Đồ án tổng hợp: Nghiên cứu kĩ thuật cố định vi khuẩn Streptococcus thermophillus và Lactobacillus bulgaricus trên cellulose sản xuất từ vi khuẩn Acetobacter xylinum

Chia sẻ: Hung Duong | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:58

Thêm vào BST

Báo xấu

331
lượt xem 65
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đồ án tổng hợp: Nghiên cứu kĩ thuật cố định vi khuẩn Streptococcus thermophillus và Lactobacillus bulgaricus trên cellulose sản xuất từ vi khuẩn Acetobacter xylinum trình bày các nội dung chính: giới thiệu về chất mang cellulose vi khuẩn, giới thiệu về vi khuẩn ST và LB, các phương pháp bảo quản vi sinh vật, tình hình nghiên cứu và cố định vi khuẩn trên chất mang BC trong và ngoài nước, phương pháp nghiên cứu đề tài, kết quả nghiên cứu, khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn ST và LT bằng phương pháp đo mật độ quang (OD) trên máy quang phổ UV – Vis, xác định hiệu quả cố định vi khuẩn lactic trên chất mang BC sau các thời gian bảo quản, đánh giá phương pháp bảo quản vi khuẩn lactic trên chất mang BC so với một số phương pháp khác,...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đồ án tổng hợp: Nghiên cứu kĩ thuật cố định vi khuẩn Streptococcus thermophillus và Lactobacillus bulgaricus trên cellulose sản xuất từ vi khuẩn Acetobacter xylinum

MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Mục lục Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ PHỤ LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Ký hiệu Tên đầy dủ 1 BC Bacterial cellulose 2 ST Streptococcus thermophillus 3 LB Lactobacillus bulgaricus 4 AX Acetobacter xylinum
DANH MỤC BẢNG STT Số hiệu Tên Bảng Trang 1 1.1 Cấu trúc BC ở một số loài vi khuẩn 3 Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào của 2 vi 2 3.1 31 khuẩn LB và ST
DANH MỤC HÌNH Số STT Tên hình Trang hiệu Cấu trúc cellulose (a) của vi khuẩn (BC) ( × 20000 lần) và 1 1.1 5 (b) của thực vật (PC) ( × 200 lần) 2 1.2 Sơ đồ các con đường tổng hợp cellulose bởi AX 7 3 1.3 Màng BC ướt đang được gỡ bỏ từ môi trường nuôi cấy 10 4 1.4 Cấu tạo của AX được bao bọc bởi cellulose 11 5 1.5 Quy trình sản xuất thạch dừa 12 6 1.6 Trà túi lọc lipton 13 7 1.7 Đường saccharose 13 8 1.8 Streptococcus thermophillus 14 9 1.9 Lactobaccillus bulgaricus 14 10 1.10 Đông khô vi khuân ̉ 16 11 1.11 ̉ ̉ ̣ Bao quan lanh 16 12 2.1 Sơ đồ phân lập hai chủng vi khuẩn ST và LB 24 13 2.2 Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất sữa chua 28 Khuẩn lạc hỗn hợp hai vi khuẩn ST và LB từ sữa chua 14 3.1 30 vinamilk 16 3.2 Khuẩn lạc vi khuẩn ST (1) và LB (2) đã thuần khiết 31 17 3.3 Hình ảnh ống giống của chủng ST 32 18 3.4 Hình ảnh ống giống của chủng LB 32 Đồ thị biểu diễn đường cong sinh trưởng của 2 chủng 19 3.5 33 LB và ST trong 72 giờ 20 3.6 Thu nhận BC ướt từ môi trường nuôi cấy 35 21 3.7 Khối lượng BC tạo thành ở các mốc thời gian 35 22 3.8 BC sau khi sấy 36 23 3.9 BC trước khi ngâm (1) và sau khi ngâm dịch vi khuẩn (2) 37 24 3.10 Chế phẩm vi khuẩn lactic trên BC 38 Khả năng sống sót của chế phẩm vi khuẩn lactic trên 25 3.11 39 chất mang BC 26 3.12 Khuẩn lạc của chế phẩm ST (1) và LB (2) sau hoạt hóa 40 27 3.13 Khả năng sinh acid lactic của mẫu 1 và mẫu 2 41 Đồ thị biêu diên khả năng sông sot cua vi khuân lactic trên ̉ ̃ ́ ́ ̉ ̉ 28 3.14 chất mang BC sau các môc thời gian bao quan là 1 thang ́ ̉ ̉ ́ 43 và 2,5 thang ́ Khả năng sinh acid lactic của chế phẩm vi khuẩn lactic 29 3.15 44 qua các mốc thời gian bảo quản
Đồ án tổng hợp - 1- GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương LỜI MỞ ĐẦU Hiện nay kĩ thuật cố định tế bào đang được đề cập và quan tâm rất nhiều, đặc biệt trong quá trình bảo quản, lưu thông, cung cấp giống cho lĩnh vực lên men tạo ra sản phẩm thực phẩm. Tế bào cố định có nhiều ưu điểm so với tế bào tự do: Tiện lợi trong việc bảo quản, lưu thông và giúp giảm chi phí ở giai đoạn chuẩn bị giống. Theo khảo sát những chất mang thường dùng để cố định tế bào vi sinh vật: Aliganate, gelatin, xơ dừa, vỏ bưởi, táo, lê… Tuy nhiên những chất mang truyền thống này kém bền hoặc giá thành đắt, vì vậy việc tìm kiếm một chất mang mới có ưu thế hơn là cần thiết. Cellulose vi khuẩn hội đủ những điều kiện của một chất mang trong cố định tế bào: Giá thành rẻ, độ tinh khiết cao, có khả năng hút nước và giữ ẩm tốt nhờ cấu trúc mạng lưới cellulose, có thể bổ sung trực tiếp vào sản phẩm thực phẩm mà không xảy ra bất kỳ phản ứng phụ nào, bên cạnh đó nó còn rất tốt cho hệ tiêu hóa bởi nó mang bản chất là cellulose giống như thạch dừa…nên được chọn làm chất mang trong đề tài này. Hiện nay trong các nhà máy sản xuất sữa chua người ta chỉ bảo quản giống bằng phương pháp bảo quản lạnh, nhân giống cấy chuyền và hoạt hóa nhiều lần. Tuy nhiên chi phí cho việc bảo quản lạnh và cấy chuyền rất tốn kém, bên canh đó tiến hành hoạt hóa và cấy chuyền nhiều lần sẽ làm giảm hoạt lực của vi khuẩn lactic sau 7 – 8 thế hệ. Vì vậy các nhà sản xuất phải tiến hành mua ống giống tinh khiết từ các nhà cung cấp giống, chi phí cho việc mua ống giống tốn chi phí rất cao. Vì thế, việc cố định hai chủng vi khuẩn ST và LB trên giá thể BC là điều cần thiết. Chế phẩm vi khuẩn lactic trên chất mang BC mang lại rất nhiều thuận lợi: Điều kiện bảo quản dễ dàng, lưu thông, cung cấp giống thuận tiện, chủ đ ộng trong việc sử dụng giống, đặc biệt chế phẩm vi khuẩn lactic trên chất mang BC vẫn ở thế hệ thứ nhất. Từ thực tiễn yêu cầu em đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu kĩ thuật cố định vi khuẩn Streptococcus thermophillus và Lactobacillus bulgaricus trên cellulose sản xuất từ vi khuẩn Acetobacter xylinum” với mong muốn sẽ mang lại nhiều sự thuận lợi hơn trong việc bảo quản, lưu thông, cung cấp giống, giải quyết được vấn đề nan giải trong cung cấp và bảo quản giống cho các nhà máy sản xuất s ữa SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP
Đồ án tổng hợp - 2- GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương chua cũng như các lĩnh vực khác cần đến chế phẩm này. Trong phạm vi đề tài này em sẽ tiến hành nghiên cứu các điều kiện tối ưu để cố định 2 chủng vi khuẩn ST và LB trên chất mang BC và khảo sát thời gian bảo quản, hoạt lực của chế phẩm vi khuẩn lactic trên chất mang BC sau khi cố định và các mốc thời gian trong quá trình bảo quản. Sinh viên thực hiện Lê Thị Bốn SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP
Đồ án tổng hợp - 3- GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về chất mang cellulose vi khuẩn (BC) 1.1.1. Khái quát chung về BC 1.1.1.1. Một số vi khuẩn sinh tổng hợp BC BC được tổng hợp bởi một số vi khuẩn (bảng 1.1) (Theo Jonas và Farah, 1998). Con đường tổng hợp và cơ chế điều hòa tổng hợp BC ở các loài có kẽ giống nhau, nhưng cấu trúc BC ở mỗi loài thì khác nhau (Ross và cộng sự, 1991; Jonas và Farah,1998). Có các điểm khác biệt đáng kể về thuộc tính vật lý của các sản phẩm celluose, chủ yếu là chiều dài của chuỗi glucan (được đặc trưng bởi mức độ polymer hóa), tính kết tinh và trạng thái tính chất của nó. Tùy thuộc vào mỗi loài mà trạng thái kết tinh của cellulose khác nhau, từ đó xác định các tính chất vật lý của sản phẩm như độ bền, độ hòa tan trong các dung môi, tính chịu ảnh hưởng của các tác nhân biến tính [2,3]. Bảng 1.1. Cấu trúc BC ở một số loài vi khuẩn [2] Giống Cấu trúc cellulose Acertobacter Lớp màng ngoại bào tạo thành các dãi Achromobacter Sợi Aerobacter Sợi Agrobacterium Sợi ngắn Alcaligen Sợi Pseudomonas Các sợi không tách biệt Rhizobium Sợi ngắn Sarcina Cellulose dị hình Zoogloea Chưa xác định rõ cấu trúc AX (A.aceti ssp. Xylinum, A.xylinus), là vi sinh vật tạo cellulose hữu hiệu nhất. Gần đây nó đã được xếp vào giống mới Gluconacertobacter, bao gồm các loài là G.xylinus (Yamada avf cộng sự, 1998,2000), G.hánenii, G.europaeus, G.oboediens và G.intermedius [2,4]. 1.1.1.2. Cấu trúc của BC Cellulose là một polyme không phân nhánh bao gồm những gốc glucopyranose nối với nhau bởi nối β – 1,4. Các nghiên cứu cơ bản về BC cho thấy BC có cấu trúc hóa học giống y hệt PC (plant cellulose – cellulose thực vật). Tuy nhiên, cấu SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP
Đồ án tổng hợp - 4- GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương trúc đa phân và thuộc tính của BC khác với PC. Các sợi mới sinh ra của BC kết lại với nhau để hình thành nên các sợi sơ cấp (subfibril), có chiều rộng khoảng 1,5 nm. Là những sợi mảnh nhất có nguồn gốc tự nhiên [Kudlicka, 1989]. Các vi sợi nằm trong các bó (budle), và cuối cùng hình thành các dải (ribbon) (Yamanaka và cộng sự, 2000). Các dải có chiều dày 3 – 4 nm × chiều rộng 70 – 80 nm (Zarr,1977); 3,2 × 133 nm (Brown và cộng sự, 1976); 4,1 × 117 nm (Yumanaka và cộng sự, 2000). Trong khi chiều rộng của các sợi cellulose được tạo ra từ gỗ thông là 30.000 – 75.000 nm hay gỗ bulô (Betula) là 14.000 – 40.000 nm (hình 1.1). Những dải vi sợi cellulose mịn có chiều dài thay đổi từ 1 – 9 µ m làm hình thành nên cấu trúc lưới dày đặc, được ổn định bởi các nối hydrogen. BC khác với PC về chỉ số kết chặt, về mức độ polymer hóa, thường BC có mức độ polymer hóa từ 2.000 – 6.000 (Jonas và Farah, 1998); một vài trường hợp đạt tới 16.000 – 20.000 (Watanabc và cộng sự 1998) trong khi mức polymer hóa ở thực vật là 13.000 – 14.000 (Teeri, 1997) [2,5]. Cấu trúc của BC phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy (Watanabe và cộng sự, 1998a; Yamanaka và cộng sự, 2000). Ở điều kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn tổng hợp những miếng cellulose trên bề mặt của dịch nuôi cấy, tại ranh giới giữa bề mặt dịch lỏng và không khí giàu oxy. Các miếng BC này được gọi là BC trên môi trường tĩnh ( S – BC: Static BC). Các sợi cellulose sơ cấp liên tục được đẩy ra từ những lỗ được xếp dọc trên bề mặt của tế bào vi khuẩn, kết tinh lại thành các vi sợi, và bị đẩy xuống sâu hơn trong môi trường dinh dưỡng. Các dải cellulose từ môi trường tĩnh tạo nên các mặt phẳng song song nhưng không tổ chức, có vai trò chống đỡ cho quần thể tế bào AX (Jonas và Farah, 1998). Các sợi BC kế nhau được tạo ra từ môi trường tĩnh nối với nhau và nhánh ít hơn các sợi BC đ ược tạo từ môi trường lắc (A – BC: Agitated – BC). A – BC được tạo ra dưới dạng các hạt nhỏ, các hạt hình sao và các sợi dài, chúng phân tán rất tốt trong môi tr ường (Vadamme và cộng sự 1998). Các sợi đang lưới với nhau trong môi trường lắc giống như mô hình kẻ ô, có cả hai hướng song song và vuông góc (Watanabe và cộng sự, 1998) [2,6]. SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP
Đồ án tổng hợp - 5- GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương Sự khác nhau về cấu trúc không gian ba chiều của hai dạng S – BC và A – BC được quan sát rõ ràng hơn bằng kính hiển vi điện tử quét (scaning electron microscop). Những sợi BC kéo dài và chồng lên các sợi khác theo chiều đan chéo nhau. Những sợi A – BC thì rối rắm và cong (Johnson và Neogi,1989) [2,6]. Ngoài ra, bề mặt cắt ngang của sợi A – BC (0,1 – 0,2 µ m) lớn hơn sợi S – BC (0,05 – 0,10 µ m). Sự khác nhau về hình thái giữa hai loại BC này làm được mức độ kết tinh, kích cỡ kết tinh của chúng khác nhau [2,7]. Hai dạng kết tinh phổ biến của cellulose trong tự nhiên là Ι và ΙΙ , được phân biệt bởi các kỹ thuật phân tích bằng tia X, quang phổ, và tia hồng ngoại ( Jonhson và Neogi, 1989). Celluose Ι có thể chuyển thành cellulose II, nhưng cellulose II thì không thể chuyển thành cellulose I [2,7]. M.J. Sheu & S.P. Tai, National Taiwan University đã nghiên cứu các tính chất của BC như độ cứng, độ dính, độ dai, và ảnh hưởng của các dung dịch đường, muối, và các chất gum (HM pectin, LM pectin) lên tính chất của BC. Các mảnh BC có độ cứng là 3,68 kg, độ dính 0,37 kg, độ dai 0,36 kg (các chỉ số tương ứng theo thứ tự ở mực tươi là 3,02 kg, 0,34 kg, 0,23 kg). Độ cứng của các miếng BC giảm khi chúng được nhúng vào dung dịch đường, HM pectin, LM pectin, carrageenan, và độ cứng tăng khi được nhúng vào dung dịch muối [2,8]. Hình 1.1. Cấu trúc cellulose (a) của vi khuẩn (BC) ( × 20000 lần) và (b) của thực vật (PC) ( × 200 lần) [2,8]. 1.1.1.3. Sinh tổng hợp BC SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP
Đồ án tổng hợp - 6- GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương Sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được điều hòa một cách chuyên biệt và chính xác, liên quan đến một số lớn enzym, các phức hợp xúc tác và các protein điều hòa. Tiến trình này bao gồm sự tổng hợp uridine diphosphoglucose (UDPClc), tiền chất của cellulose, tiếp đến là sự polymer hóa glucose vào chuỗi β – 1,4 – glucan, và sự kết hợp các sợi mới vào dải (ribbon), được hình thành từ hàng trăm, thậm chí hàng ngàn sợi cellulose riêng lẽ. Con đường và cơ chế của sự tổng hợp UDPGlc tương đối được biết nhiều, trong khi đó cơ chế phân tử của sự polymer hóa glucose vào mạch dài và các mạch nhánh, sự đẩy ra bên ngoài tế bào của chúng, và sự kết hợp thành sợi cần được làm sáng tỏ hơn [2,9]. Cellulose được tổng hợp từ AX là sản phẩm cuối cùng của sự biến dưỡng carbon, phụ thuộc vào trạng thái sinh lý tế bào liên quan đến hoặc là chu trình pentose phosphate hoặc là chu trình Krebs, đi kèm với quá trình sinh tạo glucose (Ross và cộng sự, 1991; Tonouchi và cộng sự, 1996) (hình 1.2). Quá trình glycose giải không hoạt động ở vi khuẩn acid acetic bởi vì nó không tổng hợp được enzym quan trọng của con đường này đó là phosphofructose kinase (Ross và cộng sự, 1991). Ở AX, sự tổng hợp cellulose liên hệ chặt chẽ với tiến trình dị hóa oxit hóa và tiêu thụ khoảng 10% năng lượng có nguồn gốc từ những phản ứng dị dưỡng (Weinhouse, 1977). Sự tổng hợp BC không gây trở ngại cho các quá trình đồng hóa khác, bao gồm sự tổng hợp protein. (Ross và cộng sự, 1991) [2,10]. AX chuyển nhiều phức hợp carbon như: hexose, glycerol, dihydroxyacetone, pyruvate, và các dicarboxylic acid thành cellulose, thường có hiệu suất 50%. Dicsarboxylic acid đi vào chu trình Krebs nhờ vào quá trình decarboxyl hóa để thành pyruvate, chuyển thành hexose thông qua con đường sinh tạo glucose, tương tự đối với glycerol, dihydroxyacetone, và các hợp chất trung gian của chu trình pentose phosphate [2,10]. Tiền chất trực tiếp của cellulose là UDPGlc (uridine diphosphoglucose), là sản phẩm của con đường phổ biến ở các sinh vật , bao gồm cả thực vật, liên quan đến sự phosphoryl hóa glucose thành glucose – 6 – phosphate, được xúc tác bởi glucokinase, tiếp đến là quá trình đồng phân hóa hợp chất này thành glucose – α – SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP
Đồ án tổng hợp - 7- GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương 1 – phosphate, được xúc tác bởi phosphoglucomutase, và cuối cùng chuyển thành UDPGlc bởi enzym UDPGlc pyrophosphorylase. Enzym cuối cùng này dường như quan trọng liên quan đến quá trình tổng hợp BC, bởi vì một vài đột biến không tổng hợp cellulose (Cel) thiếu enzym này (Valla và cộng sự, 1989). Hơn nữa, hoạt động của pyrophosphorylase thay đổi ở những chủng AX khác nhau và hoạt động cao nhất được phát hiện ở các sinh vật tổng hợp cellulose hữu hiệu nhất, như là AX ssp. Sucrofermentans BPR 2001. Chủng này thích sử dụng frutose hơn, biểu lộ sự hoạt động cao của phosphoglucomerase, và có một hệ thống phosphotransferase. Hệ thống này chuyển fructose thành frutose – 1 – phosphate và tiếp đến là fructose – 1,6 – biphosphate (hình 1.2) [2,11]. Hình 1.2. Sơ đồ các con đường tổng hợp cellulose bởi AX [2,12] CS: Cell lulose synthase FK: Fructokinase FBP: Fructose – 1,6 – biphosphate G6PDH: Glucose – 6 – phosphate phosphatase dehydrogenase GK: Glucokinase IPFK: Frutose – 1 – phosphate kinase PGM: Phosphoglucomutase PGI: Phosphoglucoisomerase PTS: Hệ thống của phosphotransferase UGP: UDP – glucose pyrophosphorylase SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP
Đồ án tổng hợp - 8- GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương Fru – bi – P: Fructose – 1,6 – bi – Glc – 6 – P: Glucose – 6 – phosphate phosphate Fru – 6 – P: Fructose – 6 – phosphate Glu – 1 – P: Glucose – 1 – phosphate PGA: Phosphogluconic acid UDPGlc: Uridine diphosphoglucose 1.1.1.4. Các ứng dụng của BC và triển vọng Trong thực phẩm: Sản phẩm được sử dụng trong nước ép trái cây và những thuốc uống khác, trong mứt kẹo, kem, yoghurt, salad, thức ăn tráng miệng. BC có tác dụng như chất làm đặc, vật liệu ổn định dịch huyền phù, vật liệu làm vỏ bọc thực phẩm [2,20]. F.Yoshinaga và cộng sự (1997) so sánh tác động giữ ổn định dịch huyền phù của BC với các vật liệu khác như xanhangum, sorbtol monolaurate, MCC (microcystalline cellulose) và FMC (microfibrilated). MCC và MFC là các celluose có nguồn gốc từ celluose thực vật. Họ nhận thấy rằng, BC có tác dụng giữ ổn định dịch huyền phù ở các nồng độ muối khác nhau. Trong khi đó sorbitan mônlaurate không giữ được dịch huyền phù ở pH = 2 hoặc dịch huyền phù ở 20 0C. Xanthangum không ổn định được dịch huyền phù sau khi được hấp vô trùng ở 1200C trong 20 phút. Với đặc tính ổn định dịch hyền phù, BC có triển vọng là một vật liệu công nghệ mới triển vọng cho tương lai [2,20]. Đề tài do tác giả Nguyễn Thúy Hương (Đại học Bách khoa TP.HCM) thực hiện nhằm thử nghiệm cố định tế bào vi khuẩn AX trên giá thể cellulose vi khuẩn do chính nó sản sinh ra để tạo chế phẩm phục vụ nhân giống nhanh và hiệu quả. Với việc tạo màng thực phẩm, tác giả lên men bề mặt, thu hoạch màng sau 1 ngày nuôi cấy. Qua thực nghiệm cho thấy, nồng độ chế phẩm giống là 2% có thể tái sử dụng lên men thu nhận cellulose vi khuẩn 7 lần mà vẫn đảm bảo về mặt thời gian, sản lượng, chất lượng BC và hoàn toàn không có s ự khác biệt so với chế phẩm dịch giống truyền thống. Ở Việt Nam, chế phẩm giống AX có ý nghĩa đối với các cơ sở sản xuất thạch dừa trong việc chủ động nguồn giống, hạ giá thành do chế phẩm có khả năng tái sử dụng 7 lần. Màng BC thu nhận bằng phương pháp lên men bề mặt, 1 ngày. Sau khi xử lý màng thực phẩm BC đạt giá trị cảm quan, có độ chịu lực cao và không bị biến tính khi xử lý nhiệt. Sử dụng màng BC làm màng bao xúc xích được đánh giá tốt. Dùng BC làm màng bảo quản dừa SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP
Đồ án tổng hợp - 9- GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương tươi giữ nguyên chất lượng sau 2 tuần bảo quản ở nhiệt độ phòng và 4 tuần bảo quản ở nhiệt độ mát. Sử dụng màng BC hấp phụ Bacterionic 200Au/ml có thể bảo quản 3 ngày thịt tươi sơ chế tối thiểu ở nhiệt độ mát. Sản phẩm sữa chua uống với nồng độ bột BC 0,5% đạt chất lượng về chỉ tiêu cảm quan, không tách lớp, dung dịch đồng nhất trong thời gian bảo quản [Theo Tạp chí Sinh học, số 1/08]. Trong y học: Màng BC thu được từ quá trình nuôi cấy tĩnh được nghiên cứu và sử dụng làm da nhân tạo nhờ đặc tính thấm cao từ lớp màng có độ kết lớp chặt chẽ. Sau khi thanh trùng, tẩm vào lớp màng BC một số thuốc và hóa chất, lúc này BC là một lớp da nhân tạo dùng đắp vết thương [2,20]. Bộ môn Vi sinh – Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, đã thử nghiệm thành công một loại màng sinh học trị bỏng từ vi khuẩn AX, được phân lập trong nước sản xuất thạch dừa và nhiều loại nước trái cây khác. Với màng trị bỏng này, thời gian liền vết thương chỉ còn 2 – 3 ngày so với 7 ngày khi dùng băng gạc t ẩm thuốc. Nhóm nghiên cứu đã sản xuất thành công những tấm màng sinh học dai, khô ráo, mỏng 1 – 1,5 mm, diện tích 10 cm x 10 cm, với khả năng chống nhiễm khuẩn và thoát nước tốt. Để kiểm tra tác dụng của màng này, người ta đã gây bỏng độ 2 (với nhiệt độ khô) trên lưng thỏ, sau đó đắp màng sinh học lên vết thương và thay băng hằng ngày. Kết quả rất bất ngờ: Ngày thứ ba vết thương không phồng nước, ngày thứ năm vết thương khô ráo và đến ngày thứ 9 thì vết bỏng co lại đáng kể, không có mùi hôi, không nhiễm trùng. Điều này thực sự mang lại hy vọng cho bệnh nhân bỏng [19]. Trong công nghiệp dệt: BC dùng trong việc dệt vải cao cấp [13]. Trong phòng thí nghiệm: Môi trường nuôi cấy mô, cố định các vi sinh vật, một số loại enzym [2,22]. Trong công nghệ gỗ: Gỗ nhân tạo (gỗ ván dát mỏng), thay thế các sản phẩm của rừng [2,21]. Trong sản xuất giấy đặc biệt: Sử dụng trong sản xuất một số loại giấy đặc biệt nhờ tính hút và giữ mực cao (Jonhsons & cộng sự). Mitsubishi Paper Mils SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP
Đồ án tổng hợp - 10- GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương (Nhật Bản) liên kết với Ajinomoto Co. để phát triển sản phẩm giấy từ cellulose vi sinh vật (patent JP63295793). Ngoài ra BC còn được sử dụng trong vẽ, in, chất dính, và chất xơ trên trang vẽ như giấy phủ làm bề mặt láng trong công nghệ in (Connon & Anderson, 1991) [2,21]. 1.1.1.5. Đặc tính của chất mang BC BC là chất mang truyền thống trong kĩ thuật cố định tế bào, nó có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực như: Y học, môi trường và một số ngành công nghiệp khác (Yoshinaga et, al, 1997). BC có nhiều đặc tính tốt của một chất mang trong cố định tế bào vi sinh vật như: độ tinh khiết cao, có khả năng hút giữ ẩm tốt nhờ cấu trúc mạng lưới cellulose, khả năng đàn hồi tốt, có tính chất cơ lý bền, dễ dàng phù hợp với thiết bị phản ứng sinh học, có hả năng tái sử dụng và an toàn sinh h ọc (Krystynowicz, craja, 2002). So sánh với nhiều chất khác trong kĩ thuật cố định tế bào vi sinh vật cho thấy BC phù hợp với các tiêu chuẩn cơ bản và BC có ch ức năng bảo vệ tế bào ( Yoshinaga,et, at 1997). Ở Việt Nam tính chất đặc trưng của BC đã được áp dụng để cố định tế bào vi sinh vật rất hiệu quả [4]. Hình 1.3. Màng BC ướt đang được gỡ bỏ từ môi trường nuôi cấy [12] 1.1.2. Nguyên liệu sản xuất BC – Giống vi khuẩn: AX Sơ lược về AX  Lớp : Shizomycetes  Bộ : Pseudomonadales  Bộ phụ : Pseudomonadieae SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP
Đồ án tổng hợp - 11- GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương  Họ : Pseudomonadaceae [2,4]. AX có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hoặc không di động và không sinh bào tử. Chúng là vi khuẩn gram âm, nhưng gram của chúng có thể biến đổi do tế bào già đi, hay do điều kiện môi trường AX thuộc loại vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, nên chúng tăng trưởng ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trường lỏng và môi trường khí [2,4]. Đặc điểm sinh lý và sinh hóa của AX : (1) phản ứng catalase dương tính, (2) oxy hóa ethanol thành CO2 và H2O, (3) không tăng trưởng trên môi trường Hoyer, (4) không tạo sắc tố nâu, (5) tổng hợp cellulose [2,4]. Hình 1.4. Cấu tạo của AX được bao bọc bởi cellulose [18] Nhiệt độ tối ưu để AX phát triển là từ 25 – 300C và pH từ 5,4 – 6,3. Theo Hestrin (1947), pH tối ưu của AX là 5,5 và chúng khôg phát triển ở nhiệt độ 370C ngay cả trong môi trường dinh dưỡng tối ưu. Còn theo Maccomide (1996), AX có thể phát triển trong phạm vi pH từ 3 – 8, nhiệt độ từ 12 – 350C và nồng độ ethanol có thể tới 10% [2,5]. Khi nuôi trên môi trường đặc, lúc tế bào còn non, khuẩn lạc mọc riêng rẽ, nhầy và trong suốt, xuất hiện sau 3 – 5 ngày. Khi già, tế bào mọc dính nhau thành từng cụm và khuẩn lạc mọc theo đường nuôi cấy [2,5]. – Môi trường lên men: Nguyên liệu cổ điển: Nước dừa già. Quá trình tiến hành lên men theo quy trình tham khảo sau: SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP
Đồ án tổng hợp - 12- GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương ̣ Nguyên liêu ̣ Loc Nước trong ̣ ̀ Trôn đêu DAP, SA ́ Đun sôi 10 – 15phut Để nguôi ̣ Cho axit acetic ́ Giông ́ ́ Cây giông ́ Nhân giông Lên men 28 – 300C ̀ trong 9 – 15 ngay Thach dừa thô ̣ Hình 1.5. Quy trình sản xuất thạch dừa [19] Nguồn nguyên liệu chính sản xuất thạch dừa là nước dừa già (dừa khô) vào khoảng từ 10 – 12 tháng tuổi. Đây là phế phẩm của các nhà máy cơm dừa nạo sấy, cơ sở sản xuất kẹo dừa, kẹo chuối, mứt, bánh phồng… Quá trình sản xuất thạch dừa góp phần giải quyết ô nhiễm môi trường của các nhà máy, doanh nghiệp trên [13]. SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP
Đồ án tổng hợp - 13- GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương Nguyên liệu phụ là các chất bổ sung dinh dưỡng như đường (saccharose), dấm (acid acetic), Sunfat Amon (S.A), DiAmonPhotphat (DAP). Không thể thiếu dung dịch nước giống thạch dừa được nhân ra từ ống nghiệm [13]. Hiện nay BC đã được nghiên cứu sản xuất từ các nguồn khác nhau như: Từ rỉ đường, nước mía, dịch thải trái cây để cải thiện tình trạng thiếu nguyên liệu do khoảng cách về mặt địa lý, tận dụng nguồn phế phẩm, giải quyết được vấn đề ô nhiễm môi trường [3]. Trong đề tài này tôi sử dụng các nguyên liệu sau: Đường saccharose, trà túi lọc lipton, nước, giống vi khuẩn Acetobacter xylinum trong bộ sưu tập giống của trường Cao đẳng Công nghệ – Đại học Đà Nẵng. Theo tỷ lệ như sau: Cứ ½ kg đường tôi nấu với 4 lít nước, và kèm theo một gói trà túi lọc lipton nhãn vàng. Hình 1.6. Trà túi lọc lipton Hình 1.7. Đường saccharose 1.2. Giới thiệu về vi khuẩn ST và LB 1.2.1. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Streptococcus thermophillus và Lactobacillus bulgaricus 1.2.1.1. Streptococcus thermophillus (ST) Là vi khuẩn có tế bào gram (+), có khả năng bắt màu thuốc nhuộm, hình cầu đơn hoặc đôi hoặc xếp đuôi nhau tạo thành chuỗi, không di động. SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP
Đồ án tổng hợp - 14- GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương Hình 1.8. Streptococcus thermophillus 1.2.1.2. Lactobacillus bulgaricus (LB) Là vi khuẩn có tế bào gram (+), có khả năng bắt màu thuốc nhuộm, hình que, không di động. Hình 1.9. Lactobacillus bulgaricus 1.2.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Streptococcus thermophillus và Lactobacillus bulgaricus Hai chủng vi khuẩn trên đều là vi khuẩn hiếu khí, lên men đồng hình và chịu được nồng độ acid thấp (pH = 4 – 4,5). Cả hai sống cộng sinh với nhau và hỗ trợ lẫn nhau [11,5].  Streptococcus thermophillus Phát triển tốt ở nhiệt độ 500C và sinh sản tốt ở nhiệt độ 37 – 40 0C, đây là vi khuẩn chịu nhiệt lên men điển hình, có thể chịu được nhiệt độ đun nóng ở 650C trong 30 phút, nhưng chỉ có thể phát triển được trong môi trường acid thấp hơn LB [11,4].  Lactobacillus bulgaricus SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP
Đồ án tổng hợp - 15- GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương LB cũng là vi khuẩn lên men điển hình, phát triển tốt ở nhiệt độ 40 – 50 0C, trong môi trường có độ acid cao. Loài này có khả năng tạo ra khối sữa chua 2,7% acid lactic từ đường lactose. Loài LB có khả năng thủy phân casein thành một số acid amin, trong đó việc tạo thành valin là quan trọng nhất, nó như một chất kích thích cho loài ST phát triển. Vì thế trong quá trình lên men sữa chua, việc cấy hỗn hợp hai loài này cho kết quả sinh acid lactic tốt hơn khi cấy riêng từng loài [11,4]. 1.3. Các phương pháp bảo quản vi sinh vật Muc đich cua bao quan giông vi sinh vât là sau quá trinh bao quan cac tinh ̣ ́ ̉ ̉ ̉ ́ ̣ ̀ ̉ ̉ ́ ́ trang quan trong cua giông không bị mât hoăc bị giam. ̣ ̣ ̉ ́ ́ ̣ ̉ Để lam được điêu đo, người ta tiên hanh cac biên phap dựa trên nguyên tăc ̀ ̀ ́ ́ ̀ ́ ̣ ́ ́ lam giam quá trinh trao đôi chât và lam giam quá trinh hô hâp cua vi sinh vât, người ̀ ̉ ̀ ̉ ́ ̀ ̉ ̀ ́ ̉ ̣ ta chú ý đên tac đông manh lên hai quá trinh nay, trong đó ba yêu tố được quan tâm ́ ́ ̣ ̣ ̀ ̀ ́ nhiêu nhât la: Nhiêt đô, độ âm, lượng không khí tiêp xuc trực tiêp. Ngoai ra con môt ̀ ́ ̀ ̣ ̣ ̉ ́ ́ ́ ̀ ̀ ̣ số yêu tố khac cung được quan tâm đung mức. ́ ́ ̃ ́ Để bao quan vi khuân ST và LB người ta thường dung môt trong cac số ̉ ̉ ̉ ̀ ̣ ́ phương phap sau: ́ 1.3.1. Phương pháp cấy chuyền và bảo quản lạnh Hâu hêt cac cơ sở san xuât và nghiên cứu rât nhiêu phương phap nay trong ̀ ́ ́ ̉ ́ ́ ̀ ́ ̀ giữ giông vi sinh vât. Nguyên tăc nay là dựa trên sự trao đôi chât theo môt khoang ́ ̣ ́ ̀ ̉ ́ ̣ ̉ thời gian nhât đinh. Sau môt khoang thời gian lăp lai công viêc trên. Cach nay tỏ ra ́ ̣ ̣ ̉ ̣ ̣ ̣ ́ ̀ hiêu quả đôi với nhiêu vi sinh vât [18]. ̣ ́ ̀ ̣ Trước khi đem bao quan, người ta thường cây truyên giông vi sinh vât vao 3 ̉ ̉ ́ ̀ ́ ̣ ̀ – 5 ông nghiêm thach nghiêng, nuôi chung ở nhiêt độ thich hợp (thường nuôi ở nhiêt ́ ̣ ̣ ́ ̣ ́ ̣ độ 370C) cho đên khi tao được lượng sinh khôi lớn nhât, sau đó bảo quản ở nhiêt ́ ̣ ́ ́ ̣ độ lanh khoang 40C. Sau môt thang cây truyên và lăp lai như trên. Nêu keo dai, giông ̣ ̉ ̣ ́ ́ ̀ ̣ ̣ ́ ́ ̀ ́ dễ bị thoai hoa vì độ âm môi trường thach rât dễ bị giam trong quá trinh bao quan ́ ́ ̉ ̣ ́ ̉ ̉ ̉ ̣ lanh [18]. SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP