhỏ hơn so với khi nhiễm ở nồng độ 1x10 PIB/ml.

Các tác giả cũng đồng ý rằng tuổi sâu thích hợp nhất để nhân nhiễm NPV là sâu 9 ngày tuổi.

3.2 Ảnh hưởng của dịch thô và dịch ly tâm sử dụng lây nhiễm đến sự nhân lên của

virus trong cơ thể sâu

3.2.1 Đánh giá hiệu lực diệt sâu (%) của dịch thô và dịch ly tâm

Độ sạch của dịch nhiễm ban đầu đóng vai trò rất quan trọng trong quy trình sản

xuất virus. Tuy nhiên sản xuất ở quy mô lớn, việc ly tâm sẽ tốn kém thời gian và chi

phí. Vậy liệu có thể sử dụng dịch thô để sản xuất virus không? Kết quả của thí nghiệm

này sẽ giải thích được câu hỏi trên.

Số liệu ở bảng 3.3 cho thấy hiệu lực gây chết của NPV không có sự sai khác

giữa dịch thô và dịch ly tâm sau 04 đến 09 ngày nhiễm.

Bảng 3.3 Hiệu lực diệt sâu (%) của dịch thô và dịch ly tâm

Thời gian sâu chết sau Hiệu lực diệt sâu (%)

Dịch thô Dịch ly tâm nhiễm

4 ngày 25,00 ns 16,67 ns

5 ngày 71,67 ns 73,33 ns

6 ngày 80,00 ns 88,33 ns

7 ngày 91,67 ns 93,33 ns

8 ngày 91,67 ns 95,00 ns

9 ngày 100,00 ns 100,00 ns

Chú thích: Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại trong cùng một hàng

có cùng chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ tin

cậy 95%.

Ns: không khác biệt có ý nghĩa thống kê

Như vậy, không có sự khác biệt về hiệu lực gây chết sâu giữa dịch thô và dịch ly

tâm ở cùng một nồng độ. Kết quả này có thể làm cơ sở chop việc sử dụng dịch thô để

trừ sâu trên đồng ruộng. Tuy nhiên, đối với việc sản xuất virus để làm chế phẩm thì

phải đánh giá được sản lượng virus thu được.

Hình 3.1 Biểu đồ thể hiện hiệu lực diệt sâu (%) ở công thức dịch thô, dịch ly tâm

3.2.2 Khối lượng sâu chết (g/sâu) ở công thức dịch thô và dịch ly tâm Bảng

3.4 Khối lượng sâu chết nhiễm NPV của dịch thô và dịch ly tâm

Công thức Trọng lượng sâu chết (g)

Dịch thô 0,60 ± 0,14 b

Chú thích: Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại trong cùng một cột

Dịch ly tâm 0,72 ± 0,11 a

có cùng chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ tin

cậy 95%. Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy trọng lượng sâu chết khi bị nhiễm bệnh ở công thức

nhiễm dịch virus có ly tâm là 0,72 ± 0,11 (g) cao hơn ở công thức nhiễm với dịch virus

thô 0,60 ± 0,14 (g). Trong dịch thô, thể mỡ và các thành phần khác của cơ thể sâu chưa

được loại bỏ, làm ảnh hưởng đến chất lượng thức ăn. Do vậy, ở công thức dịch thô, sâu ăn ít hơn so với công thức dịch ly tâm dẫn đến trọng lượng sâu thấp hơn hẳn.

3.2.3 Tổng vi sinh vật hiếu khí có trong thức ăn sau khi nhiễm 01 ngày

Bảng 3.5 Kết quả định lượng vi sinh vật hiếu khí sau 01 ngày nhiễm giữa các công thức dịch thô và dịch ly tâm

Công thức Tổng vi sinh vật hiếu khí

(CFU/ml)

7,20x10 CT1 – Dịch thô a

3,25x10 CT2 – Dịch ly tâm b

2,472

0 c CT3 – Đối chứng

Chú thích: Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại trong cùng một cột

CV(%)

có cùng chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ tin

Kết quả bảng 3.5 cho thấy, tổng lượng vi sinh vật hiếu khí cao nhất ở dịch thô đạt 4 7,20x10

cfu/ml, sai khác có ý nghĩa so với công thức dịch ly tâm và công thức đối chứng

tương ứng với tổng lượng vi sinh vật hiếu khí 3,25x10

cfu/ml và 0 cfu/ml. Chính vì vậy,

khi nhiễm loại dịch này lên thức ăn làm cho thức ăn mau bị hư, sâu ít ăn và phát triên kém.

Kết quả này, cũng trùng với kết luận của FAO. (2012) khi cho biết, nếu sử dụng dịch gốc

không tinh sạch để nhiễm sâu thì sâu chết không chỉ do NPV mà còn do các tác nhân khác,

ảnh hưởng đến sản lượng và chất lượng của virus trong sản xuất.

cậy 95%

Vì vậy, các tác giả khuyến cáo nên sử dụng dịch ly tâm để nhiễm virus

(D.Grzywacz et al. 2011). 3.2.4 Đánh giá sản lượng virus có trong mỗi sâu chết (PIB/sâu chết) giữa công

thức dịch thô và dịch ly tâm

Bảng 3.6 Sản lượng virus có trong mỗi sâu ở công thức dịch thô và dịch ly tâm

Công thức Sản lượng NPV (PIB/sâu chết)

Chú thích: Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại trong cùng một cột

2,60 x 10 Dịch thô b 9 3,03 x 10 a Dịch ly tâm

có cùng chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ tin

cậy 99% Từ kết quả định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí giữa dịch thô và dịch ly tâm ở

bảng 3.5 đã cho thấy các thành phần trong dịch thô ngoài virus NPV thì còn các yếu tố

khác có thể gây ảnh hưởng sức sống của sâu làm sâu suy yếu dẫn đến giảm sản lượng

của virus NPV trong cơ thể sâu. Do đó số liệu ở bảng 3.6 thể hiện sản lượng virus ở

công thức dịch ly tâm đạt 3,03x10 (PIB/sâu chết) cao hơn ở công thức dịch thô có sản

lượng virus chỉ đạt 2,60x10 (PIB/sâu chết) là phù hợp với kết quả nghiên cứu trên.

3.3. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm sâu đến sản lượng NPV

3.3.1. Đánh giá hiệu lực diệt sâu (%) của các công thức sau 6h, 12h, 24h, 48h, 96h lây nhiễm

Bảng 3.7 Hiệu lực diệt sâu (%) ở các công thức sau 6h, 12h, 24h, 48h, 96h lây nhiễm

Hiệu lực diệt sâu qua các ngày (%)

Thời gian lây nhiễm

7 Ngày

5 Ngày

87,70 b 6h 84,44 ns

12h 95,40 ab 84,44 ns

97,44 ab 24h 91,11 ns

48h 100,00 a 86,67 ns

96h 73,33 ns

CV(%) 93,08 ab 10,487 15,042

Chú thích: Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại trong cùng một cột

có cùng chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ tin

cậy 95%. Ns: không khác biệt có ý nghĩa thống kê

Hình 3.2 Biểu đồ thể hiện hiệu lực diệt sâu (%) ở công thức sau 6h, 12h, 24h, 48h, 96h

Kết quả ở bảng 3.7 cho thấy, hiệu lực diệt sâu sau 3 ngày và 5 ngày nhiễm virus

giữa các công thức 6h, 12h, 24h, 48h, 96h lây nhiễm không có sự khác biệt, đến ngày

thứ 7 cho thấy hiệu lực diệt sâu ở công thức 48h cho kết quả tốt nhất đạt 100%, nhưng

không có sự sai khác rõ với công thức 12h, 24h, 96h với tỷ lệ chết đạt 95,40%,

97,44%, 93,08% , thấp nhất là 6h với hiệu lực đạt 87,70%.

Điều này cho thấy khi nhiễm sâu với cùng một nồng độ 1x107 PIB/sâu nhưng khác nhau về khoảng thời gian để sâu nhiễm hết lượng NPV đó (1x107 PIB/sâu) vào cơ

thể thì các công thức nhiễm 12h, 24h, 48h, 96h, đều có khả năng gây chết tốt. Tuy

nhiên, còn phải xét đến trọng lượng sâu và sản lượng NPV thu được mới xác định được

khoảng thời gian tối ưu để nhiễm sâu

3.3.2 Khối lượng sâu chết (g) và sản lượng virus (PIB/sâu chết) ở các công thức sau 6h, 12h, 24h, 48h, 96h lây nhiễm

Bảng 3.8 Khối lượng sâu chết (g) và sản lượng virus PIB/sâu chết ơ các công thức sau

6h, 12h, 24h, 48h, 96h lây nhiễm

Thời gian lây Trọng lượng sâu (g) Sản lượng NPV (PIB/sâu

nhiễm chết)

bc 6h 0,322 ± 0,023 b 2,038 x 10 9 2,788 x 10 12h 0,417 ± 0,115 ab

3,288 x 10 24h 0,477 ± 0,044 a abc 9 ab 9 3,761 x 10 48h 0,525 ± 0,104 a a 9 c 1,917 x 10

0,314 ± 0,01 b 17,709 96h CV(%) 1,258

Chú thích: Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại ± SD trong cùng một

cột có cùng chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ

tin cậy 95%

Kết quả ở bảng 3.8 cho thấy, trọng lượng sâu ở công thức 6h và 96h có giá trị thấp

nhất 0,322 ± 0,023 (g) , 0,314 ± 0,01 (g) và thấp hơn có ý nghĩa so với các thời gian còn

lại. Công thức 24h, 48h cho kết quả cao nhất ứng với khối lượng 0,477 ± 0,044 (g),

0,525± 0,104 (g) nhưng cũng không có sai khác rõ với công thức 12h với trọng lượng sâu

0,477 ± 0,044 (g).

Ở công thức 48h có sản lượng virus PIB/sâu chết cao nhất 3,761 x 109 PIB/sâu chết. Sản lượng virus tăng dần từ 2,038 x 109 PIB/sâu chết đến 3,761 x 109PIB/sâu chết

tương ứng với tăng thời gian lây nhiễm từ 6h đến 48h. Nhưng khi nhiễm sâu đến 96h sản lượng virus thấp nhất chỉ đạt 1,917 x 109 PIB/sâu chết .

Ở các công thức thời gian, đều phun với nồng độ như nhau, tuy nhiên lượng

thức ăn cho sâu nhiễm chỉ cho vừa đủ để sâu ăn hết trong 6h, 12h, 24h, 48h, 96h.

Với thời gian 6h lây nhiễm thì lượng virus sâu ăn vào nhanh hơn, ở thời điểm

này sâu còn quá nhỏ, mà virus tấn công vào cơ thể sâu tối đa làm cho sâu vào giai

đoạn ăn yếu sớm hơn công thức 12h, 24h, 48h, 96h làm cho khối lượng và sản lượng

virus thấp hơn công thức 12h, 24h, 48h. Còn ở công thức 96h mới chuyển sang thức

ăn sạch, do lượng phân sâu thải ra trong 4 ngày quá nhiều dẫn đến chất lượng thức ăn

bị ảnh hưởng, sâu ăn ít nên sản lượng virus và khối lượng thấp.

Như vậy, để sản xuất chế phẩm NPV, ta nên chọn thời gian lây nhiễm là 24h vì

ở công thức này, hiệu lực diệt sâu cũng như là khối lượng, sản lượng NPV cho kết

quả không sai khác nhiều đối với công thức đạt kết quả tốt nhất là công thức 48h.

Nhưng công thức 24h lại có thể tiết kiệm được chi phí, lượng thức ăn lây nhiễm hơn

công thức 48h nên sẽ mang lại hiệu quả kinh tế cao hơn.

CHƯƠNG IV

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1 Kết luận

Sâu 9 ngày tuổi với nồng độ nhiễm 1x10 PIB/sâu cho sản lượng cao nhất.

Chọn thời gian lây nhiễm là 24h để sản xuất chế phẩm NPV.

Sử dụng dịch ly tâm để lây nhiễm NPV cho sản lượng virus cao hơn nhiễm bằng

dịch thô. 4.2 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm NPV số lượng lớn và ứng

dụng trên diện rộng.

Nghiên cứu tạo chế phẩm NPV phù hợp trên các loại cây trồng. Nghiên cứu dụng cụ và mật độ phù hợp để lây nhiễm SLNPV.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Nguyễn Thị Hai và Nguyễn Hoài Hương, 2015. Phân lập, định danh virus gây chết

sâu khoang Spodoptera litura (Fabr.) và hiệu lực của chúng. Tạp chí Bảo vệ thực

vật số 1 năm 2015 trang 16-23.

2. Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004, Giáo trình Côn trùng Nông nghiệp, phần

B: Côn trùng gây hại cây trồng chính ở Đồng bằng sông Cửu Long, Tủ sách Đại

Học Cần Thơ.

3. Nguyễn Thị Như Quỳnh và Lê Văn Trịnh, Nguyễn Thị Nga, Hà Thị Thu Thủy

(2014). Phát triển chế phẩm sinh học npv-spl bằng công nghệ tế bào để phòng trừ

sâu khoang

4. Nguyễn Thị Như Quỳnh, 2014, Nghiên cứu sản xuất chế phẩm NPV-Spl (Nucle

Polyhedrosis Virus) từ tế bào gốc sâu khoang để phòng trừ sâu hại cây trồng nông

nghiệp. Luận văn thạc sĩ., Học viện nông nghiệp Việt Nam.

5. Phạm Thị Thùy, 2004, Công nghệ sinh học trong bảo vệ thực vật, Nhà xuất bản

Đại học Quốc Gia Hà Nội.

6. Phạm Văn Ty (2007), Virut học – NXB giáo dục

7. Phạm Văn Ty và Vũ Nguyên Thành (2006), Công nghệ sinh học tập 5 – NXB giáo

dục

TÀI LIỆU TIẾNG ANH 8. Abbott W. S., (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide.-

Journal of Economic Entomology, 18: 265-267.

9. Agsaoay, M.V., (1998). Management of the common cutworm, Spodoptera litura

(Fabr.) on peanut, Arachis hypogaea L. using Bacillus thuringiensis Berliner and

nuclear polyhedrosis virus.FAO.

10. Ahmad cheraghian, (2014). Tobacco budworm, Spodoptera litura (Fabricius)

Lepidoptera:Noctuidae. Bureau of Plant Pest Surveillance and Pest Risk Analysis

Iran.

11. Ahmad, M., Arif, M.I. and Ahmad, M. (2007). Occurrence of insecticide

resistance in field populations of Spodoptera litura (Lepidoptera : Noctuidae) in

Pakistan. Crop Protec., 26 (6) : 809- 817.

12. Ahmed, A. M., M. Etman, and G. H. S. Hooper. 1979. Developmental and

reproductive biology of Spodoptera litura (F.) (Lepidoptera: Noctuidae). J. Aust.

Ent. Soc. 18: 363–372.

13. Asi, M. R. ; Bashir, M. H. ; Afzal, M. ; Zia, K. ; Akram, M., (2013). Potential of

entomopathogenic fungi for biocontrol of Spodoptera litura Fabricius

(Lepidoptera: Noctuidae). : Journal of Animal and Plant Sciences 2013 Vol.23

No.3 pp.913-918.

14. Bergold gh. (1963).The molecular structure of some insect virus inclusion bodies.

15. Biji et al. (2006) Quantitative estimation of Hyblaea puera NPV production in

three larval stages of the teak defoliator, Hyblaea puera(Cramer). Journal of

Virological Methods 136(1-2):78-82.

16. Boucias, D. W. Johnson, G. E. Allen, (1980). Effects of Host Age, Virus Dosage, and

Temperature on the Infectivity of a Nucleopolyhedrosis Virus Against Velvetbean

Caterpillar, Anticarsia gemmatalis, Larvae.

17. Briese, D. T. 1986. Insect resistance to baculovirus. In : The Biology of

Baculoviruses, Vol.2. R.R. Granados and B.A. Federici (eds.). CRC Press, Boca

Raton, Florida, pp. 237-263.

18. CABI. 2009. Crop protection compendium: global module. Commonwealth

Agricultural Bureau International, Wallingford, UK.

19. Chari, M. S. andS. N. Patel. 1983. Cotton leaf worm Spodoptera litura Fabricius

its biology and integrated control measures. Cotton Dev 13: 465-482.

20. Crook N. E. (eds.), Hunter-Fujita, F. R., P. F. Entwistle and H. F. Evans

(1998) Insect Viruses and Pest Management. Wiley, New York.

21. Divya, D. (2016). Management of Spodoptera Litura: Imperial Journal of

Interdisciplinary Research (IJIR) Vol-2, Issue-5, 2016.

22. Doyle JJ, Doyle JL (1990) Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus

12:13–15.

23. Faust, R. M. (1966). Content of nucleic acid in intact nuclear polyhedral bodies

isolated from virus-infected beet armyworms, Spodoptera exigua (Lepidoptera:

Noctuidae). J. Invertebr. Pathol. 8: 273-274.

24. Gupta G.P, S. Rani, A. Birah and M. Raghuraman (2005). Improved artiﬁcial diet

for mass rearing of the tobacco caterpillar, Spodoptera litura (Lepidoptera:

Noctuidae).

25. Gitanjali J. Chaudhari S. and Ramaskrishnan N. (1994). Age-related responsed of

Spodoptera litura (Fab.) to nuclear polyhedrosis virus. J. Ent. Res., 23(3): 247-

260.

26. Groner A 1986. Specifity and safety of baculoviruses. Pp. 177-202. In: The biology

of Baculoviruses, Vol. I, Biological Properties and Molecular Biology, (RR

Granados, BA Federici, Eds.) CRC Press, Boca Raton.

27. Grzywacz (2011). The helicoverpa armigera npv production manual.

28. Grzywacz D, Richards A, Rabindra RJ, Saxena H, Rupela OP (2005). Efficacy of

biopesticides and natural plant products for H. armigera control. In

Heliothis/Helicoverpa management- Emerging Trends and Strategies for Future

research (Sharma HC Ed.), New Delhi: Oxford &IBH, pp 371-389.

29. Grzywacz et al., 1998.The in vivo production of Spodoptera littoralis nuclear

polyhedrosis virus.

30. Gupta S.C. et al. (2007). Management of insect pests of okra with biopesticides

and chemicals. Ann. Pl. Protec. Sci.

31. Harrap K.A. (1972), The structure of nuclear polyhedrosis viruses: III. Virus

assembly.

32. Hill, D. S. (1993). Agricultural insect pests of the tropics andtheir control.

Cambridge, UK: Cambridge UniversityPress.

33. Hill, D. S. 1975. Agricultural insect pests of the tropics and their control.

Cambridge Univ. Press, London.

34. Hochberg ME (1991). Extra-host interactions between a braconid

endoparasitoid Apanteles glomeratus and a baculovirus for larvae of Pieris

brassicae. Journal of Animal Ecology.

35. Hong Tong, Su Qi, Xiaomao Zhou and Bai Lianyang (2013). Field resistance of

Spodoptera litura (Fabricius) (Lepidoptera: Noctuidae) to organophosphates,

pyrethroids, carbamates and four new chemistry insecticides in Hunan, China. J.

Pest. Sci., 50(1) : 201-211.

36. Hostetter D L and Puttler B 1991. Anew broad host spectrum Nuclear

polyhedrosis virus isolated from a celery looper, Anagrapha falcifera (Kirby),

(Lepidoptera: Noctuidae). Environmental Entomology 20 : 1480-1488.

37. Ignoffo CM (1981) The fungus Nomuraea rileyi as a microbial insecticide: fungi.

In: Microbial Control of Pests and Plant Diseases 1970-1980 1st ed. (Edited by

Burges HD), pp 513-38 Academic Press, London.

38. James D.Harper, (1973) Food consumption by cabbage loopers infected with

nuclear polyhedrosis virus. Journal of Invertebrate Pathology Volume 21, Issue

2, March 1973, Pages 191-197.

39. Jayaraj, S. and Rabindra, R. J. 1990. Microbial control and integrated pest

management. Proceedings of indo USSR joint workshop on problems and

potentials of Biocontrol of pests and Diseases, Bangalore, 263-387 P.

40. Jones, W. J. and Poprawski, T. J. 2000. Host plant effects on activity of the

mitosporic fungi Beauveria bassiana and Paecilomyces fumosoroseus against two

populations of Bemisia whiteflies (Homoptera: Aleyrodidae).

41. Kalmakoff, J. V. Ward, 2003. Baculoviruses. University of Otago, Department of

Microbiology.

42. Karma et al. (2012), Evaluation and production of improved formulation of

nucleopolyhedrosis virus of Spodoptera litura. Bulletin of Insectology 65 (2): 247-

256, 2012 ISSN 1721-8861.

43. Kelly D.C. and Tinsley, T.W. 1985. Taxonomy and nomenclature of insect

pathogenic viruses. In K. Maramorosch and K.E. Sherman (eds.), Viral

Insecticides for Biological Control. Academic Press, London, pp. 3-26.

44. Matsuura H, Naito A (1997) Studies on the cold-hardiness and overwintering of

Spodoptera litura F. ( Lepidoptera: Noctuidae): VI. Possible overwintering areas

predicted from meteorological data in Japan. Appl Entomo Zool 32:167_177.

45. Matsuura H, Naito A (1997) Studies on the cold-hardiness and overwintering

of Spodoptera litura F. (Lepidoptera: Noctuidae): VI. Possible overwintering

areas predicted from meteorological data in Japan. Appl Entomol Zool 32:167–

177.

46. Mehrvar A., R.J. Rabindra , K. Veenakumari and G.B. Narabenchi (200 7)

Standardization of Mass Production in Three Isolates of

Nucleopolyhedrovirus of Helicoverpa armigera (Hübner) . Pakistan Journal

of Biological Sciences, 10: 3992-3999.

47. Minion, F.C., Coons, L.B. and Brown, J.R. 1979. Characterization of the

Polyhedral Envelope of the Nuclear Polyhedrosis Virus of Heliothis virescens. J.

Invertebr. Pathol., 34: 303.

48. Mohammad Monobrullah and Uma Shankar. 2008. Sublethal effects of SpltNPV

infection on developmental stages of Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae).

Bio-control Science and Technology.

49. Monobrullah, M., & Nagata, M. (2000). Optimisation of Spodoptera litura Fab.

Nucleopolyhedrovirus Production in Homologous Host Larvae. Insect Science and

Its Application, 20(2), 157-165.

50. Monobrullah. Md. and Nagata. M. 2000. Developmental resistance in orally

inoculated mature larvae of Spodoptera lilura (Fab.) to its nuclear polyhedrosis

virus (NPV). Journal of Entomological Research. 24: 1-8.

51. Nasution, D.E.A., Miranti, M. and Melanie, M., (2015). Biological Test of

Formulation of Subculture Helicovepa armigera Nuclear Polyhedrosis Virus

(HaNPV) on Mortality of Spodoptera litura Larvae infested to cabbage (Brassica

oleracea Var. capitata Linn.) Plantation. Knowl. Publ. Serv., 2: 646-648.

52. O'Reilly DR, Miller LK, Luckow VA (1994) The baculovirus expression vectors:

a laboratory manual. Oxford: Oxford University Press.

53. Pearson, E. O. 1958. The insect pests of cotton in tropical Africa. Commonwealth

Inst. Entomol., London.

54. Rao, G. V. R., Wightman, J. A., & Ranga Rao, D. V. (1993). World review of the

natural enemies and diseases of podoptera litura (F.) (Lepidoptera: Noctuidae).

Insect Science Application, 14, 273–284.

55. Ranga Rao G.V., Ch. Sridhar Kumar, K. Sireesha, and P. Lava Kumar

(2015) Role of Nucleopolyhedroviruses (NPVs) in the Management of

Lepidopteran Pests in Asia.

56. Ravishankar B. S. and M. G . Venkatesha* (2010). Effectiveness of SINPV

of Spodoptera litura (Fab.) (Lepidoptera: Noctuidae) on different host

plants.

57. Roberts, D. W., Fuxa, J. R., Gaugler, R., Goettel, M, Jaques R. and Maddox.

J.(1991). Use of pathogens in insect control, In: (Pimentel, D. ed.). CRC Handbook

of Pest Management in Agriculture, second edition, Boca.

58. Sahayaraj, K. and Paulraj, M. G. (1998). Relative toxicity of some plant extracts to

groundnut leaf miner Aproaerema modicella Dev. International Arachis

Newsletters, 15: 62-63.

59. Shapiro, M., 1986. In vivo production of baculoviruses. In: Granados, R.R.,

Federici, B.A. (Eds.), The Biology of Baculoviruses, vol. II. CRC Press, Boca

Raton, FL, pp. 31–61.

60. Shaurub, E.H., Meguid, A.A. and Aziz, N.M.A., (2014). Effect of individual and

combined treatment with Azadirachtin and Spodoptera littoralis multicapsid

nucleopolyhedro virus (SpliMNPV, Baculoviridae) on the Egyptian cotton

leafworm Spodoptera littoralis (Boisduval) (Lepidoptera: Noctuidae). Ecol.

Balkanica, 6: 93-100.

61. SINGH, S.P AND JALALI, S.K., 1997. Management of Spodoptera litura

(Fabricius) (Lepidoptera: Noctuidae). Shashpa, 2: 203-206.

62. Smits, P. H., & Vlak, J. M. (1988). Biological activity of Spodoptera

exigua nuclear polyhedrosis virus against S. exigua larvae. Journal of Invertebrate

Pathology.

63. SUMMERS, M. D. & SMITH, G. E. (1978). Analysis of baculovirus genomes with

restriction endonucleases. Virology 89, 517-527.

64. Szewczyk B, Rabalski L, Krol E, Sihler W, Souza ML (2009). Baculovirus

biopesticides-a safe alternative to chemical protection of plants. J. Biopestic.,

2:209–216.

65. Tohnishi M. Flubendiamide, a novel insecticide highly active against

lepidopterous insect pests. J. Pestic. Sci. 2005;30:354–360.

66. Tran Thi Kieu Trang and S. Chaudhari, Bioassay of nuclear polyhedrosis virus

(npv) and in combination with insecticide on Spodoptera litura (Fab).

67. Tuan, S. J., Chen, W. L. and Kao, S. S. 1998. In vivo mass production and control

efficacy of Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae) nucleopolyhedrosis virus.

Chinese Journal of Entomology, 18: 101-116.

68. USDA. 1982. Pests not known to occur in the United States or of limited

distribution: Rice cutworm. USDA-APHIS-PPQ.

69. Venkateswarlu, U., Madhumathi, T. and Rao, P.A. 2005. Relative toxicity of novel

insecticides against insecticide resistant Guntur strain of Spodoptera litura (Fab.)

on cotton in Andhra Pradesh. Pesticide Research Journal, 17(1):33-35.

70. Vinay K (1997). Studies on enhancement of Baculovirus activity on Helicoverpa

armigera (Hubner). Ph.D. Thesis, IARI, New Delhi, India, 107p.

71. Vinod Kumari, and Singh, N.P. 2009. Spodoptera litura nuclear polyhedrosis

virus (NPV-S) as a component in Integrated Pest Management (IPM) of

Spodoptera litura (Fab.) on cabbage. J. Biopesticides, 2(1) 84-86.

72. Yamanaka, H., F. Nakasuji, and K. Kiritani, 1975, Development of the tobacco

cutworm Spodoptera litura in special reference to the density of larvae. Bull. Koch.

Inst. Agric. For Sci. 7: 1–7. (English summary).

TÀI LIỆU INTERNET

73. Merry Youle, 2012. It’s Raining Viruses!

http://schaechter.asmblog.org/schaechter/2012/01/its-raining-viruses.html

74. Phạm Thị Anh Thơ Trần Thị Thơm, 2014. Một số sâu hại cây trồng chủ yếu và biện

pháp phòng trừ sâu ăn rau.

https://www.slideshare.net/SinhKy-HaNam/bvtv-46thothom-c7su-hi-rau

75. Sâu khoang (Sâu ăn tạp) hại rau, đậu (Spodoptera litura).

http://camnangcaytrong.com/sau-khoang-sau-an-tap-sd66.html

76. Virus gây bệnh và ứng dụng của virus trong thực tiễn.

https://sinhhoc247.com/virus-gay-benh-va-ung-dung-cua-virus-trong-thuc-tien-

a5088.html

PHỤ LỤC 1

DANH MỤC HÌNH ẢNH

CÔNG THỨC 1 – DỊCH THÔ

(A) Sâu được nhiễm với dịch virus thô

(B) Sâu chết ở công thức nhiễm dịch virus thô

CÔNG THỨC 2 – DỊCH LY TÂM

(D) Sâu chết ở công thức dịch ly tâm

CÔNG THỨC 3 – ĐỐI CHỨNG

ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ

(A)(B) Khuẩn lạc ở lần lặp I công thức dịch thô

(C)(D) Khuẩn lạc ở lần lặp II công thức dịch thô

(E)(F) Khuẩn lạc ở lần lặp III công thức dịch thô

a) Khuẩn lạc ở lần lặp I công thức dịch ly tâm

(b) (c) Khuẩn lạc ở lần lặp II công thức dịch ly tâm

(d) (e) Khuẩn lạc ở lần lặp II công thức dịch ly tâm

Khuẩn lạc ở công thức đối chứng

SÂU CHẾT Ở CÔNG THỨC ẢNH HƯỞNG VỀ THỜI GIAN

PHỤ LỤC 2 SỐ LIỆU THÔ 3. Ảnh hưởng của tuổi sâu và nồng độ lây nhiễm

1.1 Hiệu lực diệt sâu

Sâu 7 ngày tuổi

102 0 0 2 2 0 Lần 1 105 0 0 8 10 2 104 0 0 5 6 0 106 0 1 11 12 5 103 0 0 2 3 0 107 0 3 11 13 3 ĐC 0 0 0 1 0

4 20 11 29 5 30 1 Ngày sau khi nhiễm 4 5 6 7 8 Tổng số sâu chết sau 8 ngày

HIỆU LỰC DIỆT SÂU

ACRSIN

10,34 13,79 18,76 21,80 34,48 35,96 65,52 54,04 96,55 79,30 100,00 90,00

Sâu 7 ngày tuổi

ACRSIN

13,79 27,59 37,93 48,28 58,62 58,62 72,41 21,80 31,68 38,02 44,01 49,96 49,96 58,32

1.2 Sản lượng virus thu được trên tổng số sâu chết

Lần nhắc I II III PIB Trung bình Log(x+1) 105 2,64 x1010 2,98 x1010 2,26 x1010 2,63 x1010 10,42 Sâu 7 ngày tuổi 106 3,17 x1010 3,86 x1010 3,52 x1010 3,52 x1010 10,55 107 3,44 x1010 3,25 x1010 3,16 x1010 3,28 x1010 10,52

Lần nhắc I II III PIB Trung bình Log(x+1) 106 2,87 x1010 2,46 x1010 3,15 x1010 2,83 x1010 10,45 Sâu 9 ngày tuổi 107 5,85 x1010 6,21 x1010 6,37 x1010 6,14 x1010 10,79 108 2,51 x1010 2,84 x1010 2,16 x1010 2,50 x1010 10,40

Lần nhắc I II III PIB Trung bình Log(x+1) 106 1,15 x1010 1,26 x1010 1,32 x1010 1,24 x1010 10,09 Sâu 11 ngày tuổi 107 1,89 x1010 1,65 x1010 1,23 x1010 1,59 x1010 10,20 108 2,44 x1010 1,86 x1010 2,12 x1010 2,14 x1010 10,33

4. Ảnh hưởng của dịch thời gian lây nhiễm

2.1 Số sâu chết

SÂU CHẾT CT1- ĐỐI CHỨNG

Lần nhắc Sau 1 ngày nhiễm Sau 2 ngày nhiễm Sau 3 ngày nhiễm Sau 4 ngày nhiễm Sau 5 ngày nhiễm Sau 6 ngày nhiễm Sau 7 ngày nhiễm Sau 8 ngày nhiễm I 0 0 0 0 0 0 0 0 II 0 0 0 0 0 1 0 0 III 0 0 0 0 0 2 0 0

SÂU CHẾT

Lần nhắc Sau 1 ngày nhiễm Sau 2 ngày nhiễm Sau 3 ngày nhiễm Sau 4 ngày nhiễm Sau 5 ngày nhiễm Sau 6 ngày nhiễm Sau 7 ngày nhiễm Sau 8 ngày nhiễm III 0 0 1 8 2 1 0 1 CT2-6h II 0 0 2 5 6 1 0 0 I 0 0 0 9 5 0 0 0

SÂU CHẾT

Lần nhắc Sau 1 ngày nhiễm Sau 2 ngày nhiễm Sau 3 ngày nhiễm Sau 4 ngày nhiễm Sau 5 ngày nhiễm Sau 6 ngày nhiễm Sau 7 ngày nhiễm Sau 8 ngày nhiễm CT2-12h II 0 1 0 6 5 0 2 0 III 0 0 0 6 7 1 1 I 0 0 0 9 4 1 0 0

SÂU CHẾT

Lần nhắc Sau 1 ngày nhiễm Sau 2 ngày nhiễm Sau 3 ngày nhiễm Sau 4 ngày nhiễm Sau 5 ngày nhiễm Sau 6 ngày nhiễm Sau 7 ngày nhiễm Sau 8 ngày nhiễm CT2-48h II 0 0 0 6 9 III 0 0 1 7 5 2 I 1 0 1 3 6 3 1

SÂU CHẾT

Lần nhắc Sau 1 ngày nhiễm Sau 2 ngày nhiễm Sau 3 ngày nhiễm Sau 4 ngày nhiễm Sau 5 ngày nhiễm Sau 6 ngày nhiễm Sau 7 ngày nhiễm Sau 8 ngày nhiễm CT2-96h II 0 0 1 3 7 2 2 0 III 1 0 1 4 4 3 2 1 I 0 0 2 2 4 2 3 2

SÂU CHẾT

Lần nhắc Sau 1 ngày nhiễm Sau 2 ngày nhiễm Sau 3 ngày nhiễm Sau 4 ngày nhiễm Sau 5 ngày nhiễm Sau 6 ngày nhiễm Sau 7 ngày nhiễm Sau 8 ngày nhiễm CT2-24h II 0 0 1 10 4 III 1 0 1 5 5 1 1 1 I 0 0 2 8 4 1

2.2 Khối lượng sâu ở các công thức

I 0,315 II 0,058 III 0,6

I 0,115 II 0,087 III 0,100 0,364 0,036 0,429

0,080 0,179 0,212 0,674 0,301 0,285

0,595 0,316 0,511 0,511 0,262 0,259

0,340 0,376 0,243 0,262 0,365 0,366 KHỐI LƯỢNG SÂU CHẾT CT-6h 0,469 0,217 0,483 KHỐI LƯỢNG SÂU CHẾT CT-12h 0,272 0,164 0,369

0,281 0,230 0,215 0,578 0,242 0,752

0,361 0,699 0,338 0,382 0,353 1,239

m(g) TB 0,320 0,301 0,346 0,504 0,374

0,468 0,314 I II III 0,491 0,476 0,054 0,419 0,585 0,206 0,405 0,425 m(g) TB 0,433 0,295 0,537 0,387 0,366 0,231

0,174 0,592 0,543 KHỐI LƯỢNG SÂU CHẾT CT-24h 0,825 0,526 0,250

0,294 0,217 1,002

0,652 0,356 0,791

0,768 0,360

0,736

0,744

m(g) TB 0,473 0,436 0,523

I II III I II III

KHỐI LƯỢNG SÂU CHẾT CT-96h KHỐI LƯỢNG SÂU CHẾT CT-48h

0,110 0,492 0,372 0,598 0,779 0,673 0,715 0,716 0,356 0,262 0,414 0,303 0,226 0,353 0,211 0,909 0,105 0,36 0,36 0,2 0,44 0,15 0,57 0,48 0,12 0,101 0,467 0,258 0,849 0,482 0,565 0,858 0,883

m(g) TB 1,029 0,609 0,643 0,409 0,558

0,45 0,28 0,2 0,15 0,35 0,42 0,41 0,11 0,45 0,21 0,42 0,46 0,22 0,06 0,39 0,16 0,42 0,37 0,46 0,23 0,49 0,51 0,19 0,18

0,41

0,21

m(g) TB 0,326 0,307 0,309

2.3 Sản lượng virus ở các công thức

10^-2 TB PIB/ml PIB/sâu 10^-3 TB PIB/ml PIB/sâu Virus TB SẢN LƯỢNG VIRUS CT 6h 325 263 311 340 266 305 330 278 315 331,67 269 310,33 1,66 x109 1,35 x109 1,55 x109 2,23 x109 1,75 x109 2,05 x109 32 33 30 35 29 29 25 29 39 35.33 29 29.33 1,77 x109 1,45 x109 1,47 x109 2,38 x109 1,89 x109 1,94 x109 2,31 x109 1,82 x109 1,99 x109

12h 10^-2 TB PIB/ml PIB/sâu 10^-3 TB PIB/ml PIB/sâu Virus TB SẢN LƯỢNG VIRUS CT 12h 475 243 354 509 243 365 494 264 353 492,67 250 357,33 2.46 x109 1,25 x109 1,79 x109 3.79 x109 1,62 x109 2,56 x109 53 24 34 57 26 38 29 39 62 57,33 26,33 37 2,87 x109 1,32 x109 1,85 x109 4,41 x109 1,71 x109 2,65 x109 4,10 x109 1,66 x109 2,61 x109

SẢN LƯỢNG VIRUS CT 24h 24h 495 360 498 10^-2 475 369 397 510 378 409 493.33 369 434,67 TB 2.47 x109 1,85 x109 2,17 x109 PIB/ml 3.76 x109 2,65 x109 3,20 x109 PIB/sâu 53 37 43 10^-3 55 40 46 50 39 47 52,67 38,67 45,33 TB 2,63 x109 1,93 x109 2,27 x109 PIB/ml 4,01 x109 2,78 x109 3,34 x109 PIB/sâu 3,88 x109 2,71 x109 Virus TB 3,27 x109

48h 10^-2 TB PIB/ml PIB/sâu 10^-3 TB PIB/ml PIB/sâu Virus TB SẢN LƯỢNG VIRUS CT 48h 485 350 559 508 363 585 349 579 496 496,33 354 574,33 1,77 x109 2,87 x109 2,48E+09 2,49 x109 4,62 x109 3,87E+09 53 35 62 49 39 59 51 40 63 38 51 61,33 2,55 x109 1,90 x109 3,07 x109 3,97 x109 2,68 x109 4,94 x109 3,92 x109 2,59 x109 4,78 x109

SẢN LƯỢNG VIRUS CT 96h

I III

II 1,36 x109 1,39 x109 1,56 x109 1,74 x109 9,50 x108 1,46 x109 1,39 x109 1,44 x109 1,49 x109 1,70 x109 9,50 x108 1,75 x109 1,35 x109 1,40 x109 1,40 x109 1,85 x109 1,10 x109 1,10 x109 VIRUS TB 1,56 x109 1,20 x109 1,46 x109

5. Ảnh hưởng của dịch ly tâm và dịch thô

3.1 Số sâu chết ở công thức dịch thô và dịch ly tâm

SÂU CHẾT DỊCH LY TÂM

I II III IV V VI

Sau 4 ngày nhiễm 2 3 1 1 1 2

Sau 5 ngày nhiễm 4 4 6 7 8 5

Sau 6 ngày nhiễm 2 1 2 1 1 2

Sau 7 ngày nhiễm 2 1 0 0 0 0

Sau 8 ngày nhiễm 0 0 1 0 0 0

Sau 9 ngày nhiễm 0 1 0 1 0 1

SÂU CHẾT DỊCH THÔ

I II III IV V VI

Sau 4 ngày nhiễm 8 7 9 9 9 8

Sau 5 ngày nhiễm 4 3 3 2 1 3

Sau 6 ngày nhiễm 2 2 1 1 0 1

Sau 7 ngày nhiễm 0 1 1 1 0 1

Sau 8 ngày nhiễm 0 1 0 1 0 1

Sau 9 ngày nhiễm 0 0 0 0 0 0

3.2 Khối lượng sâu chết ở công thức dịch thô và dịch ly tâm

KHỐI LƯỢNG SÂU CHẾT Ở CT DỊCH THÔ

0,87 0,72 0,68 0,76 0,83 0,52 0,45 m(g)

0,77 0,76 0,83 0,92 0,78 0,38 0,74 0,84

0,52 0,84 0,79 0,78 0,78 0,74 0,38 0,59

0,35 0,53 0,43 0,62 0,58 0,63 0,57 0,76

0,8 0,51 0,58 0,66 0,76 0,78 0,67 0,57

0,79 0,43 0,66 0,58 0,71 0,71 0,54 0,75

KHỐI LƯỢNG SÂU CHẾT Ở CT DỊCH LY TÂM

0,69 0,67 0,68 0,66 0,59 0,9 0,61 m(g)

0,76 0,65 0,56 0,58 0,6 0,76 0,75 0,76

0,64 0,75 0,67 0,76 0,6 0,85 0,67 0,57

0,6 0,78 0,68 0,6 0,81 0,78 0,6 0,83

0,7 0,61 0,78 0,83 0,69 0,76 0,8 0,73

0,79 0,64 0,89 0,73 0,79 1,18 0,73 0,66

3.3 Sản lượng virus ở công thức dịch thô và dịch ly tâm

SẢN LƯỢNG VIRUS Ở DỊCH LY TÂM 4,78 x109 2,56 x109 2,56 x109 2,36 x109 2,87 x109 2,68 x109 3,63 x109 3,32 x109 3,41 x109 3,40 x109 2,34 x109 3,45 x109 2,38 x109 2,52 x109 3,09 x109 2,68 x109 3,28 x109 3,18 x109 2,80 x109 2,85 x109 3,57 x109 2,86 x109

SẢN LƯỢNG VIRUS Ở DỊCH THÔ 3,02 x109 2,12 x109 3,00 x109 2,87 x109 2,95 x109 2,66 x109 2,83 x109 1,84 x109 1,85 x109 2,39 x109 3,00 x109 3,16 x109 1,91 x109 2,98 x109 3,16 x109 2,81 x109 1,66 x109 2,21 x109 2,91 x109 2,91 x109 3,06 x109 2,00 x109

3.4 Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí ở công thức dịch thô và dịch ly tâm

CT1 – Dịch thô

I 62 83 II 54 113 CT2 – Dịch ly tâm CT3 – Đối chứng III 4 2 III 25 25 I 42 II 27 34 II 1 0 I 0 1 III 69 52 10-3

PHỤ LỤC 3 XỬ LÝ SỐ LIỆU Hiệu lực diệt sâu đã được quy đổi sang ASIN

Sản lượng NPV thu được quy đổi sang log(x+1);

1. Hiệu lực diệt sâu sau 8 ngày lây nhiễm của các nồng độ ở sâu 7, 9, 11 ngày tuổi

‘HIEU LUC DIET SAU, SAU 8 NGAY NHIEM’

Duncan's Multiple Range Test for Y

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 40

Error Mean Square 11.17636

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N AB

A 90.000 3 9N10^7

A 90.000 3 9N10^8

A 86.433 3 7N10^7

B 77.790 3 7N10^6

C 63.153 3 11N10^8

C 59.647 3 9N10^6

D 53.353 3 7N10^5

D 50.633 3 11N10^7

D 49.310 3 11N10^6

E 43.713 3 9N10^5

F E 41.353 3 11N10^5

F G 37.333 3 7N10^4

F G 35.930 3 9N10^4

HIEU LUC DIET SAU, SAU 8 NGAY NHIEM’

The GLM Procedure

Duncan's Multiple Range Test for Y

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N AB

H G 32.253 3 11N10^4

H I 27.637 3 7N10^3

J I 26.003 3 11N10^3

J I 25.743 3 9N10^3

J I K 21.697 3 7N10^2

J K 21.313 3 9N10^2

K 18.597 3 11N10^2

2. Đánh giá sản lượng NPV thu được trên tổng số sâu chết ở các độ tuổi và các

nồng độ lây nhiễm

‘SAN LUONG’

The GLM Procedure

Duncan's Multiple Range Test for Y

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 18

Error Mean Square 0.003004

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N AB

A 10.78667 3 9N10^7

B 10.54667 3 7N10^6

B 10.51667 3 7N10^7

C B 10.45000 3 9N10^6

C D 10.41333 3 7N10^5

C D 10.39333 3 9N10^8

D 10.33000 3 11N10^8

E 10.19667 3 11N10^7

F 10.09333 3 11N10^6

3. Hiệu lực diệt sâu (%) của dịch thô và dịch ly tâm

Hiệu lực diệt sâu (%) sau 4 ngày nhiễm TB

25.00 CT1 10 CT1 30 CT1 40 CT1 20 CT1 10 CT1 40

ACRSIN

16.67 CT2 20 CT2 30 CT2 10 CT2 10 CT2 10 CT2 20

CT1 18.43 CT1 33.21 CT1 39.23 CT1 26.57 CT1 18.43 CT1 39.23 29.18

CT2 26.57 CT2 33.21 CT2 18.43 CT2 18.43 CT2 18.43 CT2 26.57 23.61

‘HIEU LUC DIET SAU, 4 NGAY NHIEM’

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for N

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 10

Error Mean Square 64.63633

Critical Value of t 2.22814

Least Significant Difference 10.342

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N T

A 29.183 6 CT1

A 23.607 6 CT2

Hiệu lực diệt sâu (%) sau 5 ngày nhiễm TB

70 71.67 CT1 70 CT1 80 CT1 70 CT1 70 CT1 70 CT1

70 73.33 CT2 60 CT2 70 CT2 70 CT2 80 CT2 90 CT2

ACRSIN TB

CT1 56.79 CT1 63.43 CT1 56.79 CT1 56.79 CT1 56.79 CT1 56.79 57.90

CT2 50.77 CT2 56.79 CT2 56.79 CT2 63.43 CT2 71.57 CT2 56.79 59.36

‘HIEU LUC DIET SAU, 5 NGAY NHIEM’

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for N

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 10

Error Mean Square 29.59931

Critical Value of t 2.22814

Least Significant Difference 6.9988

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N T

A 59.357 6 CT2

A 57.897 6 CT1

Hiệu lực diệt sâu (%) sau 6 ngày nhiễm TB

80 80.00 CT1 90 CT1 80 CT1 70 CT1 90 CT1 70 CT1

90 88.33 CT2 80 CT2 80 CT2 90 CT2 90 CT2 100 CT2

ACRSIN TB

CT1 71.57 CT1 63.43 CT1 56.79 CT1 71.57 CT1 56.79 CT1 63.43 63.93

CT2 63.43 CT2 63.43 CT2 71.57 CT2 71.57 CT2 90.00 CT2 71.57 71.93

‘HIEU LUC DIET SAU, 6 NGAY NHIEM’

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for N

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 10

Error Mean Square 69.06121

Critical Value of t 2.22814

Least Significant Difference 10.691

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N T

A 71.928 6 CT2

A 63.930 6 CT1

Hiệu lực diệt sâu (%) sau 7 ngày nhiễm TB

80 91.67 CT1 100 CT1 90 CT1 100 CT1 100 CT1 80 CT1

90 93.33 CT2 100 CT2 90 CT2 90 CT2 90 CT2 100 CT2

ACRSIN TB

CT1 90.00 CT1 71.57 CT1 90.00 CT1 90.00 CT1 63.43 CT1 63.43 78.07

CT2 90.00 CT2 71.57 CT2 71.57 CT2 71.57 CT2 90.00 CT2 71.57 77.71

‘HIEU LUC DIET SAU, 7 NGAY NHIEM’

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for N

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 10

Error Mean Square 135.077

Critical Value of t 2.22814

Least Significant Difference 14.951

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N T

A 78.072 6 CT1

A 77.713 6 CT2

Hiệu lực diệt sâu (%) sau 8 ngày nhiễm TB

80 91.67 CT1 100 CT1 90 CT1 100 CT1 100 CT1 80 CT1

90 95.00 CT2 100 CT2 90 CT2 100 CT2 90 CT2 100 CT2

ACRSIN TB

CT1 90.00 CT1 71.57 CT1 90.00 CT1 90.00 CT1 63.43 CT1 63.43 78.07

CT2 90.00 CT2 71.57 CT2 90.00 CT2 71.57 CT2 90.00 CT2 71.57 80.78

‘HIEU LUC DIET SAU, 8 NGAY NHIEM’

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for N

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 10

Error Mean Square 140.7381

Critical Value of t 2.22814

Least Significant Difference 15.261

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N T

A 80.785 6 CT2

A 78.072 6 CT1

Hiệu lực diệt sâu (%) sau 9 ngày nhiễm TB

100 100.00 CT1 100 CT1 100 CT1 100 CT1 100 CT1 100 CT1

100 100.00 CT2 100 CT2 100 CT2 100 CT2 100 CT2 100 CT2

ACRSIN TB

CT1 90.00 CT1 90.00 CT1 90.00 CT1 90.00 CT1 90.00 CT1 90.00 90.00

CT2 90.00 CT2 90.00 CT2 90.00 CT2 90.00 CT2 90.00 CT2 90.00 90.00

‘HIEU LUC DIET SAU, 9 NGAY NHIEM’

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for N

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 10

Error Mean Square 0

Critical Value of t 2.22814

Least Significant Difference 0

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N T

A 90.00 6 CT1

A 90.00 6 CT2

4. Khối lượng (g) sâu chết ở công thức dịch thô và dịch ly tâm

Khối lượng (g) Dịch ly tâm Dịch thô

sâu chết 0.717447 0.664681

The TTEST Procedure

Statistics

Lower CL Upper CL Lower CL Upper CL

Variable N Mean Mean Mean Std Dev Std Dev Std Dev Std

Err Minimum Maximum

D 47 -0.105 -0.053 -54E-5 0.1478 0.1779 0.2234 0.0259

-0.51 0.32

T-Tests

Variable DF t Value Pr > |t|

D 46 -2.03 0.0478

5. Sản lượng PIB/sâu chết ở công thức dịch thô và dịch ly tâm

Sản lượng virus Dịch ly tâm 3.03 x109 Dịch thô 2.60 x109

Log(x+1) 9.480916762 9.415724362

The TTEST Procedure

Statistics

Lower CL Upper CL Lower CL Upper CL

Variable N Mean Mean Mean Std Dev Std Dev Std Dev Std

Err Minimum Maximum

D 22 0.0228 0.0677 0.1127 0.078 0.1014 0.1449 0.0216

-0.09 0.28

T-Tests

Variable DF t Value Pr > |t|

D 21 3.13 0.0050

6. Tổng vi sinh vật hiếu khí sau khi nhiễm 1 ngày

Tổng vsv hiếu khí sau khi nhiễm 1 ngày ở các công thức TB

CLT

7.20x104 CLT 4.20x104 8.35x104 CLT 3.05x104 6.05x104 7.20x104 2.50x104 3.25x104 LT LT LT

0 0 0 0 DC DC DC

Log(x+1) TB

CLT 4.857339 CLT 4.921692 CLT 4.781763 4.853598

4.397957 4.501844 LT 4.62326 LT 4.484314 LT

0 0 0 0 ĐC ĐC ĐC

‘TONG VSV HIEU KHI, TPC’

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for N

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 6

Error Mean Square 0.005942

Critical Value of t 2.44691

Least Significant Difference 0.154

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N T

A 4.85360 3 CLT

B 4.50184 3 LT

C 0.00000 3 DC

7. Hiệu lực diệt sâu ở công thức 6h, 12h, 24h, 48h, 96h

Sau 3 ngày lây nhiễm TB

14.96 12.13 6h 0.00 6h 21.42 6h

0.00 4.99 12h 0.00 12h 14.96 12h

21.42 19.27 24h 21.42 24h 14.96 24h

14.96 12.13 48h 21.42 48h 0.00 48h

22.79 19.50 96h 22.79 96h 12.92 96h

‘HIEU LUC DIET SAU SAU 3 NGAY NHIEM’

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for N

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 10

Error Mean Square 72.48665

Critical Value of t 2.22814

Least Significant Difference 15.489

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N T

A 19.500 3 96h

A 19.267 3 24h

A 12.127 3 48h

A 12.127 3 6h

A 4.987 3 12h

Sau 5 ngày lây nhiễm TB

75.04 68.58 58.91 67.51 6h 6h 6h

68.58 63.43 68.58 66.87 12h 12h 12h

75.04 90.00 63.43 76.16 24h 24h 24h

58.91 90.00 68.58 72.50 48h 48h 48h

53.73 63.43 60.00 59.05 96h 96h 96h

‘HIEU LUC DIET SAU SAU 5 NGAY NHIEM’

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for N

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 10

Error Mean Square 105.9034

Critical Value of t 2.22814

Least Significant Difference 18.722

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N T

A 76.157 3 24h

A 72.497 3 48h

A 67.510 3 6h

A 66.863 3 12h

A 59.053 3 96h

Sau 7 ngày lây nhiễm TB

75.04 74.50 61.29 70.27 6h 6h 6h

75.04 74.50 90.00 79.85 12h 12h 12h

90.00 90.00 73.90 84.63 24h 24h 24h

90.00 90.00 90.00 90.00 48h 48h 48h

67.21 90.00 76.10 77.77 96h 96h 96h

‘HIEU LUC DIET SAU SAU 7 NGAY NHIEM’

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for N

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 10

Error Mean Square 71.27492

Critical Value of t 2.22814

Least Significant Difference 15.359

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N T

A 90.000 3 48h

B A 84.633 3 24h

B A 79.847 3 12h

B A 77.770 3 96h

B 70.277 3 6h

8. Khối lượng (g) sâu chết ở công thức 6h, 12h, 24h, 48h, 96h

Khối lượng sâu chết ở các công thức thời gian TB

0.320 0.301 0.346 0.322 6h 6h 6h

0.433 0.295 0.523 0.417 12h 12h 12h

0.473 0.436 0.523 0.477 24h 24h 24h

0.609 0.409 0.558 0.525 48h 48h 48h

0.309 0.314 96h 0.326 96h 0.307 96h

‘TRONGLUONGSAU’

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for N

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 10

Error Mean Square 0.005303

Critical Value of t 2.22814

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N T

A 0.52533 3 48h

A 0.47733 3 24h

B A 0.41700 3 12h

B 0.32233 3 6h

B 0.31400 3 96h

9. Sản lượng PIB/sâu chết ở công thức 6h, 12h, 24h, 48h, 96h

Sản lượng virus thu được (PIB/sâu chết)

6h 6h 6h

12h 12h 12h

24h 24h 24h

48h 48h 48h

1.992 x109 2.606 x109 3.270 x109 4.778 x109 2.214 x109 1.818 x109 1.662 x109 2.712 x109 2.585 x109 1.626 x109 2.306 x109 4.097 x109 3.884 x109 3.919 x109 1.912 x109 TB 2.038 x109 2.788 x109 3.288 x109 3.761 x109 1.917 x109 96h 96h 96h

log(x+1) TB

9.259 9.299 9.363 9.307 6h 6h 6h

9.221 9.416 9.612 9.416 12h 12h 12h

9.433 9.514 9.589 9.512 24h 24h 24h

9.412 9.679 9.593 9.562 48h 48h 48h

9.211 9.345 9.281 9.279 96h 96h 96h

‘PIB’

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for N

Alpha 0.05

Error Mean Square 0.014025

Critical Value of t 2.22814

Least Significant Difference 0.2155

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N T

A 9.56133 3 48h

B A 9.51200 3 24h

B A C 9.41633 3 12h

B C 9.30700 3 6h

C 9.27900 3 96h