Đồ án tốt nghiệp: Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT NÔNG NGHIỆP

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thị Hai

Sinh viên thực hiện

: Quách Hồng Thúy

MSSV: 1411100668 Lớp: 14DSH03

TP. Hồ Chí Minh, 2018

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện trên cơ sở lý

thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Hai. Các

số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ

công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan này.

Tp. Hồ Chí Minh, ngày …… tháng …… năm……

Sinh viên

Quách Hồng Thúy

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

LỜI CÁM ƠN

Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học

Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy tại Viện Khoa Học Ứng Dụng

cùng tất cả các thầy cô đã truyền dạy những kiến thức quý báu cho em trong suốt

những năm học vừa qua.

Qua đây em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Nguyễn Thị Hai, người đã

định hướng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời

gian làm khoá luận tốt nghiệp. Bên cạnh đó em xin c ảm ơn các thầy cô ở Phòng Thí

nghiệm Viện Khoa Học Ứng Dụng cùng các anh chị, bạn bè đã nhiệt tình giúp đỡ và

tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài của mình.

Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên cạnh, động viên con những

lúc khó khăn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng như trong cuộc

sống

Tp. Hồ Chí Minh, ngày …… tháng …… năm……

Sinh viên

Quách Hồng Thúy

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU…………………………………………………………………………… 1

1. Tính cấp thiết của đề tài…………………………………………………….. 1

2. Phương pháp nghiên cứu………………………………………………………… 1

3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu……………………………………………….. 2

4. Ý nghĩa đề tài khoa học………………………………………………………….. 2

5. Các kết quả đạt được của đề tài…………………………………………………...3

6. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp:……………………………………………………. 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………………………. 4

1.1 Tổng quan về chủng Bacillus spp………………………………………………. 4

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu……………………………………………………………. 4

1.1.2 Phân loại……………………………………………………………………… 5

1.1.3 Đặc điểm sinh thái học phân bố trong tự nhiên………………………………. 5

1.1.4 Đặc điểm hình thái học……………………………………………………….. 6

1.1.5 Đặc điểm sinh hóa…………………………………………………………….. 6

1.1.6 Đặc điểm tế bào và khả năng sinh bào tử…………………………………….. 8

1.1.7 Khả năng đối kháng nấm bệnh của các chủng Bacillus spp………………….. 10

1.1.8 Mức độ an toàn sinh học……………………………………………………… 16

1.2 Tổng quan về các chủng nấm gây bệnh đốm trắng trên thanh long……………. 16

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

1.2.1 Giới thiệu về bệnh đốm trắng………………………………………………… 16

1.2.2 Tác hại của bệnh đốm trắng: ………………………………………………….19

1.2.3 Giới thiệu về chủng nấm gây bệnh…………………………………………… 19

1.2.4 Phân loại……………………………………………………………………… 21

1.2.5 Đặc điểm hình thái học……………………………………………………….. 22

1.2.6 Lịch sử nghiên cứu…………………………………………………………… 22

1.3 Nấm gây bệnh héo vàng trên cây ớt (Fusarium sp.)…………………………… 25

1.3.1 Giới thiệu về bệnh héo vàng trên cây ớt……………………………………… 25

1.3.2 Giới thiệu về chủng nấm gây bệnh chủ yếu…………………………………... 25

1.3.3.Lịch sử nghiên cứu……………………………………………………………. 27

1.3.4 Phân loại……………………………………………………………………… 27

1.3.5 Đặc điểm sinh thái học phân bố trong tự nhiên………………………………. 27

1.3.6 Đặc điểm hình thái học……………………………………………………….. 28

1.4 Giới thiệu về enzyme ngoại bào……………………………………………….. 29

1.4.1 Tổng quan về Enzyme Chitinase……………………………………………... 29

1.4.2 Tổng quan về Enzyme Cellulase……………………………………………... 32

1.5 Phân giải lân khó tan trong đất ………………………………………………….35

1.5.1 Khái niệm…………………………………………………………………….. 35

1.5.2 Sự chuyển hóa lân trong đất………………………………………………….. 36

1.5.3 Vi sinh vật phân giải lân khó tan……………………………………………... 37

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

1.6 Khả năng sinh IAA……………………………………………………………... 39

1.6.1 Lịch sử nghiên cứu IAA……………………………………………………… 40

1.6.2 Khái niệm…………………………………………………………………….. 41

1.6.3 Vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng cây trồng (PGPR)…………………. 42

1.6.4 Các chủng vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng cây trồng (PGPR)……… 44

1.7 Tình hình nghiên cứu sử dụng Bacillus spp. ứng dụng vào sản xuất nông

nghiệp………………………………………………………………………………..45

1.7.1 Nghiên cứu nước ngoài……………………………………………………….. 45

1.7.2 Nghiên cứu trong nước……………………………………………………….. 46

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU… 48

2.1Thời gian và địa điểm nghiên cứu………………………………………………. 48

2.2 Vật liệu nghiên cứu……………………………………………………………... 48

2.2.1 Vật liệu……………………………………………………………………….. 48

2.2.2 Hóa chất………………………………………………………………………. 48

2.2.3 Môi trường……………………………………………………………………. 49

2.3.Thiết bị và dụng cụ……………………………………………………………... 50

2.3.1 Thiết bị……………………………………………………………………….. 50

2.3.2 Dụng cụ………………………………………………………………………. 51

2.4 Bố trí thí nghiệm………………………………………………………………... 52

iii

2.5 Phương pháp nghiên cứu……………………………………………………….. .54

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

2.5.1 Phương pháp lấy mẫu 54

2.5.2 Phương pháp pha loãng………………………………………………………. 55

2.5.3 Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn……………………………………….. 55

2.5.4 Phương pháp tăng sinh………………………………………………………... 56

2.5.5 Phương pháp quan sát hình thái tế bào……………………………………….. 57

2.5.6 Phương pháp xác định đặc điểm sinh hóa…………………………………… 58

2.5.7 Phương pháp cấy chuyển để bảo quản giống…………………………………. 65

2.5.8 Phương pháp bảo quản giống bằng giữ lạnh…………………………………. 65

2.5.9 Phương pháp khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase, chitinase) của

các chủng vi khuẩn…………………………………………………………………. 66

2.5.10 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn……………………………………... 69

2.5.11 Khả năng phân giải phosphate khó tan……………………………………... 75

2.5.12 Khả năng sinh IAA………………………………………………………….. 77

2.5.13 Phương pháp đối kháng nấm……………………………………………….. 78

2.5.13 Đánh giá khả năng phòng trừ nấm bệnh trên trái thanh long……………….. 79

2.5.14 Đánh giá khả năng phòng trừ nấm bệnh trên cây ớt………………………… 81

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………………………… 83

3.1 Kết quả phân lập các chủng Bacillus spp. từ đất nông nghiệp…………………. 83

3.1.1. Đặc điểm hình thái của các chủng…………………………………………… 83

3.1.2 Kết quả kiểm tra đặc điểm sinh hóa của các chủng…………………………... 89

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

3.2. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng………………………............ 90

3.2.1 Khả năng sinh enzyme chitinase……………………………………………... 90

3.2.2 Khả năng sinh enzyme cellulase....................................................................... 92

3.3 Khả năng đối kháng nấm của các chủng……………………………………….. 95

3.3.1. Khả năng đối kháng nấm Fusarium sp……………………………………… 95

3.3.2. Khả năng đối kháng nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng thanh

long…………………………………………………………………………………..97

3.4. Khả năng phân giải lân khó tan của các chủng………………………………… 100

3.5 Khả năng sinh IAA của các chủng……………………………………………… 102

3.9 Đánh giá khả năng ức chế nấm bệnh của các chủng vi khuẩn đối với thanh long ứng

dụng bảo quản sau thu hoạch……………………………………………………… 105

3.10 Kết quả hiệu quả đối kháng nấm Fusarium sp. gây chết cây ớt………………. 110

3.11 Định danh các chủng có triển vọng…………………………………………… 117

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ……………………………………….. 120

4.1. Kết luận …………………………………………………………………………120

4.2. Kiến nghị……………………………………………………………………….. 120

TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………. 122

PHỤ LỤC………………………………………………………………………… 1

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

NB: Môi trường Nutrient Broth

NA: Môi trường Nutrient Agar

NMSL: Nước muối sinh lý

PDA: Môi trường Potato D-glucose Agar

PDB: Môi trường Potato D- glucose Broth

LBNT: Lây bệnh nhân tạo

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Đặc điểm hình thái và khuẩn lạc Bacillus spp. trên môi trường NA theo

Malarkodi Chelladurai et al (2013)

Hình 1.2: Triệu chứng bệnh khi xuất hiện trên thân, cành thanh long (Nguồn: Viện bảo

vệ thực vật, 2014)

Hình 1.3: Triệu chứng bệnh trên quả thanh long chin (Nguồn: Viện bảo vệ thực

vật,2014)

Hình 1.4 Hình thái nấm Scytalidium dimidiatum dưới kính hiển vi ở vật kính 40X.

Hình 1.5: Đặc điểm hình thái vi nấm Fusarium oxysporum (Jeon CS et al, 2013)

Hình 2.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng phân giải cellulase của các chủng

Bacillus spp.

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng phân giải chitinase c ủa các chủng

Bacillus spp.

Hình 2.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định mật độ vi khuẩn – dựng đường chuẩn tế

bào

Hình 2.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định mật độ nấm – dựng dường chuẩn nấm

Hình 3.1.: Kết quả nhuộm gram của các chủng vi khuẩn. Quan sát ở 100x

Hình 3.2: Kết quả nhuộm bào tử của các chủng vi khuẩn. Quan sát 100X

Hình 3.3: Đường kính vòng phân giải chitin (cm)

Hinh 3.4: Đường kính vòng phân giải CMC (cm)

vii

Hình 3.5: Hiệu lực ức chế nấm bệnh Fusarium sp.của các chủng Bacillus spp.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Hình 3.6: Hiệu lực ức chế nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum của các chủng

Bacillus spp.

Hình 3.7: Hàm lượng photphat khó tan do các chủng Bacillus sp.p. phân giải (Trong đó

A: thí nghiệm; B: đối chứng)

Hinh 3.8: Lượng photphat các chủng Bacillus spp. phân giải theo thời gian

Hình 3.9: Khả năng sinh IAA c ủa các chủng vi khuẩn. (Trong đó A: Bổ sung

tryptophan, B: là không bổ sung tryptophan)

Hình 3.10: Khả năng sinh IAA của các chủng Bacillus spp.

Hình 3.11: Chỉ số bệnh hại trên thanh long sau 7 ngày

Hình 3.13: Chiều cao cây qua các nghiệm thức

Hình 3.14: Chiều dài rễ qua các nghiệm thức

Hình 3.15: Số lá qua từng nghiệm thức

Hình 3.16: Kết quả giải trình tự gen 16S của mẫu BPS6

Hình 3.17: Kết quả tra cứu trên BLAST SEARCH (NCBI) của chủng BPS6

Hình 3.18: Kết quả giải trình tự 16S của chủng BTA7

viii

Hình 3.19: Kết quả tra cứu trên BLAST SEARCH (NCBI) của chủng BTA7

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Một số thử nghiệm sinh hóa đặc trưng ở Bacillus spp.

Bảng 1.2: Các chất kháng sinh được tổng hợp ở một số loài Bacillus spp. (M. Dworkin,

The Prokaryotes, 2006)

Bảng 3.1 : Hình dạng khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn phân lập được

Bảng 3.2 : Kết quả thử nghiệ sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập được.

Bảng 3.3: Khả năng sinh enzyme chitinase của các chủng sau 24 giờ

Bảng 3.4: Khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập

Bảng 3.5: Hiệu quả ức chế nấm Fusarium sp. của các chủng vi khuẩn

Bảng 3.6: Hệu lực ức chế nấm bệnh sau 3 ngày, 5 ngày (%)

Bảng 3.7: Khả năng phân giải photphate khó tan sau các khoảng thời gian (𝜇𝑔/𝑚𝑙)

Bảng 3.8: Khả năng sinh IAA của các chủng Bacillus spp. sau 5 ngày

Bảng 3.9: Chỉ số bệnh đốm trắng trên thanh long ở các nghiệm thức

Bảng 3.10: Tỷ lệ (%) nảy mầm, tỷ lệ (%) sống sót, chiều dài rễ, chiều cao cây, số lá

trên cây.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

MỞ ĐẦU

Tính cấp thiết của đề tài

Trong những năm gần đây, nền nông nghiệp Việt Nam ngày càng được nhiều nước

trên thế giới biết đến với những mặt hàng nông sản xuất khẩu chủ lực như: lúa, gạo, cà

phê, hồ tiêu, ớt, thanh long, vú sữa... Đáp ứng được những tiêu chí về chất lượng của

các nước trên thế giới. Tuy nhiên, nông nghiệp ở nước ta vẫn còn dựa chủ yếu vào

phân bón và thuốc bảo vệ thực vật hóa học. Hệ quả, nông dân không chỉ tốn nhiều chi

phí cho hóa chất mà sự đa dạng hệ vi sinh vật đất và chất lượng đất bị suy giảm nghiêm

trọng. Vì vậy, biện pháp sinh học được tập trung nghiên cứu và thay thế dần các biện

pháp hóa học. Các kết quả nghiên cứu cho thấy các loài vi khuẩn Bacillus có khả năng

đối kháng với nhiều loài nấm gây bệnh có thể bảo vệ cây trồng, chống lại các vi sinh

vật gây bệnh, đồng thời tạo điều kiện cho cây trồng sinh trưởng và phát triển tốt

(Dunlap et al, 2013; Jamil Shafi et al., 2017; Radhakrishnan et al., 2017). Do đó, nhiều

chủng Bacillus đã được sản xuất thành chế phẩm ở nhiều nước trên thế giới. Ở Việt

Nam, việc nghiên cứu sử dụng Bacillus để tạo phân bón vi sinh đã được quan tâm và

triển khai (Phạm Văn Toản, 2002). Tuy nhiên, việc sử dụng Bacillus để trừ bệnh hại

vẫn còn khá hạn chế, chủ yếu là nhập chế phẩm từ nước ngoài. Mặt khác, hiệu lực đối

kháng bệnh của các chủng Bacillus vẫn khá biến động. Xuất phát từ những lý do trên,

sinh viên tiến hành đề tài: “Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong

sản xuất nông nghiệp.”

2. Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp tổng hợp tài liệu:

+ Thu thập, tìm hiểu các tài liệu tham khảo, sách, giáo trình và internet liên quan đến

đề tài.

+ Tổng hợp, lựa chọn các tài liệu liên quan đến mục tiêu của đề tài.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

- Phương pháp nghiên cứu:

+ Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme ngoại bào và tuyển chọn các

chủng có khả năng sinh enzyme mạnh nhất từ các nguồn đất.

+ Thực hiện một số khảo sát về hình thái, thử nghiệm sinh hóa đặc trưng cho các chủng

Bacillus spp. để tuyển chọn chủng mong muốn, loại các vi sinh vật có nguy cơ gây

bệnh.

+ Bố trí các thí nghiệm khảo sát tương ứng từng thí nghiệm

- Phương pháp thu thập và xử lý số liệu:

+ Ghi nhận số liệu trực tiếp từ các thí nghiệm bố trí khảo sát.

+ Xử lý số liệu bằng phần mềm Statistical Analysis System (SAS) và Microsoft Excel

2013.

3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng: Nghiên cứu thử nghiệm trên các chủng vi khuẩn có khả năng ức chế nấm

bệnh từ các nguồn đất khác nhau.

- Phạm vi giới hạn đề tài: Vi khuẩn Bacillus spp. được phân lập từ đất.

4. Ý nghĩa đề tài khoa học

- Ý nghĩa khoa học:

Phân lập được chủng vi khuẩn Bacillus spp. có khả năng ức chế nấm bệnh đạt hiệu quả

cao, góp phần xác định một số đặc điểm về hình thái tế bào và hình thái khuẩn lạc của

một số chủng vi khuẩn nhóm Bacillus subtilis.

- Ý nghĩa thực tiễn:

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Dựa trên kết quả thí nghiệm nghiên cứu thu được để góp phần tìm ra chủng vi khuẩn

có khả năng ức chế nấm bệnh mạnh ứng dụng để tạo ra các chế phẩm bảo quản sau thu

hoạch thanh long, các loại phân bón sinh học góp phần nâng cao sự phát triển ở cây

trồng, thay thế dần các sản phẩm hóa học góp phần bảo vệ môi trường.

5. Các kết quả đạt được của đề tài

-Phân lập được 8 chủng vi khuẩn, từ kết quả phân lập sau khi định danh sơ bộ bằng các

phản ứng test sinh hóa đặc trưng của Bacillus subtilis thì trùng khớp.

-Kết quả khả năng ức chế nấm bệnh được thực hiện cho các chủng vi khuẩn phân lập

được làm cơ sở sản xuất chế phẩm sinh học.

-Bước đầu ứng dụng vi khuẩn phân lập tuyển chọn được vào quá trình bảo quản sau

thu hoạch thanh long và nâng cao sự phát triển ở cây ớt

6. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp:

- Phần Mở đầu.

- Chương 1: Tổng quan tài liệu - nội dung chương đề cập đến các nội dung liên quan

đến tài liệu nghiên cứu.

-Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu - nội dung chương đề cập đến các

dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án.

-Chương 3: Kết quả và thảo luận - nội dung chương đưa ra những kết quả mà đề tài

thực hiện được và đưa ra những thảo luận, biện chứng cho kết quả thu được.

-Phần Kết luận và đề nghị: nội dung tóm lại những kết quả mà đề tài đạt được và đề

nghị cho những hướng cần cải thiện thêm trong đề tài.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về chủng Bacillus spp.

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu

Từ bacillus nhằm miêu tả hình dáng của một nhóm vi khuẩn khi được quan sát dưới

kính hiển vi. Nó xuất phát từ tiếng Latin có nghĩa là hình que. Do đó, một số nơi gọi là

khuẩn que hoặc trực khuẩn.

Tuy nhiên, Bacillus (viết hoa và in nghiêng) là tên của một chi gồm các vi khuẩn

hình que, Gram dương, hiếu khí thuộc về họ Bacillaceae trong Firmicutes.

Chi Bacillus được đặt tên vào năm 1835 bởi Christian Gottfried Ehrenberg, có chứa

vi khuẩn hình que (trực khuẩn). Ông đã có bảy năm trước đó được đặt tên là chi

Bacterium. Bacillus sau đó đã được Ferdinand Cohn sửa đổi để mô tả thêm chúng như

là bào tử hình thành bào tử, vi khuẩn Gram dương, hiếu khí hoặc vi khuẩn kỵ khí.

Giống như các chi khác liên quan đến lịch sử vi sinh vật như Pseudomonas và Vibrio,

267 loài Bacillus có mặt khắp nơi. Chi này có sự đa dạng 16S ribosome rất lớn và đa

dạng về môi trường.

Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 do Christion Erenberg và

tên của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là “Vibrio subtilis”. Gần 30 năm sau, Casimir

Davaine đặt tên cho loài vi khuẩn này là “Bacteridium”. Năm 1872, Ferdimand Cohn

xác định thấy loài trực khuẩn này có đầu vuông và đặt tên là Bacillus subtilis. Năm

1941, Bacillus subtilis được phát hiện trong phân ngựa bởi tổ chức y học Nazi của

Đức. Lúc đầu, chúng được dùng chủ yếu để phòng bệnh lị cho các binh sĩ Đức chiến

đấu ở Bắc Phi. Năm 1949 – 1957, Henry và cộng sự tách được các chủng thuần khiết

của Bacillus subtilis. Gần đây, Bacillus subtilis đã được nghiên cứu, sử dụng rộng rãi

trên thế giới. Từ đó, thuật ngữ “Subtilis therapy” ra đời. Bacillus subtilis được sử dụng

ngày càng phổ biến và được xem như sinh vật phòng và trị các bệnh về rối loạn đường

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

tiêu hóa, các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, tiêu chảy… Ngày nay, Bacillus subtilis

đã và đang được nghiên cứu rộng rãi với nhiều tiềm năng và ứng dụng hiệu quả trong

chăn nuôi, công nghiệp, xử lý môi trường…

1.1.2 Phân loại

Theo phân loại của Bergey (1974), Bacillus thuộc:

Kingdom: Bacteria

Division: Firmicutes

Class: Bacilli

Order: Bacillales

Family: Bacillaceae

Genus: Bacillus

1.1.3 Đặc điểm sinh thái học phân bố trong tự nhiên

Vi khuẩn Bacillus thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi. Chúng phân

bố hầu hết trong môi trường tự nhiên, phần lớn cư trú trong đ ất và rơm rạ, cỏ khô nên

được gọi là “trực khuẩn cỏ khô”, thông thường đất trồng trọt có khoảng 106– 107 triệu

cfu/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, đất hoang thì sự hiện diện của chúng rất

hiếm.

Bacillus subtilis có khả năng dùng các hợp chất vô cơ làm nguồn carbon trong khi

một số loài khác như Bacillus haericus, Bacillus cereus cần các hợp chất hữu cơ là

vitamin và amino acid cho sự sinh trưởng. Đặc biệt các loài như Bacillus popilliae,

Bacillus lentimobus có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng không phát triển trong môi

trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường như: Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB)

theo Hiroshi Fujikawa và Mitsugu Matsushita (2007).

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

1.1.4 Đặc điểm hình thái học

Hình 1.1: Đặc điểm hình thái và khuẩn lạc Bacillus spp. trên môi trường NA theo

Malarkodi Chelladurai et al (2013)

Bacillus spp. là trực khuẩn gram dương, hai đầu tròn, phản ứng catalase dương

tính, chúng có khả năng tạo bào tử để tồn tại trong môi trường khắc nghiệt. Các chủng

Bacillus spp. có các roi giúp chúng di chuyển, vì vậy chúng có khả năng di chuyển

nhanh chóng trong chất lỏng. Kích thước tế bào của chúng khoảng 0,5-0,8µm × 1,8-3

µm. Khi gặp điều kiện bất lợi, Bacillus spp. sẽ hình thành bào tử để vượt qua điều kiện

bất lợi, nếu gặp điều kiện thuận lợi bào tử Bacillus spp. sẽ nảy mầm và phát triển như

một tế bào mới với chu kỳ sống mới. Bào tử Bacillus subtilis có hình bầu dục, kích

thước khoảng 0,6 - 0,9 µm. Phân bố không theo quy tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần

tâm nhưng không chính tâm theo Hong et al (2009).

1.1.5 Đặc điểm sinh hóa

Bacillus spp. có một số test sinh hóa đặc trưng sau: Lên men nhưng không sinh hơi

các loại đường glucose, maltose, mannitol, sucrose, xylose; Indol (-); VP (+); nitrate

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

(+); H2S (-); NH3 (+); catalase (+); amylase (+); casein (+); citrate (+); có kh ả năng di

động và hiếu khí.

Bảng 1.1: Một số thử nghiệm sinh hóa đặc trưng ở Bacillus spp.

Phản ứng sinh hóa Kết quả

Catalase +

Indol -

MR +

VP +

Citrate +

Nitrate +

Gelatin +

Di động +

Amylase +

Arabinose +

Xylose +

Saccharose +

Mannitol +

Glucose +

Lactose -

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Maltose +

(Theo Holt,1992, trích từ Lý Kim Hữu,2005)

1.1.6 Đặc điểm tế bào và khả năng sinh bào tử

1.1.6.1 Đặc điểm tế bào

Tế bào Bacillus spp. thường có hình que, là tế bào gram dương, chúng có khả năng

sinh ra bào tử để tồn tại qua thời điểm khó khăn, điều kiện môi trường khắc nghiệt như

nhiệt độ tăng cao, môi trường dinh dưỡng cạn kiệt, khô hạn. Thành phần hóa học chủ

yếu của vách tế bào là lớp peptidoglycan dày mang điện tích dương đóng vai trò là duy

trì cấu trúc của vách tế bào theo McKenney et al(2013).

1.1.6.2 Cấu tạo bào tử

Bacillus spp. sinh bào tử, chiều ngang bào tử không vượt quá chiều ngang của tế

bào vi khuẩn nên không làm thay đổi hình thái tế bào mang bào tử. Bào tử là một cấu

trúc hình thành do sự biến đổi của tế bào sinh dưỡng trong một giai đoạn nào đó của

quá trình sinh trưởng của vi khuẩn như điều kiện môi trường không thuận lợi, tế bào

phát triển đến một giai đoạn nhất định. Hai chủng vi khuẩn gram dương có khả năng

tạo bào tử là Bacillus và Clostridium. Bào tử vi khuẩn là một cấu trúc rất phức tạp bào

tử có nhiều lớp màng bao bọc, lớp ngoài cùng gọi là lớp màng khá mỏng và đó là lớp

vỏ của tế bào mẹ, ngay dưới đó là lớp áo bào tử, lớp áo bào tử gồm nhiều lớp protein

mỏng và không có tính thấm, lớp áo bào tử này đảm bảo tính kháng c ủa bào tử. Vỏ của

bào tử gồm nhiều lớp peptidoglycan chiếm một thể tích khá lớn, ít cầu nối nội peptide

và ít liên kết chéo. Trong cùng của bào tử là lõi bào tử được vách bào tử bao bọc có cấu

trúc như một tế bào bình thường nhưng đang trong tình trạng bất hoạt theo McKenney

et al (2013).

1.1.6.3 Đặc điểm của bào tử

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Bào tử ở Bacillus spp. không phải là hình thức sinh sản như ở nấm mà chúng là

dạng cấu trúc đặc biệt có tính kháng chuyên biệt giúp chủng loài tồn tại qua giai đoạn

điều kiện sống bất lợi. Bào tử không chỉ có khả năng lưu tồn tốt trong những điều kiện

khó khăn của môi trường sống mà chúng còn có khả năng sống rất lâu (bào tử trong

xác sinh vật cổ đại 1000 năm hoặc dưới đáy băng hà 3000 năm hoặc trong quặng mỏ

250 triệu năm đến nay vẫn còn sống theo Hong et al (2009). Nhiệt độ 1000C, bào tử

của một số loài Bacillus có thể chịu đựng được từ 2,5 - 20 giờ. Ngoài việc chịu được

nhiệt độ khô cao, bào tử có thể chịu được khô hạn cũng như tác động của nhiều loại

hóa chất cũng như các loại tia sáng.

Quá trình hình thành bào tử: các tế bào sinh bào tử trong những điều kiện thiếu thức

ăn hoặc có tích lũy các s ản phẩm trao đổi chất có hại sẽ bắt đầu thực hiện quá trình

hình thành bào tử. Trong bào tử nước liên kết chiếm đến 40% và chứa nhiều ion Ca2+.

1.1.6.4 Sự nảy mầm của bào tử

Khả năng tạo bào tử: theo Bùi Thị Phi (2007) thì một trong những đặc điểm quan

trọng nhất của Bacillus subtilis là khả năng sinh bào tử trong những điều kiện nhất

định. Bacillus subtilis hình thành bào tử theo chu kỳ sống hay khi gặp điều kiện bất lợi.

Theo Bùi Thị Phi (2007) sự tạo bào tử diễn ra gồm nhiều giai đoạn và mất đến 8 giờ để

hoàn tất. Quá trình chuyển từ trạng thái nghỉ sang tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn được

gọi là quá trình nảy mầm của bào tử. Quá trình gồm 3 giai đoạn là: hoạt hóa, nảy mầm

và sinh trưởng.

Nảy mầm

Protein chứa nhiều cystenin trong áo bào tử hóa xốp lên làm tăng tính thấm, xúc tiến

sự hoạt động của enzyme protease. Khi đó lượng protein trong áo bào tử giảm xuống.

Các cation bên ngoài có thể xâm nhập vào lớp vỏ bào tử và làm trương lớp vỏ bào tử

lên, sau đó làm tan ra và tiêu đi. Khi đó, nước bên ngoài sẽ xâm nhập vào lớp vỏ bào

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

tử, làm cho lõi trương to lên, các loại enzyme bắt đầu được hoạt hóa, bắt đầu quá trình

tổng hợp thành tế bào.

Trong quá trình nảy mầm, các đặc tính chịu nhiệt, tính chiết quang,... bắt đầu giảm dần,

lượng dipicolinate-canxi, acid amin, polypeptide dần dần mất đi, bắt đầu việc tổng hợp

DNA, RNA và protein trong vỏ bào tử. Bào tử chuyển thành tế bào sinh dưỡng.

Khi nảy mầm, bào tử có thể đâm ra theo phía cực hoặc đâm ngang. Lúc đó thành tế bào

còn rất mỏng và chưa hoàn chỉnh, do đó nâng cao khả năng tiếp nhận thêm DNA ngo ại

lai để thực hiện quá trình biến nạp.

Sức đề kháng của bào tử

Bào tử có sức đề kháng cao đối với các yếu tố vật lý và hóa học như: nhiệt độ, tia cực

tím, áp suất và chất sát trùng.

Bào tử có sức đề kháng cao và sống lâu là do các yếu tố:

Nước trong bào tử phần lớn ở trạng thái liên kết, do đó không có khả năng làm biến

tính protein khi tăng nhiệt độ.

Do bào tử có khối lượng lớn ion Ca2 + và acid dipicolinic, protein của bào tử kết hợp

với dipicolinate canxi thành một phức chất có tính ổn định cao đối với nhiệt độ.

Các enzyme và các ho ạt chất sinh học khác chứa trong bào tử đều tồn tại dưới dạng

không hoạt động, hạn chế sự trao đổi chất của bào tử đối với tế bào bên ngoài.

Với cấu trúc có nhiều màng bao bọc và tính ít thẩm thấu của các lớp màng làm cho các

chất hóa học và chất sát trùng khó có thể tác động tới bào tử.

1.1.7 Khả năng đối kháng nấm bệnh của các chủng Bacillus spp.

Bacillus spp. là một tác nhân sinh học đầy tiềm năng trong việc phòng trừ bệnh hại cây

trồng. Chúng có khả năng đối kháng các loại vi nấm gây bệnh với phổ tác động rộng,

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

không gây hại cho con người và cây trồng. Mặt khác, có thể phân hủy các thành phần

thực vật già cõi, hệ sợi nấm đã chết của các loài nấm khác nhau thành các hợp chất hữu

cơ nhỏ hơn, theo thời gian tạo thành lớp mùn cho đất (Markovich và Kononova, 2003;

Narasimhan và Shivakumar, 2012). Vi khuẩn Bacillus subtilis nằm trong nhóm vi

khuẩn có khả năng đối kháng với một số nấm gây bệnh cho cây. Trong các vi sinh vật

đối kháng, vi khuẩn Bacillus được chứng minh có khả năng đối kháng với nhiều loại

nấm như: Rhizoctonia, Sclerotinia, Fusarium, Pythium và Phytopthora và một số vi

khuẩn khác nhờ vào khả năng sinh ra các chất kháng sinh (Lê Đức Mạnh và cộng sự,

2003; Nguyễn Văn Thanh, Nguyễn Thu Hoa, 2005; Nguyễn Xuân Thành và cộng sự,

2003; Võ Thị Thứ, 1996).

Tính đối kháng với các nấm hại này bằng cách cạnh tranh dinh dưỡng và tiết kháng

sinh. Cạnh tranh không gian sống giữa vi khuẩn và nấm. Do vi khuẩn phát triển nhanh

hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng trong môi trường, đồng

thời tạo ra một số kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm bị ức chế (Nguyễn Lân Dũng

và Hoàng Đức Thuận, 1976).

Các chuyên gia tại Đại Học Havard, Mỹ cho biết: khi chất dinh dưỡng bắt đầu cạn kiệt,

các vi sinh vật đối phó bằng cách chuyển sang tình trạng “ngủ đông”, hay nghỉ ngơi

trong một thời gian dài. Bacillus subtilis thực hiện điều đó bằng cách tạo ra bào tử, có

thể duy trì trạng thái sống tiềm tàng trong nhiều năm, thậm chí hàng thế kỉ. Tuy nhiên

trong thí nghiệm này, nhóm nghiên cứu nhận thấy ở giai đoạn rất sớm của sự hình

thành bào tử, một vài tế bào Bacillus subtilis đã tạo ra kháng sinh để giết chết những tế

bào vi khuẩn ở bên cạnh chưa bắt đầu quá trình này. Chất kháng sinh sẽ phá vỡ màng

tế bào vi khuẩn bị tấn công, giải phóng chất dinh dưỡng và được tế bào đang hình

thành bào tử tiêu thụ.

Theo các nhà nghiên cứu trên, quá trình tạo bào tử tiêu tốn một lượng lớn năng lượng,

phải mất vài giờ và khi đã bắt đầu thì không thể đảo ngược. Do đó, vi khuẩn sẽ cố gắng

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

tránh thời điểm đó càng lâu càng tốt. Đặc biệt, khi dinh dưỡng trong môi trường đã cạn

kiệt, vi khuẩn Bacillus subtilis sẽ tiết ra các chất kháng sinh tiêu diệt vi khuẩn bên cạnh

để hút chất dinh dưỡng và kéo dài thời kì chờ đợi này, cho đến khi phải chuyển sang

sống tiềm sinh (Nguyễn Thị Công Dung, 2004).

Chủng vi sinh vật có thể tiết ra chất kháng sinh, cạnh tranh về dinh dưỡng hoặc tấn

công trực tiếp lên tơ nấm gây bệnh, hay tiết ra những chất kích thích sinh trưởng giúp

cho cây trồng tăng khả năng kháng bệnh.

* Tiết kháng sinh:

- Chi vi khuẩn Bacillus tiết các loại kháng sinh kanosamine (Milner et al., 1996),

bacillomycin (Volpo n et al., 1999), iturin A2 (Yoshida et al., 2002), prodigrosin và (+)-

(S)- dihydroaeruginoic acid (Carmi et al., 1994; Nguyễn Thị Thu Nga, 2003). Theo

Carmi et al. (1994) thì DAPG, PRN, PLT và (+)-(S) dihydroaeruginoic acid có khả

năng hạn chế các nấm gây bệnh cây như Sclerotium rolfsii, Colletotrichum

gloeosp.orioides và Rhizoctonia solani. Trong các loại kháng sinh trên, DAPG và

PRN được phát hiện khá nhiều ở các chi vi khuẩn đối kháng. Có loại kháng sinh có phổ

ức chế rộng như DAPG, nó có thể ức chế được cả nấm, vi khuẩn và tuyến trùng gây hại

(Nguyễn Thị Thu Nga, 2003).

Bảng 1.2: Các chất kháng sinh được tổng hợp ở một số loài Bacillus spp. (M. Dworkin,

The Prokaryotes, 2006)

Loài TÁC DỤNG CỦA CÁC LOẠI KHÁNG SINH

Đối kháng Ức chế Kháng sinh Đối kháng Đối

vi khuẩn quá trình phổ rộng nấm kháng

Gram tạo sợi vi

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

dương khuẩn

Gram

âm

Bacillus Subtilin Surfactin Difficidin Bacillomycin

subtilis F Bacilysin Oxydifficidin

Mycobacillin

Bacillus Gramicidin

brevis S

Lincar

Gramicidin

Tyrocidin

Bacillus Bacitracin

licheniformis

Surfactin

Công thức cấu tạo C53H93N7O13, là chất hoạt động bề mặt rất mạnh, thường được sử

dụng như một loại kháng sinh, bao gồm heptapeptides vòng (L-asparagin, acid

glutamic, L-leucine, L-valine và hai D-leucines) (Marc Ongena, Guillaume Henry,

Philipe Thonart, 2010, Chapter 5).

Nó là một lipopeptide vòng tạo ra do các vi khuẩn hình thành nội bào tử gram dương

như Bacillus subtilis. Do có hoạt tính bề mặt rất mạnh, nó có tính đối kháng mạnh với

vi khuẩn, virus, kháng các tế bào ung thư, chống mycoplasma và tan huyết, tuy nhiên ít

tác động đối với nấm. Một chuỗi acid béo kỵ nước dài 13-15 carbon cho phép nó xâm

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

nhập vào màng tế bào. Tác động của surfactin làm ức chế các kênh chuyển ion trên

trong lớp màng lipid kép, đồng thời ức chế hoạt tính của enzyme cylic AMP

phosphodiesterase theo Isaac S., (1992).

Iturin

Iturin có công thức hóa học C55H86N14O16 (Hiradate et al và Yu et al, 2002), iturin có

tính đối kháng mạnh với nấm và nấm men, có khả năng làm tan huyết tuy nhiên kháng

khuẩn hạn chế và không có khả năng kháng virus (Nakano, Michiko M., Zuber, Peter,

1998).

Trong số các kháng sinh nhóm iturin, đ ại diện là iturin A, mycosubtilin và

bacillomycin thường được nghiên cứu nhiều nhất cho hoạt động kiểm soát sinh học.

Đây là những heptapeptides với một acid béo β-amino. Iturin A là lipopeptide chống

nấm đặc trưng bởi sự hiện diện của các đồng phân fl-Aminoacid tan trong chất béo.

Iturin tác động lên màng tế bào chất, làm tan màng và tạo những lỗ thủng trên đó để

làm mất tính thẩm thấu chọn lọc của màng (Marc Ongena, Guillaume Henry, Philipe

Thonart, 2010, Chapter 5).

Iturin A là một lipopeptide chống nấm đặc trưng bởi sự hiện diện của các đồng phân fl-

Aminoacid tan trong chất béo (Pyoung Tl Kim, Jaewon Ryu, Young Hwan Kim, Youn

Tae Chi, 2010).

Fengycin

Theo Vanittanakom et al (1986), fengycin có khả năng làm tan huyết kém hơn iturin và

sucfactin, tuy nhiên tính đối kháng với nấm tốt hơn và có một số tác dụng kìm hãm đối

với vi khuẩn E.coli (M. Dworkin, 2006). Fengycin được tổng hợp nhiều trong pha tăng

trưởng, đạt nồng độ cực đại ở cuối pha tăng trưởng và duy trì ở nồng độ thấp với hàm

lượng ổn định trong pha cân bằng (Tsuey-Pin Lin, Chyi-Liang Chen, Li-Kwan Chang,

Johannes Scheng-Ming Tschen và Shih-Tung Liu, 1999).

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Fengycin là một lipodecapeptide vòng, chứa một acid béo β-hydroxy với chiều dài

chuỗi 16-19 nguyên tử carbon. Fengycin ở dạng bột, không màu, tan trong các dung

môi hữu cơ phân cực: methanol, ethanol và dimetyl formamit, ít tan trong

dichloromethane và tert-butanol, không hòa tan trong nước, acetone, diethylether

(Tsuey-Pin Lin, Chyi-Liang Chen, Li-Kwan Chang, Johannes Scheng-Ming Tschen và

Shih-Tung Liu, 1999).

Bacilysocin

Bacilysocin là phospholipid có tính kháng khuẩn mạnh đối với nấm, được tổng hợp khi

bắt đầu pha cân bằng sau đó thì giảm dần. Bacilysocin là kháng sinh có bản chất

phospholipid được phát hiện đầu tiên trên Bacillus subtilis. Cấu trúc của bacilysocin là

1-(12-methyltetradecanoyl)-3-phosphoglyceroglycerol. Bacilysocin được tổng hợp từ

tiền chất là phosphatidylglycerol, là một phospholipid chủ yếu của Bacillus subtilis.

Quá trình chuyển phosphatidylglycerol thành bacilysocin được thực hiện bởi enzyme

lysophospholypase được mã hóa bởi gene ytpA (Norimasa Tamehiro, Yoshiko

Okamoto-Hosoya, Susumu Okamoto, Makoto Ubukata, Masa Hamada, Hiroshi

Naganawa và Kozo Ochi, 2002).

* Tiết ra các enzym phân huỷ vách tế bào

Vách tế bào nấm gồm nhiều thành phần như glucan, chitin, protein (Phạm Văn Kim,

1999). Theo Nielsen và cộng sự năm 1997 thì vi khuẩn đối kháng có khả năng tiết ra

các enzyme phân huỷ các thành phần glucan hay chitin hoặc thành phần protein của

vách tế bào nấm gây bệnh. Các dòng vi khuẩn Paenibacillus polymyxa, Bacillus

pumilus, Bacillus spp. có khả năng tiết enzyme thuộc nhóm glucan như cellulase,

mannase và xylanase và các enzyme phân hủy protein của vách tế bào nấm Aphamyces

cochlioides gây bệnh thối rễ trên cây củ cải đường. Vi khuẩn Bacillus cereus strain 65

có khả năng tạo enzyme chitinase có khối lượng phân tử 36Kda, chitinase này giúp

phân giải diacetylchitodibose. Khi áp dụng Bacillus cereus strain 65 trực tiếp vào đất

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

thì bảo vệ cây bông vải con khỏi bệnh thối rễ do nấm Rhizoctonia solani (Pleban,

1997); Nguyễn Thị Thu Nga, 2003).

1.1.8 Mức độ an toàn sinh học

Bacillus subtilis là chủng vi khuẩn probiotic thể hệ mới có tính an toàn cao đối với con

người.

Bacillus subtilis là loài vi khuẩn đã được sử dụng phổ biến ở Nhật Bản trong các món

ăn cổ truyền từ hàng nghìn năm trước và là thực phẩm an toàn đối với con người.

Hiện nay ở châu Âu và ở Mỹ, vi khuẩn này được chỉ định là đủ điều kiện về an toàn

thực phẩm, tiếng Anh gọi là QPS (Qualified Presumption of Safety) hay GRAS

(Generally Regarded As Safe).

Bacillus subtilis đã được các nhà khoa học chứng minh là rất an toàn và không hề có

tác dụng phụ với liều uống lên đến 1×1011 CFU/ngày (Hong et al, 2008). Bacillus

subtilis cũng đã được nghiên cứu tính chất, sự an toàn và khả năng tồn tại và phát triển

ở ruột (Hong et al, 2009).

Theo hướng dẫn của Cộng đồng châu Âu và Mỹ, đề xuất bởi tổ chức Lương thực Quố c

tế (FAO) và Tổ chức Y tế thế giới (WHO) (FAO/WHO, 2002), Cơ quan An toàn Thực

phẩm châu Âu EFSA (European Food Safety Authority, EU) và Cục An toàn Thực

phẩm và Thuốc của Mỹ FDA (Food & Drug Administration, USA), Bacillus subtilis đã

được định danh tên chủng bằng công nghệ gen.

1.2 Tổng quan về các chủng nấm gây bệnh đốm trắng trên thanh long

1.2.1 Giới thiệu về bệnh đốm trắng

Bệnh đốm trắng (đốm nâu) là một loại bệnh nguy hiểm trên thanh long, bệnh hại

trên cành và quả gây thiệt hại kinh tế lớn cho nhiều vùng trồng thanh long của bà con.

Dựa vào triệu chứng gây hại mà bà con địa phương thường có những tên gọi khác nhau

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

như bệnh nấm tắc kè, bệnh đốm nâu, bệnh đốm trắng (do trong quá trình phát sinh,

phát triển biểu hiện của bệnh thường thay đổi liên tục theo từng giai đoạn diễn tiến của

bệnh). Bệnh đốm trắng thanh long do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra. Loại

nấm này có bào tử sinh trưởng khỏe, khả năng lây lan nhanh, chống chịu tốt với nhiều

loại thuốc hóa học đặc trị nấm nói chung (có tính kháng thuốc mạnh) do đó hiện nay

chưa có một loại thuốc hóa học nào có khả năng đặc trị loại bệnh này (bệnh đốm trắng;

đốm nâu). Bào tử nấm gây bệnh bằng cách nảy mầm trên bề mặt thân cành, quả thanh

long, sau đó xâm nhập vào trong mô gây hoại tử.

Bệnh đốm trắng hiện nay được xem là vấn nạn của bà con tại các vùng trồng thanh

long. Bệnh phát triển mạnh và lây lan rộng tại các tỉnh trồng thanh long (Bình Thuận –

Long An - Tiền Giang – Vĩnh Long...). Hiện nay các nhóm thuốc hóa học gần như

không có tác dụng triệt đề, nhiều bà con chia sẻ rằng khi phun các lo ại thuốc được xem

là đặc trị bệnh nhưng chỉ có tác dụng “cầm bệnh” một thời gian sau đó chúng lại phát

triển mạnh trở lại (tái nhiễm bệnh) (Viện bảo vệ thực vật, 2014).

Triệu chứng bệnh biểu hiện trên cành: Khi bệnh mới phát sinh vết bệnh thường là

những chấm nhỏ (đốm nhỏ) hình tròn màu trắng. Lúc đầu vết bệnh có biểu hiện hơi

lõm xuống so với bề mặt xung quanh, gặp điều kiện thuận lợi (ẩm cao) vết bệnh phát

triển to dần và có xu hướng phát triển lồi lên (giống như mụn ghẻ nhô lên) có màu

vàng gỉ sắt đến nâu. Khi bệnh nặng số lượng vết bệnh tăng lên và chúng liên kết với

nhau tạo thành những vết loang sần sùi nhô lên có màu nâu giống như da con tắc kè

nên bà con nhiều nơi gọi là nấm tắc kè. Trong thời kỳ phát triển bệnh nếu gặp mưa ẩm

vết bệnh có thể bị thối nhũn (Viện bảo vệ thực vật, 2014).

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Hình 1.2: Triệu chứng bệnh khi xuất hiện trên thân, cành thanh long (Nguồn: Viện bảo

vệ thực vật, 2014)

Triệu chứng bệnh biểu hiện trên quả: Tương như trên cành, các vết bệnh nằm rải

rác trên bề mặt quả, vết bệnh là những đốm tròn lồi trên bề mặt quả ảnh hưởng đến

chất lượng quả.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Hình 1.3: Triệu chứng bệnh trên quả thanh long chín (Nguồn: Viện bảo vệ thực vật

,2014)

1.2.2 Tác hại của bệnh đốm trắng:

Bệnh đốm trắng trên thanh long diễn biến rất phức tạp, lây lan nhanh trên diện rộng,

phát triển mạnh vào mùa mưa. Ở một số vườn thanh long mới trồng, bệnh đốm trắng

đã xuất hiện trên cành với tỷ lệ bệnh dao động từ 1-5%. Trên một số vườn thanh long

kinh doanh, bệnh nặng hơn với tỷ lệ bệnh dao động từ 10-50%. Bệnh phát triển mạnh

trên cành non và trên quả gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng sản

phẩm. Nếu không bị bệnh, trọng lượng quả đạt ≥600g/quả. Nếu như quả bị bệnh, hoặc

trọng lượng quả <500 g/quả, dẫn đến thua lỗ. Việc thâm canh quá mức, bón phân và sử

dụng thuốc BVTV không đúng cách có thể sẽ gây ảnh hưởng đến tình hình dịch hại và

ngày càng khó kiểm soát (Viện bảo vệ thực vật, 2014)

1.2.3 Giới thiệu về chủng nấm gây bệnh

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Hình 1.4 Hình thái nấm Scytalidium dimidiatum dưới kính hiển vi ở vật kính 40X.

A: Tản nấm trên môi trường CMA sau 7 ngày nuôi cấy.

B, C, D, E, F, G: các dạng bào tử đốt

( Nguồn: Trung tâm kiểm dịch sau nhập khẩu II, 6/2013)

Dựa vào đặc điểm hình thái bào tử, cành bào tử, kích thước bào tử và hình thái tản

nấm dựa vào khóa phân loại của Ellis (1976) đã xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng

trên Thanh long là do nấm Scytalidium dimidiatum (B. Sutton & Dyko, 1989), hiện nay

nấm còn được gọi tên là Neoscytalidium dimidiatum (Crous & Slippers, 2006).

Neoscytalidium dimidiatum thuộc ngành nấm túi (Ascomycota), Ascomyta có thể

sinh dưỡng dạng sợi đa bào, phân nhánh phức tạp có vách ngăn một tế bào thường có

một nhân đôi khi có nhiều nhân, dạng chuyển hóa dạng sợi bắt đầu đứt đoạn ra tạo

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

thành cơ thể đơn bào hình tròn, bầu dục, chứa nhiều nhân hay một nhân. Vách tế bào

được cấu tạo bằng chitin hay glucan đa số hoại sinh gây mục gỗ, hoại sinh trên đất,

trong nước trên cạn, thực vật, động vật, một số loại ký sinh gây bệnh trên thực vật,

động vật đơn bội chiếm ưu thế và người gây ra những thiệt hại lớn.

Ascomyta sinh sản sinh dưỡng bằng sự chia đôi tế bào nảy chồi, đứt đoạn sợi nấm,

bào tử áo, bào tử màng dày, sinh sản vô tính bằng bào tử đỉnh (conidia) và sinh s ản hữu

tính bằng bào tử túi. Các bào tử khác tính (+; -) sợi nấm đơn bội, phân nhánh thành hệ

sợi nấm hình thành các c ặp cơ quan sinh sản, giao phối sinh chất, hình thành sợi sinh

túi đa bào sau đó phân chia nguyên nhiễm kết hợp thành nhân lưỡng bội rồi giảm

nhiễm tạo thành bào tử túi.

Chu trình sống của Ascomyta gồm 3 giai đoạn: giai đoạn đơn bội, giai đoạn song

hạch, giai đoạn lưỡng bội, trong đó giai đoạn đơn bội chiếm ưu thế.

Một số Ascomyta hình thành quả thể trong đó có quả thể kín, quả thể mở lổ và quả

thể hở.

1.2.4 Phân loại

Đặc điểm phân loại của nấm N. dimidiatum (Rous & Slippers., 2006)

Kingdom: Fungi

Division: Ascomycota

Class: Dothideomycetes

Order: Botryosphaeriales

Family: Botryosphaeriaceae

Genus: Neoscytalidium

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Species: N. dimidiatum

1.2.5 Đặc điểm hình thái học

Tản nấm mọc rất nhanh trên môi trường PDA, 3 ngày sau khi cấy đã mọc đầy đĩa.

Tản nấm ban đầu có màu xám trắng sau 10 ngày nuôi c ấy có màu xám đen đến màu

đen, mặt sau tản nấm có màu đen, không có vòng đồng tâm. Sợi nấm có màu nâu đen

đến màu nâu đậm, vươn cao như bông gòn trên bề mặt môi trường. Cành bào tử sinh ra

trực tiếp từ bề mặt của môi trường nuôi cấy, cành bào tử đơn lẻ, thẳng hoặc hơi cong.

Bào tử đốt có màu nâu nhạt đến nâu sậm, hầu hết không có vết ngăn, bào tử hình thành

rất nhanh chỉ sau 2 ngày nuôi cấy. Bào tử dạng chuỗi hoặc đơn lẻ có nhiều hình dạng

khác nhau như hình que, hình tròn, hình quả lê, hình trứng, hình trụ. Kích thước trung

bình của bào tử khoảng 9.17𝜇𝑚 - 21.2 𝜇𝑚*4.05𝜇𝑚 -7.75𝜇𝑚.

1.2.6 Lịch sử nghiên cứu

1.2.6.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước:

Thanh long là cây ăn quả phổ biến và được sử dụng rộng rãi nhất trên thế giới. Vì vậy,

việc nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm đang được quan tâm, đã có rất nhiều

nghiên cứu về tình hình bệnh hại trên Thanh long. Thanh long bị gây hại bởi một số

bệnh như bệnh thối đầu cành (Alternaria sp.), bệnh đốm nâu trên cành (Gleosporium

agaves), bệnh đốm xám hay còn gọi là nám cành (Sphaceloma sp.). Tuy nhiên những

năm gần đây Thanh long lại bị gây hại nặng bởi nấm Neoscytalidium dimidiatum đây là

một bệnh có ảnh hưởng lớn đến năng suất chất lượng sản phẩm gây thiệt hại lớn cho

người trồng Thanh long. Trước vấn đề cấp thiết trên, nhiều nhà khoa học trên thế giới

đã nghiên cứu tìm hiểu về nấm Neoscytalidium dimidiatum.

Theo báo cáo đầu tiên về nấm N. dimidiatum trên cây có múi tại Italya (G. Polizzi et al,

2008) vào tháng 9 năm 2008 một căn bệnh mới đã được phát hiện và chú ý ở phía

Sicily, Italy trong vườn cây có múi như cam ngọt (Citrus sinensis (L.) Osbeck c v.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Tarocco Scires) 2 tuổi đã xuất hiện một bệnh mới với triệu chứng điển hình là chồi

kém phát triển và thối trên thân, cành, gốc ghép, vết thối chảy gôm.

Theo báo cáo đ ầu tiên về nấm N.dimidiatum và N.novaehollandiae trên cây xoài tại

Australia của ( J. D. Ray, T. Burgess và V. M. Lanoiselet. 2010), N.dimidiatum là loài

nấm có phạm vi phân bố và có nhiều ký chủ: cây dương mai, hạt sung, vả, cây có múi,

chuối, mận và nhiều cây trồng khác ở Mỹ (Farret al., 1980). N.dimidiatum còn gây hại

trên xoài (Reckhaus 1987) và nhất là trên Thanh long (Brown 2012). N.dimidiatum gây

nên các triệu chứng như héo cành, chết mầm, thối, chảy gôm và làm cây chết. Yếu tố

quan trọng nhất ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm N.dimidiatum là độ ẩm

(Punithalingam and Waterson 1970; Reckhaus 1987; Elshafie and Ba-Omar 2001).

N.dimidiatum được báo cáo lần đầu tiên tại Australia liên quan đến bệnh chết mầm của

xoài (2010). Tại Australia đã tiến hành khảo sát về sức khỏe cây trồng do Bộ nông

nghiệp và thực phẩm Tây Australia kết hợp với kiểm dịch viên Australia thực hiện.

Tháng 8 năm 2008 trong cuộc khảo sát này các nghiên cứu đã tiến hành phân lập các

triệu chứng chết mầm trên cây xoài và rễ cây sung, sau khi tiến hành phân lập đã phát

hiện nguyên nhân gây bệnh làm chết mầm, thối rễ, thối cây… là do nấm

Neoscytalidium dimidiatum gây ra. Neoscytalidium dimidiatum tiếp tục được phân lập

và tiến hành giải trình tự một phần DNA của từng vùng ITS kết quả xác định là do

Neoscytalidium gây ra. Trong cuộc khảo sát, N.dimidiatum cũng được phân lập từ các

mẫu xoài lấy tại Derby, trong tháng 9 năm 2008, Broome vào tháng 9 năm 2008 và

Đảo Bathurst, Northen Territory vào tháng 10 năm 2008. Sau khi phân lập, các nhà

khảo sát đã tiến hành lây bệnh nhân tạo và tái phân lập theo quy tắc Kock đã thu được

kết quả tốt. Tiến hành kiểm tra lại các chủng thu thập với các cuộc điều tra trước

(2005) các nhà khảo sát đã phát hiện rằng N.dimidiatum đã xuất hiện và gây hại tại

Australia trong thời gian dài trước đó (phân lập từ cây có múi (Torula dimidiate 1914)).

Theo báo cáo này, yếu tố nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển gây hại của bệnh.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Trước đây N.dimidiatum có nhiều tên gọi khác nhau như: Fusicoccum dimidiatum,

Scytalidium dimidiatum, Scytalidium lignicola, Hendersonula toruloidea , (Crous et al,

2006).

Theo nghiên cứu của Mohd et al (2013), viện nghiên cứu sở nông nghiệp, Đại học quốc

gia Đài Loan, Trung Quốc, vào tháng 9 năm 2009 và 2010 bệnh đốm trắng đã xuất hiện

ở một số cây Thanh long tại Đài Loan. Triệu chứng của bệnh là các vết nhỏ, tròn, vết

bệnh lõm, màu cam. Bệnh được xác định do nấm N.dimidiatum gây ra.

1.2.6.2. Tình hình nghiên cứu trong nước:

Hiện nay tại Việt Nam có rất ít thông tin về nấm gây bệnh đốm trắng trên cây Thanh

long, chỉ có thông tin nghiên cứu của Viện nghiên cứu cây ăn quả Miền nam (2011)

rằng bệnh đốm trắng do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra. Nấm này còn có tên

khác là Scytalidium dimidiatum, Scytalidium lignicola, Hendersonula toruloidea ,…

bệnh chủ yếu xuất hiện và tấn công mạnh và mùa mưa, nhiệt độ thích hợp cho nấm

phát triển từ 20-300C. Ẩm độ càng cao càng tạo điều kiện thuận lợi cho bệnh tấn công

và lây lan mạnh. Bệnh lây theo gió và nguồn nước nhiễm bệnh. Qua theo dõi thấy bệnh

hại nặng ở những vùng có mực nước ngầm cao, những vườn vệ sinh kém, rậm rạp và bị

che mát nhiều, vườn sử dụng nhiều phân đạm hay phân bón phân chuồng chưa ủ hoai,

vườn sử dụng nhiều chất kích thích tăng trưởng hay vườn bón thiếu trung vi lượng đều

có tỉ lệ bệnh cao hơn bình thường và khi có bệnh thì khó phòng trừ hơn. Vết bệnh ban

đầu là những đốm tròn nhỏ màu trắng, hơi lõm, về sau chuyển sang màu vàng cam và

khi bệnh phát triển nặng đốm bệnh trở thành vết loét có màu nâu, hơi nổi lên và gây

ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây, năng suất và giá trị thương phẩm của quả. Bệnh

thường gây hại trên bẹ non, nụ bông, quả non và giai đoạn chuẩn bị thu hoạch.

Theo Võ Thị Thu Oanh và cộng sự (2014) khi so sánh trình tự vùng gen ITS-RADN

của mười một mẫu phân lập nấm Neoscytalidium dimidiatum tại Viện Nghiên Cứu

CNSH và Môi Trường - trường Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh cho thấy các mẫu

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

phân lập tương đồng rất cao với trình tự của loài Neoscytalidium dimidiatum đã được

định danh về hình thái.

1.3 Nấm gây bệnh héo vàng trên cây ớt (Fusarium sp.)

1.3.1 Giới thiệu về bệnh héo vàng trên cây ớt

Bệnh héo vàng do nấm Fusarium sp. gây ra là một trong những bệnh nguy hiểm

gây thiệt hại lớn ở nhiều nước châu Âu, châu Á, châu Mỹ và châu Đại Dương. Bệnh

thường thấy nhiều ở thời vụ có thời tiết nóng, nhiệt độ trong vụ trồng cà chua trên

250C. Ở những nước có nhiệt độ mát mẻ thường thấy bệnh trong nhà kính. Theo Binder

và Hutchinson (1959) cà chua bị bệnh héo vàng do nấm Fusarium sẽ chết nhanh và

thiệt hại lớn khi cùng bị tuyến trùng (Meloidogine incognita) xâm nhập vì tuyến trùng

làm giảm tính chống bệnh của cà chua đối với nấm Fusarium.

Trên cây ớt, bệnh thường gây hại giai đoạn cây con đến ra hoa, quả.

Triệu chứng điển hình là lá biến vàng và héo dần từ lá dưới gốc lên lá trên ngọn, cây

sinh trưởng kém, cuối cùng toàn cây bị héo và chết. Gốc và rễ cây bệnh có vết nâu rồi

khô dần, bó mạch trong thân cây hóa nâu. Phần gốc gần mặt đất teo tóp nhỏ lại và đôi

khi có lớp tơ mỏng màu trắng bao phủ. Lá cây chết có màu vàng và khô. Thời gian từ

khi cây có biểu hiện bệnh đến khi cây chết kéo dài hàng tháng.

1.3.2 Giới thiệu về chủng nấm gây bệnh chủ yếu

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Hình 1.5: Đặc điểm hình thái vi nấm Fusarium oxysporum (Jeon CS et al, 2013)

(A): tản nấm sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA; (B) : tản nấm sau 7 ngày nuôi

cấy (C): tản nấm sau 7 ngày nuôi cấy mặt dưới đĩa) (D), (E): bào tử vi nấm, (F): cuống

bào tử vi nấm.

Nấm Fusarium equiseti gây bệnh thối bầu bí khi quả tiếp xúc với đất (Burgess et al,

1988). Nấm Fusarium oxysporum gây bệnh thối nõn ngô (Nelson et al, 1988) và gây

thối nõn dứa (Bolkan et al, 1974). Cũng theo Burgess et al (1998) nấm Fusarium

oxysporum là tác nhân gây bệnh héo và thối rễ, thân, mầm cây. Theo Binder và

Hutchison (1959) cà chua bị bệnh sẽ bị chết nhanh hơn và thiệt hại nhanh hơn khi cùng

bị tuyến trùng (Meloidogin incognita) xâm nhập vì tuyến trùng đã làm giảm khả năng

chống bệnh của cây gây ra bệnh thối rễ và lở cổ rễ ở cây bí ngô là do nấm. Ngoài ra,

theo R.H.Stover ở vùng nhiệt đới loài nấm Fusarium oxysporum còn gây hại trên nhiều

ký chủ khác nhau như thuốc lá, cà chua, khoai lang, khoai tây, cây hoa huệ, cây ớt…

Đây là những bệnh có tác hại kinh tế lớn trong sản xuất.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

1.3.3.Lịch sử nghiên cứu

Các loài nấm Fusarium sp. đã được nghiên cứu từ khoảng đầu thế kỷ XIX. Đến nay

đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về nấm Fusarium đã được công bố và có ý nghĩa

lớn trong sự phát triển của khoa học kỹ thuật. Nấm Fusarium thuộc

lớp Hyphomycetes., nhóm nấm bất toàn Fungi imperfecti, đây là loại nấm có thành

phần rất phong phú và đa dạng, trong đó sự biến động của một số loài phụ thuộc cơ bản

vào đặc điểm khí hậu ở các vùng khác nhau trên thế giới. Loài nấm này gây hại nhiều

loại cây trồng trên tất cả các bộ phận đặc biệt bộ phận gốc, rễ của cây.

1.3.4 Phân loại

Ngành: Ascomycota

Lớp: Deuteromycetes

Họ: Tuberaulariaceae

Bộ: Moniliales

Chi: Fusarium

1.3.5 Đặc điểm sinh thái học phân bố trong tự nhiên

Nấm Fusarium là loại nấm tồn tại chủ yếu trong đất xâm nhiễm gây bệnh bên trong

bó mạch thông qua bộ rễ do rễ làm nhiệm vụ hút nước và chất dinh dưỡng.

Nấm Fusarium có 2 giai đoạn tồn tại trong đất: giai đoạn sinh trưởng tích cực và

giai đoạn tiềm sinh (giai đoạn ngủ nghỉ). Ở điều kiện thích hợp, môi trường có đầy đủ

chất dinh dưỡng, nấm sẽ sinh trưởng tích cực. Ngược lại, khi gặp điều kiện bất lợi,

lượng dinh dưỡng trong đất còn rất ít thì nấm sẽ chuyển sang giai đoạn tiềm sinh. Lúc

này, các loài Fusarium sẽ hình thành cấu trúc tiềm sinh là bào tử hậu. Cũng trong giai

đoạn này, cường độ hô hấp và nguồn dinh dưỡng dự trữ được tích lũy trong hệ sợi nấm

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

sẽ được các loài Fusarium sử dụng ở mức thấp nhất, nhằm đảm bảo sự tồn tại của

chúng trong thời gian dài. Một số loài Fusarium không sản sinh bào tử hậu thì chúng sẽ

tiếp tục tồn tại bằng cách làm chậm lại các hoạt động hoại sinh hay ký sinh trong cơ thể

vật chủ. Vì thế, sau khi thu hoạch vụ mùa với các cây bị bệnh do Fusarium thì khả

năng trong đất còn sót lại Fusarium là rất cao.

Nấm Fusarium oxysporum có dạng bào tử lớn trong suốt, có nhiều vách ngăn, bào tử

hình trăng khuyết, một đầu thắt lại hình bàn chân. Dạng bào tử nhỏ, đơn hoặc đa bào

hình cầu hoặc hình bầu dục. Một số loài Fusarium oxysporum có bào tử nhỏ, bào tử

hậu và quả thể hoặc không có bào tử hậu. Theo Booth (1977 -1979) đã chú ý vào bản

chất tế bào phân sinh mà từ đó sinh ra bào tử nhỏ, là một trong những chỉ tiêu đầu tiên

để phân loại nấm trên cơ sở đó ông cho rằng nấm Fusarium oxysporum có số lượng 90

loài. Gần đây Burgess et al (1993) đã đưa ra cơ sở phân loại nấm Fusarium

oxysporum gồm các chỉ tiêu như sau:

+Hình thành bào tử lớn.

+Hình thành bào tử nhỏ.

+Hình dạng và kiểu bào tử nhỏ.

+Kích thước của bào tử nhỏ.

1.3.6 Đặc điểm hình thái học

Fusarium sp. là chi lớn nhất trong Tuberculariaceae, chúng hoại sinh hoặc ký sinh

trên nhiều cây trồng, cây ăn trái và rau. Nó là nguyên nhân chính làm héo rũ cây chủ.

Hệ sợi nấm lan toả khắp mô mạch và lấp kín mạch gỗ. Sự lấp mạch gỗ sẽ cản trở quá

trình chuyển vận nước làm héo cây, Fusarium sp. cũng sản xuất một số chất độc tiết

vào mạch dẫn cây chủ cũng có thể gây héo rũ, nhiều loài thực vật bị Fusarium sp. tấn

công. Hệ sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn, sợi nấm thường không màu, chuyển màu

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

nâu khi già. Hệ sợi nấm sản sinh độc tố tiết vào hệ mạch gây héo cây chủ. Cơ thể dinh

dưỡng dạng sợi đa bào, phân nhánh phức tạp, vách ngăn có lỗ thủng đơn giản ở giữa.

Trong một tế bào có một nhân hoặc nhiều nhân. Vách tế bào bằng chitin, glucan. Nấm

sống hoại sinh hoặc ký sinh trên thực vật, gặp phổ biến trong đất, cũng g ặp trên các vật

liệu cellulose. (Nguyễn Lân Dũng, Bùi Xuân Đồng, Lê Đình Lương, 1982)

Nấm Fusarium sp. phát triển nhanh chóng trên môi trường PDA ở nhiệt độ 250C và

hình thành tản nấm có hình thể tơi xốp như bông hoặc bằng phẳng hoặc lan rộng trên

môi trường nuôi cấy. Mặt trên của tản nấm có thể có màu trắng, kem, vàng, vàng cam,

đỏ, tím hồng hoặc tím. Mặt dưới nó có thể không màu, vàng cam, màu đỏ, màu tía sẫm,

hay màu nâu.

1.4 Giới thiệu về enzyme ngoại bào

1.4.1 Tổng quan về Enzyme Chitinase

1.4.1.1 Khái niệm

Chitinase (EC 3.2.1.14), còn gọi là [poly β-1,4-(2-acetamido-2-deoxy)-D-glucosid

glucanohydrolase]) là enzyme thủy phân chitin thành các đơn phân N-

acetylglucosamine, chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết β-

1,4-glycoside giữa C1 và C4 của hai phân tử N-acetylglucosamine liên tiếp nhau trong

chitin. Enzyme này có ở nhiều loài khác nhau như thực vật, động vật không xương

sống, động vật có vú, côn trùng, chân khớp, nấm, vi khuẩn và virus. Chân khớp và nấm

cần chitinase trong s ự phân chia tế bào để tăng trưởng. Chitinase được tạo thành trong

suốt quá trình sinh trưởng của nấm.

Đối với nấm sợi, chitinase tham gia nhiều chức năng như phân giải thành tế bào,

nảy mầm bào tử, phát triển khuẩn ty và tự phân khuẩn ty, biệt hóa bào tử, đồng hóa

chitin và ký sinh. Ở vi khuẩn, chitinase được tạo ra để sử dụng chitin làm nguồn

carbon.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

1.4.1.2 Phân loại chitinase

Dựa vào cấu trúc phân tử: Chitinase được sắp xếp vào 2 họ Glycohydrolase (enzyme

thủy phân đường):

- Họ glycohydrolase18: là họ chitinase lớn nhất với khoảng 180 chi, có cấu trúc xác

định gồm 8 xoắn α/β cuộn tròn, được tìm thấy ở nhiều loại sinh vật như vi khuẩn, nấm,

thực vật, côn trùng, hữu nhũ và virus. Họ này bao gồm chủ yếu là enzyme chitinase,

ngoài ra còn có các enzyme khác như chitodextrinase, chitobiase và N-

acetylglucosaminidase.

- Họ glycohydrolase 19: họ này gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu ở thực vật như

cà chua (Solanum tuberosum), cải (Arabidopsis thaliana), đậu Hà Lan (Pisum

sativum), ngoài ra còn có ở xạ khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus

influenzae… Chúng có cấu trúc hình cầu có cuộn giống lysozyme (EC 3.2.1.17) của

động vật và phage, bao gồm motif cuộn α + β và hoạt động thông qua cơ chế nghịch

chuyển. Thực vật và vi sinh vật như Streptomyces tạo chitinase thuộc cả 2 họ, trong khi

côn trùng và hầu hết sinh vật khác chỉ tạo chitinase thuộc họ glycohydrolase 18.

• Dựa vào trình tự amino acid: Dựa vào trình tự đầu amin (N), sự định vị của enzyme,

điểm đẳng điện, peptid nhận biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại enzyme

chitinase thành 5 nhóm:

- Nhóm I: là những đồng phân enzyme trong phân tử có vùng đầu N giàu cysteine chứa

khoảng 40 acid amin (giống với vùng đầu N ở hevein và các enzyme khác có ái lực đối

với chitin hay N-acetylglucosamine) nối với tâm xúc tác thông qua một đoạn giàu

glycin hoặc prolin ở đầu carboxyl (C)(peptid nhận biết). Vùng giàu cysteine có vai trò

quan trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ chất chitin nhưng không cần cho hoạt động

xúc tác. Các vùng gắn chitin này không phải luôn đóng vai trò quan trọng trong việc

tăng cường hoạt tính xúc tác enzyme mà chúng cần để tạo các đặc tính sinh học riêng

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

biệt cho chitinase ở nhiều loài khác nhau. Ở nấm men, vùng gắn chitin nằm ở đầu C

giúp định vị chitinase trên thành tế bào nấm men, đóng vai trò trong việc phân tách tế

bào mẹ khỏi các tế bào chị em. Ở thuốc lá và nhiều loài thực vật khác, các chitinase

này nằm trong không bào và được cảm ứng từ sự nhiễm nấm, vi khuẩn hay virus.

Chitinase nhóm I của thuốc lá có vùng đầu C giàu cystein đóng vai trò là vùng gắn

chitin.

- Nhóm II: là những đồng phân enzyme trong phân t ử chỉ có tâm xúc tác có trình tự

amino acid tương tự ở chitinase nhóm I, thiếu đoạn giàu cysteine ở đầu N và peptide

nhận biết ở đầu C. Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm và vi khuẩn. Chúng được cảm

ứng bởi các tác nhân bên ngoài. Ở thực vật, các protein nhóm II thuộc loại protein

kháng bệnh và được tế bào tiết ra dưới nhiều điều kiện stress khác nhau.

- Nhóm III: Trình tự amino acid hoàn toàn khác với chitinase nhóm I và II, nhưng r ất

giống về trình tự với lysozyme ở Hevea brasiliensis, vì thế chúng mang ho ạt tính

lysozyme. Ở thực vật, các chitinase nhóm III là các protein kháng bệnh và được tiết ra

ngoại bào.

- Nhóm IV: là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm, 41-47% trình

tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tương tự như chitinase nhóm I và khá giống với

chitinase vi khuẩn. Trong phân tử cũng có đoạn giàu cysteine nhưng kích thước phân

tử nhỏ hơn đáng kể so với chitinase nhóm I.

- Nhóm V: dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn chitin

(vùng giàu cysteine) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hóa ở thực vật bậc

cao.

• Dựa vào phản ứng phân cắt:

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, chitin-1,4-β- chitobiosidase, N-

acetyl-β-D-glucosaminidase (exochitinase) và chitobiase.

Endochitinase là enzyme phân cắt nội mạch chitin một cách ngẫu nhiên tạo các

đoạn oligosaccharide, đã được nghiên cứu từ dịch chiết môi trường nuôi cấy nấm mốc

Trichoderma harzianum (2 loại endochitinase: M1=36kDa, pI1=5,3±0,2 và

M2=40kDa, pI2=3,9), Gliocladium virens (M=41kDa, pI=7,8).

Chitin-1,4-β-chitobiosidase là enzyme phân cắt chitin (exochitinase) từ đầu không

khử tạo thành các sản phẩm chính là các chitobiose, cụ thể enzyme này được thu từ

Trichoderma harzianum (M=36kDa, pI=4,4±0,2).

N-acetyl-β-D-glucosaminidase (exochitinase) (EC 3.2.1.30) là enzyme phân c ắt

chitin từ một đầu cho sản phẩm chính là các monomer N-acetyl-D- glucosamin.

Chitobiase là enzyme phân c ắt chitobiose thành 2 đơn phân N-acetyl-D-

glucosamin. Ngoài ra, đối với chitosan - dẫn xuất deacetyl hóa của chitin, chitosanase

(EC 3.2.2.132) xúc tác thủy phân chitosan tạo thành các oligosaccharide tương ứng.

1.4.2 Enzyme Cellulase

1.4.2.1 Khái niệm

Enzyme cellulase là một phức hợp enzyme có tác dụng thủy phân cellulose thông

qua phân cắt liên kết 1,4-D–glucoside trong cellulose tạo sản phẩm glucose cung c ấp

cho công nghiệp lên men. Nguồn thu cellulase lớn nhất hiện nay là vi sinh vật.

Hệ cellulase gồm:

+ endo -(1,4)–β-D-glucanase (EC.3.2.1.4)

+ exo-(1,4)-β-D-glucanase (EC.3.2.1.91)

+ β-glucosidases (EC.3.2.1.21)

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Hoạt động phối trộn thủy phân cellulose thành glucose.

1.4.2.2 Cơ chế tác động của enzyme Cellulase

Cellulose là enzyme phức tạp xúc tác sự phân giải cellulose thành s ản phẩm cuối cùng

là glucose. Gồm ba giai đoạn chủ yếu:

Giai đoạn 1: dưới tác động của cellulose và các tác nhân c ủa môi trường làm thay

đổi tính chất lý hóa của cellulose, làm cho phân tử cellulose từ dạng tinh thể thành

dạng hoạt động. Khi phân tử cellulose ở dạng hoạt động, các endocellulose dễ dàng tác

động và phân giải chúng thành cellulose hòa tan (polysaccharide), cellotetrose,

cellobiose, glucose, mà chủ yếu của giai đoạn này là tạo thành các cellulose hòa tan.

Giai đoạn thứ 2: Cellulose biến đổi sau giai đoạn 1 bị phân giải các cellobiose

(disaccharide) và cellotetrose dưới tác dụng của exocellulase. Giai đoạn cuối cùng:

dưới tác dụng của cellobiose (β-1,4-glucosidase), các đoạn cellobiose bị thủy phân

thành glucose, β-1,4-glucosidase là những enzyme rất đặc hiệu thủy phân cellobiose

thành D-glucose.

1.4.2.3. Phân loại và đặc điểm của enzyme Cellulase

Theo Wood và Mc.Cral (1979), enzyme cellulase được phân chia theo chức năng thành

3 nhóm:

Exocellulase (exobiohydrolase; 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase).

Endocellulase (endoglucanase; 1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase).

β-glucosidase (cellbiase; β-D-glucoside glucohydrolase).

Hoạt tính của hệ enzyme cellulase đạt cao nhất khi nhiệt độ nằm trong kho ảng từ 40-

600C, pH nằm trong khoảng 4 – 7. Cellulase bị ức chế bởi những sản phẩm phản ứng

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

của nó như glucose, cellobiose. Hg2+ ức chế hoàn toàn cellulose, trong khi các ion như

Mn2+, Ag+, Cu2+ và Zn2+ chỉ ức chế nhẹ.

Hoạt tính của chế phẩm cellulase bị mất hoàn toàn sau 10 – 15 phút ở 800C.

Exocellulase được tổng hợp bởi Trichoderma reesei và đã được các nhà khoa học

nghiên cứu rất kỹ. Chúng bao gồm hai loại: exocellulase kiểu I và exocellulase kiểu II.

Exocellulase kiểu I chiếm 60% lượng protein có trong dịch nuôi cấy Trichoderma

reesei. Chúng có phân tử lượng khoảng 66.000 Da, điểm đẳng điện là 4,4(PI = 4,4).

Loại enzyme này tác dụng cả lên cellulose vô định hình và cellulose kết tinh. Nhưng

chúng lại không tác đến cellulose biến tính như carboxylmethyl cellulose (CMC) hay

hydroxyethycellulose, cellohexaose β-nitrophenyl, β-glucoside hay β- glucan.

Exocellulase kiểu I chứa khoảng 496 amino acid.

Exocellulase kiểu II có phân tử lượng 53.000 Da, PI = 5,0. Chúng cũng không tác

động lên CMC, chúng có khả năng tác động đến cellulose hòa tan và cả cellulose

không hòa tan. Exocellulose kiểu II chưa khoảng 471 amino acid. Exocellulase của

Cellulomonas fimi có một số tính chất khác biệt so với của Trichoderma reesei.

Exocellulase của Cellomonas fimi có chứa 443 amino acid. Enzyme này có ba

cầu nối disulfide. Hai cầu nối disulfide nằm trong trung tâm hoạt động còn một cầu nối

nằm ngoài trung tâm ho ạt động. Exocellulase của Clostridium thermocellum có phân tử

lượng 68.000 – 75.000 Da.

Endoglucanase có nhiều trong dịch nuôi cấy Trichoderma reesei. Các nhà khoa

học chia chúng thành hai loại endoglucase kiểu I và endoglucanase kiểu II.

Endoglucanase kiểu I chứa 459 amino acid, phân tử lượng khoảng 48.121 Da.

Endoglucanase kiểu II chứa 418 amino acid, phân tử lượng 42.200 Da. Các enzyme

này có thể hoạt động ở nhiệt độ khá cao.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Ngoài ra endoglucanase còn được tìm thấy ở Clostridium themocellum,

Cellulomonas fimi và các vi sinh vật khác. Các endoglucanase của các vi sinh vật khác

thường không khác biệt nhiều.

β-glucosidase là nhóm enzyme khá phức tạp, chúng có khả năng hoạt động trong

pH rất rộng (pH từ 4,4 – 8,4), phân tử lượng 50.000 – 98.000 Da, PI (isoeletric point)

8,4 và có thể hoạt động ở nhiệt độ cao. β-glucosidase của Trichoderma reesei chứa đến

713 amino acid với phân tử lượng là 75.340 Da. Trong dịch chiết, chúng chiếm 1% so

với tổng lượng protein thu được. β-glucosidase của Clostridium thermocellum được

chia làm hai loại β-glucosidase A và β-glucosidase B. β-glucosidase A chứa khoảng

448 amino acid và có phân tử lượng 51.82 Da. Chúng ho ạt động mạnh ở pH 6,0 – 6,5

và ở nhiệt độ 600C. Chúng tham gia thủy phân cellobiose nhưng không thủy phân

CMC.

1.5 Phân giải lân khó tan trong đất

1.5.1 Khái niệm:

Lân là chất dinh dưỡng thiết yếu cho sự tăng trưởng của cây trồng, khi không cung

cấp đủ lân, cây sẽ sinh trưởng, phát triển chậm, do đó giảm năng suất (Sawyer và

Creswell, 2000). Lân có thể ở dạng hòa tan, có giá trị sử dụng đối với cây trồng, cây

trồng có thể hấp thu để sử dụng hoặc ở dạng khó tan, cây trồng không thể hấp thu được

(Lê Huy Bá, 2000).

Lân hòa tan hay còn gọi là lân dễ tan sẽ nhanh chóng bị cố định thành dạng khó tan

trong đất chua. Lân khó tan chiếm tới 95-99% tổng lượng lân có trong đ ất. Tỷ lệ lân dễ

tan và lân khó tan trong đất được quyết định bởi thành phần và tính chất của đất, thành

phần hữu cơ có trong đất, độ chua, độ kiềm của đất. Hoạt động của các cation kim lo ại

(Ca, Fe, Mg,…) và các hợp chất oxide của các kim lo ại này trong đ ất cũng làm lân dễ

tan bị cố định. Vì vậy, để cây trồng sử dụng lân sẵn có trong đất đạt hiệu quả vẫn là

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

một thách thức lớn với nền nông nghiệp. Trong đất, lân tồn tại ở hai hình thức: vô cơ

và hữu cơ. Mỗi hình thức là một dãy liên tục nhiều hợp chất của lân, tồn tại ở các giai

đoạn khác nhau và luôn trong trạng thái cân bằng động với nhau (Sharpley, 2006).

1.5.1.1 Lân vô cơ

Lân vô cơ tồn tại ở dạng muối phosphate của những nguyên tố Ca, Fe, Al, Mg… Ở đất

trung tính và đất kiềm thì phosphate canxi là chủ yếu, còn ở đất chua thì phosphate sắt,

nhôm là chủ yếu. Có thể phân loại lân vô cơ theo tính tan như sau:

- Lân vô cơ khó tan (Ca3(PO4)2, AlPO4, FePO4, Mg3(PO4)2,…): là các muối phosphate

khó tan trong nước, cây không thể hấp thu được.

- Lân vô cơ dễ tan (Na2HPO4, K2HPO4, MgHPO4, Al2(HPO4)3, CaHPO4, KH2PO4,

NaH2PO4, …): cây trồng dễ dàng sử dụng các loại muối phosp.hate này.

Trong thực tế, lân dạng (H2PO4)− là dạng cây trồng dễ hấp thu nhất. Phosphate canxi dễ

được huy động để làm thức ăn cho cây hơn là phosphate sắt, phosphate nhôm.

1.5.1.2 Lân hữu cơ

Lân hữu cơ tồn tại ở các chất có nguồn gốc động vật, thực vật. Từ xác bã của động vật,

thực vật qua sự phân giải của vi sinh vật trong đ ất tạo thành dạng chất mùn. Lân hữu

cơ trong đất chủ yếu ở trong thành phần mùn và vật liệu hữu cơ. Đất càng giàu mùn thì

càng giàu lân hữu cơ (Trần Kong Tấu, 2009).

1.5.2 Sự chuyển hóa lân trong đất

Trong tự nhiên, lân tham gia vào các quá trình chuyển đổi vật chất bằng cả con

đường hóa học và sinh học. Sự xuất hiện, tồn tại và chuyển hóa của lân trong tự nhiên

diễn ra theo 3 quá trình sau:

Khoáng hóa: Là quá trình chuyển hóa lân dạng hữu cơ thành lân dạng vô cơ.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Cố định sinh học (Immobilization): Là quá trình tái sử dụng lân vô cơ nhờ VSV và

qua đó chuyển đổi lân vô cơ thành lân hữu cơ trong protoplasm của VSV.

Cố định hóa học (Fixation): Là quá trình chuyển đổi lân dạng tan sang dạng khó tan

dưới tác dụng của các phản ứng hóa học giữa ion (PO4)3- và cation kim loại.

Trong đất có nhiều loại VSV khoáng hóa được lân hữu cơ. Các VSV này tiết ra các

enzyme khử phosphoryl đồng thời giải phóng ion phosphate. Phản ứng enzyme nhanh

khi hợp chất lân hữu cơ vừa mới bón vào đất và sau đó xảy ra chậm khi lân đã bị cải

biến (tức là lân đã tạo các phức liên kết với Fe, Al, các chất hữu cơ phân tử lượng cao

và bị giữ chặt trên các phần tử sét).

Khi bón phân lân vào đất, trong vòng vài giờ, độ ẩm của đất sẽ bắt đầu hòa tan các

hạt phân tạo thành các ion orthophosphate (H2PO4)−, (HPO4)2− mà cây trồng có thể sử

dụng được (Schulte và Kelling, 1996).

1.5.3 Vi sinh vật phân giải lân khó tan

Vi sinh vật phân giải lân khó tan là những VSV (nấm men, nấm mốc, vi khuẩn, xạ

khuẩn) trong quá trình sinh trưởng, phát triển tiết ra các hợp chất có khả năng phân giải

các hợp chất phosphate vô cơ khó tan trong đất thành dạng hòa tan mà cây trồng có thể

sử dụng. Có nhiều VSV trong đ ất có khả năng phân giải lân khó tan trong đất thành

dạng dễ tan có giá trị sử dụng cho cây trồng (Antoun et al, 1998). Trong đất, các VSV

là trung tâm của chu trình chuyển hóa lân và đóng vai trò trung gian quan trọng trong

việc chuyển hóa lân vô cơ và hữu cơ, giải phóng lân có giá trị cung cấp cho cây trồng

(McLaughlin, 1988; Oberson, 2001).

Có hai loại lân được giải phóng bởi VSV:

- Lân được giải phóng bởi các quá trình hòa tan (Rodríguez và Fraga, 1999).

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

- Lân giải phóng từ tích lũy trong sinh khối của VSV (Oehl, 2001). Trong quần thể

VSV đất, các VSV phân giải lân có thành phần loài khác nhau và thay đổi tùy từng loại

đất (Banik và Dey, 1982; Kucey et al, 1989).

Mật độ VSV phân giải lân thay đổi khác nhau ở các loại đất của các khu vực địa lý

khác nhau. Mật độ VSV hòa tan lân cũng thay đổi theo từng vùng đất, tập trung nhiều

nhất ở vùng đất có rễ cây (Brown và Rovira, 1999).

Các VSV có khả năng hòa tan lân có thể tồn tại cả trong đất giàu lân ho ặc nghèo

lân tổng số (Oehl, 2001). Các VSV phân giải lân có thể kể đến là Pseudomonas,

Bacilllus, Flavobacterium, Aspergillus, Rhizobium, Fusarium, Achromobacter,

Agrobacterium.

Các chủng đã được dùng trong thương mại: Bacillus megaterium, Bacillus

circulans, Bacillus subtilis, Bacillus polymyxa, Bacillus sir calmous, Pseudomonas

striata, một số Penicillium sp., Aspergillus awamori (Nguyễn Thu Hà, 2013). Theo

Babenko et al (1984), lượng lân hòa tan tăng tuyến tính cùng với sự tăng trưởng của vi

khuẩn trong môi trường nuôi cấy, lượng lân hòa tan tăng tại các điểm khác nhau trong

những giai đoạn tăng trưởng (không phải trong suốt thời gian nuôi cấy).

1.5.3.1. VSV phân giải lân vô cơ

Goldstein (1986) đã nghiên cứu đánh giá khả năng của các vi khuẩn khác nhau khi

hòa tan các hợp chất lân vô cơ khó tan như canxi phosp.hate và quặng apatit. Các vi

khuẩn Goldstein xác định có khả năng này là Pseudomonas, Bacillus, Rhizobium,

Burkholderia, Achromobacter, Agrobacterium, Microccocus, Aereobacter,

Flavobacterium và Erwinia.

Khả năng phân giải các loại lân vô cơ của các vi khuẩn khác nhau là khác nhau.

Theo nhiều nghiên cứu thì có thể thấy Bacillus, Rhizobium, Pseudomonas là một trong

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

những vi khuẩn có khả năng phân giải lân vô cơ mạnh nhất (Arora và Gaur, 1979;

Illmer và Schinner, 1992; Halder và Chakrabartty, 1993; Rodríguez và Fraga, 1999).

Phân tích dịch nuôi cấy của các VSV có khả năng hòa tan lân đã cho thấy sự hiện

diện của số lượng các acid hữu cơ như malic, glyoxalic, succinic, fumaric, tartaric,

alpha keto butyric, oxalic, citric, acid 2-ketogluconic và gluconic (Lapeyrie et al, 1991;

Cuningham và Kuaick, 1992; Illmer et al, 1995; Fasim et al, 2002; Kim et al, 1997).

Trong số đó, acid gluconic có vẻ là tác nhân thường gặp nhất của quá trình hòa tan lân

vô cơ. Các vi khuẩn sinh acid gluconic đã được báo cáo là Pseudomonas sp. (Illmer và

Schinner, 1992), Erwinia herbicola (Liu et al, 1992), Pseudomonas cepacia (Goldstein

et al, 1993). Chủng vi khuẩn Bacillus liqueniformis và Bacillus amyloliquefaciens đã

được xác định là có khả năng sản xuất hỗn hợp các acid lactic, isovaleric, isobutyric,và

acid acetic có vai trò tham gia vào quá trình hòa tan lân vô cơ khó tan (Rodríguez và

Fraga, 1999).

1.5.3.2 VSV phân giải lân hữu cơ

Sự tồn tại của các vi khuẩn sinh enzyme phosphatase khoáng hóa được lân hữu cơ

trong đất đã được nhiều công trình nghiên c ứu đề cập đến (Greaves và Webley, 1965;

Raghu và MacRae, 1966; Bishop et al, 1994; Abd-Alla, 1994).

Qua nghiên cứu hoạt động phân giải lân hữu cơ của các enzyme phosphatase khác

nhau ở vùng rễ ngô, lúa mạch, lúa mì, Burn (1983) đã nhận thấy hoạt tính của các

phosphatase mạnh nhất ở đất chua đến trung tính.

Các vi khuẩn sinh enzyme phosp.hatase có vai trò quan trọng để phân giải lân hữu

cơ có thể kể đến là Rhizobium (Abd-Alla, 1994), Pseudomonas (Gügi và et al, 1991),

Bacillus (Skrary và Cameron, 1998).

1.6 Khả năng sinh IAA

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

1.6.1 Lịch sử nghiên cứu IAA

Darwin (1880) khảo sát hiện tượng quang hướng động, ông thấy ngọn diệp tiêu

hướng về phía có ánh sáng và khi che ngọn lại thì không có hiện tượng này, từ đó ông

cho rằng có một chất gì đó ở ngọn diệp tiêu điều khiển sự vân động này.

Paal (1914- 1919) đã khảo sát ảnh hưởng tương quan giữa đỉnh diệp tiêu và thân

diệp tiêu:

Nếu cắt ngọn diệp tiêu thì thân diệp tiêu không kéo dài

Nếu cắt ngọn diệp tiêu thì thân diệp tiêu sẽ dài ra

Nếu gắn ngọn diệp tiêu lệch một bên thì bên đó sẽ kéo dài bên còn lại thì không

Như vậy, có một chất gì đó ở ngọn diệp tiêu và di chuyển xuống dưới điều khiển sự

kéo dài thân diệp tiêu phần bên dưới.

Boysen-Jensen (1913) ngăn cách chớp diệp tiêu bằng miếng mica hoặc kim loại thì

thân diệp tiêu cũng không dài ra. Nếu thay miếng mica bằng một miếng agar mỏng thì

thân diệp tiêu sẽ dài ra và nếu lấy miếng agar có gắn chớp diệp tiêu đặt lên trên một

diệp tiêu khác đã bị cắt chớp thì diệp tiêu sau này cũng dài ra. Ông khẳng định một lần

nữa là có một chất gì đó ở ngọn diệp tiêu và di chuyển xuống dưới điều khiển sự kéo

dài thân diệp tiêu phần bên dưới.

Went (1926) đặt chớp diệp tiêu lên khối agar sau đó lấy khối agar đặt lại trên thân

diệp tiêu thì thân cũng vươn dài. Nếu miếng agar đặt lệch thì thân diệp tiêu cũng phát

triển lệch. Thí nghiệm này một lần nữa chứng minh giả thuyết trên là đúng. Went đ ặt

tên cho chất đó là Auxin.

Koll (1934) đã xác định được công thức hóa học của Auxin và gọi tên là Indole

acetic acid (IAA). Auxin tồn tại trong cây bằng nhiều hình thức khác nhau như: Auxin

tự do, tiền auxin và auxin liên kết (Lê Văn Bé, 2008).

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

1.6.2 Khái niệm:

Auxin là hormone tăng trưởng thực vật hiệu quả nhất và IAA là loại auxin phố biến

nhất. IAA được tổng hợp từ tiền chất L-tryptophan. Sự sinh tổng hợp IAA của hệ vi

sinh vùng rễ đóng vai trò quan trọng đối với sự phát triển của cây. Một số loài của các

giống Azospirillum, Gluconacetobacter và Pseudomonas là những vi khuẩn cố định

đạm nhưng nhờ vào khả năng tổng hợp IAA của chúng cũng nên cũng được xem là vi

khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng thực vật, góp phần làm tăng sản lượng cây trồng

(Kloepper et al, 1989).

Auxin có tác dụng sinh lý đến quá trình sinh trưởng của tế bào, hoạt động của tầng

phát sinh, sự hình thành rễ, hiện tượng ưu thế ngọn, tính hướng của thực vật, sự sinh

trưởng của quả và tạo quả không hạt. Auxin kích thích sự sinh trưởng giãn của tế bào,

đặc biệt giãn theo chiều ngang của tế bào làm tế bào to về chiều ngang, vì vậy làm cho

các bộ phận của cây to về bề ngang.

IAA (acid indole-3- acetic), trong thực vật IAA có thể tồn tại ở dạng tự do hoặc liên

kết với glucose hay peptide. IAA và các dẫn xuất của nó thường được gọi là auxin hay

hormone sinh trưởng, đây là hormone thực vật được biết sớm nhất.

Ở thực vật bậc cao, IAA tập trung nhiều trong các chồi, là đang sinh trưởng, trong

tầng phát sinh, trong hạt đang lớn, trong phấn hoa. IAA được tổng hợp tại đỉnh sinh

trưởng của thân. Trong cây IAA di chuyển từ đỉnh xuống gốc với tốc độ 10-15mm/giờ.

IAA (acid indole-3- acetic) thuộc nhóm phytohormones và thường được gọi là

nguồn gốc quan trọng nhất trong nhóm auxin. Nó ho ạt động như một phân tử tín hiệu

quan trọng trong việc điều tiết sự phát triển thực vật bao gồm cả sinh cơ quan, đáp ứng

với môi trường, phản ứng của tế bào chẳng hạn như tăng kích thước của tế bào, phân

chia, phân biệt và điều hòa gen (Ryu và Patten, 2008). Có rất nhiều loài vi khuẩn có

khả năng tạo ra IAA - hormone thực vật nhóm auxin. Con đường sinh tổng hợp tạo ra

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

IAA đã được xác định lượng IAA dư thừa từ sinh tổng hợp đã tạo nên sự tương tác

giữa thực vật và vi khuẩn. Tương tác giữa vi khuẩn có khả năng tổng hợp IAA và thực

vật dẫn đến sự thay đổi về bệnh lý trong miễn dịch thực vật. Xem xét vai trò của thực

vật có khả năng sinh IAA trong tương tác của chúng với thực vật cho thấy vi khuẩn sử

dụng hormone thực vật này để tương tác dịch với thực vật như một phần chiến lược để

xâm nhập vào bên trong tế bào thực vật của chúng như là sự khắc phục của cơ chế

miễn thực vật cơ bản. Hơn nữa, vài báo cáo gần đây cho thấy IAA cũng có thể là phân

tử báo hiệu trong vi khuẩn và do đó có thể ảnh hưởng trực tiếp đối với sinh lý học vi

khuẩn (Spaepen et al, 2007). Có nhiều hệ vi thực vật đất có khả năng tổng hợp auxin

hoàn toàn cả khi ở trong đất hay trong nuôi cấy. Tiềm năng tổng hợp auxin bởi vi

khuẩn vùng rễ có thể được sử dụng như một công cụ sàng lọc có hiểu quả chủng PGPR

(Khalid et al, 2004).

1.6.3 Vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng cây trồng (PGPR)

PGPR (Plant Growth Promoting Rhizobactera) được gọi là những chủng vi khuẩn

vùng rễ thúc đẩy sự tăng trưởng thực vật. Nhóm vi khuẩn tổng hợp IAA là nhóm vi

khuẩn vùng rễ đang được nghiên cứu hiện này nhằm cải thiện tỷ lệ nảy mầm hạt giống,

chất lượng cây trồng thông qua sự thúc đẩy nảy mầm, tăng chiều cao của cây, tăng

chiều dài và diện tích bề mặt rễ, do đó cho phép các loài thực vật dễ hấp thụ chất dinh

dưỡng và nước từ đất.

Sự phát triển của thực vật trên nền đất nông nghiệp chịu ảnh hưởng của nhiều yếu

tố vô sinh và hữu sinh. Khái niệm vùng rễ lần đầu tiên được giới thiệu bởi Hiltner để

mô tả các vùng hẹp của đất xung quanh rễ, nơi dân số vi khuẩn được kích thích phát

triển bởi sự hoạt động của rễ (Hiltner, 1904).

Theo McCully (2005), vùng rễ bao gồm đất xung quanh rễ cũng như các nhân tố

vật lý, hóa học, sinh học, ở trong đấy đã được thay đổi bởi hoạt động của rễ. Ngoài một

số lượng các vi khuẩn còn có các vi sinh vật khác như nấm, động vật nguyên sinh và

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

tảo cùng tồn tại trong vùng rễ. Để hỗ trợ cho các hoạt động của những vi khuẩn có lợi

cho vùng rễ của mình, thực vật sẽ giải phóng các hợp chất hữu cơ thông qua dịch tiết

(Lynch, 1990) tạo ra một môi trường sống rất chọn lọc (Garcia et al, 2001).

Theo Hallmann et al (1997) liên tục thấy sự tồn tại của vi khuẩn trong đ ất vùng rễ,

bề mặt rễ và nội bào của các mô thực vật. Sự tương tác kết hợp của thực vật và vi sinh

vật như một kết quả của đồng tiến hóa, việc sử dụng các nhóm vi khuẩn sau để sản xuất

những chế phẩm sinh học phải được điều chỉnh trước, để nó phù hợp với một hệ thống

nông nghiệp bền vững lâu dài. PGPR thường được sử dụng như những chế phẩm sinh

học để cải thiện tốc độ tăng trưởng và năng suất của cây trồng nông nghiệp, chúng như

một biện pháp khả thi để thay thế phân hóa học, thuốc trừ sâu, và các chất kích thích

(Ashrafuzzaman et al, 2009). Việc sử dụng phân bón sinh học và chất tăng trưởng sinh

học từ vi khuẩn cố định cũng như lợi ích vi sinh vật mang lại có thể làm giảm lượng sử

dụng phân bón hóa học do đó chi phí sản xuất thấp hơn. Không chỉ có vậy, việc sử

dụng PGPR để tăng năng suất thay thế phân bón hóa học còn giúp giảm thiểu ô nhiễm

và bảo vệ môi trường, hướng đến một nền nông nghiệp sinh thái (Stefan et al, 2008).

Do đó vi khuẩn vùng rễ là một tác nhân tiềm năng cho sự thúc đẩy tăng trưởng thực

vật trong nông nghiệp (Chaiharn et al, 2008), được sử dụng như những chế phẩm sinh

học để cải thiện tốc độ tăng trưởng và năng suất của cây trồng nông nghiệp. PGPR

hoặc sự kết hợp của PGPR và AMF (Arbuscular mycorrhiza fungi-nấm vùng rễ

Arbuscular) có thể nâng cao hiệu quả sử dụng chất dinh dưỡng của phân bón và cho

phép áp dụng tỷ lệ giảm phân bón hóa học (Adesemoye et al, 2009). Việc sử dụng

PGPR phân lập được như những chế phẩm phân bón sinh học có lợi cho canh tác lúa

giúp tăng cường sự phát triển của lúa bằng cách thúc đẩy tăng trưởng những chỉ tiêu

sinh lý khác. Ứng dụng sự tương tác kết hợp của PGPR như phân sinh học ảnh hưởng

đến năng suất và có lợi cho tăng trưởng của đậu chickpea trong điều kiện thực nghiệm

(Rokhzadi et al, 2008).

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Tầm quan trọng của vi khuẩn vùng rễ từ lâu đã được công nhận, tuy nhiên, vi

khuẩn vùng rễ chỉ là một phần nhỏ trong tổng số 3 dạng sinh học đất. Có 1 nhóm vi

khuẩn đất trong các thập niên gần đây đang được các nhà khoa học tập trung nghiên

cứu là nhóm vi khuẩn được gọi là vi khuần vùng rễ thúc đẩy tăng trưởng thực vật

(PGPR). Vi khuẩn vùng rễ thúc đẩy tăng trưởng thực vật là vi khuẩn cư ngụ ở rễ cây

chúng có khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật, làm giảm bệnh hoặc các thiệt hại do

côn trùng. PGPR đã và đang được quan tâm nghiên cứu rất nhiều và nhiều sản phẩm

của nó đã được thương mại hóa phục vụ cho sản xuất nông nghiệp (Antoun và

Kloepper, 2001). Ví dụ, chi Rhizobium là nhóm vi khuẩn vùng rễ được biết đến rộng

rãi nhất và nó đã được thương mại hóa thành công với nhiều ứng dụng thực tế trong

nông nghiệp theo nguyên lý phát triển cộng sinh với thực vật (Saharan et al, 2011).

1.6.4 Các chủng vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng cây trồng (PGPR)

Vào đầu những thế kỷ này, mặc dù có rất nhiều loại vi khuẩn liên kết hay cộng sinh

với thực vật từ đó kiểm soát sự sinh trưởng của thực vật nhưng chúng lại chưa được

nghiên cứu rộng rãi cho đến khi các công bố mang tính đột phá về sự tương tác của vi

khuẩn đến thực vật những nghiên cứu của Bashan và Holguin (1998), sự phát hiện vi

khuẩn Pseudomonas có khả năng kiểm soát các mầm bệnh và gián tiếp điều khiển thực

vật của Kloeppeer và cộng sự (1980) hay việc tìm thấy Azosprillum sp., loài vi khuẩn

sống tự do tăng nhanh xung quanh vùng rễ của cây trồng nhiệt đới (Maria và cs, 2002).

Một số loài vi khuẩn thuộc chi Azospirillum, Alcaligenes, Arthrobacter,

Acinetobacter, Bacillus, Burkholderia, Enterobacter, Erwinia, Flavobacterrium,

Pseudomonas, Rhizobium, Serratia liên quan đến rễ cây và có gây ra các tác dụng có

lợi đối với sự tăng trưởng của thực vật (Egamberdiyeva, 2005). Thành phần dịch tiết ở

rễ của từng loài thực vật đóng vai trò quan trọng trong việc lựa chọn và làm phong phú

thêm các loại vi khuẩn. Vì vậy, cộng đồng vi khuẩn trong vùng rễ phát huy tùy theo

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

tính chất và nồng độ các hợp chất hữu cơ của dịch tiết cũng như khả năng tương ứng

của vi khuẩn để sử dụng như các nguồn năng lượng đó (Curl và Truelove, 1986).

1.7 Tình hình nghiên cứu sửu dụng Bacillus spp. ứng dụng vào sản xuất nông

nghiệp

1.7.1 Nghiên cứu nước ngoài

Năm 2007, Edgecomb và Manker nghiên cứu thành công chế phẩm vi sinh từ

Bacillus có mật độ là 1x109 CFU/ml hay CFU/g. Khi dùng sẽ được pha loãng theo

khuyến cáo của nhà sản xuất, thời gian bảo quản dưới 2 năm. Chế phẩm này có thể

được pha chung với thuốc trừ nấm hóa học mà vẫn giữ được hiệu quả đối kháng.

Năm 2006, S.A.El-Hassan và S.R.Gowen đã nghiên cứu về thời gian bảo quản chế

phẩm Bacillus subtilis với glucose, bột hoạt thạch (talc) và than bùn để trừ bệnh héo rũ

trên cây đậu, kết quả sau 30 ngày bảo quản mật độ Bacillus subtilis trên glucose, bột

hoạt thạch tương đối cao so với chế phẩm từ than bùn tương ứng là 10,6; 10,3 và 8,83

log10 CFU/g. Sau 240 ngày, tổng mật độ giảm xuống 9,4; 8, 9 và 5,2 log10 CFU/g và

đến ngày thứ 360, mật độ bào tử chỉ còn 8,6; 7,8 và 3,5 log10 CFU /g tương ứng của

chế phẩm glucose, talc và than bùn. Các kết quả cho thấy chế phẩm Bacillus Subtilis từ

glucose và bột hoạt thạch có thời gian bảo quản lâu hơn chế phẩm từ than bùn khi bảo

quản ở nhiệt độ phòng.

Năm 2013, N. Ashwini và cộng sự đã sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis làm tác nhân

đối kháng sinh học phòng ngừa bệnh thán thư trên ớt do chủng C.gloeosporioies OGC1

là tác nhân. Vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng đối kháng với nhiều tác nhân gây

bệnh trong điều kiện in vitro từ 41-57%. Trong thí nghiệm xử lý hạt giống với tác nhân

gây bệnh và vi khuẩn đối kháng cho hiệu quả kháng bệnh trên 87,5%, tỷ lệ nảy mầm

đạt 85%, so với đối chứng không dùng vi khuẩn Bacillus subtilis thì mức độ nhiễm

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

bệnh trên 77,5% và chỉ 1% hạt giống nảy mầm được thành cây. Điều này cho thấy hiệu

quả trong phòng ngừa bệnh thán thư của vi khuẩn Bacillus subtilis là rất khả quan.

Nan Zhang và ctv (2011) đã dùng Bacillus subtilis N11 phối vào phân bón sinh

học BIO2 nhằm kiểm soát nấm Fusarium gây ra bệnh héo chuối, kết quả cho thấy

BIO2 làm giảm đáng kể tỷ lệ mắc Fusarium gây héo so với nhóm đối chứng.

Một nghiên cứu khác cũng liên quan tới bệnh héo chuối do nấm Fusarium

oxysporum gây ra của Beibei Wang và ctv (2012) trong nghiên cứu này 57 chủng vi

khuẩn được phân lập từ rễ cây chuối khỏe mạnh, kết quả cho thấy dòng Bacillus

amyloliquefaciens W19 cho thấy có thể làm giảm đáng kể Fusarium gây héo và thúc

đẩy sự phát triển của cây chuối khi kết hợp với phân hữu cơ.

Viện nghiên cứu Nông nghiệp Ấn Độ đã sử dụng phosphobacterium trên lúa mì,

đại mạch, ngô, rau quả cho thấy các cây trồng đều phản ứng tích cực với việc tẩm

nhiễm VSV phân giải lân, làm tăng năng suất và khả năng sử dụng lân, đồng thời nâng

cao chất lượng sản phẩm.

Theo Gaur và Alagawadi (1992) nhiều kết quả khoa học đã chứng minh ở Liên

Xô, năng suất cây trồng tăng 5-10% và có trường hợp đạt 30% khi sử dụng Bacillus

megateirum var phosphaticum phân giải lân, hiệu quả này tương ứng ở Ấn Độ là 10-

20%. Nhưng sản phẩm này đã không đạt hiệu quả tương ứng với đất tại Hoa Kỳ (Smith

và cộng sự, 1962). Chắc rằng trong trường hợp này tính chất của đất là một trong

những yếu tố quyết định hiệu quả của VSV phân giải lân.

1.7.2 Nghiên cứu trong nước

Theo Đỗ Thị Huỳnh Mai, Nguyễn Thị Liên (2014), đã phân lập được 26 dòng vi

khuẩn Bacillus spp. có khả năng đối kháng với nấm Neoscytalidium dimidiatum gây

bệnh đốm trắng từ vùng đất trồng lan Ngọc điểm của 7 mẫu đất được thu tại Cần Thơ,

Vĩnh Long và Bến Tre. Các dòng vi khuẩn phân lập được có hiệu lực đối kháng với

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

nấm gây bệnh dao động từ 62,2 – 79,2% sau 4 ngày chủng vi khuẩn. Dòng vi khuẩn

đối kháng cao nhất là SH8 với hiệu lực đối kháng là 79,2%. Qua khảo sát các cơ chế

đối kháng, kết quả thu được có 21/26 dòng vi khuẩn có khả năng sản sinh siderophore,

25/26 dòng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose, 25/26 dòng vi khuẩn có khả năng

phân giải chitin, 26/26 dòng vi khuẩn có khả năng phân giải protein.

Hồ Thị Mỹ Hồng, Nguyễn Thanh Bình ở trung tâm ứng dụng sinh học Hà Nội đã

sản xuất chế phẩm subtin từ Bacillus subtilis để phòng trừ nấm bệnh Ostriniaa

furnacalis trên bắp.

Noriokimura Yokohamo (1940) đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Kumura từ

Bacillus subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng nấm Aspergillus

Flavus, A. paraciticus.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1Thời gian và địa điểm nghiên cứu

-Thời gian: Đề tài này được thực hiện từ tháng 1/2018 đến tháng 7/2018

-Địa điểm: Đề tài này được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh Viện Khoa học Ứng

Dụng Hutech, trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Vật liệu:

Nguồn mẫu 1: Mẫu đất lấy từ cây thanh long bệnh được trồng tại Xã Song Phú, Huyện

Tam Bình, tỉnh Vĩnh Long.

Nguồn mẫu 2: Mẫu đất lấy từ cây thanh long bệnh được trồng tại Xã Hàm Chính,

Huyện Hàm Thuận Bắc, tỉnh Bình Thuận.

Nguồn mẫu 3: Mẫu đất lấy từ cây cà phê được trồng tại xã Xuân Bảo, Huyện Cẩm Mỹ,

tỉnh Đồng Nai.

Nguồn mẫu 4: Mẫu đất lấy từ cây thanh long được trồng tại huyện Chợ Lách, tỉnh Bến

Tre.

- Chủng Bacilus subtilis và Lactobacilus sp. do trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp

Nông nghiệp Công nghệ cao, Khu Nông nghiệp Công nghệ cao cung cấp dùng làm đối

chứng dương và đối chứng âm.

2.2.2 Hóa chất

NaNO3

K2HPO4

MgSO4.7H2O

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

FeSO4.7H2O

KCl

Chitin

Tinh bột

CMC

Lugol

Malachite Green 5%

NaCl

NaOH 1N

KOH 40%

Gelatin

HCl 1N

Glycerol 40%

Cồn

Nước cất

Thuốc thử Kovac’s

Thuốc thử Methylred

2.2.3 Môi trường

Môi trường Nutrient Broth - NB (g/l)

Meat extract 3,0

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Pepton 5,0

Môi trường Pikovskaya - P (g/l)

Glucose 10,0

Ca3(PO4)2 5,0

(NH4)2SO4 0,5

KCl 0,2

NaCl 0,2

MgSO4.7H2O 0,1

MnSO4 0,001

FeSO4 0,001

Yeast extract 0,5

Các loại môi trường tổng hợp:

Môi trường Potato Dextrose Agar – PDA

Môi trường Simmon Citrate Agar - SCA (thử nghiệm biến dưỡng citrate)

Môi trường Methyl Red Voges Proskauer Broth (MR-VP Broth)

2.3.Thiết bị và dụng cụ

2.3.1 Thiết bị

Tủ cấy vi sinh

Tủ lạnh

Tủ ấm

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Bếp từ

Máy quang phổ

Nồi hấp Autoclave

Bể điều nhiệt

Máy lắc

Máy ly tâm

Kính hiển vi

Cân phân tích

2.3.2 Dụng cụ

Ống nghiệm

Đèn cồn

Đĩa petri

Dụng cụ đục lỗ thạch

Đũa thủy tinh

Bông thấm nước

Ống ly tâm

Bông không thấm

Giấy đo pH

Cốc thủy tinh các loại

Ống đong các loại

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Chai thủy tinh

Pipette thủy tinh 1ml, 5ml, 10ml

Que cấy vòng

Erlen 100ml, 500ml, 1000ml

Que cấy thẳng

Chai đun môi trường 200ml, 500ml

Que cấy trang

Micropipette 100µl, 1000µl

2.4 Bố trí thí nghiệm

2.4.1 Bố trí thí nghiệm

MẪU ĐẤT

PHÂN LẬP

TEST SINH HÓA

KHẢO SÁT CÁC ĐẶC ĐIỂM CÓ LỢI

PHÂN GIẢI LÂN

SINH IAA

SINH ENZYME NGOẠI BÀO

ĐỐI KHÁNG NẤM

Fusarium sp.

CHITINASE

Neoscytalidium dimidiatum

CELLULASE

Bảo quản sau thu hoạch thanh long

Trồng ớt

Đánh giá, tuyển chọn các chủng có ưu điểm vượt trội

Các chủng VSV có khả năng bảo quản sau thu hoạch thanh long, phòng trừ nấm Fusarium trên cây ớt và kích thích tăng trưởng

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Hình 2.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

2.4.2 Thuyết minh quy trình:

Mẫu đất sau khi thu từ các nguồn đất nông nghiệp sẽ tiến hành phân lập trên môi

trường NA. Sau 48h nuôi cấy trên môi trường NA, tiến hành quan sát những khuẩn lạc

đặc trưng của Bacillus, các khuẩn lạc được chọn sẽ tiến hành cấy ria nhiều lần để làm

thuần và test một số thử nghiệm sinh hóa theo kháo phân loại Bergy (1974) nhằm định

danh sơ bộ các chủng thuộc chi Bacillus spp. Sau khi định danh sơ bộ các chủng được

lựa chọn sẽ tiến hành khảo sát các đặc điểm có lợi như: Khả năng sinh enzyme ngo ại

bào bao gồm enzyme chitinase và cellulase, khả năng đối kháng các lo ại nấm bệnh như

Fusarium sp., Neoscytalidium Dimidiatum, kế tiếp là khảo sát khả năng sinh IAA và

phân giải lân khó tan. Sau khi tiến hành các thí nghiệm đối kháng nấm bệnh, các chủng

có ưu thế vuột trội sẽ được lựa chọn thử nghiệm in vivo. Đối với chủng nấm

Neoscytalidium dimidiatum, tiến hành khảo sát khả năng đối kháng nấm bệnh của các

chủng vi khuẩn trên trái thanh long nhằm ứng dụng bảo quản sau thu ho ạch thanh

long. Đối với chủng nấm Fusarium sp, khảo sát khả năng đối kháng nấm bệnh của các

chủng vi khuẩn thông qua thí nghiệm trồng ớt và theo dõi sự phát triển của cây ớt.

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Phương pháp lấy mẫu

Mẫu đất được lấy tại các vùng đất nông nghiệp, mẫu đất trồng lấy ở tầng mặt, độ sâu

20-30cm

Lượng mẫu khoảng 300g - 500g. Mẫu được đựng trong túi PE đã được khử trùng, dụng

cụ lấy mẫu phải được làm sạch sau mỗi lần lấy để tránh tạp nhiễm giữa các mẫu với

nhau.

Mẫu đất sau khi thu được ghi đầy đủ các thông tin: Ngày tháng l ấy mẫu, địa diểm lấy

mẫu.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

2.5.2 Phương pháp pha loãng

Mục đích:

Làm giảm mật độ vi khuẩn có mặt trong dịch tăng sinh mẫu hay dịch đồng nhất mẫu

giúp cho việc phân lập riêng rẽ từng khuẩn lạc tế bào được dễ dàng hơn.

Nguyên tắc:

Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhất trong phương pháp phân tích

vi sinh nhưng rất quan trọng, việc pha loãng mẫu ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả thí

nghiệm, khi mẫu được pha loãng đến nồng độ thích hợp sẽ thuận lợi cho người phân

tích vi sinh đọc kết quả hay thực hiện các phân tích định lượng một cách dễ dàng nhất

có thể.

Phương pháp:

Phương pháp này chỉ dùng trong trường hợp vi sinh vật phân bố nhiều trong mẫu và để

định lượng vi sinh vật trong mẫu thí nghiệm.

Dung dịch pha loãng là nước muối sinh lý

Chuẩn bị sẵn dung dịch nước muối sinh lý 0,9% và phối vào chính xác 9 ml vào

mỗi ống nghiệm có nút đậy rồi đem hấp khử trùng.

Dùng micropipette hút 1ml dung dịch cần pha loãng cho vào ống nước muối sinh

lý đã chuẩn bị vô trùng để pha loãng và tiến hành thao tác pha loãng đến một dãy nồng

độ nhất định thích hợp. Ống nước muối sinh lý đã hút 1ml dung dịch cần pha loãng vào

sẽ là ống có nồng độ pha loãng là 10-1, pha loãng tiếp sẽ là 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6….

2.5.3 Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn

Huyền phù mẫu: cân 5g đất cho vào ống phancon chứa 45ml nước muối sinh lý

0.9% đã được hấp khử trùng, lắc đều.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Xử lý nhiệt: đặt ống phancon chứa huyền phù mẫu đất ở 800C với thời gian 20

phút trong bể điều nhiệt ủ để diệt bớt những vi khuẩn không có khả năng chịu nhiệt và

các tế bào không sinh bào tử.

Dùng micropipette hút 0,1ml dịch mẫu từ các ống nghiệm đã được pha loãng ở các

nồng độ 10-3, 10-4, 10-5, dùng que cấy trang trang đều dịch mẫu trên môi trường NA

cho đến khi bề mặt môi trường thật khô, dùng paraphin quấn quanh vành đĩa để tránh

tạp nhiễm. Để yên khoảng 60 phút rồi đặt úp đĩa xuống, quấn paraphin quanh đĩa để

tránh nhiễm từ bên ngoài. Ủ ở nhiệt độ phòng. Sau 48h, quan sát khuẩn lạc đặc trưng.

Sau 2 ngày nuôi cấy, tiến hành quan sát hình thái khuẩn lạc. Chọn những khuẩn lạc

có hình dạng đặc trưng và mọc riêng lẽ để quan sát: Khuẩn lạc có màu vàng xám, dạng

hình tròn, tâm sẫm màu, viền nhăn, bề mặt phẳng hoặc hơi sần sùi, khô, đường kính từ

3-7mm để cấy ria trên môi trường NA tạo dòng vi khuẩn được phân lập từ khuẩn lạc

đơn.

Làm thuần: Sau khi cấy ria lần thứ nhất, tiến hành chọn khuẩn lạc đơn trong đĩa

cấy tiếp tục thực hiện cấy ria cho đến khi các khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa cấy có cùng

hình dạng và kích thước.

2.5.4 Phương pháp tăng sinh

a. Mục đích:

Phương pháp này nhằm giúp cho vi khuẩn hồi phục khả năng sinh trưởng để phát

triển bình thường trong môi trường nuôi cấy tiếp theo giúp làm ổn định giống và nâng

cao tính chính xác của các thí nghiệm.

b. Phương pháp:

Môi trường NB được sử dụng để làm môi trường tăng sinh. Môi trường này được

hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút ở 1atm. Thực hiện thao tác trong điều kiện vô

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

trùng, cho 1ml chủng vi khuẩn trong eppendorf hay 1ml dịch nuôi cấy trong môi

trường tăng sinh trước đó hoặc dùng que cấy ria lấy 1 khuẩn lạc riêng rẽ cho vào chai

môi trường NB, ủ và lắc ở 150 vòng/ phút trong 24 giờ trước khi đưa vào thí nghiệm

chính.

2.5.5 Phương pháp quan sát hình thái tế bào

2.5.5.1 Nhuộm Gram

Các chủng sau khi được làm thuần bằng phương pháp cấy ria được quan sát hình

thái vi thể bằng phương pháp nhuộm gram để xác định từng chủng vi khuẩn này thuộc

nhóm Gram dương hay Gram âm. Chúng được tăng sinh trong môi trường thích hợp

trong 18-24 giờ, lắc 150 vòng/ phút ở điều kiện nhiệt độ phòng.

Kỹ thuật nhuộm Gram: Phương pháp Hucker cải tiến theo Nguyễn Lân Dũng và

cộng sự, 2001.

- Làm tiêu bản: dùng que cấy lấy sinh khối làm vết bôi trên lame, hơ khô trong không

khí. Vết bôi sẽ được cố định vào phiến kính bằng cách hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn

2-3 lần. Mục đích của việc cố định vết bôi nhằm: giết chết vi khuẩn, gắn chặt vi khuẩn

vào lam kính và làm vết bôi bắt màu tốt hơn vì các tế bào chết bắt màu tốt hơn các tế

bào sống.

- Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm Crystal violet trong 30 giây.

- Rửa nước

- Nhuộm lugol trong 1 phút.

- Rửa nước.

- Tẩy cồn 96 0 trong 20-30 giây, để nghiêng tiêu bản và nhỏ từng giọt cồn cho đến khi

tan hết màu.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

- Rửa nước.

- Nhuộm bổ sung Fushin hoặc Safranin từ 10-30 giây.

- Rửa nước.

- Để khô và quan sát dưới kính hiển vi.

2.5.5.2 Nhuộm bào tử

- Vi sinh vật được nhuộm bào tử để xác định khả năng sinh bào tử của chúng, nếu

chúng có khả năng sinh bào tử chứng tỏ chúng có thể là Bacillus sp.p. và ngược lại thì

không. Cấy ria hoặc trang vi khuẩn từ đĩa khuẩn lạc thuần nhất sang đĩa môi trường

NA mới và tiến hành đem ủ ở 370C trong 7-10 ngày với mục đích cho vi khuẩn sinh

bào tử. Quy trình nhuộm bào tử được thực hiện theo phương pháp của Nguyễn Lân

Dủng và Đinh Thúy Hằng (2006).

- Dùng que cấy vòng vô trùng lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc riêng lẻ để làm vết bôi

trên lame.

- Cố định vết bôi bằng ngọn lửa đèn cồn.

- Đặt một cốc nước lên bếp từ và đun từ từ đến khi đạt khoảng 800C nhằm tăng độ hấp

thụ malachite Green c ủa bào tử rồi đặt một tấm giấy lọc lên miệng cốc. Đặt lame có vết

bôi lên trên tấm giấy lọc và đặt thêm 1 tấm giấy lọc nữa lên vết bôi, nhỏ từ từ

malachite green 5% lên phía trên vết bôi và luôn giữ cho chúng không bị khô trong

vòng 5 phút nhuộm. Rửa vết bôi bằng nước cất khoảng 30 giây. Nhuộm bổ sung với

thuốc nhuộm Fushin trong khoảng 60 - 90 giây rồi rửa lại bằng nước cất.

- Thấm khô và quan sát dưới vật kính 100x cùng dầu soi kính.

2.5.6 Phương pháp xác định đặc điểm sinh hóa

2.5.6.1 Khả năng di động

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

a. Mục đích: Xác định khả năng di động của VSV.

b. Nguyên tắc: VSV di động nhờ cấu trúc protein gọi là tiên mao (flagella) có ở nhiều

vi khuẩn hình que, một số vi khuẩn hình cầu. Khả năng di động là một trong những căn

cứ có thể dùng để phân biệt VSV. Khả năng này có thể được quan sát dựa vào sự tăng

trưởng và di động của VSV vào bên trong môi trường thạch mềm.

c. Tiến hành

- Cấy đâm sâu VSV vào môi trường thạch mềm (0,5% agar).

- VSV di động sẽ làm môi trường đục, phát triển lan ra khỏi vết cấy.

- VSV không di động sẽ phát triển quanh đường cấy, môi trường không bị đục.

2.5.6.2 Thử nghiệm catalase

Quy trình được thực hiện theo Sharmin và Rahman (2007)

a. Mục đích: Định tính khả năng sinh enzyme catalase của VSV.

b. Nguyên tắc: Các VSV hiếu khí và kị khí tùy ý chứa chuỗi truyền điện tử

cytochrome đều có enzyme catalase. Enzyme này là một trong những enzyme

có vai trò bảo vệ tế bào khỏi các tổn thương bởi các dẫn xuất có độc tính cao

của oxy phân tử trong tế bào hiếu khí và kỵ khí tùy ý. Các VSV này có khả năng

biến dưỡng năng lượng theo phương pháp hô hấp với oxy là chất nhận điện tử

cuối cùng trong chuỗi chuyển điện tử tạo H2O2. Catalase thủy phân hydrogen

peroxide (H2O2) thành H2O và O2 ngăn cản sự tích tụ phân tử có độc tính cao

này trong tế bào. Tuy nhiên, ngoài catal ase, nhiều enzyme peroxide khác trong

hệ thống các enzyme bảo vệ tế bào khỏi stress oxy hóa cũng có khả năng thủy

phân hydrogen peroxide. Các enzyme này cũng hiện diện ở các tế bào, VSV

hiếu khí và kị khí tùy ý có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

hô hấp hiếu khí. Sự thủy phân hydrogen peroxide sẽ giải phóng O2 được ghi

nhận qua hiện tượng sủi bọt khí.

c. Tiến hành:

- Tạo vết bôi VSV (lấy từ môi trường nuôi cấy thạch nghiêng) trên lam kính sạch.

- Nhỏ 1-2 giọt H2O2 30%.

- Quan sát sau 1-2 giây. Phản ứng (+): có bọt khí xuất hiện. Phản ứng (-): không có bọt

khí xuất hiện.

2.5.6.3 Thử nghiệm citrate

a. .Mục đích: Xác định khả năng của một số VSV sử dụng citrate như nguồn carbon

duy nhất cho hoạt động trao đổi chất.

b. Nguyên tắc: Sự biến dưỡng citrate bởi VSV sẽ tạo ra CO2 làm kiềm hóa môi trường.

Mặt khác mọi sinh vật có khả năng sử dụng citrate thường dùng ammonium làm nguồn

đạm duy nhất. Sự phân giải muối ammonium sinh NH3 làm kiềm hóa môi trường. Sự

gia tăng giá trị pH được chỉ thị bằng sự đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường. Tiến

hành: Chuẩn bị môi trường Simmons Citrate Agar với chỉ thị là bromothymol blue.

Dùng que cấy vô trùng cấy ria khuẩn lạc thuần lên bề mặt môi trường SCA trong đĩa

thạch. Ủ ở 300C trong 24-48 giờ, khi cần có thể để đến 4 ngày.

c. Kết quả: Phản ứng (-): môi trường giữ nguyên màu xanh lục. Phản ứng (+): môi

trường chuyển sang màu xanh dương

2.5.6.4 Thử nghiệm Indole

a. Nguyên tắc: Phát hiện khả năng của VSV có khả năng tạo vòng indol trong môi

trường canh trypton

b. Cơ sở sinh hóa:

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Tryptophan là một aminoacid có thể bị oxy hóa bởi một số VSV có hệ enzyme

tryptophanase tạo ra sản phẩm chứa gốc indol.

Các hợp chất trung gian trong quá trình thủy giải tryptophan là acid indolpyruvic từ đó

indol được hình thành thong qua khử amin, hình thành skatol (methyl indol) là quá

trình carboxyl của acid indol acetic.

Enzyme tryptophanase xúc tác phản ứng khử amin của tryptophan và tách nhân thơm

ra khỏi phân tử tryptophan hình thành indol. Việc phát hiện indol được thực hiện bằng

phản ứng giữa các phân tử này với các thuốc thử chứa p- dimethylaminobenzaldehyde

(p-DMAB). Nhân pyrol của indol chứa nhóm –CH2 sẽ kết hợp với nhân benzen của p-

DMAB tạo nên phức chất dạng quinone có màu đỏ.

c. Cách tiến hành:

VSV được nuôi trong môi trường canh trypton trong khoảng 24-48 giờ. Nhỏ vài giọt

ether để kéo indol lên bề mặt môi trường, thêm vài giọt thuốc thử Kovac’s hoặc thuốc

thử Erhlich. Quan sát sau vài phút.

d. Đọc kết quả:

Thử nghiệm (+): trên bề mặt môi trường xuất hiện vòng màu đỏ cánh sen.

Thử nghiệm (-): trên bề mặt môi trường không xuất hiện vòng màu đỏ

2.5.6.5 Thử nghiệm Methy Red

a. Nguyên tắc:

Nhằm xác định khả năng VSV sản xuất và duy trì các sản phẩm acid bên trong môi

trường trong quá trình lên men glucose.

b. Cơ sở sinh hóa

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Thử nghiệm Methy red dựa trên cơ sở sử dụng chất chỉ thị pH là methy red để nhận

biết lượng ion H+ có trong môi trường sau khi VSV lên men glucose. Hàm lượng H+ có

trong môi trường phụ thuộc vào tỷ lệ CO2 và H2, hàm lượng hai chất này lại phụ thuộc

vào con đường chuyển hóa của từng loại VSV.

Đối với các VSV đường ruột, thời gian nuôi cấy cho thử nghiệm này là từ 18-24 giờ.

Các VSV này đều tạo acid trong môi trường khi chúng bắt đầu phát triển.

Đối với các VSV cho phản ứng methyl red âm tính ngay ban đ ầu một lượng acid hình

thành trong môi trường nhưng kéo dài thời gian nuôi cấy → chuyển hóa các sản phẩm

acid này bằng các phản ứng decarboxyl tạo nên các sản phẩm trung tính như acetoin →

pH môi trường là trung tính.

Thử nghiệm methyl red phụ thuộc rất lớn vào thời gian nuôi cấy để xác định sự khác

nhau trong con đường chuyển hóa glucose. Thử nghiệm này được tiến hành trong 2-5

ngày ở 370C.

c. Cách tiến hành:

Nuôi cấy VSV trong môi trường glucose photphate (MR-VP broth) ủ trong khoảng 2-5

ngày. Thêm vài giọt thuốc thử methyl red pha theo tỷ lệ 0,1g trong 300ml cồn và cho

nước vào để đạt thể tích 500.

d.Đọc kết quả

Thử nghiệm (+): môi trường chuyển sang màu đỏ

Thử nghiêm (-): môi trường không đổi màu

2.5.6.6 Thử nghiệm VP:

a. Nguyên tắc: Phát hiện khả năng VSV tạo thành 1 số sản phẩm trung tính

acetylmethylcarbimol (acetoin) trong quá trình lên men glucose.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

b. Cơ sở sinh hóa:

Thử nghiệm VP nhằm xác định acetoin một sản phẩm trung tính trong quá trình trao

đổi glucose trong tế bào VSV. Ở tế bào VSV, sự phân hủy glucose tạo ra các sản phẩm

trung gian là acid pyruvic từ đó có thể chia VSV thành 2 nhóm theo 2 con đường

chuyển hóa pyruvic khác nhau như sau: nhóm trao đổi không tạo thành 2,3- butanediol

như E.coli là nhóm VP (-), và nhóm trao đổi tạo thành 2,3- butanediol, như Klebsiella

là nhóm VP (+). Tuy nhiên phản ứng VP nhằm mục đích phát hiện acetoin là một tiền

chất của 2,3-butanediol. Vì acetoin là tiền chất của 2,3- butanediol nên trong quá trình

nuôi cấy tích lũy rất ít. Để dễ dàng cho quá trình phát hiện, VSV phải được nuôi trong

điều kiện hiếu khí. Quá trình chuyển hóa aceoin và 2,3-butanediol là quá trình thuận

2,3- butanediol dehydrogenase

nghịch có thể biễu diễn như sau:

Diactyl reductase

2,3- butanediol ↔ acetoin

Để phát hiện acetoin trong quá trình nuôi cấy VSV, 𝛼 − 𝑛𝑎𝑝ℎ𝑡𝑜𝑙 được sử dụng như

một loại thuốc thử phát hiện trong môi trường kiềm mạnh được tạo ra KOH 40% được

cho vào môi trường thử nghiệm.

KOH 40%

Guanidine

Cơ chế phát hiện acetoin được biểu diễn như sau:

Trong pepton

glucose→acetoin+ → diacetyl → phức chất màu đỏ hồng

c. Tiến hành:

Cấy VSV vào môi trường MR-VP broth. Ủ ở nhiệt độ 370C trong 2-5 ngày. Thêm vào

canh khuẩn dung dịch thuốc thử 𝛼 − 𝑛𝑎𝑝ℎ𝑡𝑜𝑙 5% trong cồn và dung dịch KOH 40%

với tỷ lệ 3:1. Quan sát phản ứng xảy ra trong 5 phút.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

d.Kết quả:

Thử nghiệm (-): môi trường không đổi màu

Thử nghiệm (+): xuất hiện màu đỏ trên bề mặt môi trường.

Thử nghiệm thủy phân gelatin:

a. Nguyên tắc:

Thử nghiệm khả năng của VSV có thể tổng hợp các enzyme ngo ại bào làm thủy giải

gelatin.

b. Cơ sở sinh hóa:

Gelatin là một loại protein có kích thước phân tử lớn. VSV muốn sử dụng protein này

như một nguồn cung cấp năng lượng thì chúng phải có khả năng tổng hợp được các

enzyme ngoại bào phân giải gelatin thành các phân t ử nhỏ hơn hay monomer. Các

enzyme này thuộc nhóm galatinase được tiết ra từ bên ngoài tế bào.

c. Cách tiến hành

Để nhận biết được khả năng làm tan gelatin của VSV cơ chất này được thêm vào trong

môi trường nuôi cấy. Khi chưa cấy VSV vào, môi trường chứa gelatin sẽ ở dạng đông

đặc. Sau khi nuôi c ấy VSV có khả năng tiết gelatinase sẽ làm môi trường tan chảy

thành dạng lỏng

Phương pháp tiến hành như sau: Cấy đâm sâu VSV vào môi trường dinh dưỡng chứa

gelatin, ủ ống ở nhiệt độ phòng cùng với một ống nghiệm không chứa VSV trong 7-14

ngày. Cả 2 ống sau khi ủ được cho vào tủ lạnh qua đêm.

d. Đọc kết quả:

Thử nghiệm (+): môi trường bị tan chảy

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Thử nghiệm (-): môi trường vẫn đông

2.5.7 Phương pháp cấy chuyển để bảo quản giống

Phương pháp cấy chuyền này thực hiện trên môi trường thạch NA đối với vi khuẩn

Bacillus spp. Các môi trường phải được hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút trước khi

tiến hành thí nghiệm.

Dùng que cấy vòng vô trùng (hơ trên ngọn lửa đèn cồn) lấy sinh khối VSV cấy zich

zắc trên bề mặt môi trường thạch nghiêng. Đậy nút bông lại, quấn paraffin và ủ ở nhiệt

độ phòng trong 24 giờ, khi thấy xuất hiện khuẩn lạc thì chuyển ống nghiệm vào tủ lạnh

40C để giữ giống.

Phương pháp này được thực hiện định kỳ 1-2 tháng cấy chuyền một lần, đảm bảo

chủng vi khuẩn luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết và giống

không phải hoạt hóa trước khi nhân giống.

Ưu điểm: Phương pháp này có thể thực hiện áp dụng cho mọi loài vi sinh vật, ngoài ra

phương pháp này còn đơn giản, dễ thực hiện.

Khuyết điểm: Thời gian bảo quản ngắn, hao phí môi trường, công sức và thời gian cho

công việc. Nếu không duy trì được điều kiện tối ưu thì khả năng chủng giống sẽ thay

đổi phẩm chất ban đầu mà rất khó xác định được nguyên nhân trong quá trình c ấy

chuyền.

2.5.8 Phương pháp bảo quản giống bằng giữ lạnh

Song song với phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng người ta còn thực

hiện tiến hành giữ giống trong điều kiện nhiệt độ thấp. Phương pháp bảo quản này có

thể giữ giống vi khuẩn trong thời gian khá dài (từ 3-5 tháng, nếu giữ ở -700C có thể bảo

quản mẫu đến 10 năm mới cần cấy chuyền).

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Cấy tăng sinh chủng thuần khiết vào chai môi trường NB đối với vi khuẩn Bacillus

spp. vô trùng, lắc 150 vòng/ phút/ trong 24 giờ. Sau đó hút 1ml dịch tăng sinh cho vào

eppendorf để đem đi ly tâm ở 10000 vòng/ 15 phút. Hút bỏ dịch lỏng và thu cặn chứa

sinh khối vi khuẩn. Hút 0,15 ml glycerol 40% và 0,85 ml môi trường nuôi cấy cho vào

eppendorf lắc đều và tiến hành bảo quản giống ở tủ lạnh sâu (glycerol là chất làm giảm

nhiệt độ đóng băng và thời gian tan chảy, chúng bao phủ bề mặt tế bào và ngăn cản quá

trình hình thành các tinh thể đá gây tổn thương màng tế bào vi khuẩn và các vi sinh vật

khác)

2.5.9 Phương pháp khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase, chitinase)

của các chủng vi khuẩn

Chủng vi khuẩn đã làm thuần

Tăng sinh trên môi trường NB pH=7, lắc 150v/p trong 24h

Chuẩn bị môi trường khoáng bổ sung 1% CMC

Đỗ đĩa

Đục lỗ thạch

Hút 1ml dịch từ bình tăng sinh ly tâm 10000v/p trong 10 phút

Cặn

2.5.9.1 Bố trí thí nghiệm

Hút 50𝜇l dịch ly tâm cho vào các giếng thạch

Ủ 24h và bổ sung lugol vào, tiến hành đo vòng phân giải

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng phân giải cellulase của các chủng

Chủng vi khuẩn đã làm thuần

Tăng sinh trên môi trường NB pH=7, lắc 150v/p trong 24h

Chuẩn bị môi trường khoáng bổ sung 1% chitin

Đỗ đĩa

Đục lỗ thạch

Hút 1ml dịch từ bình tăng sinh ly tâm 10000v/p trong 10 phút

Cặn

Bacillus spp.

Hút 50 l dịch ly tâm cho vào các giếng thạch

Ủ 24h và bổ sung lugol vào, tiến hành đo vòng phân giải

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng phân giải chitinase c ủa các chủng

Bacillus spp.

2.5.9.2: Quy trình thực hiện

a. Nguyên tắc: Thí nghiệm theo phương pháp của Egorow NX (1976), dựa vào khả

năng khuếch tán của các enzyme được bơm vào lỗ thạch, phân giải protein của các

chủng VSV bằng cách đo kích thước vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc. Enzyme

tác động lên cơ chất trong môi trường agar, cơ chất bị phân hủy, độ đục của môi trường

bị giảm và trở nên trong suốt. Độ lớn của vòng phân giải phản ánh hoạt lực của

enzyme.

b. Mục đích:

Nhằm xác định khả năng phân hủy chitin, cellulose của các chủng vi khuẩn, tiến hành

thử sơ bộ theo phương pháp đục lỗ trên đĩa thạch.

c. Phương pháp:

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Nuôi vi sinh vật trong môi trường NB ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/ phút. Sau 24 giờ

nuôi cấy thu lấy dịch nuôi trong điều kiện vô trùng, ly tâm 10.000 vòng/phút thu l ấy

dịch trong.

Tiếp theo, đổ môi trường đĩa thạch có chứa cơ chất 1% chitin, 1% CMC vô trùng vào

đĩa petri. Chờ cho môi trường nguội và đông lại tiếp theo đục lỗ thạch (đường kính 5

mm) thành các giếng.

Dùng micropipette hút 1ml dung dịch thu được sau ly tâm bơm vào các giếng trong đĩa

petri. Ủ 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó, quan sát vòng phân gi ải bằng thuốc thử lugol.

Dùng thuốc thử đổ lên bề mặt thạch nếu có enzyme thì nó tạo thành vùng phân giải

xung quanh giếng.

d. Đọc kết quả

- Khả năng phân giải enzyme được đánh giá qua hiệu số (D-d) mm. D-d càng lớn thì

khả năng phân giải enzyme càng cao.

Trong đó :

D : là đường kính vòng phân giải (mm) - d : là đường kính giếng thạch (mm)

Kiểm tra khả năng sinh enzyme cellulase trên môi trường chứa CMC. Dùng dung dịch

lugol đổ lên bề mặt nuôi cấy. Nếu vi khuẩn sinh cellulase thì sẽ xuất hiện vòng trong

suốt xung quanh giếng, còn vùng chưa bị phân giải sẽ có màu tím.

Kiểm tra khả năng sinh enzyme chitinase trên môi trường chứa chitin. Dùng dung dịch

lugol đổ lên bề mặt nuôi cấy. Nếu vi khuẩn sinh chitinase thì sẽ xuất hiện vòng trong

suốt xung quanh giếng, còn vùng chưa bị phân giải sẽ có màu tím.

2.5.10 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn

2.5.10.1 Xác định mật độ tế bào VSV

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Chủng vi khuẩn

Tăng sinh 24h trên môi trường NB

Ly tâm 4000v/p trong 15p

Pha loãng thành các nồng độ 10- 1,…10-7

Thu sinh khối

Cấy trang 3 nồng độ cuối

Hòa tan bằng NMSL 0.9% vô trùng

Quấn paraffin xung quanh đĩa ủ 48h ở 370C

Đo OD 600nm

Đếm khuẩn lạc

a. Bố trí thí nghiệm

Hình 2.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định mật độ vi khuẩn – dựng đường chuẩn tế

bào

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

b. Tiến hành:

Tăng sinh chủng Bacillus spp. trên nôi trường NB. Lắc trên máy lắc với tốc độ 150v/p

trong vòng 24 giờ. Sau 24 giờ, ta tiến hành đo 𝑂𝐷600𝑛𝑚 và cấy trang ở cùng thời điểm.

Đo 𝑶𝑫𝟔𝟎𝟎𝒏𝒎: Chủng Bacillus spp. sau khi được tăng sinh 24 giờ đem đi ly tâm 4000

vòng/15 phút, rửa lại vài lần bằng nước cất đến khi sạch môi trường sau đó cho NMSL

0.9% bằng đúng thể tích dịch tăng sinh trước khi ly tâm (trước khi ly tâm dịch tăng

sinh là 20ml thì sau khi ly tâm cần dùng 20ml NMSL để hòa tan sinh khối).

Ta thực hiện pha loãng dịch tăng sinh VSV đã được xác định mật độ theo hệ số 2𝑛

bằng cách:

+ Hút 2ml nước muối đã được khử trùng ở 1210C trong 15 phút vào các ống nghiệm,

trong đó có 1 ống làm mẫu trắng.

+ Đối với ống nghiệm để pha loãng (tất cả đều được đánh số thứ tự rõ ràng): Hút 2ml

dịch tăng sinh cho vào ống thứ nhất, lắc đều ta được dung dịch pha loãng 2 lần. Sau đó

từ ống thứ nhất hút 2ml sang ống thứ 2, lắc đều ta được dung dịch pha loãng 4 lần.

+ Tiến hành tương tự ta được chuỗi ống nghiệm chứa dung dịch pha loãng theo hệ số

2n: 2 lần, 4 lần, 8 lần, 16 lần, 32 lần, 64 lần, …

+ Đo 𝑂𝐷600𝑛𝑚 các ống chứa dịch đã pha loãng

Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm khuẩn lạc:

-Pha loãng mẫu:

Chuẩn bị NMSL 0.9% , phối vào các ống nghiệm mỗi ống 9ml, hấp khử trùng 1210C,

15 phút, 1atm.

Tiến hành pha loãng: VSV vào ống thứ nhất được nồng độ pha loãng 10-1, sau đó cho

tiến hành pha loãng tiếp tục cho đến khi đạt nồng độ 10-8.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

-Cấy trang:

Hút 0,1ml dịch pha loãng ở ống 10−5 vào đĩa petri chứa môi trường NA. Chọn nồng độ

từ 10−5 đế𝑛 10−9 để cấy trang, mỗi nồng độ lặp lại trên 3 đĩa. Sau khi trang khô, ta ủ ở

nhiệt độ 370C trong 24 – 48 giờ cho khuẩn lạc có thể phát triển thuận lợi để đếm.

Đếm tất cả các khuẩn lạc riêng rẽ trên các đĩa cấy. Thông thường người ta chọn các đĩa

𝑵

có khuẩn lạc từ 25-250. Tính toán kết quả dựa trên công thức:

A(cfu/ml hoặc cfu/g) = 𝒏𝟏𝑽𝟏𝒇+⋯+𝒏𝟐𝑽𝒇𝟐

A: số TBVK (khuẩn lạc) trong 1g hoặc 1ml mẫu

N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn

n: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i

V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường

f: độ pha loãng tương ứng

Từ kết quả đo OD600nm và kết quả đếm khuẩn lạc ta tiến hành dựng đường chuẩn tế

bào và có được phương trình đường chuẩn cho các khảo sát tiếp theo.

Để có được mật độ tế bào (tb/ml), sử dụng kết quả S0 tính được chia cho hệ số pha

loãng 2n ở trên sẽ ra được mật độ tế bào(tb/ml) ở từng giá trị đo OD600nm. Sau đó l ấy

log sẽ được log (tb/ml).

2.5.10.2 Phương pháp xác định mật độ nấm

a. Bố trí thí nghiệm

Chủng nấm

Tăng sinh trên Potato D- glucose Broth

Cấy điểm vào môi trường PDA

Thu bào tử

NMSL 0.9% có pha Tween 80

Định mức lên 100ml

Pha loãng 10-1-10-8

Pha loãng theo cơ số 2

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Cấy trang trên PDA

Đếm bào tử

Đo OD 600nm

Hình 2.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định mật độ nấm – dựng dường chuẩn nấm

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

b. Tiến hành: Các chủng nấm được tăng sinh trong môi trường Potato D -Glucose

Broth, ủ ở 370C trong 72 giờ. Dùng que cấy vòng lấy bào tử cấy điểm lên đı̃a môi trường Potato D-Glucose Agar, ủ ở 37 0C trong 72 giờ. Tiến hành thu bào tử và cấy

trang trên cùng bình tăng sinh.

* Tiến hành thu bào tử:

Sau khi ủ ở 370C trong điều kiện tối, tiến hành quan sát các đı̃a PDA đã cấy và chọn đı̃a PDA có bào tử xuất hiện kı́n đı̃a.

Sử dụng nước muối sinh lý 0,9% có 0,2% Tween 80 cho từ từ vào đı̃a PDA đã

chọn và cạo nhẹ trên bề mặt để thu lấy bào tử. Lặp lại nhiều lần đến khi bề mặt đı̃a không còn bào tử.

Dùng nước muối sinh lý 0,9% có 0,2% Tween 80 định mức lên 100ml và được

nồng độ pha loãng là 10-2.

Đối với ống nghiệm để pha loãng (tất cả đều được đánh số thứ tự rõ ràng): Hút 2ml

dịch cho vào ống thứ nhất, lắc đều ta được dung dịch pha loãng 2 lần. Sau đó từ ống

thứ nhất hút 2ml sang ống thứ 2, lắc đều ta được dung dịch pha loãng 4 lần.

Tiến hành tương tự ta được chuỗi ống nghiệm chứa dung dịch pha loãng theo hệ số

2n: 2 lần, 4 lần, 8 lần, 16 lần, 32 lần, 64 lần, …

Sử dụng lượng bào tử vừa thu đo bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 600nm, dùng

nước muối sinh lý 0,9% có 0,2% Tween 80 pha loãng 2 lần đến giá trị mong muốn(

OD trong khoảng 0.4). Lặp lại 3 lần và thu nhận giá trị trung bı̀nh.

Định lượng bào tử nấm bằng phương pháp cấy trang:

Pha loãng mẫu:

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Chuẩn bị NMSL 0.9% có bổ sung Tween 80%, phối vào các ống nghiệm mỗi ống 9ml,

hấp khử trùng 1210C, 15 phút, 1atm.

Tiến hành pha loãng: VSV vào ống thứ nhất được nồng độ pha loãng 10-1, sau cho tiến

hành pha loãng tiếp tục cho đến khi đạt nồng độ 10-8.

Cấy trang:

Hút 0,1ml dịch pha loãng ở ống 10−5 vào đĩa petri chứa môi trường PDA. Chọn nồng

độ từ 10−5 đế𝑛 10−9 để cấy trang, mỗi nồng độ lặp lại trên 3 đĩa. Sau khi trang khô, ta ủ

ở nhiệt độ 370C trong 24 – 48 giờ cho bào tử có thể phát triển thuận lợi để đếm.

Đếm tất cả các bào tử riêng rẽ trên các đĩa c ấy. Thông thường người ta chọn các đĩa có

𝑵

khuẩn lạc từ 15-150. Tính toán kết quả dựa trên công thức:

A(cfu/ml hoặc cfu/g)= 𝒏𝟏𝑽𝟏𝒇+⋯+𝒏𝟐𝑽𝒇𝟐

A: số bào tử trong 1g hoặc 1ml mẫu

N: tổng số bào tử được trên các đĩa đã chọn

n: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i

V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường

f: độ pha loãng tương ứng

Từ kết quả đo OD600nm và kết quả đếm bào tử nầm ta tiến hành dựng đường chuẩn tế

bào và có được phương trình đường chuẩn cho các thí nghiệm tiếp theo.

2.5.11 Khả năng phân giải phosphate khó tan

a. Mục đích: Các chủng khác nhau sẽ có khả năng phân giải phosphate khó tan khác

nhau. Do đó, để thu được chủng có đặc tính phân giải phosphate khó tan tốt ứng dụng

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

được trong thực tiễn nông nghiệp, cần thiết đánh giá ho ạt tính phân giải phosphate khó

tan của từng chủng VSV.

b. Đánh giá hoạt tính phân giải phosphate của các chủng VSV dựa trên nồng độ

Orthophosphate (PO4)3- có trong dịch nuôi cấy. Nồng độ orthophosphate càng cao

chứng tỏ lượng phosphate khó tan bị phân giải càng nhiều.

Nồng độ orthophosphate được xác định bằng phương pháp Stannous Chloride

(Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater).

Trong môi trường acid, orthophosphate trong mẫu sẽ phản ứng với ammonium

molypdate (AM) tạo thành molypdophosphoric acid (NH4)3PO4.12MoO3 màu vàng.

(PO4)3- + 12(NH4)2MoO4 + 24H+ → (NH4)3PO4.12MoO3 + 21NH4+ + 12H2O

Acid này sau đó bị khử bởi thiếc Clorua SnCl2 và sản phẩm khử là phức chất

(NH4)3(4MoO2.2MoO3) màu xanh dương.

(NH4)2PO4.12MoO3 + Sn2+ + 16H+ → (NH4)3(4MoO2.2MoO3) + Sn4++ 8H2O

Phức màu xanh có bước sóng hấp thụ cực đại ở 690 nm. Sử dụng máy quang phổ đo

OD ở bước sóng 690 nm để xác định độ hấp thụ màu của phức chất. Để tính tương

quan giữa chỉ số mật độ quang (OD) và nồng độ orthophosphate cần thiết lập đường

chuẩn phosp.hate sử dụng chất chuẩn là KH2PO4.

c.Tiến hành

Thực hiện nuôi cấy các chủng VSV phân lập được trên môi trường NB đã được

hấp khử trùng, nuôi ủ trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng trên máy lắc 150 vòng/phút. Sau

24 giờ, kiểm soát dịch tăng sinh VSV ở OD600nm = 0,8 bằng chính môi trường NB đã

hấp khử trùng để đảm bảo mật độ tế bào bằng nhau giữa các VSV. Hút 1ml dịch nuôi

cấy NB cấy chuyển vào 20ml môi trường P đã hấp khử trùng, nuôi cấy lắc 150

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Sau 3, 5, 7, 9, 11 ngày, kiểm tra khả năng phân giải

phosphate khó tan của từng VSV bằng phương pháp Stannous Chloride. Việc kiểm tra

này dừng lại khi lượng phosphate hòa tan ở mốc sau giảm so với mức ngay trước nó.

Mẫu đối chứng là mẫu chỉ chứa môi trường P đã hấp khử trùng nhưng không c ấy

VSV. Lặp lại 3 lần với mỗi mẫu

Để tính tương quan giữa chỉ số mật độ quang (OD) và nồng độ orthophosphate cần

thiết lập phương trình tương quan giữa hai chỉ số đó bằng KH2PO4.

*Xác định lượng phosphate dễ tan có trong dịch nuôi cấy VSV

Lấy dịch nuôi cấy VSV, đem ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch trong, bổ

sung thêm 4ml AM, 10 giọt dung dịch SnCl2. Định mức tới vạch 50ml bằng nước cất,

lắc đều bình, đợi 10-12 phút, đo OD690nm.

Tính toán lượng phosphate do VSV hòa tan vào dịch nuôi cấy:

[orthophosphate]VSV = [orthophosphate]TN – [orthophosphate] ĐC

2.5.12 Khả năng sinh IAA

a. Mục đích: Xác định khả năng sinh tổng hợp chất điều hòa tăng trưởng IAA của các

chủng

VSV.

b. Nguyên tắc: Đánh giá khả năng sinh IAA c ủa các chủng VSV dựa trên nồng độ IAA

có trong dịch chiết nuôi cấy vi khuẩn. Nồng độ IAA có trong dịch chiết càng cao

chứng tỏ khả năng sinh IAA c ủa VSV càng mạnh. Nồng độ IAA được xác định bằng

phương pháp so màu trên máy quang phổ với thuốc thử Salkowski ở bước sóng 530nm.

c. Tiến hành

Đánh giá khả năng sinh IAA của các chủng VSV

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Thực hiện nuôi cấy các chủng VSV phân lập được trên môi trường NB có bổ sung

0.1% tryptophan đã được hấp khử trùng, nuôi ủ trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng trên máy

lắc 150 vòng/phút.

Nuôi cấy lắc ở nhiệt độ phòng sau 5 ngày, thu dịch nuôi cấy đo lượng IAA được vi

khuẩn trổng hợp và tiết ra môi trường bằng phương pháp Salkowski (Glickmann và

Dessaux, 1995).

Lặp lại 3 lần với mỗi mẫu. Mẫu đối chứng chỉ chứa môi trường đã hấp khử trùng.

2.5.13 Phương pháp đối kháng nấm

Phương pháp khuếch tán lỗ thạch được sử dụng

Các chủng nấm được tăng sinh trên môi trường PDA sau 3 ngày. Các đĩa nấm có

tơ mọc đầy đĩa sẽ được lựa chọn thí nghiệm.

Chuẩn bị môi trường PDA, dùng khoan thạch có đường kính 5mm, đục 4 lỗ xung

quanh đĩa. Sau đó, tiến hành dùng dao cấy, cấy chuyền nấm sang và đặt giữa đĩa. Cùng

ngày cấy nấm tiến hành tăng sinh các chủng vi khuẩn trên môi trường NB trong 24 giờ.

Sau 24h, tiến hành cấy đối kháng, đối với chủng nấm Fusarium sp., sau 24 giờ,

dùng micropipette hút 50 𝜇𝑙 dịch nuôi cấy vi khuẩn cho vào 4 lỗ.

Đối với chủng Neoscytalidium dimidiatum, tiến hành dùng micropipette hút 1ml

dịch vi khuẩn sau tăng sinh cho vào các Eppendorf vô trùng, ly tâm 10000v/p trong 10

phút. Sau đó dùng micropipette hút 50𝜇𝑙 dịch ngoại bào cho vào 4 lỗ.

Đối với đĩa đối chứng, dịch nuôi cấy, dịch ngoại bào vi khuẩn được thay bằng

nước cất

Sau khi bơm dịch, đợi dịch thấm và khô khoảng 30 phút rồi tiến hành quấn paraffin

quanh đĩa để tránh tạp nhiễm, ủ ở nhiệt độ phòng trong điều kiện tối.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Theo dõi đường kính nấm sau 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày.

𝑅1−𝑅2

Khả năng ức chế của nấm nấm bệnh được tính theo công thức của Fokkema (1976)

𝑅1

PMIG = (%)

Trong đó:

R1: Bán kính tản nấm của nấm bệnh ở công thức đối chứng (không cấy nấm đối kháng)

(cm).

R2: Bán kính tản nấm của nấm bệnh ở công thức đối kháng (cm).

PIMG (Percent Inhibition of Mycelial Grow): Chỉ số đối kháng

+ PIMG 50: Chỉ số đối kháng thấp.

+ PIMG 51- 60: Chỉ số đối kháng trung bình.

+ PIMG 61-75: Chỉ số đối kháng cao.

+ PIMG >75: Chỉ số đối kháng rất cao.

2.5.13 Đánh giá khả năng phòng trừ nấm bệnh trên trái thanh long

Sau khi có kết quả đối kháng nấm ở đĩa petri, chọn các chủng vi khuẩn có khả năng

kháng tốt tiến hành thử nghiệm trên trái thanh long

Các chủng sau khi được lựa chọn sẽ tiến hành tăng sinh trên môi trường NB sau 18

giờ. Kiểm soát mật độ tế bào của các chủng thông qua việc đo OD.

Sau 18 giờ, mật độ tế bào đạt khoảng 2.108 cfu/ml sẽ được lựa chọn.

Các chủng sau khi đạt mật độ sẽ tiến hành ly tâm 4000v/p trong thời gian 15 phút

thu dịch ngoại bào và bổ sung Tween 80 với tỷ lệ 1% so với thể tích môi trường.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Các chủng nấm sẽ được tăng sinh trên môi trường PDB (Potato D-glucose Broth)

trong 3 ngày. Sau 3 ngày, tiến hành đo OD để kiểm tra mật độ nấm có trong môi

trường. Chủng nấm đạt mật độ 108 cfu/ml.

Quy trình khảo nghiệm hiệu quả trừ bệnh đốm trái thanh long của dịch ngoại bào vi

khuẩn Bacillus spp. theo phương pháp của Đỗ Văn Sử và Lê Minh Trường (2016).

Bố trí các nghiệm thức lần lượt như sau:

+ Nghiệm thức 1 (NT1): Phun dịch ngoại bào vi khuẩn ở 2 ngày trước lây bệnh nhân

tạo (LBNT).

+ NT2: Phun dịch ngoại bào ở 2 ngày sau LBNT.

+ NT3: Phun dịch ngoại bào không lây bệnh nhân tạo

+ NT4: Lây bệnh nhân tạo không phun dịch ngoại bào

+ NT5 : Đối chứng không phun khuẩn không lây bệnh nhân tạo

- Phương pháp lây bệnh: Sử dụng tăm tre đã khử trùng gây thương cho trái thanh long

ở 5 điểm trên trái thanh long, mỗi điểm gây thương 5 nốt (tập trung thành vòng để dễ

nhiễm bệnh). Mỗi chủng thực hiện với 3 quả.

- Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi chỉ số bệnh hại sau 5, 7, 10, 15 ngày.

𝑁1∗1)+(𝑁3∗3)+(𝑁5∗5)+⋯+(𝑁𝑛∗𝑛)

Theo dõi mức độ hư hỏng ở quả giữa các nghiệm thức

𝑁∗𝑛

Chỉ số bệnh hại (%) : * 100

Trong đó:

N1 là (lá, củ, quả) bị bệnh ở cấp 1

N3 là (lá, củ, quả) bị bệnh ở cấp 3

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Nn là (lá, củ, quả) bị bệnh ở cấp n

N tổng số (lá, củ, quả) điều tra

n là cấp bệnh cao nhất (cấp 9)

Chỉ số bệnh/ chỉ số hại trên quả và phân cấp bệnh trên quả được căn cứ dựa vào Quy

chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện dịch hại trên cây trồng

(QCVN 01-38:2010/BNNPTNT)

2.5.14 Đánh giá khả năng phòng trừ nấm bệnh trên cây ớt

Sau khi có kết quả đối kháng nấm ở đĩa petri, chọn các chủng vi khuẩn có khả năng

kháng tốt tiến hành thử nghiệm in vivo

Xử lý đất: Đất trồng tiến hành cho vào các túi PE vô trùng và đem hấp khử trùng ở

1210C trong 15 phút để diệt hết các vi khuẩn có trong đất.

Chuẩn bị các ly nhựa, cân vào mỗi ly 100g đất đã được hấp khử trùng.

Các chủng sau khi được lựa chọn sẽ tiến hành tăng sinh trên môi trường NB sau 18

giờ. Kiểm soát mật độ tế bào của các chủng thông qua việc đo OD. Sau 18 giờ, mật độ

tế bào đạt 108 cfu/ml sẽ được lựa chọn.

Các chủng sau khi đạt mật độ sẽ bổ sung Tween 80 với tỷ lệ 1% so với thể tích môi

trường và phun vào đất.

Các chủng nấm sẽ được tăng sinh trên môi trường PDB (Potato D-glucose Broth)

trong 4 ngày. Sau 4 ngày, tiến hành đo OD để kiểm tra mật độ nấm có trong môi

trường. Chủng nấm đạt mật độ 108 cfu/ml.

Bố trí các nghiệm thức như sau:

+ Nghiệm thức 1 (NT1): Tưới huyền phù vi khuẩn (với mật số 108 cfu/ml) trước khi

trồng 1 ngày và tưới huyền phù nấm (với mật số 108 cfu/ml) sau khi trồng 7 ngày.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

+ NT2: Tưới huyền phù nấm (với mật số 108 cfu/ml) trước khi trồng 1 ngày và tưới

huyền phù vi khuẩn (với mật số 108 cfu/ml) sau khi trồng 7 ngày.

+ NT3: Tưới huyền phù vi khuẩn (với mật số 108 cfu/ml) trước khi trồng 1 ngày

+ NT4: Tưới huyền phù nấm (vớ mật số 108 cfu/ml) trước khi trồng 1 ngày.

+ NT5: Tưới nước cất

- Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ cây chết, số lá trên cây, chiều cao cây và chiều dài rễ.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả phân lập các chủng Bacillus spp. từ đất nông nghiệp

3.1.1. Đặc điểm hình thái của các chủng

Từ các mẫu đất đã phân lập được 20 chủng vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi

trường NA chứa protein là nguồn carbon duy nhất. Trong đó có 8 chủng có đặc điểm

hình thái tương đồng với chủng Bacillus subtilis do Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp

Nông nghiệp Công nghệ cao Tp. HCM cung cấp. Tất cả 8 chủng nghi ngờ là Bacillus

đều có dạng hình tròn, rìa răng cưa đều, hoặc không đều, bề mặt khô nhăn hoặc không

nhăn, đường kính trung bình kho ảng từ 0,2-0,8cm. Một số chủng có tâm sẫm màu, màu

sắc các dạng khuẩn lạc thường là màu trắng ngã vàng đến màu hơi vàng. Đặc điểm

hình thái của các chủng được trình bày cụ thể ở bảng 3.1.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Bảng 3.1 : Hình dạng khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn phân lập được

Chủng phân lập được Đặc điểm khuẩn lạc sau Hình ảnh khuẩn lạc

48h nuôi cấy

BTS5 Khuẩn lạc dạng tròn,

đường kính 0.5-0.9cm,

rìa răng cưa không đều,

bề mặt khô, màu trắng

BTS5

hơi ngả vàng

BT06 Khuẩn lạc dạng tròn,

đưởng kính từ 0.2-

0.4cm, tâm sẫm màu,

rìa răng cưa, nhăn, bề

mặt khô, màu trắng hơi

vàng.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

BTA7 Khuẩn lạc dạng tròn,

nhỏ, đường kính 0.2-

0.5cm, rìa răng cưa

không đều, bề mặt

nhăn, nhô cao tạo thành

khóm.

BPS6 Khuẩn lạc dạng tròn,

đường kính 0.4-0.7cm,

bề mặt khô, nhăn, rìa

răng cưa không đều,

tâm sẩm màu, hơi nhô

cao.

BP05 Khuẩn lạc dạng tròn, rìa

BP05

răng cưa không đều, bề

mặt nhăn. Đường kính

0.3-0.6cm

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

BM06 Khuẩn lạc tròn, lồi, rìa

răng cưa, bề mặt khô,

nhăn, đường kính 0.3-

0.5cm

BM07 Khuẩn lạc dạng tròn, bề

mặt khô, nhăn, đường

kính khuẩn lạc từ 0,3-

0.5, nhô cao tạo thành

khóm

BD01 Khuẩn lạc dạng tròn, bề

mặt khô, tâm sẫm màu,

đường kính từ 0.4-0.8

cm, màu hơi vàng

BD01

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Ngoài việc xác định đặc điểm tế bào của các chủng vi khuẩn được nhuộm gram và

nhuộm bào tử. Kết quả cho thấy, cả 8 chủng này đều là vi khuẩn Gram dương và có

khả năng sinh bào tử. Đây cũng là những đặc điểm của vi khuẩn Bacillus (hình 3.1).

BPS6 BP05

BTS5 BTA7 BTA7

BT06 BM06

BM07 BD01

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Hình 3.1.: Kết quả nhuộm gram của các chủng vi khuẩn. Quan sát ở 100x

BPS6

BP05

BTA7

BTS5

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

BT06 BM06

BM07 BD01

Hình 3.2: Kết quả nhuộm bào tử của các chủng vi khuẩn. Quan sát 100X

3.1.2 Kết quả kiểm tra đặc điểm sinh hóa của các chủng

Đặc điểm về hình thái chưa đ ủ cơ sở để khẳng định đây là các chủng Bacillus spp.

Vì vậy, cần phải kiểm tra các đặc điểm sinh hóa đặc trưng của chi Bacillus theo khóa

phân loại của Bergey (1974). Kết quả thử nghiệm cho thấy các chủng vi khuẩn phân

lập được đều thuộc chi Bacillus.

Các kết quả thử nghiệm sinh hóa cụ thể được thể hiện qua bảng 3.2. (Xem thêm Phụ

lục E)

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Bảng 3.2 : Kết quả thử nghiệm sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập được.

BPS6 BP05 BTA7 BTS5 BT06 BM06 BM07 BD01 DC (-) Chủng DC

(+) Thử

nghiệm

Catalase + + + + + + + + - +

Di động + + + + + + + + - +

Citrate + + + + + + + + - +

MR + + + + + + + + - +

VP + + + + + + + + - +

Indole - - - - - - - - - -

Gelatin + + + + + + + + - +

3.2. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn

3.2.1 Khả năng sinh enzyme chitinase

Sau khi nuôi cấy 24 giờ, chuẩn bị thuốc thử Lugol và tráng đều bề mặt đĩa, kết quả

cho thấy xuất hiện vòng phân giải xung quanh các giếng thạch ở tất cả các chủng vi

khuẩn phân lập. Đường kính vòng phân giải của các chủng thay đổi tùy thuộc vào từng

chủng.

Đối với khả năng sinh enzyme chitinase phân gi ải chitin có trong môi trường, ghi

nhận được kết quả như bảng 3.3.( Xem thêm phụ lục G Hình 1)

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Bảng 3.3: Khả năng sinh enzyme chitinase của các chủng sau 24 giờ

Chủng Đường kính vòng phân giải chitin (cm)

BM06 2,2c±0,29

BD01 2,2c±0,29

BTA7 2,8ab±0,31

BM07 1,2d±0,29

BT06 2,2c±0,29

BTS5 2,8ab±0,21

BPS6 3,3a±0,35

BP05 2,5bc±0,4

Các giá trị trung bình cùng kí tự trong cùng 1 cột không có khác biệt có ý nghĩa thống

kê (p<0,01)

3.5

2.5

Đường kính TB

1.5

0.5

Chủng

BM06 BD01 BTA7 BM07 BT06 BTS5 BPS6 BP05

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Hình 3.3: Đường kính vòng phân giải chitin (cm)

Từ hình 3.3 nhận thấy, các chủng phân lập đều có khả năng sinh enzyme

chitinase, đường kính vòng phân giải dao động từ 1,2cm – 3,3 cm. Các chủng thể hiện

khả năng sinh enzyme rất khác biệt. Trong đó chủng BPS6 có vòng phân gi ải lớn nhất

với 3,3cm, chủng BM07 có vòng phân giải thấp nhất là 1,2cm.

Theo nghiên c ứu của Nguyễn Thị Liên (2016), khả năng phân giải chitin của các

chủng Bacillus spp. phân lập được sau 24 giờ nuôi cấy dao động từ 0,17cm – 3,1cm.

Trong đó chủng CT13 là 3,1cm, CT9 là 2,63cm. Chủng cho kết quả thấp nhất là CT18

đường kính vòng phân giải là 0,17cm. Kết quả thí nghiệm nhận thấy so sánh với kết

quả của Nguyễn Thị Liên và cs (2016), thì kết quả xem như tương đồng. Bên cạnh đó,

theo nghiên cứu của Hien et al (2017) cho kết quả vòng phân giải chitin từ 0,13 – 1,47

cm, kết quả này cho thấy các chủng vi khuẩn của thí nghiệm cho kết quả tốt hơn.

3.2.2. Khả năng sinh enzyme cellulase:

Đối với khả năng sinh enzyme cellulase phân giải cellulose có trong môi trường, ghi

nhận được kết quả như bảng 3.4. (Xem thêm phụ lục G hình 2)

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Bảng 3.4: Khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập

Đường kính vòng phân giải CMC (cm) Chủng

BM06 1,07cd±0,12

BD01 0,9d±0,17

BTA7 1,2c±0,29

BM07 0,87d±0,12

BT06 1,06cd±0,12

BTS5 1,03d±0,15

BPS6 1,43b±0,12

BP05 1,9a±0,05

Các giá trị trung bình cùng kí tự trong cùng 1 cột không có khác biệt có ý nghĩa thống

kê (p<0,01)

2.5

1.5

Đường kính T B

0.5

Chủng

BM06

BD01

BTA7

BM07

BT06

BTS5

BPS6

BP05

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Hình 3.4: Đường kính vòng phân giải CMC (cm)

Từ hình 3.4 cho thấy các chủng phân lập đều có khả năng sinh enzyme cellulase,

đường kính vòng phân giải dao động từ 0,87cm – 1,9cm. Khả năng sinh enzyme

cellulase ở các chủng rất khác nhau. Trong đó chủng BP06 có vòng phân giải lớn nhất

với 1,89cm, chủng BM07 có vòng phân giải nhỏ nhất là 0,87cm. Kết quả này cho thấy

khả năng sinh enzyme cellulose ở tất cả các chủng đều thấp hơn so với khả năng sinh

enzyme chitinase.

So sánh với báo cáo của Huỳnh Phương Thảo (2017), khả năng sinh enzyme

cellulase của các chủng Bacillus subtillis dao động từ 0,89cm-1,1cm, nhận thấy kết quả

thí nghiệm ở mức tương đồng. Trong nghiên cứu của Hien et al (2017) cho kết quả

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

thấy vòng phân giải cellulose từ 0,25 – 1,33cm. Kết quả này cho thấy các chủng vi

khuẩn của thí nghiệm cho kết quả tốt hơn rất nhiều.

Từ các kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase, chitinase) có

thể khẳng định các chủng Bacillus spp. phân lập được đều có tiềm năng ức chế các loại

nấm bệnh. Bởi, thành tế bào của nấm được cấu tạo chủ yếu bởi chitin. Khả năng sinh

enzyme ngoại bào của các chủng sẽ góp phần vào việc phân hủy vách tế bào nấm, ức

chế và ngăn chặn sự phát triển của các chủng nấm bệnh. Bên cạnh đó, các chủng

Bacillus phân lập được cũng thể hiện khả năng phân giải cellulose có thể ứng dụng vào

quá trình ủ compost.

3.3 Khả năng đối kháng nấm của các chủng

3.3.1. Khả năng đối kháng nấm Fusarium sp.

Sau khi tiến hành cấy đối kháng nấm Fusarium sp.. và các chủng Bacillus spp. sau 5

ngày, 7 ngày, tiến hành đo đường kính tản nấm và ghi nhận kết quả. Kết quả được trình

bày ở bảng 3.5. (Xem thêm Phụ lục H hình 1)

Bảng 3.5: Hiệu quả ức chế nấm Fusarium sp. của các chủng vi khuẩn

Hiệu quả ức chế (%)

Chủng 5 ngày 7 ngày

BT06 24,4c±1,35 58,2b±1,56

BP05 11,1d±2,92 51,767c±2,65

BPS6 36,3b±1,91 65,533a±3,53

BTA7 42,43a±0,98 65,367a±2,31

BD01 6,12e±2,02 44,033d±2,31

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

BTS5 30,63c±3 64,9a±1,56

BM06 18,6d±0,61 44,033d±3,81

BM07 6,73e±2,96 41,9d±3,87

Các giá trị trung bình cùng kí tự trong cùng 1 cột không có khác biệt có ý nghĩa thống

% ức chế 80

TB 5 ngày

TB 7 ngày

Chủng

BT06

BP05

BPS6

BTA7

BD01

BTS5

BM06

BM07

kê (p<0,01)

Hình 3.5: Hiệu lực ức chế nấm bệnh Fusarium sp.của các chủng Bacillus spp.

Từ bảng 3.5 cho thấy, sau 5 ngày nuôi cấy, các chủng đã thể hiện khả năng ức chế

nấm bệnh. Hiệu lực ức chế nấm bệnh dao động từ 4,77% - 40,1%. Hiệu lực có sự khác

biệt rõ rệt giữa các chủng. Trong đó chủng BTA7 cho kết quả cao nhất là 40,1%, chủng

BM07 và BD01 cho kết quả thấp nhất là 4,77%. Kết quả nhận thấy, sau 5 ngày khả

năng ức chế nấm bệnh ở các chủng tương đối thấp do khả năng sinh trưởng của nấm

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Fusarium sp. khá chậm nên không nhận thấy rõ sự khác biệt giữa đĩa thí nghiệm và đĩa

dối chứng.

Sau 7 ngày nuôi c ấy, các chủng đã thể hiện hiệu lực ức chế tốt hơn. Hiệu lực ức chế

dao động từ 42,23% - 64,9%. Trong đó chủng BTS5 cho kết quả cao nhất là 64,9%,

chủng BM07 cho kết quả thấp nhất là 42,23%. Từ kết quả nhận thấy, khả năng ức chế

nấm bệnh của các chủng ở mức trung bình, sau 7 ngày nuôi c ấy, nhận thấy sự khác biệt

giữa đường kính tản nấm ở đĩa đối chứng và đĩa thí nghiệm.

Theo báo cáo của Theresa Lee et al (2017), Bacillus amyloliquefaciens DA12 có

khả năng ức chế nấm Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici sau 7 ngày vào khoảng

31,6%. Theo Sukanya Saechow et al (2017), Bacillus subtilis có khả năng ức chế nấm

bệnh Fusarium oxysporum nếu sử dụng sinh khối là 30,38-50,56 % Nhận thấy, các

chủng vi khuẩn phân lập được cho hiệu lực đối kháng tốt hơn so với nghiên cứu của

Theresa Lee (2017), Sukanya Saechow et al (2017).

3.3.2. Khả năng đối kháng nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng

thanh long

Sau khi tiến hành cấy đối kháng nấm Neoscytalidium dimidiatum và các chủng Bacillus

spp. Theo dõi đường kính nấm sau 3 ngày, 5 ngày, tiến hành đo đường kính tản nấm và

ghi nhận kết quả. Hiệu lực ức chế nấm bệnh được trình bày ở bảng 3.6. (Xem thêm phụ

lục H hình 2)

Bảng 3.6: Hiệu lực ức chế nấm bệnh sau 3 ngày, 5 ngày (%)

Chủng Hiệu lực ức chế Hiệu lực ức

(%) sau 3 ngày chế (%) sau 5

ngày

BTA7 67,3ab±2,18 64,63c±2,55

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

BTS5 76,9a±1,56 76,9a±1,56

BP05 76,7ab±1,1 59.7d±1,57

BM07 52,96b±2,81 7,73f±2,95

BPS6 73,73a±1,33 69,2b±2,78

BD01 19,1c±2,58 0g

BT06 71,2a±2,03 71,53b±2,41

BM06 56,63ab±2,64 35,2e±2,8

Các giá trị trung bình cùng kí tự trong cùng 1 cột không có khác biệt có ý nghĩa thống

kê (p<0,01)

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

% 90

TB 3 NGÀY

TB 5 NGÀY

Chủng

BTA7

BTS5

BP06

BM07

BPS6

BD01

BT06

BM06

Hiệu lực ức chế nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum

Hình 3.6: Hiệu lực ức chế nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum của các chủng

Bacillus spp.

Từ hình 3.6 nhận thấy, sau 3 ngày nuôi cấy tất cả các chủng đều cho thấy khả năng

ức chế nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng thanh long. Sau 3

ngày nuôi cấy, hiệu lực ức chế nấm bệnh của các chủng dao động từ 19,23% - 76,67%.

Trong đó, các chủng BTS6, BTS5, BP06 có hiệu lực ức chế nấm bệnh trên 70% lần

lượt là 73,73%, 76,9% và 76,67%. Sau 5 ngày nuôi cấy, hiệu lực ức chế nấm bệnh bắt

đầu giảm, dao động từ 0% -76,9%. Chủng BD01 không còn khả năng ức chế nấm

bệnh.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Nghiên cứu Đỗ Thị Huỳnh Mai, Nguyễn Thị Liên (2014) cho biết từ 26 dòng vi

khuẩn Bacillus spp. có khả năng đối kháng với nấm Neoscytalidium dimidiatum gây

bệnh đốm trắng từ vùng đất trồng lan Ngọc điểm có một số có hiệu lực đối kháng với

nấm gây bệnh dao động từ 62,2 – 79,2% sau 4 ngày chủng vi khuẩn. Như vậy, hiệu lực

đối kháng của các chủng trong nghiên cứu cũng tương đương với công bố kể trên. Kết

quả ở bảng 3.5 cũng cho thấy, chủng BTS5 là chủng có triển vọng trong đối kháng

nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng thanh long.

3.4. Khả năng phân giải lân khó tan của các chủng

Các chủng vi khuẩn sau khi được nuôi trên môi trường P lỏng, sau 3 ngày, 5 ngày, 7

ngày, tiến hành đo OD, dựa vào đường chuẩn phosphate tính toán và thu được các kết

quả trình bày ở bảng 3.7. Phương trình đường chuẩn phosphate xem ở Phụ lục D.

Bảng 3.7: Khả năng phân giải phosphate khó tan sau các khoảng thời gian (𝜇𝑔/𝑚𝑙)

Chủng Nồng độ orthophosphate do VSV phân giải (𝝁𝒈/𝒎𝒍)

1 ngày 3 ngày 5 ngày 7 ngày

BTA7 121,16cd±19,24 381,67d±7,71 560,7ab±33,4 196,74b±13,53

BPS6 251,04a±28,77 590,41a±21,76 590,09ab±49,28 193,49b±18,74

BM06 145,93bc±91,95 477,67bc±39,51 607,14a±8,96 455,82a±1,06

BT05 150,23bc±9,67 418,63cd±27,98 599,30ab±27,00 110,39cd±11,65

BTS5 182,09b±2,86 537,87ab±46,97 563,05ab±20,39 168,06bc±17,67

BP05 120,93cd±23,97 411,66cd±30,34 541,12b±23,47 202,87b±8,87

100

BD01 115,58cd±8,77 403,99d±16,21 544,23b±48,16 149,07bcd±57,62

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

BM07 101,86d±6,26 382,6d±7,02 594,42ab±10,96 100,78d±18.30

Hình 3.7: Hàm lượng phosphate khó tan do các chủng Bacillus spp. phân giải (Trong

đó A: thí nghiệm; B: đối chứng)

700

(𝜇𝑔/𝑚𝑙)

TB 1 ngày

Nồng độ orthophotphate do VSV phân giải (μg/ml) theo thời gian

a

ab

TB 3 ngày

600

ab

b

TB 5 ngày

500

a

TB 7 ngày

400

300

b

200

bc

bcd

d

cd

100

Chủng

BTA7

BPS6

BM06

BT05

BTS5

BP05

BD01

BM07

101

Hình 3.8: Lượng photphat các chủng Bacillus spp. phân giải theo thời gian

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Từ hình 3.8 cho thấy, các chủng phân lập đều có khả năng phân giải phosphate khó

tan trên môi trường Pikovskaya lỏng, các chủng khác nhau thì khả năng phân giải

phosphate khó tan cũng khác nhau. Nồng độ orthophosphate do VSV hòa tan vào dịch

(µg/ml) của các chủng VSV thay đổi khác nhau qua các mốc thời gian nuôi cấy. Thông

qua kết quả, nhận thấy sau khi nuôi cấy 1 ngày thì các chủng đã bắt đầu phân giải

photphate khó tan có trong môi trường. Nhìn chung, lượng phosphate phân giải sẽ tăng

theo thời gian đến ngày thứ 5 sau nuôi cấy sẽ đạt kết quả cực đại và giảm ở ngày thứ 7.

Lượng phosphate phân giải không có quá nhiều sự chênh lệch quá nhiều giữa các

chủng. Các chủng BM06, BT05 cho kết quả tốt nhất lần lượt là 607,14 (µg/ml) và

599,3 (µg/ml).

Theo nghiên cứu của Samiran Banerjee et al (2010) thì chủng TRSB16 (Bacillus

spp.) phân lập từ đất trồng cà chua ở Ấn Độ có khả năng phân giải Ca3(PO4)2 tốt nhất

là 239 µg/ml. So sánh với kết quả thí nghiệm nhận thấy, các chủng phân lập được đều

cho kết quả tốt hơn nghiên cứu của Samiran Banerjee et al (2010).

Ngoài ra, theo báo cáo của Rahim Nosrati et al (2014), thì chủng Azotobater spp.

phân lập từ đất trồng có khả năng phân giải lân tốt nhất là 225 µg/ml sau 3 ngày nuôi

cấy trên môi trường P. Từ kết quả này nhận thấy, so sánh với kết quả thí nghiệm nhận

thấy, các chủng Bacillus spp. phân lập được cho hiệu quả tốt hơn các nghiên cứu.

3.5 Khả năng sinh IAA của các chủng

Sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường NB không bổ sung tryptophan và có bổ sung

tryptophan, tiến hành đo OD và dựa vào đường chuẩn tính toán kết quả. Đường chuẩn

102

IAA xem ở Phụ Lục C.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Bảng 3.8: Khả năng sinh IAA của các chủng Bacillus spp. sau 5 ngày

Chủng Hàm lượng IAA (không Hàm lượng IAA ( có

tryp) tryp)

BT06 5,77b ±0,14 13,49d±0,12

BP05 3,34d±0.10 9,82e±0,14

BTS5 3,18d±0.05 18,6b±0,19

BTS6 7,81a±0.07 9,74e±0,17

BM06 4,14c±0.08 19,25a±0.05

BTA7 2,38e±0.12 15,25c±0.39

BD01 0,077f±00 1,39g±0,12

BM07 0,033f±0.01 2,38f±0,08

Các giá trị trung bình cùng kí tự trong cùng 1 cột không có khác biệt có ý nghĩa thống

103

kê (p<0,01)

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Hình 3.9: Khả năng sinh IAA của các chủng vi khuẩn. (Trong đó A: Bổ sung

tryptophan, B: là không bổ sung tryptophan)

(μg/ml)

Không tryp

có tryp

chủng

bt06

bp05

bts5

bts6

bm06

bta7

bd01

bm07

-5

Hình 3.10: Khả năng sinh IAA của các chủng Bacillus spp.

Từ hình 3.10 nhận thấy có 6 chủng cho thấy khả năng sinh IAA trong môi trường

NB (chưa bổ sung tryp) sau 5 ngày nuôi cấy, kết quả dao động từ 2,4 μg/ml -7,81

μg/ml. Trong đó, chủng BPS6 cho kết quả các nhất với 7,81 μg/ml và chủng BP05 cho

104

kết quả thấp nhất là 2,4 μg/ml.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Khi bổ sung tryptophan vào môi trường nuôi cấy, tiến hành đo OD và nhận thấy

hàm lượng IAA sinh ra cao hơn, và tất cả các chủng đều có khả năng sinh IAA. Sau 5

ngày nuôi cấy, kết quả dao động từ 1,39-19,25 μg/mL. Trong đó, chủng BM06 cho kết

quả cao nhất là 19,25 và thấp nhất là 1,39 của chủng BD01.

So sánh với nghiên cứu về sự tăng trưởng rễ trong quả Kiwi, Erturk et al. (2010) đã

báo cáo hàm lượng IAA khi không bổ sung IAA đối với chủng PGPR Bacillus RC23

(4,3 μg/ml), nhận thấy kết quả thí nghiệm tốt hơn so với kết quả báo cáo của Erturk và

cộng sự. Bên cạnh đó, nghiên cứu của Karnwal (2009) về khả năng sinh IAA c ủa P.

aeruginosa sau 48 giờ nuôi cấy trong môi trường không chứa Trp là 0,8 μg/ml thì

nhóm VSV của thí nghiệm này đều có khả năng sinh IAA tốt hơn.

Ngoài ra, kết quả thí nghiệm vượt trội so với những kết quả được báo cáo bởi một

số tác giả. Assumption (2008), trong các nghiên c ứu về đậu tương, thấy rằng các chủng

Bacillus sp.p. có thể sinh các IAA đ ạt hàm lượng từ 2,6 đến 6,5 μg/mL. Araujo và

Guerreiro (2010), đánh giá các chủng Bacillus trong nghiên cứu về ngô (Zeamays) có

thể sinh các IAA đ ạt hàm lượng từ 0,75 đến 21,3 μg/mL. Theo S.Reetha (2014), trong

nghiên cứu về hành tây, thấy ra chủng Pseudomonas fluorescens and Bacillus subtilis

có thể sinh IAA đạt hàm lượng từ 15.38±0,537 và 2.67±0,325(μg/mL).

3.9 Đánh giá khả năng ức chế nấm bệnh của các chủng vi khuẩn đối với thanh

long ứng dụng bảo quản sau thu hoạch

Các thí nghiệm được thực hiện theo bố trí thí nghiệm, sau 5, 7, 10, 15 ngày, đếm số vết

bệnh xuất hiện do lây bệnh nhân tạo, ghi nhận kết quả, tính toán c ấp số bệnh và chỉ số

105

bệnh hại. Kết quả đươc trình bày trong bảng 3.8. (Xem thêm Phụ lục I)

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Bảng 3.9: Chỉ số bệnh đốm trắng trên thanh long ở các nghiệm thức

Chủng khuẩn Nghiệm thức Chỉ số bệnh (%) ở Chỉ số bệnh (%) ở

5 ngày sau nhiễm 10 ngày sau nhiễm

BTS5 0e 7,4cde± 00 NT1

NT2 7,4bc± 00 7,4 cde± 00

NT3 1,23ed± 2,14 3,7fg± 00

NT1 BTA7 7,4bc± 00 10,2bc± 0,69

NT2 10,6b± 0,69 11b± 00

NT3 3,7cd± 00 8,6fg± 2,08

NT1 BPS6 0e 9,8bc± 2,08

NT2 3,7cd± 00 11b± 00

NT3 6,99bc± 0,74 4,933ef± 2,08

NT1 BP05 3,7cd± 00 6,17def± 2,14

NT2 7,4bc± 00 7,4cde± 00

NT3 6,17c± 2 6,17def± 2,14

NT1 BT06 1,23cd± 2,14 3,7fg± 00

NT2 11b± 00 7,4cde± 00

106

NT3 9,8b± 2 9,8bc± 2,09

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

NT4 53,03a± 4,27 100a± 00

NT5 7,4bc± 2,14 11b± 00

CV (%) 17,85 10,52

Các giá trị trung bình cùng kí tự không khác biệt có nghĩa ở mức có xác xuất p<0,01.

Ghi chú :+ Nghiệm thức 1 (NT1): Phun dịch vi khuẩn (với mật độ 2.108 cfu/ml) trước

lây nhiễm nấm (với mật độ 2.108 cfu/ml) 2 ngày

+ NT2 :Phun dịch vi khuẩn với mật độ 2.108 cfu/ml sau lây nhiễm nấm (với

mật độ 2.108 cfu/ml) 2 ngày

+ NT3: phun dịch vi khuẩn không lây bệnh nhân tạo (với mật độ 2.108 cfu/ml)

+ NT4: lây bệnh nhân tạo, không phun dịch vi khuẩn (với mật độ 2.108

cfu/ml)

107

+ NT5: đối chứng không phun dịch vi khuẩn, không lây bệnh

CSBH %

NT1

NT2

NT3

NT4

NT5

b bc

cd e

Chủng

BP05

BTA7

BPS6

BT06

BTS5

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Hình 3.11: Chỉ số bệnh hại trên thanh long sau 5 ngày

Sau 5 ngày, ở tất cả các các nghiệm thức 1, 2, 3 (có phun dịch ngoại bào của vi

khuẩn), tất cả các quả thanh long chỉ bị bệnh ở cấp 1 ( bệnh hại dưới 5% diện tích quả).

Trong khi đó, ở công thức 4, lây bệnh nhân tạo, nhiều quả thanh long đã bị bệnh đến

cấp 3. Chỉ số bệnh ở các công thức có phun dịch ngoại bào vi khuẩn đều thấp hơn hẳn

so với thanh long ở công thức không phun dịch ngoại bào. So sánh ở cùng thời gian 5

ngày, nhận thấy tỷ lệ bệnh hại ở nghiệm thức 4 cao hơn các nghiệm thức khác rất

nhiều. So sánh kết quả ở nghiệm thức 1 và nghiệm thức 2 với nghiệm thức 4 cho thấy

khả năng ức chế nấm bệnh của các chủng vi khuẩn là rất tốt. Bên cạnh đó, màu sắc quả

thanh long ở NT1 NT2 so với NT4 là khác biệt rất lớn. Ở NT4 cuốn quả thanh long đã

bắt đầu héo vàng, và chuyển sang hư hỏng, ở NT1 và NT2, quả thanh long vẫn còn rất

tươi. So sánh, giữa nghiệm thức 3 và nghiệm thức 5, nhận thấy chỉ số bệnh hại gần như

tương đồng. Tuy nhiên, khi quan sát màu sắc và độ tươi của thanh long, nhận thấy ở

108

nghiệm thức 3, thanh long duy trì được màu sắc và độ tươi hơn so với nghiệm thức 5.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Điều này cho thấy, việc bổ sung dịch ngoại bào của vi khuẩn ngoài khả năng ức chế sự

phát triển của nấm đốm trắng còn có tác dụng chống các nấm bệnh khác, giúp cho trái

CSBH %

120

NT1

100

NT2

NT3

NT4

NT5

cde

b fg

cde

def

cde fg

def

BP05

BTA7

BPS6

BT06

BTS5

chủng/NT

thanh long tươi lâu hơn.

Hình 3.12: Chỉ số bệnh hại trên thanh long sau 10 ngày

Sau 10 ngày thí nghiệm nhận thấy, cấp bệnh hại ở các NT1 NT2 NT3 không có dầu

hiệu tăng, tuy nhiên chỉ số bệnh hại thì có xu hướng tăng so với 7 ngày. Tuy nhiên, khi

so sánh với NT4 nhận thấy, các chủng vi khuẩn vẫn còn tiếp tục duy trì đối kháng. Chỉ

số bệnh hại ở NT4 là 100% cao hơn rất nhiều so với NT1 là 11%, NT2 11%. Bên cạnh

đó, sau ngày thứ 10, NT4 quả bắt đầu hư hỏng. So sánh giữa NT3 và NT5, nhận thấy

NT5 quả thanh long bắt đầu héo dần và hư hỏng.

Từ các kết quả nghiên cứu cho thấy, các chủng Bacillus spp. không chỉ cho kết quả

đối kháng nấm rất tốt trong điều kiện invitro mà trong các thử nghiệm invivo, các kết

quả ghi nhận được cũng rất tốt. Sau 10 ngày theo dõi thí nghiệm, kết quả nhận thấy

mức độ kiểm soát nấm bệnh đạt khoảng 74,2%-84%. Bên cạnh đó, sự khác nhau giữa

NT1( phun khuẩn) và NT5 (quả đối chứng), có thể nhân thấy các chủng Bacillis spp.

109

có khả năng ức chế sản sinh ethylen, ngăn chặn quá trình hô hấp của quả sau thu hoạch

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

dẩn đến việc làm chậm quá trình chín của quả, kéo dài thời gian bảo quản quả thanh

long. Từ đây có thể khẳng định, các chủng Bacillus spp. rất có tiềm năng trong việc

bảo quản sau thu hoạch thanh long.

Trong báo cáo của Y.Wang (2010), khi sử dụng Bacillus subtilis EXWB1 để kiểm

soát quá trình chín và hư hỏng ở dưa hấu sau thu hoạch đã chỉ ra lượng ethylene sinh ra

đã bị trì hoãn vào 2 ngày, khi so với đối chứng giảm 72,3% và giảm 61,6% ethylene

vào ngày thứ 4. So sánh với kết quả thí nghiệm nhận thấy các chủng thí nghiệm cho kết

quả tương đồng với báo cáo của Y.Wang (2010). Tuy nhiên, do hạn chế của đề tài nên

lượng ethylene bị kìm hãm bởi các chủng vi khuản chỉ được định tính thông qua màu

sắc và mức độ hư hỏng ở quả chứ không có kết quả chính xác lượng ethylene đã giảm.

Theo nghiên cứu của L. Korsten và E.E. De Jager (1995) đã chỉ ra hiệu quả ức chế

nấm bệnh của các chủng Bacillus spp. trong bảo quản sau thu ho ạch bơ đạt từ 6,4%-

67,7%. Trong đó chủng Bacillus Subtilis đạt hiệu quả ức chế từ 26,9% - 67,7%. Theo

Parisa Mohammadi et al (2017), khi s ử dụng Bacillus subilis kiểm soát bệnh mốc xanh

trên quả chanh nhận thấy, đường kính nấm bệnh giảm lần lượt là 1,49cm và 2,09cm so

với đối chứng. Sinh viên nhận thấy so với kết quả thí nghiệm, các chủng Bacillus spp.

phân lập được cho kết quả tốt hơn.

3.10 Hiệu quả đối kháng nấm Fusarium sp. gây chết mầm ớt và khả năng kích

thích sinh trưởng cây ớt của các chủng vi khuẩn

Hạt ớt được xử lý với nấm Fusarium sp. và dịch nuôi cấy vi khuẩn theo các công

thức ( Bảng 3.10). Sau khi hạt ớt nảy mầm, theo dõi sự phát triển của cây con sau 15

ngày và tiến hành ghi nhận kết quả. Các chỉ tiêu ghi nhận kết quả gồm có: Chiều cao

cây, chiều dài rễ và số lá. Các kết quả được ghi nhận qua bảng 3.10.

110

Tỷ lệ nảy mầm ớt theo dõi sau 7 ngày và tỷ lệ sống sót theo dõi sau 15 ngày

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Các kết quả ghi nhận được cho thấy, tỷ lệ nảy mầm ở các chủng dao động từ 80-100%

ở các nghiệm thức (Bảng 3.10).

Bảng 3.10: Tỷ lệ (%) nảy mầm, tỷ lệ (%) sống sót, chiều dài rễ, chiều cao cây, số lá

trên cây.

Chủng Nghiệm Chiều cao Dải rễ(cm) Số lá Tỷ lệ cây Tỷ lệ nảy

thức cây( cm) sống (%) mầm (%)

NT1 1,85ef 1,325d 2,875a±0,4 100a±0,0 100%

±0,31 ±0,21 8

1,625fg 1,275d±0,1 1,5c±0,58 80a±0,0 80% 2 BTA7

±0,63 5

1,95ef 1,5cd±0,24 2,875a±0,4 100a ±0,0 100% 3

8 ±0,19

0,25h ±0,29 0,1f±0,12 0e±0,0 26,67b±23, 80% 4

3bcd ±0,42 1,375d±0,1 2,25abc±0,5 83,33a±14, 100% 5

43 3

3,35bc± 3,15a ±0,26 2,125bc±0, 85a±13,23 80% 1

0,13 25

1,875ef±0,2 1,175d 2,75ab±0,5 85a±13,23 100% 2 BTS5

5 ±0,24

4,325a±0,5 2,4b±0,14 2,65ab±0,0 100a±0,0 80% 3

111

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

0,25h 0,1f±0,12 0e±0,0 26,67b±23, 80% 4

±0,29 09

3bcd ±0,42 1,375d±0,1 2,25abc±0,5 83,33b±14, 100% 5

3 43

3.5b±0.4 1,85c±0,19 1,875c±0,2 93,33a±11, 100% 1

5 55

1,75ef±0,5 0,55e ±0,1 2bc±0,0 93,33a±11, 100% 2 BT06

2,9bcd±0,55 1,8c ±0,24 0,775d±0,2 93,33a±11, 80% 3

6 55

0,25h ±0,29 0,1f±0,12 0e±0.0 26,67b±23, 80% 4

3bcd±0,42 1,375d 2,25abc±0.5 83,33a±14, 100% 5

±0,13 43

2,45ed±0,1 1,85c±0,29 2bc±0,0 86,67a±11, 100% 1

9 57

1g±0.0 0,55e±0,1 1,75c±0,5 91,2a±14,4 80% 2 BM06

2,7cd±0,22 0,775e±0,0 2bc±0 86,67a±11, 75% 3

1 57

0,25h±0,29 0,1f±0,12 0e±0,0 26,67b±23, 80% 4

112

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

5 3bcd±0,42 1,375d±0,1 2,25abc±0,5 83,33a±14, 100%

3 43

CV 16,16 13,57 18,02 13,77

(%)

Các giá trị cùng kí tự trong cùng 1 cột không có khác biệt có ý nghĩa thống kê

(p<0,01)

Ghi chú: + Nghiệm thức 1 (NT1): Tưới huyền phù vi khuẩn khuẩn (với mật số 108

cfu/ml) trước khi trồng 1 ngày và tưới huyền phù nấm (với mật số 108 cfu/ml) sau khi

trồng 7 ngày.

+ NT2: Tưới huyền phù nấm (với mật số 108 cfu/ml) trước khi trồng 1 ngày và tưới

huyền phù vi khuẩn (với mật số 108 cfu/ml) sau khi trồng 7 ngày.

+ NT3: Tưới huyền phù vi khuẩn khuẩn (với mật số 108 cfu/ml) trước khi trồng 1 ngày

+ NT4: Tưới huyền phù nấm (vớ mật số 108 cfu/ml) trước khi trồng 1 ngày.

+NT5: Tưới nước cất

Từ bảng 3.10 nhận thấy, các chỉ tiêu theo dõi ở NT4 cho kết quả thấp nhất so với

các nghiệm thức còn lại. Số lượng cây ớt sống sót 26,67%. Thời gian theo dõi sự phát

triển của các cây ớt sau nảy nầm là 15 ngày. Có thể nhận thấy, nấm bệnh Fusarium sp.

đã ức chế và gây bệnh trực tiếp lên giai đoạn cây con của cây ớt.

So sánh các các kết quả ở nghiệm thức 1 (NT1), nghiệm thức 2 (NT2) và NT4, sinh

viên nhận thấy sự khác biệt kết quả mang ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức. Tỷ lệ

sống sót của cây ở NT1 và NT2 từ 80%-100%. So sánh giữa NT3 và NT5 sinh viên

nhận thấy, tỷ lệ sống sót và sự phát triển ở NT3 (86,67% - 100%) tốt hơn NT5

113

83,33%.

NT1

bcd

NT2

NT3

NT4

NT5

chủng/NT

BTA7

BT06

BTS5

BM06

-1

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Hình 3.13: Chiều cao cây qua các nghiệm thức

Từ hình 3.13, sinh viên nhận thấy chiều cao cây ở các chủng và ở giữa các nghiệm

thức có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê. Chiều cao cây của các cây ớt có bổ sung

các chủng vi khuẩn ở NT1 dao động từ 1,85cm – 3,5cm trong đó chủng có kết quả cao

nhất là BT06 3,5cm và BTA7 có kết quả thấp nhất là 1,85cm. NT2 dao động từ 1cm-

1,875cm trong đó chủng có kết quả thấp nhất là BM06 1cm và cao nhất BTS5

1,875cm. So sánh kết quả giữa nghiệm thức 3 (NT3) và nghiệm thức 5 (NT5), nhận

thấy có sự khác biệt đáng kể. Ở NT3, các cây ớt được bổ sung các chủng vi khuẩn

trước khi trồng cho thấy sự phát triển tốt hơn. Chiều cao trung bình cây của các cây ớt

ở NT3 dao động ở mức từ 1,95 – 4,325cm, trong đó chủng BTS5 cho kết quả 4,325cm,

114

NT5 là 3cm.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

CHIỀU DÀI RỄ CÂY QUA CÁC NGHIỆM THỨC (cm)

3.5

2.5

NT1

NT2

NT3

1.5

NT4

NT5

0.5

BTA7

BT06

BTS5

BM06

-0.5

Hình 3.14: Chiều dài rễ qua các nghiệm thức

Từ hình 3.14 sinh viên nhận thấy chiều dài rễ của các cây ớt có bố sung các chủng

vi khuẩn ở NT1 dao động từ 1,325cm – 3,15cm trong đó chủng có kết quả thấp nhất là

BTA7 1,325cm, và cao nhất là chủng BTS5 3,15cm, NT2 dao động từ 0,55cm-

1,275cm, trong đó BP05 cho kết quả thấp nhất là 0,55cm và chủng BPS5 cho kết quả

cao nhất là 1,275cm. So sánh kết quả giữa nghiệm thức 3 (NT3) và nghiệm thức 5

(NT5), nhận thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa hai NT. Ở NT3, các cây ớt

được bổ sung các chủng vi khuẩn trước khi trồng cho thấy sự phát triển tốt hơn. Chiều

115

dài rễ của các cây ớt dao động từ 0,775 cm – 2,4cm ở NT3 và ở NT5 1,375cm.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

3.5

abc

NT1

2.5

NT2

NT3

1.5

NT4

NT5

0.5

BTA7

BT06

BTS5

BM06

SỐ LÁ QUA TỪNG NGHIỆM THỨC

Hình 3.15: Số lá trên cây ớt của các chủng ở các nghiệm thức

Từ hình 3.15 sinh viên nhận thấy số lá của các cây ớt có bố sung các chủng vi

khuẩn ở NT1 dao động từ 1,875 – 2,875 trong đó BT06 có kết quả thấp nhất là

1,875cm, cao nhất là chủng BTS5 là 2,875cm, NT2 dao động từ 1,5-2,75 trong đó cao

nhất ở chủng BTS5 là 2.67 và thấp nhất ở chủng BTA7 là 1,5. So sánh kết quả giữa

nghiệm thức 3 (NT3) và nghiệm thức 5 (NT5), nhận thấy có sự khác biệt mang ý nghĩa

thống kê giữa 2 NT. Ở NT3, các cây ớt được bổ sung các chủng vi khuẩn trước khi

trồng cho thấy sự phát triển tốt hơn. Số lá của các cây ớt ở NT3 dao động từ 0,775 –

2,875cm và ở NT5 là 2,25cm.

Qua các kết quả thí nghiệm, sinh viên nhận thấy các chủng Bacillus spp. có khả

năng ức chế nấm bệnh Fusarium trên cây ớt rất tốt. Kết quả này cũng tương tự kết quả

của nhiều nghiên cứu trước. Theo Caroline Fadeke Ajilogba và cộng sự (2017), khi sử

dụng các chủng Bacillus spp. kiểm soát nấm bệnh Fusarium sp. trên cây cà chua đạt

kết quả khá cao. Trong đó chiều cao cây và chiều dài rễ trên cây cà chua khi bổ sung

Bacillus cereus (38mm ± 1,47 và 31mm ± 1,22) dài hơn đáng kể (p = 0,05) so với đối

116

chứng khi theo dõi trên cùng một điều kiện.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Theo nghiên cứu của K.Karimi et al (2012) nhận thấy khi bổ sung các chủng

Bacillus subtilis vào đất và trồng đậu xanh chiểu cao cây dao động từ 32,41cm – 35cm,

chiều dài rễ dao động 15,29cm - 17,04cm cao hơn so đối chứng lần lượt là là 32,25cm

và 14,16cm (P=0,05). Sinh viên nhận thấy, kết quả thí nghiệm tương đương với kết quả

của nghiên cứu.

3.11 Định danh các chủng có triển vọng

Trên cơ sở các kết quả kể trên, sinh viên nhận thấy chủng BPS6, BTS5 và BTA7

cho các kết quả đối kháng nấm bệnh và hỗ trợ sinh trưởng cây trồng tốt. Trong đó,

chủng BPS6 và BTS5 có nhiều đặc điểm tương đồng về hình dáng khuẩn lạc. Vì vậy,

sinh viên tiến hành gửi mẫu sang công ty Nam Khoa để định danh sinh học phân tử 2

chủng BPS6 và BTA7. Kết quả cho thấy:

- Chủng PBS6 là chủng Bacillus sutilis với độ tương đồng lên đến 100%. (Hình 3.16 và

Hình 3.17)

117

Hình 3.16: Kết quả giải trình tự gen 16S của mẫu BPS6

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Hình 3.17: Kết quả tra cứu trên BLAST SEARCH (NCBI) của chủng BPS6

- Chủng BTA7 là chủng Bacillus amyloliquefaciens với độ tương đồng lên đến 100%

(hình 3.18 và hình 3.19)

118

Hình 3.18: Kết quả giải trình tự 16S của chủng BTA7

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

119

Hình 3.19: Kết quả tra cứu trên BLAST SEARCH (NCBI) của chủng BTA7

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1. Kết luận

Đã phân lập được 8 chủng vi khuẩn có đặc điểm hình thái và đ ặc điểm sinh hóa trùng

với đặc điểm của chi Bacillus theo khóa phân loại của Bergey.

Các chủng phân lập được đều có khả năng sinh enzyme cellulase và chitinase. Trong

đó, BPS6 và BTS5 có khả năng sinh chitinase cao nhất. Chủng BP06 và BPS6 là 2

chủng có khả năng sinh cellulase cao nhất.

Các chủng phân lập được đều có khả năng phân giải phosp.hate khó tan. Trong đó,

chủng BM06 và BTS5 có khả năng phân giải phosphate khó tan cao nhất.

Các chủng phân lập được đều có khả năng đối kháng với 2 loài nấm Fusarium sp. và

Neoscytalidium dimidiatum trong điều kiện in vitro. Trong đó, chủng BTS5 và BTA7

có khả năng đối kháng nấm Fusarium sp. cao nhất. Chủng BTS5 và BT06 có khả năng

đối kháng nấm Neoscytalidium dimidiatum cao nhất.

Các chủng phân lập được đều có khả năng đối kháng nấm Neoscytalidium dimidiatum

trong điều kiện invivo và có khả năng kéo dài thời gian bảo quản sau thu hoạch trái

thanh long so với đối chứng.

Trên đồng ruộng, các chủng vi khuẩn phân lập được đều có khả năng kháng nấm

Fusarium sp. và tăng cường sự sinh trưởng của cây trồng tốt hơn so với đối chứng.

Đã định danh được 2 chủng BPS6 và BTA7 với tên khoa học tương ứng là Bacillus

sutilis và Bacillus amyloliquefaciens với độ tương đồng lên đến 100%

4.2. Kiến nghị

- Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng với các loài nấm bệnh khác.

120

- Nghiên cứu kết hợp các chủng để nâng cao hoạt tính sinh học của chúng.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

- Nghiên cứu sử dụng các chủng có triển vọng để bảo quản sau thu hoạch quả thanh

121

long.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tham khảo tiếng việt:

Bùi Thị Phi, 2007. Phân lập, khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis và tìm

hiểu khả năng sinh enzyme của vi khuẩn để sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học.

Lê Huy Bá (2000). Sinh Thái Môi Trường Đất, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Thành

phố Hồ Chí Minh.

Nguyễn Lân Dũng, Bùi Xuân Đồng, Lê Đình Lương (1982), Vi nấm, NXB khoa học

và kĩ thuật Hà Nội

Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2001). Vi sinh vật học, Nhà

xuất bản Giáo dục. Hà Nội

Nguyễn Lân Dũng, Đinh Thúy Hằng (2006). Vi sinh vật hoc, NXB Giáo dục, Hà Nôi.

Nguyễn Thị Trần Thụy (2009), Nghiên cứu tuyển chọn chủng Bacillus phân lập từ đất

vườn sinh protease kiềm, luận văn thạc sỹ sinh học, Đại học sư phạm TP. Hồ Chí

Minh, TP. Hồ Chí Minh.

Phạm Văn Toản (2002). Báo cáo kết quả đề tài KHCN.02.06: Nghiên cứu áp dụng

công nghệ mới nhằm mở rộng việc sản xuất, ứng dụng phân VSV cố định đạm và phân

giải lân phục vụ phát triển nông nghiệp bền vững. Hội nghị tổng kết các chương trình

khoa học và công nghệ cấp Nhà nước giai đoạn 1996-2000. Hà Nội 12/2002

Trần Kong Tấu (2009), Tài Nguyên Đất, Nhà xuất Bản Đại Học Quốc Gia Hà Nội.

Vũ Minh Đức, Ngô Tự Thành, Bùi Thị Việt Hà, Chu Văn Mẫn, Nghiên cứu hoạt tính

enzym ngoại bào của một số chủng Bacillus mới phân lập và khả năng ứng dụng chúng

122

trong xử lí nước thải, Khoa Sinh, Trường đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Tài liệu tham khảo tiếng anh:

Antoun, H., C.L. Beauchamp, N. Goussard, R. Chabot, and L. Roger (1998). Potential

of Rhizobium and Bradyrhizobium speciess as plant growth promoting

Booth C (1971), Fusarium nomenclature, The genus Fusarium, chủ biên,

Commonweath Mycological Institute, Kew, Surrey

Burgess L.W. và các cộng sự (2009), Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam,

Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Quốc tế Australia (ACIAR).

Burgess LW, Nelson PE, Toussoun TA, Forbes GA. Distribution of Fusarium species

in section Roseum, Arthrosporiella, Gibbosum and Discolor recovered from grassland,

pasture and pine nursery soils of Eastern Australia. Mycologia. 1988;80(6):815–824.

Caroline Fadeke Ajilogba et al (2017). Application of Bacillus amyloliquefaciens to

control black rot disease on cabbage caused by Xanthomonas campestris pv.

Campestris. DOI:10.6716/JPM.201709_59(3).0005

Dunlap CA, Bowman MJ, Schisler DA. Genomic analysis and secondary metabolite

production in Bacillus amyloliquefaciens AS 43.3: a biocontrol antagonist of Fusarium

head blight. Biol Control. 2013;64(2):166–175.

Hamel C Vujanovic V, Yergeau E, Arnaud M.S (2006), "Biodiversity and

Biogeopraphy of Fusarium Species from Northeastern North American Asp.aragus

Fields Based on Microbiogical and Molercular Approaches", Sp.ringer Science anh

Business Media.

Holt và cs, 1994. Bergey’s manual of determinative bacteriology

Hong HA, Khaneja R, Tam NM, Cazzato A, Tan S, Urdaci M, Brisson A, Gasbarrini

A, Barnes I, Cutting SM (March 2009). "Bacillus subtilis isolated from the human

123

gastrointestinal tract". Research in Microbiology. 160 (2): 134–43.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Jamil Shafi, Hui Tian & Mingshan Ji, 2017.Bacillus Species as versatile weapons for

plant pathogens: a review. Journal of Biotechnology & Biotechnological Equipment

Volume 31,

Julien J Guadet J, Lajay J.F, Brygoo Y (1989), "Phylogeny of some Fusarium, as

dertermined by large_subumit rARN sequence comparison".

M. Dworkin, The Prokaryotes - Vol. 4: Bacteria: Firmicutes, Cyanobacteria. Sp.ringer

Publisher, 2006

Malarkodi Chelladurai et al (2013).Bacterial synthesis of silver nanoparticles by using

optimized biomass growth of Bacillus spp.

McKenney, Peter T.; Driks, Adam; Eichenberger, Patrick (2013). "The Bacillus subtilis

endospore: assembly and functions of the multilayered coat". Nature Reviews

Microbiology. 11 (1): 33–44. doi:10.1038/nrmicro2921

N. Ahmed, S. Shahab (2011). Phosp.hate Solubilization: Their Mechanism Genetics

And Application. The Internet Journal of Microbiology. Volume 9 Number 1. DOI:

10.5580/2327.

Nelson PE, Dignani MC, Anaissie EJ. Taxonomy, biology and clinical asp.ect

of Fusarium sp.ecies. Clinical Microbiology Review. 1994;7(4):479–504. [PMC free

article] [PubMed]

Nirenberg HI Gerlach W (1982), "The genus Fusarium - a pictorial atlas".

P. Alvaro, Elke Lang, Susanne Verbarg, Cathrin Sp.roer, Raul RivasJunli (2009).

Acinetobacter strains IH9 and OCI1, two rhizosp.heric phosp.hate solubilizing isolate s

able to promote plant growth, constitute a new genomovar of Acinetobacter

124

calcoaceticus

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Radhakrishnan R, Hashem A, Abd Allah E., 2017. Bacillus: A Biological Tool for

Crop Improvement through Bio-Molecular Changes in Adverse Environments. Front

Physiol., 8: 667.

Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, American Public

Health Association, Washington D.C. Method 4500-P D Stannous Chloride Method

Y.Yang et al (2010). Postharvest biological control of melon pathogens using bacillus

subtilis exwb1. Journal of Plant Pathology (2010), 92 (3), 645-652

Tài liệu tham khảo internet:

https://vi.wikipedia.org/wiki/Tr%E1%BB%B1c_khu%E1%BA%A9n

https://toc.123doc.org/document/1416930-lich-su-phat-hien-dac-diem-phan-loai-va-su-

phan-bo-cua-vi-khuan-bacillus-subtilis-dac-diem-hinh-thai-dac-diem-ni-cay.htm

http://kythuatnuoitrong.com/dac-tinh-sinh-hoc-cua-vi-khuan-bacillus-sutilis/

http://thuysancantho.vn/dac-tinh-sinh-hoc-cua-vi-khuan-bacillus-sutilis/

http://biosun.vn/benh-dom-trang-tren-cay-thanh-long/

.http://ppri.org.vn/tinh-hinh-benh-dom-trang-thanh-long-va-phuong-an-giai-quyet-

c2a114.html

https://123doc.org//document/2566881-nghien-cuu-xac-dinh-nam-gay-benh-loet-tren-

cay-thanh-long.htm

http://biosun.vn/benh-dom-trang-tren-cay-thanh-long/

http://hoinongdan.cantho.gov.vn/Default.asp.x?tabid=199&NDID=1048&key=Nong_d

an_Thot_Not_trong_cay_ot_trung_mua_duoc_gia

125

http://www.congtyhai.com/benh-heo-vang-tren-cay-ot

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

https://vietnamnongnghiepsach.com.vn/2017/10/14/cac-phong-va-tri-benh-heo-vang-

tren-cay-ot/

http://phubinhlab.com/san-pham/nutrient-agar-na-biolife-italia

https://vi.wikipedia.org/wiki/Vi_khu%E1%BA%A9n

https://www.slideshare.net/haholuki/kiem-nghiem-vi-sinh-vat-part1

http://doan.edu.vn/do-an/so-luoc-ve-chitin-va-chitinase-24496/

1.http://ppri.org.vn/tinh-hinh-benh-dom-trang-thanh-long-va-phuong-an-giai-quyet-

c2a114.html

http://biosun.vn/tinh-hinh-benh-dom-trang-thanh-long/

126

https://en.wikipedia.org/wiki/Neoscytalidium_dimidiatum

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC A: ĐƯỜNG CHUẨN NẤM

Đường chuẩn nấm Neoscytalidium dimidiatum

Mật độ bào tử ghi nhận được sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường PB là 6.44×10^8

cfu/ml

Bảng 1 : OD ghi nhận được sau 3 lần do

HSP.L Log tb OD OD TB

(cfu/ml)

2 8,51 0,428 0,427 0,306 0,387

4 8,21 0,301 0,245 0,372 0,306

8 7,9 0,199 0,235 0,241 0,225

16 7,6 0,171 0,087 0,117 0,125

32 7,3 0,024 0,014 0,016 0,018

0.45

0.4

y = 0.3032x - 2.1844 R² = 0.995

0.35

0.3

0.25

Series1

0.2

Linear (Series1)

0.15

0.1

0.05

7.5

8.5

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Hình 1: Đường chuẩn nấm Neoscytalidium dimidiatum

Đường chuẩn nấm Fusarium sp.

Mật độ nấm sau nuôi cấy 5 ngày trên môi trường PDB 6.2× 108 cfu/ml

Bảng 4.2: OD ghi nhận được sau 3 lần do

HSP.L Log OD OD trung

(cfu/ml)

2 8,49 0,638 0,432 0,415 0,495

4 8,19 0,375 0,382 0,398 0,385

8 7,89 0,268 0,288 0,218 0,258

16 7,59 0,193 0,123 0,167 0,161

32 7,29 0,027 0,011 0,007 0,015

0.6

0.5

y = 0.3947x - 2.8511 R² = 0.9968

0.4

Series1

0.3

Linear (Series1)

0.2

0.1

7.5

8.5

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Hình 2: Đường chuẩn nấm Fusarium sp.

PHỤ LỤC B: ĐƯỜNG CHUẨN TẾ BÀO VI KHUẨN

Đường chuẩn tế bào chủng BM06

Mật độ tế bào sau nuôi cấy trên môi trường NB đạt 1.5×108 cfu/ml

HSPL log od tb

4 7,57 0,575 0,464 0,575 0,538

8 7,27 0,392 0,325 0,45 0,389

16 6,97 0,252 0,248 0,259 0,253

32 6,67 0,103 0,044 0,198 0,115

64 6,37 0,008 0,001 0,017 0,002

Bảng 1: Od sau 3 lần đo

0.6

y = 0.4487x - 2.8678 R² = 0.9979

0.5

0.4

0.3

Series1

Linear (Series1)

0.2

0.1

6.5

7.5

-0.1

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Hình 1: Đường chuẩn vi khuẩn chủng BM06

Đường chuẩn chủng BT06

Mật độ tế bào sau 24h nuôi cấy trên môi trường NB là 2.69×10^8 cfu/ml

Bảng 2: OD sau 3 lần đo

HSPL log tb OD od tb

4 7,83 0,609 0,755 0,691 0,685

8 7,52 0,309 0,611 0,599 0,511

16 7,23 0,246 0,498 0,411 0,385

32 6,92 0,182 0,214 0,198 0,198

64 6,62 0,034 0,027 0,017 0,026

0.8

0.7

y = 0.5403x - 3.5418 R² = 0.9977

0.6

0.5

Series1

0.4

Linear (Series1)

0.3

0.2

0.1

6.5

7.5

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Hình 2: Đường chuẩn tế bào chủng BT06

Đường chuẩn tế bào của chủng BP05

Mật độ tế bào sau nuôi cấy 24h trên môi trường NB đạt 3.09×108 cfu/mL

Bảng 3: Kết quả đo OD sau 3 lần

HSP.L Log tb OD Od tb

2 8,19 0,837 0,816 0,798 0,817

4 7,98 0,755 0,712 0,477 0,648

8 7,59 0,464 0,46 0,339 0,421

16 7,29 0,22 0,228 0,125 0,191

32 6,98 0,047 0,032 0,023 0,034

0.9

0.8

y = 0.6487x - 4.5116 R² = 0.996

0.7

0.6

0.5

Series1

0.4

Linear (Series1)

0.3

0.2

0.1

6.5

7.5

8.5

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Hình 4.10: Đường chuẩn tế bào chủng BP05

Đường chuẩn tế bào chủng BPS6

Mật độ tế bào sau nuôi cấy trên môi trường NB đạt 3.13×108cfu/ml

Bảng 4: Od sau 3 lần đo

HSP,l log tb OD od tb

4 7,89 0,681 0,625 0,515 0,607

8 7,59 0,411 0,467 0,43 0,446

16 7,29 0,346 0,292 0,28 0,306

32 6,99 0,212 0,182 0,158 0,184

64 6,69 0,007 0,003 0,005 0,005

0.7

0.6

y = 0.4887x - 3.2528 R² = 0.9967

0.5

0.4

Series1

0.3

Linear (Series1)

0.2

0.1

6.5

7.5

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Hình 4: Đường chuẩn tế bào chủng BPS6

Đường chuẩn tế bào chủng BTA7

Mật độ tế bào sau nuôi cấy trên môi trường NB đạt 5.1×108 cfu/mL

Bảng 5: Kết quả od sau 3 lần đo

HSPL log tb od

4 8,1 0,575 0,513 0,547 0,545

8 7,8 0,428 0,345 0,385 0,386

16 7,5 0,325 0,225 0,263 0,271

32 7,2 0,79 0,125 0,161 0,155

64 6,9 0,064 0,008 0,009 0,027

0.6

y = 0.4223x - 2.8907 R² = 0.9963

0.5

0.4

Series1

0.3

Linear (Series1)

0.2

0.1

6.5

7.5

8.5

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Hình 5: Đường chuẩn tế bào chủng BTA7

Đường chuẩn tế bào chủng BTS5

Mật độ tế bào sau nuôi cấy trên NB đạt 3.05×108 cfu/ml

Bảng 6: OD sau 3 lần đo

HSP,L log tb od

2 8,18 0,648 0,605 0,562 0,605

4 7,88 0,481 0,512 0,357 0,45

8 7,58 0,401 0,357 0,28 0,346

16 7,28 0,177 0,19 0,164 0,177

32 6,98 0,052 0,043 0,034 0,043

0.7

0.6

y = 0.4657x - 3.2056 R² = 0.9963

0.5

0.4

Series1

0.3

Linear (Series1)

0.2

0.1

6.5

7.5

8.5

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Hình 6: Đường chuẩn tế bào chủng BTS5

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

PHỤ LỤC C: ĐƯỜNG CHUẨN IAA

Chuẩn bị thuốc thử Salkowski

Lấy 553ml H2SO4 (98%) cho vào nươc cất đủ một lít, để nguội sau 12h, được dung

dịch H2SO4 10,8M.

Cân 4,5g FeCl3 cho vào 1 lít dung dịch H2SO4 10,8M ở trên thu được thuốc thử

Salkowski.

Chuẩn bị dung dịch IAA ở các nồng độ chuẩn

Cân 0,01g IAA bổ sung vào 100ml môi trường nuôi cấy ban đầu, thu được dung dịch

IAA có nồng độ 100mg/l. Pha loãng để thu được dung dịch IAA ỏ các nồng độ 5, 10,

15, 20, 25 mg/l.

Hút 1ml mỗi nồng độ IAA ở trên cho vào ống nghiệm được dán băng keo đen bổ sung

vào mỗi ống 2ml thuốc thử Salkowski, lắc đều để 15 phút trong tối, ở nhiệt độ phòng

chờ phản ứng xảy ra hoàn toàn. Tiến hành đo OD ở bước sóng 530nm.

Từ kết quả xác định được phương trình đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa chỉ

số OD 530nm và nồng độ IAA (mg/l) gọi tắt là dường chuẩn IAA.

Bảng kết quả biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang theo nồng độ IAA(mg/l) gọi tắt

là đường chuẩn IAA.

Bảng 1: Xây dựng đường chuẩn tính toán nồng độ IAA

Thể tích IAA 100mg/l (ml) 0 10 15 20 25 5

Thể tích môi trường (ml) 100 95 90 85 80 75

0 10 15 20 25 5 Nồng độ IAA (𝜇𝑔/𝑚𝑙)

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Hình 1: Nồng độ IAA

Nồng độ IAA OD

(

0 0

5 0,221

10 0,405

15 0,555

20 0,705

25 0,815

Bảng 3: Od tương ứng từng nồng độ IAA

0.9

0.8

y = 0.0298x + 0.0938 R² = 0.9926

0.7

0.6

0.5

Series1

0.4

Linear (Series1)

0.3

0.2

0.1

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Hình 2: Đường chuẩn IAA

PHỤ LỤC D: ĐƯỜNG CHUẨN PHOSPHATE

Để tính tương quan giữa chỉ số mật độ quang (OD) và nồng độ orthophosphate cần

thiết lập phương trình tương quan giữa hai chỉ số đó bằng KH2PO4.

* Xác định phương trình thể hiện mối trương quan giữa chỉ số OD690nm và nồng độ

orthophosp.hate

Chuẩn bị dung dịch Amonium molypdate (AM).

Thêm từ từ 280ml H2SO4 đậm đặc vào 600ml nước cất, chờ dung dịch nguội, tiếp tục

thêm 25g (NH4)6Mo7O24.4H2O và hòa tan hoàn toàn. Thêm nước cất tới 1l.

Chuẩn bị dung dịch SnCl2

Hòa tan 5g SnCl2.2H2O trong 200ml glycerol. Đun nóng dung dịch ở 800C đến khi tan

hoàn toàn. Bảo quản dung dịch trong chai nâu.

3- 10mg/l.

Chuẩn bị dung dịch PO4

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Hòa tan 1,433g KH2PO4 khan (đã sấy khô ở 1050C trong 2h trước đó) vào nước cất và

3-1000mg/l.

định mức tới 1l ta được dung dịch PO4

3- 1000mg/l ở trên thêm nước cất và định mức tới 1l ta được

Lấy 10ml dung dịch PO4

3-10mg/l.

dung dịch PO4

3- 10mg/l để pha dãy nồng độ theo bảng 1.1.

Sử dụng dung dịch PO4

Bảng 1. Xây dựng đường chuẩn tính toán nồng độ orthophosphate

3- (mg/l)

Nồng độ PO4

Hóa chất

0,8 1,6 2,4 3,2 4,0 0

0 4 8 Dung dịch KH2PO4 10mg/l (ml) 12 16 20

4 4 4 Dung dịch AM (ml) 4 4 4

Dung dịch SnCl2 (giọt) 10 10 10 10 10 10

Định mức tới vạch 50ml bằng nước cất, đảo đều bình, đợi 10 – 12 phút, đo

OD690nm

OD 0 0,214 0,373 0,545 0,733 0,877

Từ kết quả trên, ta xác định được phương trình đường chuẩn thể hiện mối tương

3- (mg/l) gọi tắt là đường chuẩn phosphate.

quan giữa chỉ số OD690nm và nồng độ PO4

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Hình 1: Nồng độ photphate sau khi pha loãng

nồng độ od

photphate( mg/l)

0 0

0,8 0,215

1,6 0,365

2,4 0,515

3,2 0,721

4 0,875

Bảng 2: OD tương ứng với từng nồng độ

0.9

y = 0.2095x + 0.0354 R² = 0.9966

0.8

0.7

0.6

Series1

0.5

Linear (Series1)

0.4

0.3

0.2

0.1

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Hình 2: Đường chuẩn photphate

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

PHỤ LỤC E: HÌNH ẢNH CÁC THỬ NGHIỆM SINH HÓA CỦA CÁC CHỦNG VI

KHUẨN PHÂN LẬP ĐƯỢC

1. Thử nghiệm catalase

A D

H C F

DC (-) DC (+)

2. Thử nghiệm khả năng di động

H C E F G D B A

DC (+) DC (-)

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

3. Thử nghiệm citrate

4.Thử nghiệm methyl red

5. Thử nghiệm VP

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

A B C D E DC (-) F G DC (+)

Hình 3.2.5: Thử nghiệm VP

6.Thử nghiệm Indole

A B F C G H D E DC (+) DC (-)

Hình 3.2.6: Thử nghiệm Indole

7. Thử nghiệm khả năng di động

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

B C D E F DC (-) A G DC (+) H

Hình 3.2.7: Thử nghiệm tan chảy Gelatin

Trong đó: A: Chủng BPS6; B: Chủng BP05; C: Chủng BTA7; D: Chủng BTS5; E:

Chủng BT06; F: Chủng BM06; G: Chủng BM07; H: Chủng BD01

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

PHỤ LỤC F

QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA

QCVN 01-38:2010/BNNPTNT

VỀ PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU TRA PHÁT HIỆN DỊCH HẠI CÂY TRỒNG

National technical regulation on Surveillance method of plant pests

QUY ĐỊNH PHÂN CẤP HẠI

I. PHÂN CẤP HẠI TRÊN LÁ, THÂN, BÔNG TRÊN LÚA, NGÔ, RAU, M ẦU VÀ

CÂY CÔNG NGHIỆP, CÂY ĂN QUẢ

1. Bệnh trên lá:

Cấp 1: < 1% diện tích lá bị hại.

Cấp 3: 1 đến 5% diện tích lá bị hại.

Cấp 5: > 5 đến 25% diện tích lá bị hại.

Cấp 7: > 25 đến 50% diện tích lá bị hại.

Cấp 9: > 50% diện tích lá bị hại.

2. Bệnh trên thân (Bệnh khô vằn, tiêm hạch):

Cấp 1: < 1/4 diện tích bẹ lá bị hại.

Cấp 3: > 1/4 đến 1/2 diện tích bẹ lá bị hại.

Cấp 5: > 1/4 đến 1/2 diện tích bẹ lá bị hại, cộng lá thứ 3, thứ 4 bị bệnh nhẹ.

Cấp 7: > 1/2 đến 3/4 diện tích bẹ lá bị hại và lá phía trên bị hại.

Cấp 9: Vết bệnh leo tới đỉnh cây lúa, các lá nhiễm nặng, một số cây chết.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

(Đối với bệnh vàng lá vi rút, nghẹt rễ thì điều tra theo nhóm, tính tỷ lệ khóm bị hại;

bệnh von, bệnh thối dảnh và các loại bệnh trên thân khác thì tính tỷ lệ % thân, dảnh bị

hại).

3. Bệnh trên bông (bông lúa):

Cấp 1: < Vết bệnh đến 1% hạt bị bệnh.

Cấp 3: > 1 - 5% hạt bị bệnh.

Cấp 5: > 5 - 25% hạt bị bệnh.

Cấp 7: > 25 - 50% hạt bị bệnh.

Cấp 9: > 50% hạt bị bệnh.

4. Bệnh trên lá, quả (bệnh loét sẹo cam, quýt):

Cấp 1: Vết bệnh đến 5% diện tích lá, quả có vết bệnh.

Cấp 3: > 5 - 10% diện tích lá, quả có vết bệnh.

Cấp 5: > 10 - 15% diện tích lá, quả có vết bệnh.

Cấp 7: > 15 -20% diện tích lá, quả có vết bệnh.

Cấp 9: > 20% diện tích lá, quả có vết bệnh.

5. Bệnh muội quả, lá, bệnh tàn lụi, bệnh xanh quả

Cấp 1: Vết bệnh đến 10% diện tích lá, quả, tán cây bị bệnh.

Cấp 3: >10 - 20% diện tích lá, quả, tán cây bị bệnh.

Cấp 5: > 20 - 30% diện tích lá, quả, tán cây bị bệnh.

Cấp 7: > 30 - 40% diện tích lá, quả, tán cây bị bệnh.

Cấp 9: > 40% diện tích lá, quả, tán cây bị bệnh.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

6. Bệnh hại cành (bệnh chảy nhựa):

Cấp 1: từ vết bệnh đến 10% diện tích cành 1 tuổi bị bệnh.

Cấp 3: > 10 - 20% diện tích cành 1 tuổi hoặc 10% cành 3 tuổi bị bệnh.

Cấp 5: > 20% diện tích cành 3 tuổi hoặc 10% cành 4 tuổi bị bệnh.

Cấp 7: > 20% cành 4 tuổi hoặc 10% cành cơ bản bị bệnh.

Cấp 9: > 20% cành cơ bản hoặc 50% chu vi vỏ gốc bị bệnh.

II. PHÂN CẤP ĐỐI VỚI LOẠI CHÍCH HÚT (rệp, nhện, bọ trĩ, bọ phấn, …) TRÊN

RAU MẦU, CÂY CÔNG NGHIỆP, CÂY ĂN QUẢ…:

Phân theo 3 cấp như sau:

Cấp 1: Nhẹ (xuất hiện rải rác).

Cấp 2: Trung bình (phân bố dưới 1/3 dảnh, búp, cờ, cây).

Cấp 3: Nặng (phân bố trên 1/3 dảnh, búp, cờ, cây).

III. ĐỐI VỚI SÂU ĐỤC THÂN, CÀNH CỦA CÂY ĂN QUẢ, CÂY CÔNG NGHIỆP:

Cấp 1: Nhẹ (cây có 1 - 2 vết đục trên thân hoặc 1 cành bị héo, cây vẫn xanh tốt).

Cấp 2: Nhẹ (cây có 3 - 5 vết đục thân hoặc 2 đến 4 cành bị đục, cây phát triển trung

bình).

Cấp 3: Nặng (dùng tay lắc nhẹ, cây bị gẫy do vết đục của sâu, tán cây vàng héo).

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

PHỤ LỤC G: HÌNH ẢNH THỂ HIỆN KHẢ NĂNG SINH ENZYME NGOẠI BÀO

CỦA CÁC CHỦNG BACILLUS SPP.

1. Enzyme Chitinase

BP06 BTS5

BM07 BD01

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

BM06 BTA7

BPS6

BT06

Hình 1: Khả năng sinh enzyme chitinase của các chủng vi khuẩn

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

2. Enzyme Cellulase

BP06 BM06

BD01 BTA7

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

BPS6 BM07

BTS5 BT06

Hình 2: Khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng vi khuẩn

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

PHỤ LỤC H: HÌNH ẢNH THỂ HIỆN KHẢ NĂNG ỨC CHẾ NẤM BỆNH CỦA

CÁC CHỦNG BACILLUS SPP.

1. Khả năng ức chế nấm bệnh Fusarium sp.

BTA7 DC -

BPS6 BTS5

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

BD01 BT06

BP05

BM07

Hình 1a: Hiệu lực ức chế nấm sau 5 ngày

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

BM07 DC -

BPS6

BTA7

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

BT06 BTS5

BD01 BM06

Hình 1b: Hiệu lực ức chế nấm bệnh sau 7 ngày

2. Khả năng ức chế nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

BPS6 DC -

BM06 BP06

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

BM07 BD01

BTS5 BTA7

BT06

Hình 2a: Hiệu quả ứng chế nấm bệnh sau 3 ngày

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

BTA7

DC -

BTS5

BPS6

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

BM06

BD01

BP05

BM07

BT05

Hình 2b Hiệu lực ức chế nấm bệnh sau 5 ngày

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

PHỤ LỤC I: HÌNH ẢNH THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG ỨC CHẾ NẤM BỆNH

NEOSCYTALIDIUM DIMIDIATUM CỦA CÁC CHỦNG BACILLUS SPP. TRÊN

TRÁI THANH LONG

1. Tỷ lệ nhiễm bệnh trên thanh long sau 5 ngày

a. Nghiệm thức 4 sau 5 ngày

d: Nghiệm thức 5 sau 5 ngày

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

BT06

BP05

BPS6

BTS5

BTA7

b: Nghiệm thức 3 sau 5 ngày

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

BT06

BPS6

BP05

BTA7

BTS5

c: Nghiệm thức 2 sau 5 ngày.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

BTS5

BT06

BPS6

BP05

BTA7

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

d:Nghiệm thức 1 sau 5 ngày

Hình 1: Tỷ lệ nhiễm bệnh sau 5 ngày qua các nghiệm thức

a: Nghiệm thức 5 sau 10 ngày

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

a: Nghiệm thức 4 sau 10 ngày

BTS5

BPS6

BTA7

BP05

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

BTS5

BP05

BPS6

BT06

b Nghiệm thức 1 sau 10 ngày

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

BTA7

c Nghiệm thức 3 sau 10 ngày

BT06

BP05

BPS6

BTS5

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

BTA7

e. Nghiệm thức 2 sau 10 ngày

Hình 2. Chỉ số bệnh hại trên thanh long sau 10 ngày

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

PHỤ LỤC J: HÌNH ẢNH THỬ NGHIỆM ỨC CHẾ NẤM BỆNH FUSARIUM SP.

CỦA CÁC CHỦNG BACILLUS SPP. TRÊN CÂY ỚT SAU 15 NGÀY

BM06

a: Nghiệm thức 1

b: Nghiệm thức 2

BTA7

BM06

BTS5

BT06

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

c: Nghiệm thức 3

d: Nghiệm thức 4

e. Nghiệm thức 5

Hình 1: Sự phát triển của cây ớt qua từng giai đoạ

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

PHỤ LỤC K

‘Phan tram uc che fusa 5 ngay’

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: phantram

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 7 4157.853333 593.979048 168.74 <.0001

Error 16 56.320000 3.520000

Corrected Total 23 4214.173333

R-Square Coeff Var Root MSE phantram Mean

0.986636 8.388225 1.876166 22.36667

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

MAU 7 4157.853333 593.979048 168.74 <.0001

‘Phan tram uc che fusa 5 ngay’

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

The ANOVA Procedure

Duncan's Multiple Range Test for phantram

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise

error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 16

Error Mean Square 3.52

Number of Means 2 3 4 5 6 7 8

Critical Range 4.474 4.667 4.792 4.883 4.952 5.006 5.050

Means with the same letter

are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

A 42.767 3 BTA7

B 36.300 3 BPS6

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Means with the same letter

are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

C 30.633 3 BTS5

C 29.067 3 BT06

D 14.867 3 BM06

D 12.400 3 BP05

E 6.733 3 BM07

E 6.167 3 BD01

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

‘Phan tram uc che fusa 7 ngay’

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: phantram

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 7 1974.965000 282.137857 136.57 <.0001

Error 16 33.053333 2.065833

Corrected Total 23 2008.018333

R-Square Coeff Var Root MSE phantram Mean

0.983539 2.605773 1.437301 55.15833

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

MAU 7 1974.965000 282.137857 136.57 <.0001

‘Phan tram uc che fusa 7 ngay’

The ANOVA Procedure

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Duncan's Multiple Range Test for phantram

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise

error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 16

Error Mean Square 2.065833

Number of Means 2 3 4 5 6 7 8

Critical Range 3.428 3.575 3.671 3.741 3.794 3.835 3.869

Means with the same letter

are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

A 65.533 3 BPS6

A 65.367 3 BTA7

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Means with the same letter

are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

A 64.900 3 BTS5

B 58.200 3 BT06

C 51.767 3 BP05

C 49.567 3 BM06

D 44.033 3 BD01

D 41.900 3 BM07

‘Phan tram uc che neo 3 ngay’

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: phantram

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 7 7880.366667 1125.766667 443.14 <.0001

Error 16 40.646667 2.540417

Corrected Total 23 7921.013333

R-Square Coeff Var Root MSE phantram Mean

0.994869 2.577685 1.593868 61.83333

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

MAU 7 7880.366667 1125.766667 443.14 <.0001

‘Phan tram uc che neo 3 ngay’

The ANOVA Procedure

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Duncan's Multiple Range Test for phantram

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise

error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 16

Error Mean Square 2.540417

Number of Means 2 3 4 5 6 7 8

Critical Range 3.801 3.965 4.071 4.148 4.207 4.253 4.291

Means with the same letter

are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

A 76.900 3 BP05

A 76.667 3 BPS6

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Means with the same letter

are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

B A 73.733 3 Bts5

B C 71.167 3 BM06

C 67.367 3 BT06

D 56.633 3 Bta7

D 52.967 3 Bm07

E 19.233 3 Bd01

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Phan tram uc che neo 5 ngay’

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: phantram

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 7 19020.11903 2717.15986 838.98 <.0001

Error 16 51.81807 3.23863

Corrected Total 23 19071.93710

R-Square Coeff Var Root MSE phantram Mean

0.997283 3.740084 1.799619 48.11708

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

MAU 7 19020.11903 2717.15986 838.98 <.0001

The ANOVA Procedure

Duncan's Multiple Range Test for phantram

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise

error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 16

Error Mean Square 3.238629

Number of Means 2 3 4 5 6 7 8

Critical Range 4.292 4.476 4.597 4.684 4.750 4.802 4.844

Means with the same letter

are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

A 76.900 3 Bts5

B 71.533 3 Bta7

B 69.200 3 Bp05

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Means with the same letter

are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

C 64.633 3 BT06

D 59.700 3 BPS6

E 35.233 3 Bm06

F 7.737 3 Bd01

G 0.000 3 Bm07

Phan phan giai chitin’

The ANOVA Procedure

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Dependent Variable: duongkinh

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 7 8.28291667 1.18327381 24.07 <.0001

Error 16 0.78666667 0.04916667

Corrected Total 23 9.06958333

R-Square Coeff Var Root MSE duongkinh Mean

0.913263 9.352643 0.221736 2.370833

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

MAU 7 8.28291667 1.18327381 24.07 <.0001

The ANOVA Procedure

Duncan's Multiple Range Test for duongkinh

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise

error rate.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 16

Error Mean Square 0.049167

Number of Means 2 3 4 5 6 7 8

Critical Range .5288 .5515 .5664 .5771 .5853 .5917 .5969

Means with the same letter

are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

3.3000 3 BPS6 A

B A 2.7667 3 BTS5

B A

B A 2.7667 3 BTA7

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Means with the same letter

are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

B 2.4667 3 BP06 C

C 2.1667 3 BD01

C 2.1667 3 BM06

C 2.1667 3 BT06

D 1.1667 3 BM07

Phan phan giai CMC’

The ANOVA Procedure

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Dependent Variable: duongkinh

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 7 2.41958333 0.34565476 46.09 <.0001

Error 16 0.12000000 0.00750000

Corrected Total 23 2.53958333

R-Square Coeff Var Root MSE duongkinh Mean

0.952748 7.344385 0.086603 1.179167

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

MAU 7 2.41958333 0.34565476 46.09 <.0001

The ANOVA Procedure

Duncan's Multiple Range Test for duongkin

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise

error rate.

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 16

Error Mean Square 0.0075

Number of Means 2 3 4 5 6 7 8

Critical Range .2065 .2154 .2212 .2254 .2286 .2311 .2331

Means with the same letter

are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

1.90000 3 BP06 A

B 1.43333 3 BPS6

C 1.16667 3 BTA7

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Means with the same letter

are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

1.06667 3 BM06 D C

D C

D C 1.06667 3 BT06

D C

D C 1.03333 3 BTS5

D 0.90000 3 BD01

D 0.86667 3 BM07

‘Phophate tung chung 1 ngay’

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: phangiai

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 7 49254.35457 7036.33637 27.66 <.0001

Error 16 4070.81199 254.42575

Corrected Total 23 53325.16657

R-Square Coeff Var Root MSE phangiai Mean

0.923661 10.73375 15.95073 148.6034

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

MAU 7 49254.35457 7036.33637 27.66 <.0001

‘Phophate tung chung 1 ngay’

The ANOVA Procedure

Duncan's Multiple Range Test for phangiai

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise

error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 16

Error Mean Square 254.4257

Number of Means 2 3 4 5 6 7 8

Critical Range 38.04 39.68 40.74 41.52 42.10 42.56 42.94

Means with the same letter

are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

A 251.04 3 BPS6

B 182.09 3 BTS5

C B 150.23 3 BT05

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Means with the same letter

are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

C B

C B 145.93 3 BM06

C D 121.16 3 BTA7

C D

C D 120.93 3 BP05

C D

C D 115.58 3 BD01

D 101.86 3 BM07

‘Phophate tung chung 3 ngay’

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: phangiai

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 7 125949.1913 17992.7416 22.79 <.0001

Error 16 12632.0520 789.5033

Corrected Total 23 138581.2433

R-Square Coeff Var Root MSE phangiai Mean

0.908847 6.236241 28.09810 450.5615

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

MAU 7 125949.1913 17992.7416 22.79 <.0001

‘Phophate tung chung 3 ngay’

The ANOVA Procedure

Duncan's Multiple Range Test for phangiai

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 16

Error Mean Square 789.5033

Number of Means 2 3 4 5 6 7 8

Critical Range 67.01 69.89 71.77 73.13 74.16 74.98 75.64

Means with the same letter

are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

A 590.41 3 BPS6

B A 537.87 3 BTS5

B C 477.67 3 BM06

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Means with the same letter

are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

D C 418.63 3 BT05

D C

D C 411.66 3 BP05

D 403.99 3 BD01

D 382.60 3 BM07

D 381.67 3 BTA7

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: phangiai

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 7 14011.55964 2001.65138 4.13 0.0089

Error 16 7746.40763 484.15048

Corrected Total 23 21757.96728

R-Square Coeff Var Root MSE phangiai Mean

0.643974 3.826634 22.00342 575.0072

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

MAU 7 14011.55964 2001.65138 4.13 0.0089

‘Phophate tung chung 5 ngay’

The ANOVA Procedure

Duncan's Multiple Range Test for phangiai

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise

error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 16

Error Mean Square 484.1505

Number of Means 2 3 4 5 6 7 8

Critical Range 52.47 54.73 56.21 57.27 58.08 58.71 59.23

Means with the same letter

are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

A 607.14 3 BM06

B A 599.30 3 BT05

B A

B A 594.42 3 BM07

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Means with the same letter

are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

B A

B A 590.09 3 BPS6

B A

B A 563.05 3 BTS5

B A

B A 560.70 3 BTA7

B 544.23 3 BD01

B 541.12 3 BP05

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

‘Phophate tung chung 7 ngay’

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: phangiai

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 7 260790.1844 37255.7406 63.18 <.0001

Error 16 9434.7557 589.6722

Corrected Total 23 270224.9401

R-Square Coeff Var Root MSE phangiai Mean

0.965086 12.31698 24.28317 197.1519

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

MAU 7 260790.1844 37255.7406 63.18 <.0001

‘Phophate tung chung 7 ngay’

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

The ANOVA Procedure

Duncan's Multiple Range Test for phangiai

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise

error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 16

Error Mean Square 589.6722

Number of Means 2 3 4 5 6 7 8

Critical Range 57.91 60.40 62.03 63.20 64.09 64.80 65.37

Means with the same letter are

not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

A 455.82 3 BM06

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Means with the same letter are

not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

202.87 3 BP05 B

196.74 3 BTA7 B

193.49 3 BPS6 B

C B 168.06 3 BTS5

C B

C B D 149.07 3 BD01

C D

C D 110.39 3 BT05

D 100.78 3 BM07

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

‘CHIEU CAO CAY’

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DV

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 13 59.29732143 4.56133242 32.35 <.0001

Error 42 5.92250000 0.14101190

Corrected Total 55 65.21982143

R-Square Coeff Var Root MSE DV Mean

0.909192 16.16362 0.375516 2.323214

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

MAU 13 59.29732143 4.56133242 32.35 <.0001

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

‘CHIEU CAO CAY’

The ANOVA Procedure

Duncan's Multiple Range Test for DV

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise

error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 42

Error Mean Square 0.141012

Means with the same letter are

not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

A 4.3250 4 NT3BTS5

B 3.5000 4 NT1BT06

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Means with the same letter are

not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

C B 3.3500 4 NT1BTS5

C B

C B D 3.0000 4 NT5

C B D

C B D 2.9000 4 NT3BT06

C D

C D 2.7000 4 NT3BM06

E D 2.4500 4 NT1BM06

F E 1.9500 4 NT3BTA7

F E

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Means with the same letter are

not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

F E 1.8750 4 NT2BTS5

F E

F E 1.8500 4 NT1BTA7

F E

F E 1.7500 4 NT2BT06

F G 1.6250 4 NT2BTA7

G 1.0000 4 NT2BM06

H 0.2500 4 NT4

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

CHIEU DAI RE’

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DV

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 13 32.94089286 2.53391484 69.67 <.0001

Error 42 1.52750000 0.03636905

Corrected Total 55 34.46839286

R-Square Coeff Var Root MSE DV Mean

0.955684 13.56998 0.190707 1.405357

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

MAU 13 32.94089286 2.53391484 69.67 <.0001

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

‘CHIEU DAI RE’

The ANOVA Procedure

Duncan's Multiple Range Test for DV

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise

error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 42

Error Mean Square 0.036369

Means with the same letter are

not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

A 3.1500 4 NT1BTS5

B 2.4000 4 NT3BTS5

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Means with the same letter are

not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

C 1.8500 4 NT1BM06

C 1.8500 4 NT1BT06

C 1.8000 4 NT3BT06

D C 1.5000 4 NT3BTA7

D 1.3750 4 NT5

D 1.3250 4 NT1BTA7

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Means with the same letter are

not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

D 1.2750 4 NT2BTA7

D 1.1750 4 NT2BTS5

E 0.7750 4 NT3BM06

E 0.5500 4 NT2BM06

E 0.5500 4 NT2BT06

F 0.1000 4 NT4

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

SO LA’

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DV

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 13 33.59803571 2.58446429 20.73 <.0001

Error 42 5.23750000 0.12470238

Corrected Total 55 38.83553571

R-Square Coeff Var Root MSE DV Mean

0.865136 18.02681 0.353132 1.958929

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

MAU 13 33.59803571 2.58446429 20.73 <.0001

The ANOVA Procedure

Duncan's Multiple Range Test for DV

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise

error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 42

Error Mean Square 0.124702

Means with the same letter are

not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

A 2.8750 4 NT1BTA7

A 2.8750 4 NT3BTA7

B A 2.7500 4 NT2BTS5

B A

B A 2.6500 4 NT3BTS5

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Means with the same letter are

not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

B A

B A C 2.2500 4 NT5

B C

B C 2.1250 4 NT1BTS5

B C

B C 2.0000 4 NT1BM06

B C

B C 2.0000 4 NT3BM06

B C

B C 2.0000 4 NT2BT06

C 1.8750 4 NT1BT06

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Means with the same letter are

not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

C 1.7500 4 NT2BM06

C 1.5000 4 NT2BTA7

D 0.7750 4 NT3BT06

E 0.0000 4 NT4

KHONG CO TRYP’

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DV

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 7 147.0292958 21.0041851 3575.18 <.0001

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Error 16 0.0940000 0.0058750

Corrected Total 23 147.1232958

R-Square Coeff Var Root MSE DV Mean

0.999361 2.294580 0.076649 3.340417

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

MAU 7 147.0292958 21.0041851 3575.18 <.0001

The ANOVA Procedure

Duncan's Multiple Range Test for DV

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise

error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 16

Error Mean Square 0.005875

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Number of Means 2 3 4 5 6 7 8

Critical Range .1828 .1907 .1958 .1995 .2023 .2045 .2063

Means with the same letter

are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

A 7.81333 3 BTS6

B 5.75333 3 BT06

C 4.14333 3 BM06

D 3.34000 3 BP05

D 3.18333 3 BTS5

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Means with the same letter

are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

E 2.38000 3 BTA7

F 0.07667 3 BD01

F 0.03333 3 BM07

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DV

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 7 957.4639625 136.7805661 3997.00 <.0001

Error 16 0.5475333 0.0342208

Corrected Total 23 958.0114958

R-Square Coeff Var Root MSE DV Mean

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

R-Square Coeff Var Root MSE DV Mean

0.999428 1.645746 0.184989 11.24042

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

MAU 7 957.4639625 136.7805661 3997.00 <.0001

‘CO TRYP’

The ANOVA Procedure

Duncan's Multiple Range Test for DV

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise

error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 16

Error Mean Square 0.034221

Number of Means 2 3 4 5 6 7 8

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Number of Means 2 3 4 5 6 7 8

Critical Range .4412 .4601 .4725 .4815 .4883 .4936 .4980

Means with the same letter

are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

A 19.2433 3 BM06

B 18.6000 3 BTS5

C 15.2533 3 BTA7

D 13.4967 3 BT06

E 9.8167 3 BP05

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Means with the same letter

are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

E 9.7400 3 BTS6

F 2.3800 3 BM07

G 1.3933 3 BD01

CHI SO BENH HAI TREN THANH LONG SAU 5 NGAY’

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DV

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 16 6995.527451 437.220466 204.97 <.0001

Error 34 72.526667 2.133137

Corrected Total 50 7068.054118

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

R-Square Coeff Var Root MSE DV Mean

0.989739 17.84971 1.460526 8.182353

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

MAU 16 6995.527451 437.220466 204.97 <.0001

‘CHI SO BENH HAI TREN THANH LONG SAU 5 NGAY’

The ANOVA Procedure

Duncan's Multiple Range Test for DV

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise

error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 34

Error Mean Square 2.133137

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Num 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

ber

Mea

Criti 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.6 3.6 3.7 3.7 3.7 3.7 3.8 3.8 3.8 3.8 3.8

cal 53 93 87 56 10 53 90 21 48 71 92 10 26 41 55 67

Rang

Means with the same letter are

not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

53.033 3 NT4 A

B 11.000 3 NT2BT06

B 10.600 3 NT2BTA7

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Means with the same letter are

not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

B 9.800 3 NT3BT06

C B 7.400 3 NT2BTS5

C B

C B 7.400 3 NT2BP05

C B

C B 7.400 3 NT1BTA7

C B

C B 7.400 3 NT5

C B

C B 6.990 3 NT3BPS6

C 6.167 3 NT3BP05

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Means with the same letter are

not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

C D 3.700 3 NT2BPS6

C D

C D 3.700 3 NT1BT06

C D

C D 3.700 3 NT3BTA7

E D 1.233 3 NT3BTS5

E D

E D 1.233 3 NT1BP05

E 0.000 3 NT1BPS6

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Means with the same letter are

not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

E 0.000 3 NT1BTS5

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DV

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 16 25152.14039 1572.00877 993.71 <.0001

Error 34 53.78667 1.58196

Corrected Total 50 25205.92706

R-Square Coeff Var Root MSE DV Mean

0.997866 10.52260 1.257760 11.95294

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

MAU 16 25152.14039 1572.00877 993.71 <.0001

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

‘CHI SO BENH HAI TREN THANH LONG SAU 10 NGAY’

The ANOVA Procedure

Duncan's Multiple Range Test for DV

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise

error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 34

Error Mean Square 1.581961

Means with the same letter are

not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

A 100.000 3 NT4

B 11.000 3 NT2BTA7

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Means with the same letter are

not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

B 11.000 3 NT2BPS6

B 11.000 3 NT5

C B 10.200 3 NT1BTA7

C B

C B 9.800 3 NT3BT06

C B

C B 9.800 3 NT1BPS6

C B

C B D 8.600 3 NT3BTA7

100

C D

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Means with the same letter are

not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

C E D 7.400 3 NT1BTS5

C E D

C E D 7.400 3 NT2BTS5

C E D

C E D 7.400 3 NT2BP05

C E D

C E D 7.400 3 NT2BT06

E D

F E D 6.167 3 NT1BP05

F E D

F E D 6.167 3 NT3BP05

F E

101

F E 4.933 3 NT3BPS6

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Means with the same letter are

not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

3.700 3 NT1BT06 F G

F G

102

3.700 3 NT3BTS5 F G

103

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Đồ án tốt nghiệp: Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Chủ đề:

Đồ án môn kỹ thuật y sinh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT NÔNG NGHIỆP

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thị Hai

Sinh viên thực hiện

: Quách Hồng Thúy

MSSV: 1411100668 Lớp: 14DSH03

TP. Hồ Chí Minh, 2018

BP05

BPS6

BP05

a

ab

ab

ab

ab

ab

b

b

a

b

b

b

bc

bcd

d

cd

(μg/ml)

CHIỀU DÀI RỄ CÂY QUA CÁC NGHIỆM THỨC (cm)

BPS6

BTA7

DC -

BTS5

BPS6

BM06

BD01

BP05

BM07

BT05

BT06

BP05

BPS6

BTS5

BTA7

BT06

BPS6

BP05

BTA7

BTS5

BTS5

BT06

BPS6

BP05

BTS5

BPS6

BTA7

BP05

BTA7

BT06

BP05

BPS6

BTS5

BTA7

Tài liệu liên quan

Tóm tắt luận án Tiến sĩ: Đánh giá sự hiện diện một số kim loại nặng trong nghêu trắng Meretrix lyrate và môi trường sống của chúng

Tiểu luận môn Biến đổi khí hậu: Tác động của biến đổi khí hậu đến sức khỏa con người

Tiểu luận môn Biến đổi khí hậu: Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu đến sinh vật ngoại lai xâm lấn

Tiểu luận môn Biến đổi khí hậu: Biến đổi khí hậu và bệnh không lây nhiễm trên thế giới

Khoá luận tốt nghiệp ngành Kỹ thuật y sinh: Thiết kế và thi công mô hình camera đo thân nhiệt và nhắc nhở người không đeo khẩu trang

Đề tài nghiên cứu khoa học: Thiết kế, chế tạo đồ gá hàn ống vi sinh theo tiêu chuẩn Din 188-50

Đề tài nghiên cứu khoa học: Nghiên cứu, thiết kế và điều khiển hệ thống rối nước tư động

Đề tài nghiên cứu khoa học: Nghiên cứu, thiết kế và chế tạo máy làm bánh truyền thống Việt Nam

Đề tài nghiên cứu khoa học: Tối ưu hóa quá trình điều chế đĩa sử dụng một lần từ thân cây chuối

Đồ án tốt nghiệp Công nghệ thực phẩm: Thiết kế nhà máy sản xuất rau quả

Tài liêu mới