Đồ án tốt nghiệp: Thiết lập quy trình phá vách bào tử nấm Linh chi Ganoderma licidum kết hợp enzyme và siêu âm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

THIẾT LẬP QUY TRÌNH PHÁ VÁCH BÀO TỬ NẤM LINH CHI GANODERMA LUCIDUM KẾT HỢP VỚI ENZYME VÀ SIÊU ÂM

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

Sinh viên thực hiện

: ĐẶNG THỊ KIM TUYỀN

MSSV: 1411100465 Lớp: 14DSH03

TP. Hồ Chí Minh, 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong đồ án này hoàn toàn trung

thực, chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Các thông tin, tài liệu

trích dẫn trong đồ án này đều được ghi rõ nguồn gốc.

TP. Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2018

Sinh viên thực hiện

Đặng Thị Kim Tuyền

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực hiện đồ án, tôi đã nhận được rất nhiều sự hỗ trợ và giúp đỡ

từ phía nhà trường cũng như gia đình. Chính vì lí do đó, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu

sắc đến họ vì đã giúp tôi đạt được thành quả như hôm nay.

Lời đầu tiên tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Công nghệ Thành

phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện để tôi được học tập thật tốt tại trường trong thời

gian qua và quý Thầy (Cô) của Viện Khoa học Ứng dụng lời cảm ơn sâu sắc, niềm tự

hào vì đã được học tập tại đây. Bên cạnh đó, để hoàn thành được bài báo cáo này, tôi

xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Hoài Hương đã tận tình chỉ dạy tôi, cho tôi thêm

động lực mỗi khi gặp khó khăn, nhờ có cô tôi mới có thể hoàn thành tốt nhất đề tài của

mình.

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn làm đồ án tại phòng thí nghiệm

Công nghệ Sinh học, trường Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh và các em

Nguyễn Bảo Trân, Nguyễn Ngọc Gia Bảo và Hồ Lí Hải Vân (15DSH) đã giúp đỡ tôi

và nhóm thực hiện đề tài nhiệt tình trong suốt quá trình thực hiện đồ án.

Ngoài ra tôi cũng xin cảm ơn quý Thầy (Cô), các anh chị phụ trách phòng thí

nghiệm khoa Dược, trường Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh đã hỗ trợ tôi

về thiết bị và dụng cụ để tôi có thể hoàn thành đồ án tốt nghiệp.

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với gia đình, người thân và các bạn bè

tôi, đã luôn quan tâm, động viên tôi trong quá trình học tập và hoàn thành báo cáo.

Trong quá trình hoàn thiện báo cáo không tránh khỏi những thiếu sót nhất định

mà tôi chưa thể khắc phục nên tôi rất mong nhận được sự góp ý của quý Thầy (Cô) để

đề tài này được hoàn chỉnh hơn.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên thực hiện

Đặng Thị Kim Tuyền

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT.......................................................................................... v

DANH MỤC B ẢNG.................................................................................................................. vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH ........................................................................................................ ix

ĐẶT VẤN ĐỀ...............................................................................................................................1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .....................................................................................................4

1.1. Giới thiệu về nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi ...............................................4

1.1.1. Giới thiệu về nấm Linh chi .............................................................................................4

1.1.1.1. Phân loại ......................................................................................................................5

1.1.1.2. Đặc điểm sinh học của nấm Linh chi........................................................................8

1.1.2. Bào tử nấm Linh chi ........................................................................................................9

1.2. Thành phần hóa học chủ yếu của nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi ....... 12

1.2.1. Các polysaccharide và peptidoglycan......................................................................... 15

1.2.2. Triterpenes ...................................................................................................................... 17

1.2.3. Saponin ........................................................................................................................... 22

1.2.4. Acid béo ........................................................................................................................... 23

1.2.5. Các thành phần khác.................................................................................................... 24

1.3. Công dụng của nấm Linh chi và bào tử Nấm Linh chi........................................ 24

1.3.1. Phòng chống ung thư ................................................................................................... 26

1.3.2. Khả năng kháng oxi hóa .............................................................................................. 27

1.3.3. Điều trị bệnh đái tháo đường ...................................................................................... 28

1.3.4. Điều trị các bệnh về tim mạch..................................................................................... 28

1.3.5. Tăng cường hệ miễn dịch ............................................................................................ 29

1.4. Phương pháp phá vỡ và trích ly hoạt chất từ bào tử nấm Linh chi ................. 29

1.4.1. Enzyme chitinase ........................................................................................................... 30

1.4.2. Giới thiệu về siêu âm phá tế bào ................................................................................. 33

1.4.2.1. Khái niệm .................................................................................................................. 33

1.4.2.2. Bản chất của sóng âm .............................................................................................. 34

1.4.2.3. Nguyên lý tác động của sóng siêu âm.................................................................... 34

Đồ án tốt nghiệp

1.4.2.4. Tác động của sóng siêu âm lên tế bào ................................................................... 36

1.4.2.5. Ứng dụng của sóng siêu âm .................................................................................... 36

1.4.2.6. Thiết bị phát sóng siêu âm ...................................................................................... 37

1.4.3. Các phương pháp phá vỡ bào tử nấm Linh chi ....................................................... 38

1.4.4. Phương pháp trích ly hoạt chất thu dầu bào tử ....................................................... 41

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 46

2.1. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................................... 46

2.1.1. Vật liệu ............................................................................................................................ 46

2.1.2. Nơi thực hiện ................................................................................................................. 46

2.1.3. Thời gian thực hiện ...................................................................................................... 46

2.1.4. Thiết bị - dụng cụ và hóa chất..................................................................................... 46

2.1.4.1. Thiết bị ....................................................................................................................... 46

2.1.4.2. Dụng cụ...................................................................................................................... 47

2.1.4.3. Hóa chất – Môi trường nuôi cấy ............................................................................ 48

2.2. Phương pháp nghiên cứu............................................................................................ 52

2.2.1. Thu enzyme chitinase bằng lên men thể rắn ............................................................ 54

2.2.1.1. Phương pháp nuôi cấy Trichoderma harzianum T2 trên môi trường thạch

PDA ............................................................................................................................ 55

2.2.1.2. Phương pháp hoạt hóa Trichoderma harzianum T2 .......................................... 55

2.2.1.3. Thu enzyme dịch trích ly bằng phương pháp tăng sinh trên môi trường rắn ... 55

2.2.1.4. Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum

T2 tối ưu hóa để thu enzyme chitinase ................................................................. 55

2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của siêu âm trong phá vỡ bào tử nấm Linh chi ................. 56

2.2.2.1. Phá vách bào tử nấm linh chi bằng phương pháp lạnh đông kết hợp sử dụng

enzyme thương mại Cellulase (EC), dịch tăng sinh nấm Trichoderma

harzianum T2 (DTL) và siêu âm............................................................................. 57

2.2.2.2. Phương pháp xác định số lượng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu ................. 57

2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng chế độ tiền xử lý bào tử .......................................................... 60

Đồ án tốt nghiệp

2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của siêu âm lên thành phần hóa học và hoạt tính sinh

học .................................................................................................................................... 61

2.2.4.1. Quy trình trích ly hoạt chất có trong bào tử nấm Linh chi ................................. 63

2.2.4.2. Định tính một số hoạt chất có trong bào tử nấm Linh chi .................................. 65

2.2.4.3. Định lượng một số hoạt chất có trong bào tử nấm Linh chi sau khi bị phá vỡ 67

2.2.4.4. Phương pháp kháng oxi hóa DPPH....................................................................... 69

2.2.4.5. Phương pháp thử độc tính tế bào artemia ............................................................ 71

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................ 73

3.1. Thu enzyme chitinase trên môi trường lên men thể rắn .................................... 73

3.2. Ảnh hưởng của siêu âm lên tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi ........................... 74

3.3. Ảnh hưởng của các chế độ tiền xử lí lạnh đông..................................................... 78

3.4. Định tính thành phần hóa học sau khi phá vỡ bào tử nấm Linh chi ................ 79

3.4.1. Định tính thành phần hóa học trong dịch phá vỡ bào tử ...................................... 80

3.4.1.1. Định tính protein ...................................................................................................... 81

3.4.1.2. Định tính saponin ..................................................................................................... 82

3.4.1.3. Định tính polysaccharide ........................................................................................ 85

3.4.1.4. Định tính triterpenoid .............................................................................................. 85

3.4.2. Định tính thành phần hóa học còn lại trong vỏ bào tử phá vỡ bằng enzyme

kết hợp siêu âm .............................................................................................................. 87

3.4.2.1. Định tính protein ...................................................................................................... 87

3.4.2.2. Định tính saponin ..................................................................................................... 87

3.4.2.3. Định tính polysaccharide ........................................................................................ 88

3.4.2.4. Định tính triterpenoid .............................................................................................. 88

3.5. Định lượng các hoạt chất thu được từ dịch phá vỡ và bào tử bị phá vỡ ......... 90

3.5.1. Định lượng polysaccharide trong dịch trích ly và bào tử của mẫu không siêu

âm và mẫu siêu âm bằng phương pháp Phenol – Sulfuric.................................... 90

3.5.2. Định lượng lipid trong dịch trích ly và bào tử của mẫu không siêu âm và mẫu

siêu âm bằng phương pháp Adam – Rose – Gottlieb .............................................. 92

3.6. Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa ............................................................................ 97

iii

Đồ án tốt nghiệp

3.7. Thử độc tính tế bào trên Artemia nauplii .............................................................. 101

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 104

4.1. Kết luận ........................................................................................................................ 104

4.2. Kiến nghị ...................................................................................................................... 104

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................... 106

Tài liệu tiếng Việt ................................................................................................................... 106

Tài liệu tiếng Anh ................................................................................................................... 106

PHỤ LỤC A ..................................................................................................................................1

PHỤ LỤC B ............................................................................................................................... 13

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

PDA: Potato Dextro Agar

EC: Enzyme Cellulase C20032

DTL: Dịch trích ly

A.nauplii: atermia nauplii

DPPH: 1,1 - Diphenyl - 2 - picryl – hydrazyl

Trolox: 6 – Hydroxy – 2, 5, 7, 8 - tetramethychroman - 2 – carboxylic

CMC: Sodium carboxymethyl cellulose

DNS: acid - 2 - hydroxyl - 3,5 – dinitrobenzoic

DMSO: Dimethyl sulfoxit

ĐC: Đối chứng

KSA: Không siêu âm

SA: Siêu âm

SA 75%: Siêu âm độ khuếch đại 75%

SA100%: Siêu âm độ khuếch đại 100%

PHC: Pha hữu cơ

PN: Pha nước

DI: Diethyl ether

HE: Hexane

BT: Bào tử

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Biến động kích thước bào tử đảm nấm Linh chi chuẩn ở các mẫu vật khác

nhau (Lê Xuân Thám, 1996) ..................................................................................................... 10

Bảng 1.2. Thành phần dược tính của nấm Linh chi ............................................................... 12

Bảng 1.3. Hàm lượng các hoạt chất sinh học trong thể quả và bào tử nấm Linh chi (Li

JJ và cộng sự (2014)) ................................................................................................................. 15

Bảng 1.4. So sánh khả năng ức chế ung thư vú của các bộ phận ở các trạng thái khác

nhau của nấm Linh chi (2,5 mg/mL) ....................................................................................... 27

Bảng 1.5. Những nghiên cứu về phá vỡ vách bào tử nấm Linh chi trên Thế giới ............. 39

Bảng 1.6. Các phương pháp trích ly ........................................................................................ 41

Bảng 1.7. Các dung môi trong chiết xuất lipid của Ganoderma lucidum

(CN1099455C) ........................................................................................................................... 44

Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm thử độc tính tế bào trên artemia nauplii.................................. 71

Bảng 3.1. Đường kính vòng phân giải chitin của enzyme chitinase thu được từ hai môi

trường cơ chất (mm) .................................................................................................................. 73

Bảng 3.2. Bảng so sánh ảnh hưởng của độ khuếch đại đến tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh

chi qua các ngày ủ enzyme........................................................................................................ 75

Bảng 3.3. Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của độ khuếch đại đến tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm

Linh chi qua các ngày ................................................................................................................ 76

Bảng 3.4. Kết quả so sánh ảnh hưởng của các chế độ tiền xử lí lạnh đông ........................ 78

Bảng 3.5. Kết quả định tính protein theo thử nghiệm biuret khi trích ly bằng hai dung

môi................................................................................................................................................ 81

Bảng 3.6. Bảng ghi nhận kết quả chiều cao cột bọt (cm) bền theo thời gian khi định

tính saponin theo thử nghiệm Fontan – Kaudel trích ly bằng diethyl ether ........................ 82

Bảng 3.7. Bảng ghi nhận kết quả chiều cao cột bọt (cm) bền theo thời gian khi định

tính saponin theo thử nghiệm Fontan – Kaudel trích ly bằng hexane ................................. 84

Bảng 3.8. Kết quả định tính saponin khi trích ly bằng hai dung môi .................................. 85

Bảng 3.9. Kết quả định tính polysaccharide khi trích ly bằng hai dung môi ...................... 85

Bảng 3.10. Kết quả định tính triterpenoid khi trích ly bằng hai dung môi ......................... 86

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.11. Bảng tổng kết các thử nghiệm định tính thành phần hóa học trong dịch phá

vỡ bằng hai dung môi ................................................................................................................ 86

Bảng 3.12. Kết quả định tính protein theo thử nghiệm biuret khi trích ly vỏ bào tử ......... 87

Bảng 3.13. Kết quả định tính saponin theo thử nghiệm tạo bọt, Fontan - Kaudel khi

trích ly vỏ bào tử......................................................................................................................... 88

Bảng 3.14. Kết quả định tính polysaccharide theo thử nghiệm Molisch khi trích ly vỏ

bào tử ........................................................................................................................................... 87

Bảng 3.15. Kết quả định tính triterpenoid theo thử nghiệm Liebermann-Burchard khi

trích ly vỏ bào tử......................................................................................................................... 88

Bảng 3.16. Bảng tổng kết các thử nghiệm định tính phần vỏ bào tử ................................... 88

Bảng 3.17. Bảng tổng kết các thử nghiệm tất cả các pha khi trích ly dịch phá vỡ bào tử

và vỏ bào tử ................................................................................................................................. 89

Bảng 3.18. Hàm lượng polysaccharide có trong dịch phá vỡ bào tử và vỏ bào tử từ

100g bào tử phá vỡ vách bằng enzyme kết hợp siêu âm và không siêu âm ....................... 91

Bảng 3.19. Bảng phân tích hàm lượng polysaccharide trong hai pha khi trích ly lỏng

lỏng dịch phá vỡ bào tử bằng diethyl ether và hexane từ 100 g bào tử không siêu âm và

siêu âm ......................................................................................................................................... 92

Bảng 3.20. Hàm lượng lipid có trong dịch phá vỡ bào tử và vỏ bào tử từ 100g bào tử

phá vỡ vách bằng enzyme kết hợp siêu âm và không siêu âm ............................................. 92

Bảng 3.21. Giả sử hàm lượng polysaccharide tổng và lipid trong mẫu không siêu âm là

100% từ đó tính ra được% polysaccharide tổng và lipid của các mẫu còn lại nhằm so

sánh ảnh hưởng của siêu âm lên hàm lượng polysaccharide và lipid trong bào tử nấm

Linh Chi ....................................................................................................................................... 93

Bảng 3.22. Tỉ lệ phần trăm quét gốc tự do DPPH của đối chứng dương Trolox ............... 97

Bảng 3.23. Tỉ lệ phần trăm (%) quét gốc tự do DPPH của các mẫu dầu bào tử ................ 97

Bảng 3.24. Bảng giá trị IC50 (µg/ml) của các mẫu dầu bào tử ............................................ 98

Bảng 3.25. Tỉ lệ phần trăm chết của ấu trùng Artemia nauplii theo nồng độ hoạt chất

trong dung dịch nuôi cấy Artemia nauplii của PHC SA (mg/ml) ...................................... 101

vii

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.26. Tỉ lệ phần trăm chết của ấu trùng Artemia nauplii theo nồng độ hoạt chất

trong dung dịch nuôi cấy Artemia nauplii của BT SA (mg/ml) ......................................... 102

viii

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Nấm Linh chi đỏ (Ganoderma lucidum) (A), nấm mọc trong tự nhiên (B) và

nấm trồng (C) .................................................................................................................................5

Hình 1.2. Bào tử nấm Linh chi dưới kính hiển vi được phóng to 3000 lần ....................... 11

Hình 1.3. Hình thái giải phẫu thể quả nấm Linh chi Ganoderma lucidum ......................... 11

Hình 1.4. Các kiểu hình bào tử đặc thù của họ nấm Linh chi............................................... 12

Hình 1.5. Cấu trúc của Ganodermasides ................................................................................. 14

Hình 1.6. Cấu trúc không gian của polysaccharide trong nấm Linh chi ............................. 17

Hình 1.7. Công thức của một số triterpene trong nấm Linh chi (Kubota và cộng sự,

1982; Helv Chim Acta 65: 611-9; Nishitoba và cộng sự, 1984; Agric Biol Chem 48:

2905-7; Sato và cộng sự, 1986; Agric Biol Chem 50: 2887- 90; Budavari và cộng sự,

1989). ................................................................................................................................... 19

Hình 1.8. Cấu trúc không gian của 29 loại triterpenoids trong bào tử nấm Linh chi

(Bingji Ma và cộng sự, 2011) ................................................................................................... 20

Hình 1.9. Tên của 29 triterpenoids trong bào tử nấm Linh chi (Bingji Ma và cộng sự,

2011) ............................................................................................................................................ 21

Hình 1.10. Các dạng sản phẩm của nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi ........................ 26

Hình 1.11. Cấu trúc chitin ......................................................................................................... 31

Hình 1.12. Cơ chế hoạt động của hệ enzyme chitinase ......................................................... 32

Hình 1.13. Quá trình phân hủy chitin thành chitosan và cellulose ...................................... 33

Hình 1.14. Quá trình hình thành, phát triển và vỡ của bọt khí ............................................ 36

Hình 1.15. Thiết bị phát sóng siêu âm dạng thanh ................................................................. 38

Hình 1.16. Máy phá mẫu, tế bào bằng sóng siêu âm Qsonica Q500 ................................... 39

Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ............................................................................................. 54

Hình 2.2 Sơ đồ thu enzyme chitinase bằng môi trường lên men thể rắn ............................ 54

Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của siêu âm trong phá vỡ bào tử

nấm Linh chi ............................................................................................................................... 57

Hình 2.4. Buồng đếm hồng cầu Neubauer .............................................................................. 58

Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng chế độ tiền xử lí bào tử................. 60

Đồ án tốt nghiệp

Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của siêu âm lên thành phần hóa học và

hoạt tính sinh học ....................................................................................................................... 62

Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm quy trình trích ly bào t ử sau khi phá vỡ ........................ 64

Hình 2.8. Phương trình phản ứng định tính polysaccharide ................................................. 66

Hình 3.1. Đường kính vòng phân giải enzyme chitinase thu được từ hai môi trường cơ

chất (mm) ................................................................................................................................... 73

Hình 3.2. Khả năng phân giải chitin của enzyme thu được từ hai môi trường................... 74

Hình 3.3. Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của độ khuếch đại đến tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm

Linh chi qua các ngày ................................................................................................................ 76

Hình 3.4. Bào tử nấm Linh chi soi dưới kính hiển vi (X400)............................................... 76

Hình 3.5. Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của siêu âm lên tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi . 77

Hình 3.6. Biểu đồ so sánh tỉ lệ phá vỡ (%) bào tử nấm Linh chi qua các chế độ tiền xử

lí ................................................................................................................................... 79

Hình 3.7. Hai pha dịch trích ly lỏng lỏng bằng diethyl ether ............................................... 81

Hình 3.8. Biểu đồ polysaccharide tổng (%) có trong dịch phá vỡ bào tử và vỏ bào tử từ

100g bào tử phá vỡ vách bằng enzyme kết hợp siêu âm và không siêu âm ....................... 92

Hình 3.9. Hàm lượng lipid có trong dịch phá vỡ bào tử và vỏ bào tử từ 100g bào tử phá

vỡ vách bằng enzyme kết hợp siêu âm và không siêu âm. ................................................... 93

Hình 3.10. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của siêu âm đến hàm lượng polysaccharide

tổng số và lipid có trong bào tử nấm Linh chi sau khi phá vỡ. ............................................ 94

Hình 3.11. Quy trình đề nghị phá vách bào tử nấm Linh chi kết hợp enzyme và siêu

âm ................................................................................................................................... 96

Hình 3.12. Biểu đồ so sánh tỉ lệ phần trăm quét gốc tự do DPPH của các mẫu dầu bào

tử ................................................................................................................................... 98

Hình 3.13 Đường chuẩn DPPH của mẫu pha hữu cơ không siêu âm và siêu âm .............. 99

Hình 3.14 Đường chuẩn DPPH của mẫu bào tử không siêu âm và siêu âm....................... 99

Hình 3.15. Biểu đồ so sánh giá trị IC50 (g/ml) của các mẫu dầu bào tử........................ 100

Hình 3.16. Phần trăm tỉ lệ chết của ấu trùng Artemia nauplii theo log nồng độ dầu bào

tử PHC SA (mg/ml) ................................................................................................................. 102

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.17. Phần trăm tỉ lệ chết của ấu trùng Artemia nauplii theo log nồng độ dầu bào

tử BT SA (mg/ml) .................................................................................................................... 103

Đồ án tốt nghiệp

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tính cấp thiết của đề tài

Từ xưa đến nay, nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) được cho là một loại dược

liệu và đã có không ít người sử dụng làm thuốc. Theo các tài liệu nghiên cứu, nấm

Linh chi có nhiều công dụng trong việc hỗ trợ điều hòa huyết áp, tăng khả năng miễn

dịch cho cơ thể, hỗ trợ giải độc và cải thiện bệnh viêm gan mãn tính, xơ gan, thần kinh

suy nhược. Có nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã định danh được các hoạt

chất và xác định tác dụng dược lý của nấm Linh chi như: Germanium, acid ganoderic,

acid ganodermic, acid oleic, ganodosteron, ganoderans, adenosin, beta – D – glucan…

(đặc biệt trong nấm Linh chi có hàm lượng germanium cao hơn trong nhân sâm đến 5 -

8 lần). Các nhà khoa học Việt Nam tìm thấy trong nấm Linh chi có chứa 21 nguyên tố

vi lượng cần thiết cho sự vận hành và chuyển hóa của cơ thể như: đồng, sắt, kalium,

magnesium, natrium, calcium. Trong đó, triterpenoid và polysaccharide được xem là

thành phần chủ yếu có trong nấm được chú ý nhiều nhất. Chính vì lí do đó mà hiện

nay việc trồng và sử dụng nấm Linh chi đang trở nên rất phổ biến và được nhiều người

quan tâm.

Bên cạnh đó, phần bào tử do nấm Linh chi phóng thích ra cũng có nhiều công

dụng bổ ích nhưng lại ít được quan tâm nghiên cứu trích ly hoạt chất. Bào tử nấm Linh

chi được cho là tinh chất của nấm Linh chi chứa nhiều chất dinh dưỡng và các đặc tính

dược lý, là sản phẩm rất tốt cho sức khỏe. Tuy nhiên, cấu tạo bào tử nấm Linh chi gồm

2 lớp vỏ cứng, việc phá vỡ bào tử nấm Linh chi để thu triệt để hoạt chất bên trong bào

tử là điều đáng được quan tâm.

Ngày nay đã có các phương pháp nghiên cứu phá vỡ bào tử nấm Linh chi bằng

cơ học kết hợp enzyme… Phương pháp phá vỡ sử dụng biện pháp cơ học vẫn chưa

mang lại hiệu quả tối ưu. Theo nghiên cứu của Ma Jingjing và cộng sự từ trường Đại

học Vũ Hán, Trung Quốc (2007), vách bào tử nấm Linh chi chứa 57,64% là chitin,

việc sử dụng enzyme chitinase và cellulase trong việc phá vỡ bào tử nấm Linh chi là

bước không thể thiếu. Nhóm sinh viên HUTECH đã phân lập nấm Trichoderma từ

nấm Linh chi phục vụ cho việc phá vách bào tử. Ngoài ra, việc kết hợp với enzyme

Đồ án tốt nghiệp

thương mại giúp phá vỡ vách bào tử nấm Linh chi, kết quả đã đạt được từ nghiên cứu

của sinh viên Nguyễn Thanh Liên Khương (khóa 13DSH) là 53.5%. Trong khi đó để

tăng hiệu suất phá vỡ thì việc ứng dụng siêu âm giúp tăng tỉ lệ phá vỡ đến 74.3%. Vì

muốn góp phần nâng cao tỉ lệ phá vỡ và chiết xuất hiệu quả các hoạt chất có trong bào

tử nấm Linh chi, nên nhóm thực hiện đề tài tiếp tục nghiên cứu các chế độ tiền xử và

áp dụng siêu âm trước và sau khi ủ bào tử với dịch enzyme. Kết quả được trình bày

trong đồ án tốt nghiệp “Thiết lập quy trình phá vách bào tử nấm Linh chi

Ganoderma licidum kết hợp enzyme và siêu âm”.

Mục đích: Thu hồi hoạt chất từ bào tử nấm Linh chi.

Mục tiêu: Thiết lập quy trình phá vách bào tử nấm Linh chi Ganoderma licidum

kết hợp enzyme và siêu âm.

Nội dung:

- Chọn môi trường lên men thể rắn thu enzyme chitinase từ Trichoderma

harzianum T2.

- Khảo sát ảnh hưởng của siêu âm và enzyme lên tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh

chi.

- Khảo sát ảnh hưởng của các chế độ tiền xử lý lên tỉ lệ phá vỡ bào tử.

- Khảo sát ảnh hưởng của siêu âm lên thành phần hóa học, hoạt tính sinh học

của bào tử nấm Linh chi.

Kết quả đạt được của đề tài:

- Xác định môi trường lên men thể rắn thu enzyme chitinase để phá vỡ bào tử

nấm Linh chi.

- Thiết lập được chế độ tiền xử lý bào tử trước khi phá vỡ.

- Thiết lập được quy trình phá vỡ bào tử kết hợp enzyme và siêu âm.

- So sánh được thành phần polysaccharide tổng và lipid tổng của bào tử phá

vỡ bằng enzyme và kết hợp enzyme với siêu âm.

- So sánh được hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết từ bào tử phá vỡ bằng

enzyme và kết hợp enzyme với siêu âm.

Đồ án tốt nghiệp

- Xác định được độc tính tế bào trên Artemia của cao chiết từ bào tử phá vỡ

bằng enzyme và kết hợp enzyme với siêu âm.

Hạn chế của đề tài:

- Chưa tối ưu hóa được thông số phản ứng enzyme như vận tốc khuấy đảo

quy mô Phòng thí nghiệm.

- Chưa tối ưu hóa được thông số siêu âm do hạn chế về thiết bị.

- Hạn chế về việc khảo sát triterpenoid và các thành phần hoá học, hoạt tính

sinh học khác của bào tử phá vỡ.

Phương pháp nghiên cứu

- Tổng quan tài liệu và tiến hành thực nghiệm.

- Đề tài được xử lí số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel và Statisticals

Analysis Systems (SAS).

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu về nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi

1.1.1. Giới thiệu về nấm Linh chi

Nấm Linh chi (tiếng Anh: Lingzhi mushroom) có tên khoa học là Ganoderma

lucidum, thuộc họ Nấm Lim (Ganodermataceae). Nấm Linh chi còn có những tên khác

như Tiên thảo, Nấm trường thọ, Vạn niên nhung... được phân bố rộng rãi ở các nước Á

Đông và thường mọc trên các thân cây khô hoặc đã chết. Ở một số nước Châu Á như

Trung Quốc, Nhật Bản, Đài Loan… nấm Linh chi được sử dụng như một loại dược

thảo thiên nhiên giúp cải thiện sức khỏe, tăng cường khả năng kháng tế bào ung thư...

Đây là một loại nấm lớn, màu tối, vỏ ngoài nhẵn bóng và nhìn giống như một khúc gỗ.

Trong tiếng Latin thì lucidus có nghĩa là “sáng bóng” hay “rực rỡ” và điều này cũng

tương thích với hình dáng bên ngoài của nấm Linh chi. Ở mỗi nơi nấm Linh chi được

gọi bằng nhiều tên khác nhau như Reishi (Nhật Bản), Lingzhi (Trung Quốc), Yeongji

(Hàn Quốc) và Ling-Chih (Đài Loan). Ngoài ra còn một số tên gọi khác như nấm vạn

niên (Nhật bản) hay nấm trường sinh (Trung Quốc). Theo 2 cuốn sách rất nổi tiếng mô

tả về các loại dược thảo của Trung Quốc, “Shen Nong Ben Cao Jing – Thần Nông Bản

Thảo Kinh” (25- 220 trước Công nguyên, thuộc triều đại Đông Hán), tác phẩm chuyên

tập hợp những kinh nghiệm về dược thực vật từ đời Hán trở về trước và “Ben Cao

Gang Mil – Bản Thảo Cương Mục” của “Li Shi Zhen – Lí Thởi Trân” (1590 trước

Công nguyên, thuộc triều đại nhà Minh), có 6 chủng nấm được biết đến tại thời điểm

lúc bấy giờ. Trong đó có hơn 250 loại nấm Linh chi được đề cập. Tuy nhiên, trong các

văn bản cổ chỉ đề cập nhiều đến khả năng chữa bệnh của nấm Linh chi đỏ.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.1: Nấm Linh chi đỏ (Ganoderma lucidum) (A),

nấm mọc trong tự nhiên (B) và nấm trồng (C)

1.1.1.1. Phân loại

Vị trí phân loại của nấm Linh chi (Nguyễn Lân Dũng, 2010)

Giới: Nấm – Mycota hay Fungi

Ngành: Nấm thật – Eumycota

Ngành phụ: Basidiomycotina

Lớp: Hymenomycetes

Lớp phụ: Hymenomycetidae

Bộ: Ganodermatales

Họ: Ganodermataceae

Chi: Ganoderma

Đồ án tốt nghiệp

Loài: Ganoderma lucidum

Từ thời cổ xưa có rất nhiều nhà nghiên cứu (cả ở Trung Quốc và phương Tây) đã

tìm hiểu về loại nấm này và họ cũng đã đưa ra rất nhiều hệ thống để phân loại nấm

Linh chi. Những nhà nghiên cứu Trung Quốc cổ đại đã chia nấm Linh chi thành rất

nhiều loại khác nhau dựa vào thể quả cũng như hình dáng bên ngoài của nấm.

Ở phương Tây, theo trình định danh có đến 8 lần đặt tên khoa học cho loài này.

Kể từ lần đặt tên đầu tiên của Curtis W (1781) cho đến khi P.A Karsten – nhà nấm học

Phần Lan xác định tên chính thức Ganoderma lucidum (Leyss. Ex Fr.) Karst đã mất

đến 100 năm (1881). Kể từ đó nấm Linh chi đỏ đã trở thành một đại diện tiêu biểu cho

chủng loại nấm này. Về sau, đặc điểm phân loại của nấm Linh chi đã được thay đổi

bởi một số nhà khoa học khác như Donk, Murrill, Furtano và Steyaert, ... sau khi họ đã

tìm ra những đặc tính khác của nấm Linh chi như các bào tử của nấm Linh chi có hình

quả trứng, lớp ngoài của thành tế bào tương đối mỏng và trong suốt, ngược lại lớp

trong của thành tế bào lại dày, màu vàng nâu và có nhiều nốt nhỏ. Cũng từ đó, nấm

Linh chi không còn được phân loại dựa vào màu sắc hay hình dạng bên ngoài nữa.

Trong bộ “Bản thảo cương mục” (in năm 1995) của Lý Thời Trân, đại danh y

Trung Quốc đã phân loại Linh chi theo màu sắc thành lục bảo Linh chi (6 loại), với màu

sắc và tên gọi khác nhau: Thanh chi, Xích chi, Hoàng chi, Bạch chi, Hắc chi, Tử chi.

- Xích Chi - Nấm Linh chi đỏ: còn được gọi là Đơn chi, Hồng chi có vị đắng,

thường được tìm thấy ở trên núi Huo. Ganoderma lucidum là đại diện chính cho loài

nấm này. Những đặc điểm của nấm Linh chi đỏ chính là nắp nấm có hình dạng giống

như quả thận hoặc hình bán nguyệt, màu nâu đỏ. Thân nấm có dạng giống như một

thân cây, cùng màu hoặc đậm hơn so với nắp nấm. Nấm Linh chi đỏ giúp ích tâm khí,

chủ vị, tăng trí tuệ. Sử dụng Linh chi đỏ để tăng cường trí nhớ, bổ trung, phòng tránh

các bệnh tim mạch và chữa trị tức ngực.

- Tử chi - Nấm Linh chi tím: còn được biết đến với tên gọi là Linh chi gỗ, màu tím

có vị ngọt. Đặc điểm của loại nấm này là nắp nấm có màu nâu hoặc nâu tím. Thể quả

có màu nâu, bào tử của chúng lớn hơn nấm Linh chi đỏ. Ganoderma sinense là đại

Đồ án tốt nghiệp

diện của loài nấm này. Tử chi có tác dụng bảo thần, làm cứng gân cốt, ích tinh, da tươi

đẹp.

- Hoàng chi - Linh chi vàng: còn gọi là Kim chi, loại nấm này có màu vàng tím, có

vị ngọt. Một cây nấm lớn có thể nặng khoảng 5 kg hoặc hơn, còn cây nấm non thì

nặng khoảng 1,5 đến 2 kg. Laetiporus sulphureus là đại diện của loài nấm này. Khi

tươi thì nấm này sẽ chứa rất nhiều nước, có tác dụng ích tì khí, trung hòa, an thần.

- Bạch chi - Linh chi trắng: còn gọi là nấm Linh chi ngọc bích, có màu trắng. Theo

như Bao Puzi mô tả thì đây là loại nấm không có chất béo, Fomitopsis officinalis là đại

diện cho loài nấm này. Loại nấm này có thể quả màu trắng, hình dáng giống như một

cái móng ngựa. Một cây nấm lớn có thể nặng đến nhiều kilogram. Loại nấm này

thường mọc trên cây thông và một số loại cây lá kim khác. Bạch chi có vị cay, tính

bình, không độc, ích phế khí, chữa ho nghịch hơi.

- Hắc chi - Linh chi đen: còn gọi là nấm Linh chi xuân hay Huyền chi có màu đen

và vị mặn. Loại nấm này thường mọc ở trong những thung lũng, nắp nấm bên ngoài có

màu đen bên trong có màu đỏ, thường mọc trên các thân cây, có vị mặn và đắng.

Amauroderma rugosum và Polyporus melanopus là 2 đại diện chính của loài nấm này.

Cả cuống và nắp của 2 loại nấm này đều có màu đen. Hắc chi có tác dụng ích thận khí,

khiến cho đầu óc sản khoái và tinh tường.

- Thanh chi – Linh chi xanh: còn gọi là nấm Linh chi rồng. Theo Bao Puzi miêu tả

thì nấm Linh chi xanh có hình dáng giống như những sợi lông của chim bói cá.

Coriolus versicolar là đại diện tiêu biểu cho loài nấm này. Đặc điểm của loài này là

mũ nấm cứng và bề mặt được bao phủ bởi những sợi lông ngắn. Thanh chi giúp cho

sáng mắt, giúp cho an thần, bổ can khí, nhân thứ, dùng lâu sẽ thấy thân thể nhẹ nhàng

và thoải mái.

Trong mỗi loài nấm Linh chi lại được chia ra rất nhiều loại khác nhau. Ví dụ như

nấm Linh chi đỏ thì có Ganoderma lucidum và Ganoderma tsugae được biết đến nhiều

nhất. Đối với Linh chi tím thì có Ganoderma neojaponicum và Ganoderma sinense.

Tuy nhiên, trong lĩnh vực trồng trọt, y dược và nha khoa, người ta chỉ tập trung nghiên

cứu 2 loại đó là Linh chi đỏ và Linh chi tím.

Đồ án tốt nghiệp

Gần đây khi đã tìm ra được phương pháp gây giống, những nhà khoa học Nhật

Bản chứng minh được rằng những cây nấm có màu sắc khác nhau không phải vì khác

loại mà chỉ vì môi trường và điều kiện sống khác nhau. Nếu thay đổi điều kiện người ta

có thể có được sáu loại từ cùng một giống.

Ngoài cách phân loại Linh chi theo màu sắc, người ta còn có thể phân loại Linh

chi theo các đặc điểm như:

 Vị trí nấm mọc trên cơ chất chủ.

 Nhóm mọc cao: tai nấm mọc từ gốc lên đến ngọn cây.

 Nhóm mọc gần đất : nấm mọc từ gốc cây chủ.

 Nhóm mọc từ đất : tai nấm mọc từ rễ cây hoặc xác mùn.

 Nhiệt độ ra nấm.

 Nhóm nhiệt độ thấp: tai nấm mọc ở nhiệt độ 200C – 230C.

 Nhóm nhiệt độ trung bình: tai nấm mọc ở 240C – 260C.

 Nhóm nhiệt độ cao: tai nấm mọc ở 270C – 300C.

Do đó, có thể thấy rằng Linh chi không những đa dạng về chủng loại mà còn đa

dạng về sinh thái, đây là loại nấm mang tính toàn cầu (Patouillard, N. 189). Linh chi

thuộc nhóm nấm lớn và rất đa dạng về chủng loại, từ khi xác lập một chi riêng là

Ganoderma Karst (1981), đến nay tính ra có tới 2000 loài và phổ biến nhất là

Ganoderma lucidum có tới 45 loại.

Ở Việt Nam, loài chuẩn Linh chi Ganoderma lucidum mới được trồng thành công

trong phòng thí nghiệm năm 1978. Năm 1994 loài nấm lim – một chủng Linh chi đỏ

đặc sắc của các rừng cây Lim miền Bắc Việt Nam đã được Phạm Văn Thụ đưa vào

nuôi trồng chủ động.

1.1.1.2. Đặc điểm sinh học của nấm Linh chi

Về hình thái ngoài, chúng cũng có ít nhiều sai khác:

- Cuống nấm: dài hoặc ngắn, đính bên có hình trụ đường kính 0,5 – 3cm, cuống

nấm ít phân nhánh, đôi khi uốn khúc. Lớp vỏ cuống màu nâu, nâu đỏ hoặc nâu đen,

bóng, không có lông phủ trên mặt tán nấm.

Đồ án tốt nghiệp

- Mũ nấm: khi non hình trứng, lớn dần hình quạt. Mũ nấm dạng thận – gần tròn,

đôi khi xòe hình quạt hoặc ít nhiều dị dạng. Trên mặt mũ có vân gợn đồng tâm và có

tia rãnh phóng xạ, màu sắc từ vàng nâu – vàng cam – đỏ cam – đỏ nâu – nâu tím – nâu

đen, được bao phủ bởi sợi không vách ngăn ngang xếp sít nhau kiểu hàng rào và có

đầu sợi dày thêm ra, đường kính đoạn sợi phình to ra 8 – 10 μm. Chính những tế bào

vỏ này tạo nên lớp vỏ bền vững và bóng như vecni cho nấm. Lớp vỏ láng phủ suốt

theo cuống. Kích thước tán biến động từ 2 – 30 cm, dày 0,8 – 2,5 cm, cuống dài từ 2,5

- 3,5 cm, tròn mập hoặc mảnh (đường kính từ 0,5 – 2,2 cm). phần đính cuống hoặc gồ

lên hoặc lõm như lõm rốn. Thịt nấm dày từ 0,4 – 1,8 cm màu vàng kem – nâu nhạt –

trắng. Nấm mềm dai khi tươi, khi khô chắc cứng và nhẹ. Hệ sợi kiểu trimitic, đầu tận

cùng lớp sợi phình hình chùy, màng rất dày đan kít vào nhau tạo thành lớp vỏ láng phủ

trên mặt trên mũ và bao quanh cuống bởi sự hình thành các chất lacate tan mạnh trong

cồn. Nhờ lớp laccate láng bóng không tan trong nước đó mà nấm chịu được mưa,

nắng. Ở lớp dưới, hệ sợi tia xuống đều đặn, tiếp giáp vào tầng sinh bào .

- Thụ tầng: Tầng sinh sản (bào tầng, thụ tầng – hymenium) là một lớp ống dày từ

0,2 – 1,7 cm, gồm các ống nhỏ thẳng, miệng tròn, trắng – vàng ánh xanh, khoảng 3 – 5

ống/mm. Đảm đơn bào mang 4 đảm bào tử hình trứng – trứng cụt – hình chùy, không

màu, dài 16 - 22μm. Thực chất đó là do màng phủ lỗ nảy mầm (germpore) phồng căng

hay lõm thụt vào mà thành.

1.1.2. Bào tử nấm Linh chi

Cũng như các loài nấm khác, nấm Linh chi khi trưởng thành sẽ sản sinh ra bào tử,

tức là hạt giống hữu ích cho đời sau. Bào tử thường được mô tả có dạng trứng cụt. Đôi

khi có tác giả mô tả là dạng hình trứng có đầu chóp tròn - nhọn. Thực ra đó là do chụp

phủ lớp nảy mầm hoặc phồng căng, hoặc lõm thụt vào mà tạo thành. Mỗi bào tử được

bao phủ với hai lớp vách rất khó phá vỡ gọi là sporoderm (FDA 1.8.1999), màu vàng

mật ong sáng, chính giữa khối nội chất tụ lại một giọt hình cầu, dạng giọt dầu, kích

thước bào tử rất nhỏ dao động khoảng từ 6,5 x 8,0 µm đến 9,6 x 12,6 µm. Vách bào tử

gồm hai lớp liên kết giữa exosporium và endosporium, có độ dày 0,8 x 1,0 µm và 11 x

14 µm, có cấu trúc phức tạp. Bào tử nấm Linh chi có hai lớp vách rất cứng, khó nảy

Đồ án tốt nghiệp

mầm (Carlos Ricardo Soccol và cộng sự, 2016). Một số nghiên cứu về kích thước bào

tử nấm Linh chi được trình bày trong bảng dưới đây (bảng 1.1).

Bảng 1.1. Biến động kích thước bào tử đảm nấm Linh chi chuẩn ở các mẫu vật khác

nhau (Lê Xuân Thám, 1996)

Nguồn Kích thước bào thử (μm) Vùng thu mẫu

1889, Patouuillard 10 – 12 x 6 – 8 Đông Dương

9,5 – 11 x 5,5 – 7 Nhật Bản 1939, Imazeki

8,5 - 11,5 x 5 – 6,5 Trung Quốc 1964, Teng

8,5 – 10,8 – 13 x 5,5 – 8,5 Indonesia, Úc châu 1972, Steyaert

9 – 13 x 6 – 8 Anh Quốc 1973, Pegler và cộng sự

7 – 12 x 6 – 8 Bắc Âu, Phi châu 1976, Ryvarden

1980, Ryvarden và cộng 7 – 12 x 6 – 8 Đông Phi châu sự

7,5 – 10 x 5 – 6,5 Bắc Việt Nam 1981, Kiet

1982, Bazzalo và cộng sự 9 – 13 x 5 – 7 Argentine

1986,Melo 8,2 – 11,5 – 13,5 x 6,5 – 7,5 – 8,1 Bồ Đào Nha

1986, Gibertson và cộng 9 – 12 x 5,5 – 8 Bắc Mỹ sự

1986, Adaskaveg và cộng 10 – 11,8 x 6,8 – 7,8 Bắc Mỹ sự

7 – 8 x 6 – 7,8 Bắc Âu 1987, Peterson

9 – 11 x 6 – 7 Trung Quốc 1989, Zhao

8,5 – 11,5 x 5 – 7 Đài Loan 1990, Hseu

9 – 12 x 5 – 7 Hà Bắc, Việt Nam 1994, Thu

1994, Tham và cộng sự 8 – 10,5 x 5 x 7 Lạng Sơn, Việt Nam

1996, Tham 7,5 – 11,5 x 5,5 – 7 Đà Lạt, Việt Nam

Khi Linh chi phóng thích bào tử, nhìn xuyên qua ánh nắng sẽ thấy từng đợt bào tử

bay qua như khói bám vào bề mặt nấm tạo thành một lớp bụi mỏng màu nâu đỏ rất mịn.

Đồ án tốt nghiệp

Tuy vậy số lượng bào tử Linh chi rất ít. Khi thu hoạch 1 tấn nấm Linh chi sẽ chỉ thu

được 1 kg bào tử.

Điều hết sức lý thú, mặc dù hình thái bên ngoài rất biến đổi, đa dạng, song về cấu

tạo tinh vi của bào tử thì có độ ổn định rất cao, dù là chủng nuôi trồng ở Nhật, Trung

Quốc, chủng nấm Lim Hà Bắc hay chủng Đà Lạt.

a) b)

Hình 1.2. Bào tử nấm Linh chi dưới kính hiển vi được phóng to 3000 lần

a) Bào tử nấm Linh chi chưa bị phá vỡ

b) Bào tử nấm Linh chi bị phá vỡ vách

Hình 1.3. Hình thái giải phẫu thể quả nấm Linh chi Ganoderma lucidum

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.4. Các kiểu hình bào tử đặc thù của họ nấm Linh chi

1: Kiểu miệng rộng, gặp ở Ganoderma và Humphrey a (có mấu lồi đáy bào tử).

2: Kiểu miệng tiêu giảm, gặp ở Haddowia và Amauroderma (lưu ý kiểu bào tử xẻ

múi ở Haddowia rất tương đồng với kiểu xẻ rãnh ở Ganoderma)

Lớp vỏ trong mỏng hơn, sát ngay bên dưới tầng nền của lớp vỏ bào tử, thường cản

quang mạnh do vậy thấy đậm màu dưới kính hiển vi quang học. Cấu trúc của lớp vỏ

trong cho đến nay còn chưa được biết rõ. Cần lưu ý rằng: khái niệm – “gai chống nhọn”

từ màng trong đâm sát màng ngoài của hầu hết các mô tả trước đây không chính xác.

Thực chất các gai hay chính các cột chống hầu như không nhọn, mà phình đầu thành

các u lồi - và chính các u lồi này đội lớp màng phủ trong suốt ngoài cùng (episporium,

exosporium hay chính là tầng phủ tectum), tạo thành các kiến trúc gò hạt - mụn cóc - u

nhú trên bề mặt vỏ bào tử. Điều này Heim (1962), Hansen (1958), Perreau (1973),

Mims và cộng sự (1989) đã từng phân tích và thảo luận nhiều.

1.2. Thành phần hóa học chủ yếu của nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi

Trong đề tài nghiên cứu năm 2005 của Nguyễn Minh Khang, thành phần dược

tính của nấm Linh chi được phân như sau:

Bảng 1.2. Thành phần dược tính của nấm Linh chi

Đồ án tốt nghiệp

Chất Hàm lượng

Nước 12 - 13%

Cellulose 54 - 56%

Lignin 13 - 14%

Hợp chất nitơ 1,6 – 2,1%

Chất béo (kể cả dạng xà phòng hóa) 1,9 - 2%

Hợp chất phenol 0,08 – 0,1%

Hợp chất Sterol toàn phần 0,11 – 0,16%

Saponin toàn phần 0,3 – 1,23%

Theo Wachtel Galor và cộng sự (2011) trong nấm Linh chi tươi, nước là thành

phần chủ yếu chiếm 90% khối lượng. Trong 10% còn lại thì protein chiếm 10- 40%,

chất béo chiếm từ 2 - 85%, carbonhydrate chiếm 3 - 28%, chất xơ chiếm 3 - 32%, hàm

lượng tro chiếm 8 - 10% cùng một số loại vitamin và khoáng chất khác như kali, can-

xi, phốt pho, ma-giê, selen, sắt, kẽm, trong đó đồng chiếm tỉ lệ nhiều nhất (Borchers và

cộng sự, 1999). Trong một nghiên cứu về những thành phần của nấm, Mau và cộng sự

(2001) đã xác định được tỷ lệ của các thành phần chủ yếu trong nấm Linh chi gồm: tro

(1,8%), carbonhydrate (26 - 28%), chất béo thô (3 - 5%), chất xơ (59%) và protein (7 -

8%). Hàm lượng của protein trong nấm Linh chi khoảng 7 - 8%, thấp hơn so với nhiều

loại nấm khác (Chang và cộng sự, 1996; Mau và cộng sự, 2001). Đặc biệt thành phần

protein của nấm Linh chi có rất nhiều các amino acid thiết yếu nhất là lysine và leucine.

Hàm lượng chất béo tổng thấp nhưng chứa nhiều acid béo không bão hòa nhiều nối đôi,

đây là các hợp chất rất có lợi cho sức khỏe của con người (Chang và cộng sự, 1996;

Borchers và cộng sự, 1999; Sanodiya và cộng sự, 2009). Ngoài ra trong nấm còn chứa

các glycoprotein và các polysaccharide.

Bên cạnh đó, nấm Linh chi có chứa rất nhiều những phân tử có hoạt tính sinh học

như các terpenoid, các steroid, các phenol, các nucleotide và những dẫn xuất của

chúng. Hoạt tính sinh học của nấm Linh chi có được chủ yếu là do các polysaccharide,

peptidoglycan và các triterpene mang lại (Boh và cộng sự, 2007; Zhou và cộng sự,

2007).

Đồ án tốt nghiệp

Địa điểm sinh trưởng của nấm Linh chi cũng được xem là yếu tố ảnh hưởng đến

hàm lượng của các hoạt chất sinh học có trong nấm Linh chi. Trong một nghiên cứu về

hoạt tính sinh học của 11 mẫu sản phẩm nấm Linh chi được trồng ở Nhật Bản, người ta

nhận thấy sự chênh lệch về hàm lượng triterpenoid giữa các mẫu dao động trong

khoảng từ 0 – 7,8% và hàm lượng các polysaccharide dao động trong khoảng từ 1,1 -

5,8% (Lu và cộng sự, 2012). Sự khác nhau về hàm lượng của các hoạt tính sinh học

trong các sản phẩm thương mại cũng chịu ảnh hưởng bởi quá trình chế biến hoặc chiết

xuất, qua đó cho thấy chiết xuất bằng nước sẽ cho hàm lượng triterpenoid ít hơn khi

chiết xuất bằng ethanol (Lu và cộng sự, 2012). Bên cạnh đó, điều kiện sinh trưởng cũng

ảnh hưởng đến hàm lượng của các hoạt chất sinh học có trong nấm Linh chi (Lu và

cộng sự, 2012).

Trước kia, việc thu thập bào tử Ganoderma lucidum rất khó nên điều này làm cho

việc nghiên cứu chức năng cũng như các hoạt chất sinh học có trong bào tử cũng trở

nên khó khăn, do đó cũng chỉ tập trung nghiên cứu vào thể quả của nấm Linh chi. Hiện

nay, việc trồng nấm Linh chi đã trở nên phổ biến hơn, việc thu thập dễ dàng cũng tạo

nhiều điều kiện để nghiên cứu về bào tử Ganoderma lucidum. Ganodermasides A, B, C

và D là dẫn xuất ergosterol phân lập từ chiết xuất methanol của bào tử Ganoderma

lucidum (Jue Wang và cộng sự, 2017). Cấu trúc của Ganodermasides A, B, C và D

được thể hiện trong hình 1.5.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.5. Cấu trúc của Ganodermasides

A, B, C và D. 1 đại diện cho A, 2 đại diện cho B, 3 đại diện cho C, 4 đại diện cho

D; 1: R 1 = H, R 2 = OH, R 3= H; 2: R 1 = H, R 2 = H, R 3 = OH; 3: R 1 = OH, R 2 ,

R 3 = O;

4: R 1 = OH, R 2 = H, R 3 = H.

Bào tử Linh chi có chứa các thành phần giống nấm Linh chi: Polysaccharide,

triterpenoid, acid béo, acid amin, vitamin, các nguyên tố vi lượng,… với hàm lượng

đậm đặc hơn Linh chi từ 7 - 20 lần (Cheng CR và cộng sự, 2010). Bào tử nảy mầm có

hoạt tính sinh học cao hơn bào tử không nảy mầm, có thể thấy việc thu các hợp chất

sinh học phụ thuộc vào việc vách bào tử có bị vỡ hay không (Carlos Ricardo Soccol và

cộng sự, 2016).

Bảng 1.3. Hàm lượng các hoạt chất sinh học trong thể quả và bào tử nấm Linh chi (Li

JJ và cộng sự, 2014)

Hàm lượng Polysaccharides Triterpenoids Protein

Thể quả nấm 0,25% - 1,42% 0,44% - 1,42% 1,82% - 3,67%

Bào tử còn nguyên 0,41% - 0,91% 0,09% - 0,12% 0,78% - 0,90%

Bào tử phá vỡ 1,03% - 2,25% 1,89% - 3,15% 0,96 % - 1,04%

1.2.1. Các polysaccharide và các peptidoglycan

Hàm lượng carbonhydrate và hàm lượng chất xơ có trong nấm Linh chi được xác

định lần lượt từ 26 - 28% và 59% (Mau và cộng sự, 2001). Hàm lượng carbohydrate

trong bào tử Ganoderma lucidum bị phá vỡ là 1,57% ± 0,06% cao hơn so với bào tử

còn nguyên là (0,41% ± 0,01%) (Yue và cộng sự, 2008).

Nấm Linh chi có chứa rất nhiều polysaccharide có khối lượng phân tử lớn, các

hợp chất này mang hoạt tính sinh học và được tìm thấy ở tất cả các bộ phận của nấm

Linh chi. Nhiều nhóm polysaccharide có thể được chiết xuất từ thân nấm, bào tử và

khuẩn ty. Các polysaccharide của nấm Linh chi có tác dụng sinh học như chống viêm,

hạ đường huyết, chống loét, chống lại sự hình thành khối u và tăng cường khả năng

Đồ án tốt nghiệp

miễn dịch (Miyazaki và cộng sự, 1981; Hikino và cộng sự, 1985; Tomoda và cộng sự,

1986; Bao và cộng sự, 2002; Wachtel Galor và cộng sự, 2004). Người ta thường chiết

xuất các polysaccharide trong nấm Linh chi bằng nước nóng sau đó tiến hành kết tủa

chúng bằng dung dịch ethanol hoặc methanol. Đôi khi cũng có thể chiết xuất bằng nước

và dung dịch kiềm. Theo kết quả phân tích, thành phần chủ yếu trong polysaccharide

của nấm Linh chi (Ganoderma lucidum - polysaccharides: GL - PSs) là đường glucose

(Bao và cộng sự, 2002; Wang và cộng sự, 2002). Ngoài ra, GL - PSs cũng có cấu trúc

polymer mạch thẳng, bao gồm: xylose, mannose, galactose và fucose với nhiều vị trí

liên kết p hoặc a khác nhau như 1 - 3, 1 - 4 và 1 - 6 với các dạng đồng phân - D hay L

(Lee và cộng sự, 1999; Bao và cộng sự, 2002). Khả năng chống lại sự hình thành khối u

của GL - PSs phụ thuộc vào cấu hình mạch nhánh cũng như tính tan của polysaccharide

này (Bao và cộng sự, 2002; Zhang và cộng sự, 2001). Ngoài ra, nấm Linh chi cũng có

chứa một mạng lưới chitin, đây là thành phần mà cơ thể người không tiêu hóa được và

đóng vai trò tạo nên độ cứng cho nấm Linh chi (Upton và cộng sự, 2000).

Có rất nhiều peptidoglycan có hoạt tính sinh học trong nấm Linh chi đã được

phân lập, bao gồm proteoglycan (GLPG) có tác dụng kháng virus (Li và cộng sự,

2005), tăng cường miễn dịch (Ji và cộng sự, 2007) và F3 là một glycoprotein trong cấu

trúc có chứa fucose (Chien và cộng sự, 2004).

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.6. Cấu trúc không gian của polysaccharide trong nấm Linh chi

1.2.2. Triterpenes

Terpenoid là nhóm chất tự nhiên, có độ dài mạch carbon là một bội số của 5, ví dụ

như menthol (monoterpene) và β - carotene (tetraterpene). Phần lớn các terpenoid thuộc

nhóm alkene, một số có chứa những nhóm chức năng, đa phần các terpenoid có cấu

trúc mạch vòng. Những hợp chất này được tìm thấy trên rất nhiều loài thực vật.

Terpenoid có tác dụng chống viêm, chống lại sự hình thành các khối u và giúp giảm

hàm lượng chất béo. Terpenoid được tìm thấy trong các loại thực vật thuộc nhóm bạch

quả, ví dụ như hương thảo (Rosemarinus officinalis) và nhân sâm (Panax ginseng) có

Đồ án tốt nghiệp

tác dụng tăng cường sức khỏe (Mahato và cộng sự, 1997; Mashour và cộng sự, 1998;

Haralampidis và cộng sự, 2002).

Triterpene là một phân lớp của terpenoid và có độ dài mạch carbon là 30. Khối

lượng phân tử khoảng từ 400 đến 600 kDa, triterpene có cấu trúc hóa học phức tạp và

có khả năng bị oxy hóa cao (Mahato và cộng sự, 1997; Zhou và cộng sự, 2007). Nhiều

loài cây có khả năng tổng hợp triterpene trong quá trình sinh trưởng và phát triển. Một

số có chứa nhiều triterpene trong nhựa, qua đó giúp các cây này chống lại các loại

bệnh. Mặc dù có hàng trăm loại triterpene đã được phân lập từ rất nhiều loại thực vật

khác nhau và phân nhóm này cũng đã cho thấy có rất nhiều tiềm năng nhưng hiện nay

có rất ít những ứng dụng của triterpene được sử dụng trong thực tế.

Trong nấm Linh chi, cấu trúc hóa học của triterpene có dạng lanostane, đây là

chất tham gia vào quá trình tổng hợp nên lanosterol, quá trình sinh tổng hợp giúp hình

thành nên các squalene mạch vòng (Haralampidis và cộng sự, 2002). Trong quá trình

chiết xuất triterpene, người ta thường sử dụng các dung môi hữu cơ như methanol,

ethanol, acetone, chloroform, ether hoặc là hỗn hợp của chúng. Dịch chiết sau đó sẽ

được phân tách bằng nhiều phương pháp khác nhau, có thể dùng HPLC thông thường

hoặc HPLC pha nghịch đảo (Chen và cộng sự, 1999; Su và cộng sự, 2001). Những

triterpene đầu tiên được Kubota phân tách từ nấm Linh chi là ganoderic acid A và B

(Kubota và cộng sự, 1982). Kể từ khi đó, hơn 100 loại triterpene cùng với cấu hình của

chúng đã được tìm ra. Trong số đó, có hơn 50 loại là đặc trưng chỉ được tìm thấy trong

nấm Linh chi. Đa số các triterpene là các ganoderic và lucidenic acid, nhưng cũng có

một số loại khác như là ganoderal, ganoderiol và ganodermic acid (Nishitoba và cộng

sự, 1984; Sato và cộng sự 1986; Budavari và cộng sự, 1989; Gonzalez và cộng sự

1999; Ma và cộng sự 2002; Akihisa và cộng sự 2007; Zhou và cộng sự 2007; Jiang và

cộng sự 2008; Chen và cộng sự 2010).

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.7. Công thức của một số triterpene trong nấm Linh chi (Kubota và cộng sự,

1982; Helv Chim Acta 65: 611-9; Nishitoba và cộng sự, 1984; Agric Biol Chem 48:

2905-7; Sato và cộng sự, 1986; Agric Biol Chem 50: 2887- 90; Budavari và cộng sự,

1989).

Nấm Linh chi rất giàu hàm lượng các triterpene, những chất này cũng góp phần

tạo nên vị đắng của nấm Linh chi. Chúng mang nhiều hoạt tính sinh học có lợi cho sức

khỏe, như khả năng chống oxy hóa và giảm hàm lượng chất béo trong cơ thể. Tuy

nhiên, hàm lượng triterpene trong nấm Linh chi lại không ổn định. Chúng phụ thuộc rất

nhiều vào giống, loài, nơi trồng, điều kiện canh tác cũng như phương pháp chế biến,

điều này đã được thể hiện trong một nghiên cứu của Chen và Su được tiến hành vào

năm 1999 và 2001 (Chen và cộng sự, 1999; Su và cộng sự, 2001).

Cho đến nay, hơn 150 triterpenoids đã được tìm thấy từ thể quả của nấm Linh chi

đại diện cho năm lớp cấu trúc chính. So với thể quả của nấm Linh chi, các nghiên cứu

về bào tử của nấm Linh chi mới bắt đầu từ năm 1988 (Hou CY và cộng sự, 1988) và có

29 loại triterpenoids đã được tìm thấy trong bào tử này. Với những tiến bộ gần đây

trong quang phổ và trắc phổ kỹ thuật hiện đại, một loạt các triterpenoids được phân lập

từ các bào tử của nấm Linh chi và đã thu hút được sự chú ý của các nhà hóa học và

dược sĩ. Tất cả các triterpenoids trong các bào tử của nấm Linh chi có quá trình tổng

hợp tương tự nhau, cụ thể là con đường acid movalonic (MVA) (Bingji Ma và cộng sự,

2011). Các Triterpenoids này được bắt đầu từ trans - squalene và sau đó đã được thay

Đồ án tốt nghiệp

đổi bởi quá trình oxy hóa, giảm, khử acid, tạo vòng, sắp xếp lại, tạo ra nhiều loại cấu

hình triterpenoids trong bào tử của nấm Linh chi.

Triterpenoids được cô lập từ bào tử Linh chi cho thấy khả năng kháng HIV-1

protease, chống khối u, và các hoạt động chống bổ sung. Triterpenoids này là thành

phần hoạt chất chính của bào tử Linh chi và biểu thị cho các hoạt tính sinh học khác

nhau được sử dụng trong dược liệu.

Hình 1.8. Cấu trúc không gian của 29 loại triterpenoids trong bào tử nấm Linh chi

(Bingji Ma và cộng sự, 2011)

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.9. Tên của 29 triterpenoids trong bào tử nấm Linh chi (Bingji Ma và

cộng sự, 2011)

Triterpenoids được cô lập từ bào tử của nấm Linh chi: năm triterpenoids thu được

từ phần tan trong ether của bào tử của nấm Linh chi và trên cơ sở tính chất hóa học và

dữ liệu quang phổ, acid ganopsoreric A (1), acid ganoderic B (2), acid ganoderic C1 (3),

Đồ án tốt nghiệp

acid ganoderic E (4) và ganodermanontriol (5) được xác định tương ứng (Bingji Ma và

cộng sự, 2011). Thí nghiệm dược lý cho thấy acid ganopsoreric A có có hoạt tính GTP

thấp đối với gan chuột bị tổn thương bởi CC14 và GaNI (Chen RY và cộng sự, 1993).

Hai triterpenoids pentacyclic mới, có tên ganosporelactone A (6) và B (7) được cô lập

từ bào tử của nấm Linh chi, có thể được bắt nguồn từ khung lanostane thông qua việc

hình thành liên kết C18 và C23 (Chen RY và cộng sự, 1991). Hai triterpenes lanostane

kiểu mới, lucidumol A (8) và p - acid ganoderic (9), cùng với một lucidumol B (10) và

bảy triterpenoids đã biết, ganodermanondiol (11), ganoderiol F (12), acid ganoderic A

(13), acid ganolucidic A (14), và 2, 3, 5. Trong số các hợp chất cô lập, các hợp chất 5,

10, 11 và 14 cho thấy khả năng kháng virus gây suy giảm miễn dịch (kháng HIV) - 1

protease hoạt động đáng kể với giá trị IC50 với giá trị 20 - 90 μM (Min BS và cộng sự,

1998).

6 loại lanostane - triterpenes mới có tính oxy hoá cao, được gọi là ganoderic acid

γ (15), acid ganoderic δ (16), acid ganoderic ε (17), acid ganoderic ξ (18), acid

ganoderic η (19), acid ganoderic θ (20), cùng với ganolucidic acid D (21) và acid

ganoderic C2 (22) thu được từ các bào tử nấm. Các khả năng gây độc của các hợp chất

15 - 21 đã được thực hiện in vitro chống dòng tế bào ung thư Meth - A và LLC (Min

BS và cộng sự, 1998). Một terpenoid C27 có hoạt tính oxy hóa cao mới, lucidenic axit

SP1 (23), thu được từ một phần CHCl3 - tan của bào tử nấm Linh chi cùng với 11

triterpenoids, acid ganoderic C6 (24), acid ganoderic G (25), và 2, 3, 5, 8, 9, 11, 12, 13,

14 (Bingji Ma và cộng sự, 2011).

1.2.3. Saponin

Saponin còn gọi là saponosid do chữ latin sapo - xà phòng (vì tạo bọt như xà

phòng), là một nhóm glycosid lớn, được tìm thấy rộng rãi trong thực vật. Người ta cũng

phân lập được saponin trong động vật như hải sâm, cá sao.

Saponin có một số tính chất đặc biệt:

- Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước, có tác dụng nhũ hoá

và tẩy sạch.

- Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng.

Đồ án tốt nghiệp

- Độc với cá vì saponin làm tăng tính thấm của biểu mô đường hô hấp nên làm mất

các chất điện giải cần thiết, ngoài ra có tác dụng diệt các loài thân mềm như giun, sán,

ốc sên.

- Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt, có tác dụng long đờm, lợi tiểu; liều cao

gây nôn mửa, đi lỏng.

- Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3-b -hydroxysteroid khác.

Tuy vậy một vài tính chất trên không thể hiện ở một vài saponin. Ví dụ:

sarsaparillosid thì không có tính phá huyết cũng như tính tạo phức với cholesterol.

Saponin đa số có vị đắng trừ một số như glycyrrhizin có trong cam thảo bắc, abrusosid

trong cam thảo dây, oslandin trong cây Polypodium vulgare có vị ngọt.

Saponin tan trong nước, alcol, rất ít tan trong aceton, ether, hexan do đó người ta

dùng 3 dung môi này để tủa saponin. Saponin có thể bị tủa bởi chì acetate, bari

hydroxyde, ammoni sulfat.

Saponin khó bị thẩm tích, người ta dựa vào tính chất này để tinh chế saponin

trong quá trình chiết xuất. Phần genin tức là sapogenin và dẫn chất acetyl sapogenin

thường dễ kết tinh hơn saponin. Saponin triterpenoid thì có loại trung tính và loại acid,

saponin steroid thì có loại trung tính và loại kiềm.

Về mặt phân loại, dựa theo cấu trúc hoá học có thể chia ra: saponin triterpenoid

và saponin steroid.

1.2.4. Acid béo

Người ta thu được lipid của bào tử bị phá vỡ bằng sắc kí lỏng CO2 siêu tới hạn

tìm thấy có 15 loại acid béo, các hợp chất chính là acid palmitic (6,12%), acid stearic

(4,97%), acid oleic (67,11%) và acid linoleic (9,63%) (Gao P và cộng sự, 2012). Chen

và cộng sự (2013) đã xác định và định lượng 9 acid béo, phần lớn trong số đó là acid

oleic (C18:1; 57,5%), acid linoleic (C18:2; 13,4%), acid palmitic (C16:0; 19,6% ), acid

hexadecenoic (C16:1; 2,2%), và acid linolenic (C18:3; 0,5%) và Liu và cộng sự

(2007) xác định được 18 acid béo. Hoạt tính của acid béo thu được từ bào tử gồm acid

nonadecanoic và acid cis-9-nonadecenoic có khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào khối u

và gây độc cho tế bào hồng cầu (HL-60) (Gao P và cộng sự, 2012).

Đồ án tốt nghiệp

1.2.5. Các thành phần khác

Tiến hành phân tích thân nấm Linh chi, người ta còn tìm thấy thành phần chất

khoáng như phospho, silicon, sulfur, kali, calcium và magnesium chiếm một tỉ lệ khá

cao. Bên cạnh đó còn có sắt, nhôm, kẽm, đồng, mangan và strontium với hàm lượng

thấp hơn. Ngoài ra còn có một số kim loại nặng như chì, cadmium và thủy ngân (Chen

và cộng sự, 1998). Trong một nghiên cứu của Chiu được tiến hành vào năm 2000, khi

phân tích nấm Linh chi hoang thuộc loài Ganoderma spp, ông đã xác định được trong

hàm lượng chất khoáng của loại nấm này có chứa 10,2% là kali, calcium và

magnesium. Cũng trong một nghiên cứu khác thì Falandysz đã không tìm thấy

cadmium và thủy ngân trong những mẫu nấm Linh chi, nhưng hàm lượng selenium

được xác định là 72 pg/g.

Trong thành phần của nấm Linh chi (Ganoderma spp) có một chất cũng nhận

được rất nhiều sự quan tâm, đó là germanium. Đây là chất có hàm lượng nhiều thứ 5

trong các chất khoáng (489 pg/g) có trong nấm Linh chi. Chất này tồn tại rất ít ở các

loại thực vật trong tự nhiên, chỉ một phần rất nhỏ được tìm thấy trong nhân sâm, lô hội

và tỏi (Mino và cộng sự, 1980). Mặc dù germanium không phải là thành phần thiết yếu,

nhưng chỉ cần một liều lượng thấp cũng đã có tác dụng tăng cường khả năng miễn dịch,

kháng khối u, chống oxy hóa và chống đột biến (Kolesnikova và cộng sự, 1997).

Những hợp chất khác cũng được tìm thấy trong nấm Linh chi đó là các loại

enzyme như metalloprotease (đây là loại enzyme có tác dụng trì hoãn quá trình đông

máu). Ngoài ra, ergosterol (provitamin D2), các nucleoside và các nucleotide (như

adenosine và guanosine) (Wasser và cộng sự, 2005; Paterson và cộng sự, 2006; Kim và

cộng sự, 2004). cũng đã được tìm thấy trong nấm Linh chi, đây là những hợp chất có

tác dụng ức chế thuận nghịch a-glucosidase và SKG-3.

Trong lớp vách sporoderm còn phát hiện được các chất vô cơ như magie, nhôm,

silicon, phosphate, lưu huỳnh, clo, kali, canxi, sắt và niken, một số chất có hàm lượng

cao như silicon (19,01%) và canxi (24,31%) (Carlos Ricardo Soccol và cộng sự, 2016).

1.3. Công dụng của nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi

Một số dạng sản phẩm từ nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi đang có hiện nay:

Đồ án tốt nghiệp

- Trà túi lọc nấm Linh chi: bồi bổ sức khỏe, tăng khả năng miễn dịch của cơ thể,

điều hòa tim mạch, hạ cholesterol, phòng và chống viêm gan, an thần, tăng trí nhớ,

tăng tuổi thọ.

- Bột Nấm Linh chi: bồi bổ sức khỏe và hỗ trợ điều trị nhiều loại bệnh ung thư, xơ

gan, điều hòa huyết áp, tiểu đường, tăng cường hệ miễn dịch, chống lão hóa…

- Viên nang dầu bào tử: Chống oxy hóa, trung hòa các gốc tự do, giảm Cholesterol

trong máu, chống xơ vữa động mạch, ổn định huyết áp, giải độc gan. Chữa mất ngủ,

giúp da dẻ mịn màng, giảm sạm nám tàn nhang. Hỗ trợ tăng hồng cầu cho bệnh nhân

ung thư. Giúp đào thải độc tố trong gan cho bệnh nhân ung thư, bệnh mãn tính, người

hay tiếp xúc rượu bia, stress.

- Bột bào tử nấm Linh chi: Tăng cường hệ thống miễn dịch, cô lập và diệt các tế

bào ung thư, chống viêm nhiễm, bảo vệ gan, tăng cường chức năng chức năng gan,

thải độc chống dị ứng, điều hoà huyết áp, nhịp tim, tăng lượng oxy trong máu, giảm

cholesterol, dùng tốt cho bệnh nhân tiểu đường.

Hình 1.10. Các dạng sản phẩm của nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi

Đồ án tốt nghiệp

Riêng đối với bào tử nấm Linh chi có thể được sử dụng dưới dạng còn nguyên

hoặc bị phá vỡ, nhưng có nhiều báo cáo đã chỉ ra rằng bào tử bị phá vỡ có hoạt tính

sinh học cao hơn so với bào tử còn nguyên. Bào tử còn nguyên đã được tìm thấy trong

phân người và động vật, như vậy bào tử Ganoderma lucidum không thể được tiêu hóa

trong cơ thể, nhưng cũng có báo cáo cho rằng bào tử với lớp vách còn nguyên vẹn có

thể hoạt động khi uống vào trong cơ thể (Carlos Ricardo Soccol và cộng sự, 2016).

1.3.1. Phòng chống ung thư

Nấm Linh chi được sử dụng phổ biến trong quá trình hỗ trợ điều trị ung thư

nhằm giúp tăng cường khả năng miễn dịch cho các bệnh nhân bên cạnh áp dụng những

liệu pháp chữa trị thông thường. Mặc dù hiện nay quá trình điều trị bệnh ung thư đã có

những tiến bộ nhất định thông qua việc chẩn đoán bệnh sớm cũng như những phương

pháp hoá trị hiện đại, tuy nhiên việc chữa dứt điểm các căn bệnh này vẫn còn gặp rất

nhiều khó khăn thử thách (theo WHO 2008). Trong quá trình tìm kiếm những phương

pháp điều trị và những tác nhân hoá trị mới, người ta đã tìm ra trong hàng trăm loài

thực vật, trong đó có cả nấm Linh chi, những hoạt chất sinh học có khả năng ngăn chặn

quá trình hình thành khối u (Wasser và cộng sự, 1999; Borchers và cộng sự, 2008).

Trong nấm Linh chi có một lượng lớn những hợp chất hoá học có thể được chiết xuất

từ thân nấm, sợi nấm và bào tử. Trong đó, các polysaccharide và triterpene là 2 nhóm

hợp chất chính trong nấm Linh chi có tác dụng ngăn ngừa ung thư và ngăn chặn quá

trình hình thành khối u, điều này đã được chứng minh trong những nghiên cứu của

Yuen và cộng sự (2005) cũng như của Zaidman và cộng sự (2005). Một trong những

tác dụng mới được tìm thấy của dịch chiết nấm Linh chi là có khả năng hỗ trợ điều trị

cho các căn bệnh mãn tính, ví dụ như bệnh ung thư và bệnh liên quan đến gan (Bao và

cộng sự, 2005). Những thí nghiệm trên động vật đã cho thấy hiệu quả đáng kể trong

việc ức chế sự hình thành và di căn của các tế bào ung thư. Tuy nhiên, việc tiến hành

những thí nghiệm này trên cơ thể người vẫn còn hạn chế.

Daniel Sliva và cộng sự (2003) đã tiến hành nghiên cứu khả năng ức chế tế bào

ung thư vú trên chuột với các trạng thái khác nhau của nấm Linh chi như: bào tử còn

Đồ án tốt nghiệp

nguyên, bào tử bị phá vỡ, bột thể quả, dịch chiết của thể quả và bào tử với các nguồn

cung cấp khác nhau và đã thu được kết quả như bảng 1.4.

Bảng 1.4. So sánh khả năng ức chế ung thư vú của các bộ phận ở các trạng thái khác

nhau của nấm Linh chi (2,5 mg/mL)

Tên Nguồn gốc Thành phần

Zihanga Zhongkeb Jilinc Two Urnd Double Cranee ReishiMaxf Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Đài Loan Mỹ Khả năng ức chế tế bào ung thư 89,3% 71,9% 9,5% 54,3% 86,5% 99%

Bào tử còn nguyên Bào tử phá vỡ Bào tử còn nguyên Bột thể quả Bột thể quả Dịch chiết thể quả và bào tử

Gần đây có nghiên cứu cho thấy rằng các acid béo C-19 là nonadecanoic acid và

cis-9-nonadecenoic acid thu được từ bào tử Ganoderma lucidum bị phá vỡ có tác dụng

chống tế bào ung thư (Gao P và cộng sự, 2012).

Từ những nhận định và kết quả thí nghiệm nêu trên cho ta thấy việc tìm ra một

quy trình phá vỡ vách bào tử nấm Linh chi hiệu quả để trích xuất các thành phần hoạt

tính sinh học từ bào tử Ganoderma là việc rất quan trọng. Đã có rất nhiều báo cáo

khoa học về các phương pháp phá vỡ bào tử Ganoderma lucidum.

1.3.2. Khả năng kháng oxi hóa

Những hợp chất chống oxi hoá trong thực vật có tác dụng ngăn ngừa ung thư

cũng như những căn bệnh nan y khác (Collins và cộng sự, 2005; Benzie và cộng sự,

2009). Những hợp chất này có tác dụng bảo vệ các thành phần có trong màng tế bào

chống lại những tổn thương do quá trình oxy hoá gây nên, qua đó giúp làm giảm những

nguy cơ gây ra đột biến và ung thư cũng như góp phần bảo vệ các tế bào miễn dịch.

Những hợp chất có trong nấm Linh chi chủ yếu là các polysaccharide và các triterpene

cũng có tác dụng chống lại quá trình oxy hoá tế bào (Lee và cộng sự, 2001; Lin và c ộng

sự, 2002; Shi và cộng sự, 2002; Wachtel Galor và cộng sự, 2005; Yuen và cộng sự,

2008; Saharelli và cộng sự, 2009; Wu và cộng sự, 2009).

Đồ án tốt nghiệp

Các thành phần hoạt tính sinh học trong Ganoderma lucidum bao gồm

polysaccharides, triterpenes, peptide và polysaccharide peptide có tác dụng gián tiếp

hoặc trực tiếp trong việc chống lão hóa (Jue W và cộng sự, 2017).

1.3.3. Điều trị bệnh đái tháo đường

Những thành phần của nấm Linh chi đã được chứng minh là có tác dụng hạ đường

huyết đối với động vật. Các ganoderan A và B là hai polysaccharide được chiết tách từ

thân nấm Linh chi, sau khi được tiêm cho chuột bị tiểu đường với liều lượng 100

mg/kg, cho thấy hàm lượng glucose trong máu giảm và tác dụng hạ đường huyết vẫn

tiếp tục kéo dài suốt 24 giờ (Hikiko và cộng sự, 1985). Cũng trong một thí nghiệm trên

chuột, ganoderan B có tác dụng làm tăng lượng insulin, qua đó làm giảm hàm lượng

glucose trong máu và điều chỉnh quá trình tổng hợp glucose dưới tác dụng của các

enzyme có sẵn trong gan (Hikiko và cộng sự, 1989). Trong một nghiên cứu khác cũng

được tiến hành trên chuột, người ta đã chứng minh được rằng một polysaccharide khác

có trong nấm Linh chi được gọi là ganoderan C cũng có tác dụng hạ đường huyết

(Hikiko và cộng sự, 1989; Tomoda và cộng sự, 1986).

1.3.4. Điều trị các bệnh về tim mạch

Chống nhiễm mỡ, xơ mạch và các biến chứng (bệnh xơ vữa động mạch vành). Có

tác dụng đặc biệt trong việc loại trừ chất cholesterol trong máu và các thành mạch, trợ

tim, lọc sạch máu, làm giảm cholesterol, giảm xơ cứng thành động mạch, thúc đẩy quá

trình lưu thông máu, tăng cường tuần hoàn máu.

Làm giảm mệt mỏi, hỗ trợ thần kinh, chống đau đầu và tứ chi, điều hòa kinh

nguyệt.

Nấm Linh chi đã được cho là có đặc tính hạ huyết áp và tăng huyết áp

(homeostasis). Một peptidoglycan có tác dụng hạ huyết áp nhẹ trên chuột SHR (bẩm

sinh tăng huyết áp) đã được phân lập từ dịch chiết nước nóng của Linh chi. Theo một

báo cáo, huyết áp của khoảng một nửa số bệnh nhân tăng huyết áp được giảm khi được

tiêm chiết xuất từ Linh chi. Điều đó đã được báo cáo rằng bệnh nhân cao huyết áp liên

quan đến angiotensin-I-converting enzyme bị ức chế bởi acid ganoderic (B, D, F, H),

ganoderal A trong nấm Linh chi.

Đồ án tốt nghiệp

1.3.5. Tăng cường hệ miễn dịch

Những tác nhân giúp làm tăng khả năng hoạt động của hệ miễn dịch cũng có tác

dụng tăng cường sức khoẻ, qua đó giúp ngăn ngừa bệnh tật. Nhiều thành phần trong

nấm Linh chi đã được chứng minh có tác dụng tăng cường sự sinh trưởng và phát triển

của các tế bào lympho, các bạch cầu đơn nhân, các tế bào NK (natural killer cells) (Bao

và cộng sự, 2001); Cao và cộng sự, 2002); Zhu và cộng sự, 2007; Ma và cộng sự,

2008). Trong một nghiên cứu của Chang và cộng sự (2009) được tiến hành trên chuột

BALB/c cho thấy dịch chiết nấm Linh chi chứa nhiều polysaccharide có tác dụng tăng

cường sự sinh trưởng và phát triển của các tế bào spleno và hoạt tính của các đại thực

bào và các tế bào NK.

Trong một nghiên cứu khác của Wang và cộng sự (1997), polysaccharide có trong

nấm Linh chi có tác dụng làm tăng khả năng hoạt động của các tế bào lympho T và các

đại thực bào, bằng cách làm tăng hàm lượng IL- ip, TNF-a và IL-6. Cũng trong một

nghiên cứu khác, quá trình ủ của các đại thực bào và các tế bào lympho T bằng các

polysaccharide đã cho thấy hàm lượng TNF- a và INF- Y tăng lên (Zhang và cộng sự,

1999).

1.4. Phương pháp phá vỡ và trích ly hoạt chất từ bào tử nấm Linh chi

Trong các nghiên cứu gần đây, bào tử của nấm Linh chi chứa một số hoạt chất

sinh học phong phú hơn nhiều so với trong thể quả của chúng (Chaiyavat Chaiyasut và

cộng sự, 2010), thành phần hoạt tính bào gồm polysaccharides, triterpenoids, amino

acids, proteins, alkaloids và các nguyên tố vi lượng, … Tuy nhiên, với bào tử của nấm

Linh chi được cấu tạo phức tạp với 2 lớp vách rất cứng và bền vững, hai lớp vách này

có thành phần gồm silica (19,01%), canxi (19,01%) và chitin (52,08 - 57,64%) (Ma

Jingjing và cộng sự, 2007), do đó việc trích ly các chất có hoạt tính sinh học từ bào tử

Ganoderma rất khó khăn.

Trong đồ án này, nhóm thực hiện đề tài đã thực hiện phá vỡ bằng phương pháp

tiền xử lý lạnh đông bào tử nấm Linh chi kết hợp sử dụng enzyme dịch nuôi cấy từ nấm

Trichoderma harzianum T2 là nấm mốc kí sinh trên nấm Linh chi cùng với chế phẩm

enzyme Cellulase C20032 của Novozyme cuối cùng là sử dụng sóng siêu âm để phá

Đồ án tốt nghiệp

vách bào tử nấm Linh chi, để thu được các chất tiếp tục thực hiện trích ly bằng diethyl

ether và ethanol.

1.4.1. Enzyme chitinase

Chitin là polysaccharide có nhiều trong tự nhiên, chúng tham gia trong hầu hết

cấu trúc polymer ở nấm và côn trùng, có công thức hóa học [C8H13NO5]n

Hình 1.11. Cấu trúc chitin

Chitin có cấu tạo và chức năng gần giống với cellulose, trong tự nhiên chitin là

chất hữu cơ chiếm thứ hai sau cellulose về số lượng, chitin thay thế một phần hay toàn

bộ cellulose trong thành tế bào của một số loài thực vật.

Chitin là chất rắn vô định hình, không tan trong nước và hầu hết các acid, cồn,

dung môi hữu cơ khác. Tuy nhiên, chitin có thể bị thủy giải bởi acid vô cơ mạnh (HCl

đậm đặc) hoặc bằng enzyme vi sinh vật.

Chitinase là enzyme thủy giải chitin, chitinase xúc tác cắt liên kết C1 và C4 của 2

đơn vị β – 1,4 – N – acetyl glucosamine (GlcNac). Hệ enzyme chitinase được phân

làm 3 lớp (Sahai và Manocha, 1993):

- Chitobiosidase: enzyme này giải phóng đơn vị diacetyl chitobiose

- Endochitinase: phân cắt liên kết bên trong cấu trúc chitin ở vị trí bất kì, phóng

thích các loại đường đa như chitotetraose, chitotriose, diacetyl chitobiose.

Endochitinase có vai trò quan trọng trong quá trình ký sinh nấm.

- β – 1,4 – N – acetyl glucosaminidase phân cắt chitotetraose, chitotriose,

diacetylchitobiose thành GlcNac monomer.

Đồ án tốt nghiệp

Glucosamin là sản phẩm phân giải cuối cùng, glucosamine là một đường khử có

nhóm amin tự do nên vừa có đặc tính của hexo monosaccharide vừa mang đặc tính của

nhóm amino.

Hình 1.12. Cơ chế hoạt động của hệ enzyme chitinase

Người ta đã tinh chế được rất nhiều chitinase, trong đó phổ biến nhất là

endochitinase có kích thước 42 kDa, sau đó là N – acetyl – β – D – glucosaminidase có

kích thước 70 – 73 kDa. Ngoài ra còn có endochitinase 37 kDa và 33 kDa (Cruz và

cộng sự, 1992), chitobiosidase 40 kDa, enzyme này có thể hoạt động một mình hoặc

kết hợp với enzyme endochitinase 42 kDa (Harman và cộng sự, 1993), exochitinase 28

kDa (Deane và cộng sự, 1998) và β – 1,4 – N – acetyl glucosaminidase 102 kDa có vai

trò duy nhất trong việc gây biểu hiện các enzyme thủy phân chitin khác nhưng chưa

tinh chế được (Harman và cộng sự, 1995).

Chitinase ở Trichoderma spp. được xem là enzyme có hoạt tính thủy phân mạnh,

hoạt động thủy phân của chitinase cũng kết hợp với các enzyme khác như β –

glucanase, sự phối hợp giữa hai enzyme này làm tăng hiệu quả hoạt động thủy phân.

Mặt khác, theo báo cáo của Lorito (1994) cho biết, có sự phối hợp tác động lên màng tế

bào giữa enzyme thủy phân chitin với các hợp chất tự nhiên cũng như chất tổng hợp.

Cơ chế phân hủy chitin trong vách bào tử nấm Linh chi

Đồ án tốt nghiệp

Theo nghiên cứu của Ma Jingjing và cộng sự từ trường Đại học Vũ Hán, Trung

Quốc (2007) về phương pháp nghiên cứu phá vỡ bào tử nấm Linh chi bằng máy nghiền

ly tâm tốc độ cao đã báo cáo rằng thành phần vách bào tử nấm Linh chi có 19,01% Si;

19,01% Ca; 52,08% - 57,64% là chitin. Cấu trúc phức tạp của vách bào tử nấm Linh

chi nhờ sự liên kết của cellulose với các thành phần trên tạo ra vách bền vững giúp cho

bào tử nấm Linh chi chống chịu được tác nhân axit và kiềm. Việc phân hủy chitin đóng

vai trò rất quan trọng trong việc phá vách bào tử nấm Linh chi. Chitin có công thức hóa

học (C8H13NO5)n trong đó C chiếm 47,29%, H chiếm 6,45%, N chiếm 6,89% và O

chiếm 39,37%. Về cấu trúc, chitin là một polysaccharide bao gồm các gốc N-acetyl-D-

glucosamine [GlcNAc, còn gọi là (1 → 4) – 2 – acetamido – 2 – deoxy – β – D –

glucose] gắn với nhau bằng liên kết β – 1,4 – O – glycoside.

Quá trình phân hủy chitin được gọi là chitinoclastic. Nếu quá trình phân hủy này

bao gồm cả sự thủy phân liên kết (1 → 4) – β – glycoside giống như trong quá trình xúc

tác chitinase phân hủy chitin thì quá trình này được gọi là chitinolytic. Ngoài ra, chitin

có thể được deacetyl hóa thành chitosan hoặc thậm chí các dạng cellulose nếu nó tiếp

tục được deamin hóa (ZoBell và Rittenberg, 1938; Campbell và Williams, 1951). Chính

vì vậy phải có sự kết hợp giữa enzyme chitinase và cellulose trong quá trình phá vách

bào tử nấm Linh chi.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.13. Quá trình phân hủy chitin thành chitosan và cellulose.

GH: họ glycosid hydrolase;

GlcNAc: N – acetylglucosamine;

GlcN: glucosamine;

Glc: glucose.

1.4.2. Giới thiệu về siêu âm phá tế bào

1.4.2.1. Khái niệm

Siêu âm (ultrasound) là sóng cơ học hình thành do sự lan truyền dao động của các

phần tử trong không gian có tần số lớn hơn giới hạn trên ngưỡng nghe của con người

(16- 20kHz). Ngoài ra, sóng siêu âm có bản chất là sóng dọc (longitudinal wave) hay

sóng nén (compression wave), nghĩa là trong trường siêu âm các phần tử dao động theo

phương cùng với phương truyền của sóng. Con người có thể nghe được sóng âm có tần

số từ 16 Hz đến 18 kHz. Sóng siêu âm là tên gọi của những sóng có tần số cao hơn 18

kHz. Giới hạn trên của tần số sóng siêu âm thường là 5 MHz đối với chất khí và 500

MHz đối với chất lỏng hay chất rắn. Trong phạm vi ứng dụng, sóng siêu âm được chia

ra thành sóng siêu âm tần số thấp, năng lượng cao (20kHz-100kHz) và sóng siêu âm tần

số cao, biên độ nhỏ (2MHz-10MHz) (Kuldiloke J., 2002).

Đồ án tốt nghiệp

- Tần số (Frequency, Hz): là số dao động phần tử thực hiện được trong 1 giây,

Các thông số của quá trình siêu âm:

- Biên độ (Amplitude): biểu thị mức độ thay đổi áp suất (so với áp suất cân bằng

(Hz).

- Cường độ (Intensity, W/m2): là năng lượng mà sóng siêu âm truyền trong một

của môi trường) trong quá trình dao động.

đơn vị thời gian qua một đơn vị diện tích đặt vuông góc với phương truyền âm. Công

thức tính I = P/S; trong đó P là công suất của nguồn âm (W), S là diện tích miền truyền

âm (m2).

1.4.2.2. Bản chất của sóng âm

Các môi trường chất đàn hồi (khí, lỏng hay rắn) có thể coi như những môi trường

liên tục gồm những phần tử liên kết chặt chẽ với nhau. Lúc bình thường, mỗi phần tử

có một vị trí cân bằng bền. Nếu tác động một lực lên phần tử A nào đó trong môi

trường này, nó sẽ rời khỏi vị trí cân bằng bền. Do tương tác tạo nên bởi các mối liên kết

với các phần tử bên cạnh, một mặt phần tử A bị kéo về vị trí cân bằng, một mặt nó cũng

chịu tác dụng bởi các lực tác động nên phần tử A sẽ di chuyển qua – lại vị trí cân bằng,

có nghĩa là phần tử A thực hiện chuyển động dưới dạng dao động. Hiện tượng này tiếp

tục xảy ra đối với các phần tử khác của môi trường. Dạng dao động cơ, có tính chất lặp

đi lặp lại, lan truyền trong môi trường đàn hồi được gọi là sóng đàn hồi hay sóng cơ.

Nói một cách khác, sóng là một hiện tượng vật lý trong đó năng lượng được dẫn truyền

dưới dạng dao động của các phần tử vật chất của môi trường truyền sóng.

Về bản chất, sóng âm là sóng cơ học, do đó nó tuân theo mọi quy luật đối với

sóng cơ, có thể tạo ra sóng âm bằng cách tác động một lực cơ.

1.4.2.3. Nguyên lý tác động của sóng siêu âm

Hiện tượng xâm thực khí

Khi sóng siêu âm được truyền vào môi trường chất lỏng, các chu trình kéo và nén

liên tiếp được tạo thành. Trong điều kiện bình thường, các phân tử chất lỏng ở rất gần

nhau nhờ liên kết hóa học. Khi có sóng siêu âm, trong chu trình nén các phân tử ở gần

nhau hơn và trong chu trình kéo chúng bị tách ra xa. Áp lực âm trong chu trình kéo đủ

Đồ án tốt nghiệp

mạnh để thắng các lực liên kết giữa các phân tử và tạo thành những bọt khí nhỏ. Bọt

khí trở thành hạt nhân của hiện tượng xâm thực khí, bao gồm bọt khí ổn định và bọt khí

tạm thời (Kuldiloke J., 2002).

Bọt khí ổn định là nguồn gốc của những bong bóng khí nhỏ, kích thước của chúng

dao động nhẹ trong các chu trình kéo và nén. Sau hàng ngàn chu trình, chúng tăng thêm

về kích thước. Trong suốt quá trình dao động, bọt khí ổn định có thể chuyển thành bọt

khí tạm thời. Sóng siêu âm làm rung động những bọt khí này, tạo nên hiện tượng “sốc

sóng“ và hình thành dòng nhiệt bên trong chất lỏng. Bọt khí ổn định có thể lôi kéo

những bọt khí khác vào trong trường sóng, kết hợp lại với nhau và tạo thành dòng nhiệt

nhỏ (Kuldiloke J., 2002).

Các bọt khí tạm thời có kích cỡ thay đổi rất nhanh chóng, chỉ qua vài chu trình

chúng bị vỡ ra. Trong suốt chu trình kéo/nén, bọt khí kéo giãn và kết hợp lại cho đ ến

khi đạt được cân bằng hơi nước ở bên trong và bên ngoài bọt khí. Diện tích bề mặt bọt

khí trong chu trình kéo lớn hơn trong chu trình nén, vì vậy sự khuyếch tán khí trong

chu trình kéo lớn hơn và kích cỡ bọt khí cũng tăng lên trong mỗi chu trình. Các bọ t khí

lớn dần đến một kích cỡ nhất định mà tại đó năng lượng của sóng siêu âm không đủ để

duy trì pha khí khiến các bọt khí nổ tung dữ dội. Khi đó các phân tử va chạm với nhau

mãnh liệt tạo nên hiện tượng “sốc sóng“ trong lòng chất lỏng, kết quả là hình thành

những điểm có nhiệt độ và áp suất rất cao (5000 0C và 5x104kPa) với vận tốc rất nhanh

106℃/s (Kuldiloke J., 2002).

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.14. Quá trình hình thành, phát triển và vỡ của bọt khí

Hiện tượng xâm thực khí mở đầu cho rất nhiều phản ứng do có sự hình thành các

ion tự do trong dung dịch; thúc đẩy các phản ứng hóa học nhờ có sự trộn lẫn các chất

phản ứng với nhau; tăng cường phản ứng polymer hoá và depolymer hóa bằng cách

phân tán tạm thời các phần tử hay bẻ gãy hoàn toàn các liên kết hóa học trong chuỗi

polymer; tăng hiệu suất đồng hoá; hỗ trợ trích ly các chất tan như enzyme từ tế bào

động vật, thực vật, nấm men hay vi khuẩn; tách virus ra khỏi tế bào bị nhiễm; loại bỏ

các phần tử nhạy cảm bao gồm cả vi sinh vật (Kuldiloke J., 2002).

Hiện tượng vi xoáy

Sóng siêu âm cường độ cao truyền vào trong lòng chất lỏng sẽ gây nên sự kích

thích mãnh liệt. Tại bề mặt tiếp xúc giữa 2 pha lỏng/rắn hay khí/rắn, sóng siêu âm gây

nên sự hỗn loạn cực độ do tạo thành những vi xoáy. Hiện tượng này làm giảm ranh giới

giữa các pha, tăng cường sự truyền khối đối lưu và thúc đẩy xảy ra sự khuyếch tán ở

một vài trường hợp mà khuấy trộn thông thường không đạt được (Kuldiloke J., 2002).

1.4.2.4. Tác động của sóng siêu âm lên tế bào

Sóng siêu âm có tần số từ 20KHz đến 1MHz sẽ tạo ra xen kẽ các sóng có áp suất

cao và áp suất thấp trong chất lỏng mà nó truyền qua. Trong suốt chu kỳ áp suất thấp,

sóng siêu âm tạo ra các bong bóng chân không nhỏ trong chất lỏng và sau đó bị phá vỡ

hoàn toàn trong chu kỳ áp suất cao. Hiện tượng này được gọi là cavitation. Sự nổ của

các bong bóng trong cavitation gây ra lực cắt thủy động lực rất mạnh và lực này sẽ tác

động lên màng tế bào và nếu đủ mạnh sẽ gây vỡ tế bào. Dãy sóng âm có tần số từ

20KHz đến 1MHz tạo ra hiện tường cavitation nhưng sóng âm có tần số ở vùng gần

20KHz tạo cavitation hiệu quả hơn. Theo Jian Bing và cộng sự (2006), hiện tượng sủi

bọt do sóng siêu âm gây ra tạo nên lực cắt xén cao làm tăng tốc độ truyền khối của chất

chiết. Ngoài ra sự vỡ bọt cũng tạo nên sự khuấy trộn mạnh giúp cho sự khuếch tán chất

chiết từ bên trong tế bào thoát ra bên ngoài dễ dàng hơn.

1.4.2.5. Ứng dụng của sóng siêu âm

Siêu âm là một lĩnh vực đang được nghiên cứu và có tiềm năng phát triển trong

ngành công nghệ thực phẩm. Sóng siêu âm có tần số từ 20kHz đến trên 25MHz thường

Đồ án tốt nghiệp

được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Có 2 lĩnh vực được ứng dụng chính trong

công nghiệp thực phẩm:

Siêu âm tần số cao và năng lượng thấp: còn được gọi là siêu âm chuẩn đoán, trong

khoảng tần số 20 – 60 MHz. Phần này được sử dụng như một kỹ thuật phân tích, không

làm phá hủy cấu trúc của mẫu, điều này được ứng dụng để xác định tính chất thực

phẩm, đo tốc độ dòng chảy, kiểm tra bao gói thực phẩm.... (Floros J. D., 1994).

Tần số thấp và siêu âm năng lượng cao (2 MHz – 10 MHz): được ứng dụng rộng

rãi như một quá trình hỗ trợ trong hàng loạt các lĩnh vực như: kết tinh, sấy, bài khí,

trích ly, lọc, đồng hoá, làm mềm thịt, quá trình oxi hoá, quá trình tiệt trùng … (Floros J.

D.,1994).

1.4.2.6. Thiết bị phát sóng siêu âm

Hình 1.15. Thiết bị phát sóng siêu âm dạng thanh

Thiết bị phát sóng siêu âm phải gồm có 3 phần tối cần thiết sau:

- Bộ phận chuyển phần lớn điện năng thành dòng điện xoay chiều tần số cao để

vận hành bộ phận biến đổi.

- Bộ phận biến đổi chuyển dòng điện xoay chiều tần số cao thành những dao động.

Phần lớn thiết bị phát sóng siêu âm ngày nay sử dụng kỹ thuật áp điện. Hình dạng và

kích thước của bộ phận này phụ thuộc vào tần số làm việc, bộ phận 20 kHz có chiều

dài gấp đôi bộ phận 40 kHz. Năng lượng qua bộ biến đổi sẽ chuyển ngược lại thành

bình phương tần số dao động, vì vậy thiết bị năng lượng cao tần số thấp được chú

Đồ án tốt nghiệp

trọng. Bộ phận biến đổi nối với hệ thống truyền sóng thông qua một thiết bị phụ

(Povey M.I.W. và Mason T.J, 1998).

- Hệ thống truyền sóng sẽ truyền những dao động vào trong lòng chất lỏng. Trong

thiết bị phát sóng siêu âm dạng bể, bộ phận biến đổi được gắn ở đáy bể và truyền trực

tiếp dao động vào chất lỏng trong bồn. Tuy nhiên, đối với thiết bị năng lượng cao

(thiết bị dạng thanh/que) dao động được khuyếch đại và truyền vào môi trường lỏng

nhờ thiết bị trung gian gắn với bộ phận biến đổi. Theo thời gian, đầu của bộ phận trung

gian này có thể bị mòn và bị giảm chiều dài cần thiết vì vậy người ta phải lắp đầu có

thể tháo gỡ được( Povey M.I.W. và Mason T.J, 1998).

Hình 1.16. Máy phá mẫu, tế bào bằng sóng siêu âm Qsonica Q500

1.4.3. Các phương pháp phá vỡ bào tử nấm Linh chi

Hiên nay trong và ngoài nước đã có khá nhiều phương pháp phá vỡ vách bào tử

Ganoderma lucidum bằng vật lý, hóa học, phương tiện cơ học và enzyme sinh học. Sử

dụng enzyme sinh học có thể lấy được tối đa các hoạt chất có trong bào tử, giúp cơ thể

người dễ hấp thu hơn, nhưng sau thời gian dài của quá trình lên men thì phải có sự kết

thúc quá trình này bằng cách tách chất rắn và sấy khô để thu được bào tử bị phá vỡ, quá

trình này phức tạp dễ gây nhiễm tạp chất gây phá hủy hoạt chất sinh học trong bào tử.

Xử lý bằng phương pháp vật lý phức tạp, sản phẩm dễ bị nhiễm tạp chất, chi phí đầu tư

thiết bị cao. Xử lý bằng phương pháp hóa học không đạt yêu cầu, dễ dàng phá hủy hoạt

Đồ án tốt nghiệp

tính sinh học trong bào tử Ganoderma lucidum, khó loại bỏ các dư lượng chất có hại.

Các phương tiện cơ học bao gồm cắt, mài, phun nghiền, nghiền không khí,

microstream,… Thiết bị nghiền siêu mịn bao gồm máy nghiền bi, máy nghiền không

khí tốc độ cao, xilanh, máy phun. Mặc dù phương tiện cơ học là một cách đơn giản và

dễ dàng để đạt được tỷ lệ phá vỡ cao và thực tế cho sản xuất công nghiệp quy mô lớn,

dầu bào tử nấm Linh chi có khả năng giảm hoạt tính do quá trình oxy hóa trong các

phương pháp tác động cơ học. Hơn nữa, chi phí hoạt động cao vì các thiết bị cơ khí đắt

tiền.

Sự phá vỡ của vách bào tử tạo điều kiện khai thác sinh khối bằng cách các hoạt

chất tiếp xúc nhiều hơn với dung môi chiết. Điều này đã được chứng minh bằng việc

tăng năng suất của dịch chiết polysaccharide lên 40,08% và quan sát thấy tác dụng sinh

học cao hơn sau khi bào tử bị phá vỡ (Ma và cộng sự, 2007). Hàm lượng carbohydrate

trong bào tử bị vỡ (1,57% ± 0,06%) cao hơn trong chiết xuất bào tử còn nguyên (0,41%

± 0,01%) (Yue và cộng sự, 2008). Hàm lượng của polysaccharides từ 0,94% bào tử còn

nguyên thấp hơn so với bào tử bị vỡ là 2,98% (Fu và cộng sự, 2009).

Do đó tìm một phương pháp đơn giản, hiệu quả để tăng tỷ lệ phá vỡ bào tử

Ganoderma lucidum, chi phí thấp và không làm giảm hoạt tính sinh học của các chất có

trong bào tử Ganoderma lucidum rất quan trọng. Một số nghiên cứu quan trọng được

trình bày ở bảng dưới đây ( Bảng 1.5).

Bảng 1.5. Những nghiên cứu về phá vỡ vách bào tử nấm Linh chi trên Thế Giới

Patent/ Nghiên cứu Tác giả Phương pháp phá vỡ bào tử Tỉ lệ phá

vỡ

JP52041208 Xin Liu, Xiao Ni Cơ học (nghiền vụn) 99,6%

Huang và cộng sự

JP52041208 Xin Liu, Xiao Ni Xử lý enzyme 99,9%

Huang và cộng sự

CN1134306A Xing Xiaohe, Zhu Ngâm nước, sấy khô và sử 85%

Shujun và cộng sự lý nhiệt vi sóng

(1995)

Đồ án tốt nghiệp

CN101596220A Zhao Hui (2009) Xử lý bằng enzyme từ dịch Không

nuôi cấy vi khuẩn nêu rõ

African Journal of Chaiyavat Len men với Lactobacillus Không

Biotechnology Chaiyasut, plantarum nêu rõ

Chakkrapong

Kruatama và

Sasithom Sirilun

(2010)

CN1165032A Du Yuguang, Bai Tiền xử lý lạnh đông, xử lý >80%

Xuefang (1996) bằng enzyme và sóng siêu

âm

US20110244556A1 Wang Cunxue và Ngâm nước, xử lý enzyme 95%

cộng sự (2002) 1,5%, sấy khô, nghiền

US20110244556A1 Xia Zhilan và cộng Sóng siêu âm trong 5 phút 40%

sự (2005)

US20110244556A1 Xia Zhilan và cộng Sóng siêu âm, xử lý enzyme 98%

sự (2005)

CN00130883 Liu X. và cộng sự Ngâm nước/ biotin, xử lý 99,9%

(2000) enzyme, nghiền

CN1114446C Liu X. và cộng sự CO2 siêu tới hạn ở áp suất 5 99,7 –

(2000) MPa-60 MPa, nhiệt độ từ 99,9%

320C - 850C

Chen Pharm Bull Bao X.F. và cộng Siêm âm 60 - 80%

sự (2002)

J Food Sci Zhao D. và cộng

sự (2014)

Liu X. và cộng sự Xử lý bằng enzyme 99,3 – CN1099455C

(2000) Chitinase, enzyme được bổ 99,8%

sung 0,002 đến 2% khối

Đồ án tốt nghiệp

lượng bào tử Ganoderma

lucidum để thủy phân

cellulase 10 phút – 3 giờ, ly

tâm hoặc siêu lọc.

CN105125595A Jinghua Luo và Lưới lọc, ngâm nước, sóng 99,3 –

cộng sự (2015) siêu âm 99,8%

Can Tho University Nguyen Minh Lên men với Lactobacillus 52,38%

Journal of Science Thuy và Nguyen plantarum

Thi My Tuyen

(2015)

1.4.4. Phương pháp trích ly hoạt chất thu dầu bào tử

Dầu bào tử Ganoderma lucidum chiết xuất phương tiện cơ học có hoạt tính sinh

học thấp, có chất lượng kém do một phần hoạt tính sinh học bị mất trong quá trình cơ

học. Một loạt các dung môi được sử dụng để trích xuất hoạt chất sinh học từ bào tử bị

phá vỡ như: methanol và chloroform thường được sử dụng để trích xuất triterpenes,

nước để trích xuất polysaccharides, dichloromethane cho chất béo, và ethanol cho chất

béo và polysaccharides.

Nghiên cứu về phương pháp chiết xuất lipid của Ganoderma lucidum thường sử

dụng các dung môi hữu cơ như hexane, benzen, ethylene dichloride, dichloroethylene,

nước sôi, ethanol,… với các thiết bị lọc thông thường để chiết xuất. Lipid trong bào tử

Ganoderma lucidum thu được sau quá trình chiết xuất, dung môi hữu cơ có thể tái sử

dụng. Một số phương pháp trích ly được trình bày ở bảng dưới đây (bảng 1.6).

Bảng 1.6: Các phương pháp trích ly

Hoạt chất sinh Phương pháp Tài liệu

học

Literatan loại Sắc kí cột của chiết xuất methanol của Min và cộng sự,

triterpene bào tử bị phá vỡ. Chem Pharm

Bull (1998)

Đồ án tốt nghiệp

Chiết xuất lipid Ngâm trong dung môi hữu cơ: hexane, Liu X. và cộng

benzen, ethylene dichloride, sự, CN1099455C

dichloroethylene, nước sôi, ethanol, … ở (2000)

nhiệt độ 25 - 1000C (nhiệt độ lọc thông

thường là 550C), thời gian 5 - 150 phút

(thường là 60 - 90 phút).

Ganodermasides A Các bào tử khô đã được chiết xuất bằng Weng Y. và cộng

và B methanol, được phân tách bằng cách lọc sự, Bioorg Med

và cô đặc. Chem (2010)

Chiết xuất thô Các bào tử ngâm trong ethanol tuyệt đối Liu X. và cộng

bằng ethanol trong 10 giờ ở 300C trên máy lắc và cô sự, Cancer Lett

quay chân không. (2002)

Các bào tử được hòa tan trong ethanol, Fukuzawa M. và

lắc trong 24 giờ, sau đó ly tâm. Năng cộng sự, Bio

suất của chiết xuất bào tử là 10% của Pharm Bull

trọng lượng ban đầu. (2008)

Bột bào tử ngâm bằng ethanol tuyệt đối Chan W.K. và

trong 3 ngày, sau khi ly tâm được tái cộng sự, J Altern

chiết thêm 3 ngày nữa. Complement

Med (2005)

Acid béo C19 Khai thác trong ethanol ở nhiệt độ phòng Gao P. và cộng

trong 40 giờ. Chiết xuất được lọc, cô sự, Fitoterapia

quay và chia thành 5 phần theo sự khác (2012)

biệt trong độ hòa tan trong etanol và

CHCl3.

Polysaccharide Định lượng bằng ethanol 95%, cặn được Bao X.F. và cộng

ủ trong nước sôi. Chiết xuất được khử sự, Chem Pharm

với acid tricloaxetic. Bull (2002)

Sau khi xử lý bằng etanol để loại bỏ chất Ma C. và cộng

Đồ án tốt nghiệp

béo, các bào tử khô được chiết xuất bằng sự,

nước sôi, và dịch chiết nước được cô đặc Phytomedicine

và được thẩm tách. (2008)

Các bào tử được hòa tan trong nước và Dong Q. và cộng

khuấy ở 40C trong 12 giờ. sự, Carbohydr

Sau khi được ly tâm trong 30 phút, phần Res (2012), Guo

nổi phía trên được cô đặc và kết tủa với L. và cộng sự,

nước không chứa ethanol. Immunopharmcol

(2009)

Chiết xuất thô Các bào tử Ganoderma lucidum được Hsu P.Y. và cộng

bằng nước chiết xuất với nước ở nhiệt độ phòng và sự, Chang Gung

Med J (2012) sau đó ở 700C

Nước sôi với nồng độ 50 mg/mL. Chiết Sliva D. và cộng

xuất được bảo quản ở 40C và trước mỗi sự, Biochem

lần thử nghiệm chiết xuất được đun nóng Biophys Res

đến 700C trong 10 phút Commun (2002)

Chiết xuất Lipid Trích xuất với CH2Cl2 trong 2 giờ. Lọc Liu X. và cộng

và phần còn lại được chiết xuất hai sự, Anal Bioanal thô bằng CH2Cl 2

(dichloromethane) lần. Dung môi được loại bỏ bằng thiết bị Chem (2007)

cô quay ở 300C.

Ergosterol, sterols, Các chất béo trong bào tử được chiết xuất Chen T.Q. và

lipids bằng cách sử dụng CO2 siêu tới hạn. cộng sự, Chem

Ethanol được thêm vào để tăng hiệu năng Nat Compd

chiết xuất. (2012)

Weng Y. và

cộng sự, Bioorg

Med Chem

(2010)

Yuan J.P. và

Đồ án tốt nghiệp

cộng sự, J Agric

Food Chem.

(2006)

Polysaccharide Sau khi nghiền trong 5 - 30 phút, thêm Zhu X. và cộng

vào một lượng nước thích hợp (10 - 30 sự, Int J Food

ml/g) ở nhiệt độ 50 - 900C trong một thời Technol (2012)

gian 30 - 150 phút. Sau đó hỗn hợp được

ly tâm (4200 vòng/ 10 phút) và phần nổi

phía trên được cô đặc.

Triterpenes bằng Chiết xuất 3 lần bằng CHCl3, ủ trong bể Gao J.J. và cộng

nước 1000C, 3 giờ. Sau khi lọc, cô quay sự, Chem Pharm CHCl 3

(chloroform) chân không. Bull (2004)

Chiết xuất lipid Chiết xuất chất lỏng CO2 siêu tới hạn Liu X. và cộng

(SCF – CO2) ở nhiệt độ khoảng 320C – sự,

450C. US6440420B1

(2001)

Bảng 1.7. Các dung môi trong chiết xuất lipid của bào tử Ganoderma lucidum

(CN1099455C)

Khối lượng thu được

STT Dung môi Phương pháp (kg)/ 100 kg bào tử

Ganoderma

Chiết suất lỏng-lỏng, nhiệt độ Hexan 35,8 kg 1 lọc 550C, thời gian lọc 60 phút

Đặt trong bể ủ ở 520C, thời Hexan 36 kg 2 gian 80 phút

Đặt trong bể ủ ở 600C, thời Hexan 27 kg 3 gian 70 phút

Đồ án tốt nghiệp

Nhiệt độ lọc 700C, thời gian lọc 4 Hexan 9,2 kg 50 phút

Chiết xuất thẩm thấu trong máy

5 Light gasoline chiết, nhiệt độ ở 500C, thời gian 37 kg

90 phút

nhiệt độ lọc 750C, thời gian lọc Dichloroethane 7,5 kg 6 20 phút

Nhiệt độ lọc 350C, thời gian lọc Ethanol 7,4 kg 7 50 phút

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Vật liệu

- Bào tử nấm Linh chi được thu thập từ trại nấm Bảy Yết, huyện Hóc Môn, Thành

phố Hồ Chí Minh được cung cấp bởi ông Phan Văn Yết. Rây bào tử để loại bỏ một số

tạp chất. Bảo quản trong điều kiện khô ráo.

- Giống nấm Trichoderma harzianum T2 được phân lập từ nấm Linh chi trong đồ

án tốt nghiệp của Nguyễn Thái Minh Hiếu (10DSH), nhận từ phòng thí nghiệm Công

nghệ Sinh học trường Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, cơ sở A, 475A

Điện Biên Phủ, phường 25, quận Bình Thạnh, Thành phố Hồ Chí Minh.

- Enzyme thương mại Cellulase C20032 được cung cấp bởi công ty TNHH Khoa

học và Công nghệ Sài Gòn.

- Trứng bào xác Artemia nauplii được cung cấp tại trường Đại học Công Nghệ

Thành phố Hồ Chí Minh.

- Viên nang Linh chi OPC, sản xuất tại công ty Cổ phần Dược Phẩm OPC, 1017

Hồng Bàng, phường 12, quận 6, Thành phố Hồ Chí Minh.

2.1.2. Nơi thực hiện

Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, trường Đại

học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, cơ sở E, Lô E1, Khu công nghệ cao, Xa lộ

Hà Nội, Phường Hiệp Phú, Quận 9, Thành phố Hồ Chí Minh.

2.1.3. Thời gian thực hiện

Từ 06/11/2017 đến 20/07/2018

2.1.4. Thiết bị - dụng cụ và hóa chất

2.1.4.1. Thiết bị

- Nồi hấp tiệt trùng Hyrayama

- Tủ cấy vi sinh cấp 1

- Bể điều nhiệt Memmert

- Bếp từ Heidolph

Đồ án tốt nghiệp

- Cân điện tử Vibra

- Cân phân tích

- Kính hiển vi quang học

- Máy đo quang phổ khả kiến SP - 300

- Máy lắc ngang

- Máy vortex Heidolph

- Máy ly tâm Universial 320

- Máy siêu âm Qsonica Q500

- Máy nước cất

- Tủ sấy Memmert - Đức

- Tủ ủ Memmert

- Tủ lạnh Toshiba

2.1.4.2. Dụng cụ

- Erlen 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml, 2000 ml

- Cốc thủy tinh 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml

- Bao nylon hấp, giấy báo, dây thun

- Bông thấm nước, bông không thấm nước

- Đĩa petri

- Đũa thủy tinh

- Kẹp

- Dao cấy

- Phễu thủy tinh

- Micropipette 100 µl, 1000 µl – đầu tuýp tương ứng

- Ống đong 50 ml, 100 ml, 500 ml

- Eppendorf 1,5 ml, 2 ml

- Ống ly tâm 50 ml

- Ống nghiệm

- Pipette thủy tinh 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml, 25 ml

- Thanh khuấy từ

Đồ án tốt nghiệp

- Buồng đếm hồng cầu Neubauer

2.1.4.3. Hóa chất - Môi trường nuôi cấy

a. Hóa chất

- Tween 80

- C4H4KNaO6

- HCl đậm đặc

- H2SO4 đậm đặc

- HCl 1%

- HCl 0,1 N

- NH4OH đậm đặc

- NaOH 0,1 N

- CH3COOH

- Na2CO3 tinh thể

- Anhydrid acetic D-glucose

- α-naphthol

- NaOH 10%

- CuSO4 3%

- Ethanol 960

- Diethyl ether

- Petroleum ether

- Hexane

- Phenol

- Phenolphtalein

- 1,1 - Diphenyl - 2 - picryl - hydrazyl (DPPH)

- 6 – Hydroxy – 2, 5, 7, 8 - tetramethychroman - 2 - carboxylic (Trolox)

- Acid ascorbic

- Đệm natri acetate 0,05 M

- Thuốc thử Lugol

1 g + Iodine

Đồ án tốt nghiệp

2 g + KI

300 ml + Nước cất

Hòa tan rồi giữ trong lọ tối màu

- Dung dịch Sodium carboxymethyl cellulose (CMC) 1% w/v CMC: cân chính xác

10 g CMC, hòa tan trong đệm natri acetate 0,05 M.

- Dung dịch acid - 2 - hydroxyl - 3,5 - dinitrobenzoic (DNS): cân 20 g DNS cho

vào cốc 2000 ml, thêm khoảng 800 ml nước cất. Đặt cốc vào chậu nước 800C khuấy

đều; hòa tan 32 g NaOH với 300 ml nước cất, thêm dung dịch NaOH này từ từ vào

dung dịch DNS, khuấy nhiệt ở 800C. Tiếp tục thêm 600 g C4H4KNaO6 vào dung dịch

DNS và tiếp tục khuấy. Làm lạnh dung dịch DNS đến nhiệt độ phòng. Chuyển dung

dịch vào bình định mức 2000 ml, thêm nước cất đến vạch lắc đều. Bảo quản dung dịch

DNS trong chai tối màu.

- Dung dịch lactose: hòa tan 0,12 g lactose monohydrate với 80 ml nước cất,

chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất đến vạch lắc đều.

- Dung dịch DNS – lactose: trộn đều 150 ml DNS với 50 ml dung dịch lactose.

- Dung dịch mononatri orthophosphate 0,2 M: hòa tan 27,8 g NaH2PO4 và định

mức đến 1000 ml bằng nước cất.

- Dung dịch dinatri hydrophosphate 0,2 M: hòa tan 53,05 g NaHPO4.7H2O và định

mức đến 1000 ml bằng nước cất.

- Dung dịch acid acetic 0,2 M: hòa tan 11,55 ml CH3COOH đậm đặc và định mức

đến 1000 ml bằng nước cất.

- Dung dịch natri acetate 0,2 M: hòa tan 16,4 g CH3COONa và định mức đến 1000

ml bằng nước cất.

- Dung dịch đệm pH 7: hút 39,0 ml dung dịch mononatri orthophosphate 0,2 M

trộn với 61,0 ml dung dịch dinatri hydrophosphate 0,2 M rồi định mức đến 200 ml

bằng nước cất.

- Dung dịch đệm pH 5: hút 14,8 ml dung dịch acid acetic 0,2 M trộn với 35,2 ml

dung dịch natri acetate 0,2 M rồi định mức đến 100 ml bằng nước cất.

Đồ án tốt nghiệp

- Huyền phù chitin từ bột chitin thương mại: cân 10 g bột chitin hòa tan với 1000

ml nước cất để được huyền phù chitin 1%.

- Pha stock DPPH 1M: cân 0,3943 g DPPH hòa tan trong 1 ml methanol, để trong

tối 2 giờ (bọc giấy bạc).

- Pha stock Trolox 1 mg/ml: cân 1 mg Trolox hòa tan vào 1 ml Methanol, để trong

tối.

b. Môi trường nuôi cấy

- Môi trường PDA (g/L)

D-glucose 5 g

Agar 5 g

Dịch chiết khoai tây 250 ml

Cloramphenicol 0,025 g

pH 6 - 7

Chuẩn bị dịch chiết khoai tây: cân 200 g khoai tây được cắt hạt lựu, cho vào cốc

2000 ml, đong nước cất tới 1000 ml rồi đun sôi hỗn hợp trên bếp từ. Đun sôi khoảng

10 phút rồi đem lọc lấy dịch trong.

- Môi trường hoạt hóa Trichoderma harzianum

Nấm Linh chi nghiền 20 g

Nước cất 30 ml

Độ ẩm 60%

- Môi trường tăng sinh rắn nấm Trichoderma harzianum

Nấm Linh chi nghiền 40 g

Malt 10 g

Dung dịch khoáng 20 ml

Cao nấm men 1 g

Chitin 0,5 g

Nước bổ sung 80 ml

Độ ẩm 70%, pH 5

- Pha dung dịch khoáng

Đồ án tốt nghiệp

NH4NO3 0,5 g

KH2PO4 0,2 g

NaCl 0,1 g

MgSO4.7H2O 0,1 g

Hòa tan và định mức bằng nước cất đến 100 ml

- Môi trường chitin – agar 1%

Chitin thương mại 2,5 g

Agar 5 g

Bổ sung nước cất đến 250 ml

Hấp tiệt trùng ở 1210C/15 phút, để nguội đến khoảng 500C tiến hành đổ đĩa, mỗi

đĩa khoảng 20 ml môi trường.

Đồ án tốt nghiệp

2.2. Phương pháp nghiên cứu

a. Mục tiêu: Thiết lập quy trình phá vách bào tử nấm Linh chi Ganoderma lucidum

kết hợp enzyme và siêu âm.

b. Nội dung:

- Chọn môi trường lên men thể rắn thu enzyme chitinase từ Trichoderma

harzianum T2.

- Khảo sát ảnh hưởng của siêu âm và enzyme lên tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi.

- Khảo sát ảnh hưởng của các chế độ tiền xử lý lên tỉ lệ phá vỡ bào tử.

- Khảo sát ảnh hưởng của siêu âm lên thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của

bào tử nấm Linh chi.

c. Phương pháp luận: Nghiên cứu này nhằm hoàn thiện những nghiên cứu trước đó

của Phòng thí nghiệm liên quan đến phá vỡ bào tử nấm Linh chi, trả lời những vấn đề

còn chưa rõ sau:

- Liệu có thể sử dụng bã nấm Linh chi nuôi cấy thể rắn thu enzyme phá vỡ bào tử

không?

- Có thể thực hiện siêu âm trước phản ứng enzyme để phá vỡ bào tử không?

- Siêu âm ảnh hưởng thế nào lên thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của bào

tử phá vỡ?

- Để giải quyết những vấn đề trên, đề tài tiến hành 4 nội dung (xem sơ đồ bố trí thí

nghiệm (Hình 2.1)).

Môi trường thể quả

Thu enzyme chitinase bằng lên men thể rắn

Đo đường kính vòng phân giải chitin

Môi trường bã nấm

Xử lí enzyme Không siêu âm

Siêu âm trước khi ủ enzyme

Xác định tỉ lệ phá vỡ

Ảnh hưởng của siêu âm và enzyme trong phá vỡ bào tử nấm Linh chi

Ủ enzyme trước khi siêu âm

-40C

-200C

Tiền xử lí

-700C

Xác định tỉ lệ phá vỡ

Bố trí thí nghiệm

-1960C

Định lượng lipid, polysaccharide tổng số

Khảo sát khả năng kháng oxy hóa

Khảo sát ảnh hưởng siêu âm lên thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

Thử độc tính trên Artemia nauplii

Đồ án tốt nghiệp

Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Đồ án tốt nghiệp

Giống gốc Tricoderma harzianum T2

Môi trường thể quả

Môi trường bã nấm

Hoạt hóa (7 ngày, 320C)

Lên men thể rắn, 72 giở, 28 – 300C

Trích ly (dung môi : cơ chất = 10 : 1)

2.2.1. Thu enzyme chitinase bằng lên men thể rắn

Nước cất + Tween 80 1%

Lọc, ly tâm (4000 vòng/ phút* 15 phút)

Thu dịch trích ly

Đo đường kính vòng phân giải chitin

Lắc 150 vòng/ phút * 24 giờ

Hình 2.2. Sơ đồ thu enzyme chitinase bằng môi trường lên men thể rắn

Đồ án tốt nghiệp

2.2.1.1. Phương pháp nuôi cấy Trichoderma harzianum T2 trên môi trường thạch

PDA

Chuẩn bị môi trường PDA như mục 2.1.4.3 cho vào bình môi trường 250 ml rồi

đem hấp khử trùng ở 1210C/ 1 atm/ 15 phút. Hấp xong, để môi trường hạ xuống

khoảng 500C rồi tiến hành đổ đĩa. Đợi thạch đông lại, tiến hành cấy điểm Trichoderma

harzianum T2 từ ống giống được phân lập từ đồ án tốt nghiệp của Nguyễn Thái Minh

Hiếu năm 2014 trường Đại học Công nghệ TP. HCM, rồi lật úp đĩa (tránh tụ nước trên

bề mặt thạch) đem ủ ở 28 - 320C. Sau 7 ngày nuôi nấm trên môi trường PDA chuyển

sang môi trường hoạt hóa Trichoderma harzianum T2.

2.2.1.2. Phương pháp hoạt hóa Trichoderma harzianum T2

Chuẩn bị môi trường hoạt hóa Trichoderma harzianum T2 như mục 2.1.4.3 phối

vào erlen 1000 ml rồi đem hấp khử trùng ở 1210C/ 1 atm/ 15 phút. Hấp xong để môi

trường hạ xuống nhiệt độ phòng, cắt 1/8 đĩa thạch PDA chứa Trichoderma harzianum

T2 đã được nuôi cấy 7 ngày cho vào erlen chứa môi trường hoạt hóa, ủ ở 28 - 320C.

Sau 7 ngày nuôi nấm trên môi trường hoạt hóa, tiến hành cấy chuyển sang môi trường

tăng sinh khối thu dịch enzyme nuôi cấy.

2.2.1.3. Thu enzyme dịch trích ly bằng phương pháp tăng sinh trên môi trường rắn

Chuẩn bị môi trường tăng sinh rắn nấm Trichoderma harzianum T2 như mục

2.1.4.3, phối vào erlen 2000 ml, hấp tiệt trùng ở 1210C/ 1 atm/ 15 phút. Để nguội về

nhiệt độ phòng rồi cấy bào tử nấm Trichoderma harzianum T2 đã nuôi cấy 7 ngày trên

môi trường hoạt hóa. Giữ bình ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày. Thực hiện trích ly bằng

nước cất lạnh vô trùng có bổ sung Tween 80 1% theo tỉ lệ nước cất/cơ chất là 10 : 1.

Đem lắc trên máy lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ rồi lọc bỏ bã. Sau đó đem ly tâm

4000 vòng/phút trong 15 phút thu dịch tăng sinh loại bỏ cặn còn sót lại.

2.2.1.4. Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy nấm Tricoderma harzianum T2 tối

ưu để thu enzyme chitinase

Chuẩn bị môi trường tăng sinh rắn nấm Trichoderma harzianum T2 như mục

2.1.4.3 nhưng thay thành phần cơ chất là hai loại: thể quả nấm Linh chi nghiền và bã

Đồ án tốt nghiệp

nấm Linh chi nghiền. Tiến hành tăng sinh và trích ly thu dịch enzyme như mục

2.2.1.3.

Tiến hành đục lỗ thạch trên đĩa petri có chứa môi trường huyền phù chitin – agar

1% đã được chuẩn bị như mục 2.1.4.3. Mỗi đĩa môi trường chitin – agar đục bốn lỗ

thạch đường kính 5 mm, sau đó dùng micropipette hút 100 µl dịch enzyme trích ly từ

hai môi trường tăng sinh rắn vào 3 lỗ thạch đã đục ở mỗi đĩa và một lỗ không nhỏ dịch

enzyme làm đối chứng. Ủ ở nhiệt độ phòng và theo dõi vòng phân giải của dịch

enzyme sau 24 giờ, 48 giờ bằng thuốc thử lugol để xác định vòng phân giải chitin.

20 gam bào tử nấm Linh chi

200 ml nước cất

Lạnh đông -40C/ 12 giờ

Rã đông ở nhiệt độ phòng

Ly tâm 4000 vòng/phút * 15 phút

Nước

Thu bào tử

Siêu âm

Ủ bào tử trong hỗn hợp enzyme

Siêu âm

Ủ bào tử trong hỗn hợp enzyme

Xác định tỉ lệ phá vỡ bào tử

2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của siêu âm trong phá vỡ bào tử nấm Linh chi

Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của siêu âm trong phá vỡ bào tử

nấm Linh chi

Đồ án tốt nghiệp

2.2.2.1. Phá vách bào tử nấm Linh chi bằng phương pháp lạnh đông kết hợp sử dụng

enzyme thương mại Cellulase (EC) và dịch tăng sinh nấm Trichoderma harzianum T2

(DTL) và siêu âm

Quy trình phá vách bào tử bằng lạnh đông bào tử kết hợp chế phẩm enzyme

Cellulase và dịch tăng sinh nấm Trichoderma harzianum T2 và siêu âm

Phương pháp tiến hành:

Cân 20 g bào tử nấm Linh chi vào cốc, thêm 200 ml nước cất vào cốc, để vào

trong tủ đá làm lạnh đông bào tử ở - 40C trong 12 giờ. Sau thời gian lạnh đông, bào tử

rã đông ở nhiệt độ phòng, khi đá đã tan hết, ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút để

tách nước, thu bào tử.

Chuẩn bị hỗn hợp enzyme: chế phẩm enzyme gốc được pha loãng thu được dung

dịch enzyme C20032 10%, dịch trích ly enzyme thu được từ phương pháp tăng sinh

rắn nấm Trichoderma harzianum T2. Thu bào tử cho vào cốc 1000 ml bổ sung thêm

hỗn hợp 300 ml enzyme C20032 10%, 300 ml dịch nuôi cấy Trichoderma harzianum

T2 và 400 ml đệm acetate pH 5. Đặt cốc trên bếp khuấy từ ở 500C và khuấy liên tục

trong 2, 4, 6, 8, 10 ngày để tăng hiệu suất phá vỡ bào tử.

Ngoài ra còn kết hợp phương pháp siêu âm để tăng tỉ lệ phá vỡ bào tử. Với công

suất máy là 500 W, thực hiện với hai độ khuếch đại 75% và 100% và siêu âm trong 1,5

phút. Hút 15 ml dịch ngâm bào tử pha với 15 ml đệm acetate pH 5 và chạy siêu âm.

Tiến hành đếm bào tử còn nguyên vẹn bằng buồng đếm hồng cầu Neubauer để

xác định tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại

x100 sau 2, 4, 6, 8, 10 ngày.

2.2.2.2. Phương pháp xác định số lượng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu (Trần

Thanh Phong, 2004; Nguyễn Đức Lượng, 2005)

Đồ án tốt nghiệp

Hình 2.4. Buồng đếm hồng cầu Neubauer

Buồng đếm hồng cầu dùng để đếm các vi sinh vật có kích thước rất nhỏ (nấm

men, bào tử nấm mốc…).

Nguyên tắc: Cấu tạo của buồng đếm hồng cầu đó là một phiến kính hình chữ

nhật, chia thành ba khoảng ngang. Khoảng giữa chia thành 2 khoảng nhỏ. Trên mỗi

khoảng nhỏ có kẻ một lưới đếm, gồm nhiều ô vuông nhỏ, mỗi ô có diện tích là 1/25

mm2, lại được chia thành các ô vuông nhỏ (thường là 16 ô), mỗi ô có diện tích là 1/400

mm2 và chiều sâu là 0,1 mm.

Như vậy thể tích của mỗi ô nhỏ là 1/400 x 0,1 = 1/4000 mm3.

Thực hiện :

- Bào tử nấm Linh chi sau khoảng thời gian ủ thích hợp, được lấy ra thực hiện đếm

bào tử nguyên vẹn bằng buồng đếm hồng cầu Neubauer.

- Thực hiện pha loãng bằng cách dùng micropipette hút 0,5 ml từ cốc chứa hỗn

hợp bào tử và enzyme và 0,5 ml đệm pH 5 cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất

lạnh vô trùng chứa 1% Tween 80 thu được độ pha loãng 10-1. Tiếp tục dùng

Đồ án tốt nghiệp

micropipette hút 1 ml hỗn hợp ở độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9 ml

nước cất lạnh vô trùng chứa 1% Tween 80 thu được độ pha loãng 10-2.

- Dùng micropipette hút 1 ml hỗn hợp sau siêu âm từ mỗi cốc cho vào từng ống

nghiệm chứa 9 ml trong nước cất lạnh vô trùng chứa 1% Tween 80 thu được độ pha

loãng 10-1. Lặp lại như trên để thu được hỗn hợp có độ pha loãng 10-2.

- Tiến hành đếm bào tử bằng buồng đếm hồng cầu Neubauer: Lắc đều mẫu pha

loãng. Đậy lá kính lên lưới đếm. Dùng ống hút vô trùng lấy mẫu, cho một giọt vào

mép lá kính, do lực mao dẫn, dịch mẫu tràn vào mặt trên lưới đếm. Chú ý không để tạo

bọt khí trong lưới đếm hoặc tràn dịch mẫu xuống rãnh. Đặt buồng đếm lên bàn kính

hiển vi và để yên trong 3 – 5 phút, sau đó tiến hành đếm bào tử.

Chú ý: nồng độ dịch huyền phù mẫu pha loãng phải đảm bảo sao cho mật

độ trong mỗi ô nhỏ không được quá 10 bào tử.

Cách đếm và tính:

- Đếm số bào tử trong 4 ô W (ô W là 4 ô nằm ở 4 góc buồng đếm Neubauer), gọi

B là số bào tử trung bình trong một ô lớn W. Trong mỗi ô trung bình, đếm tất cả những

bào tử nằm gọn trong ô và những bào tử nằm ở cạnh trên và cạnh trái. Những bào tử

nằm ngay trên vạch ngoài thì đếm 2 tính 1, còn bào tử nằm giữa 2 vạch hoặc trên 1

vạch thì 1 tính 1.

(𝐵1 + 𝐵2 + 𝐵3 + 𝐵4)

- Số bào tử trong 4 ô W là B1, B2, B3 và B4.

- B trung bình =

𝐵𝑛

- Tỉ lệ bào tử phá vỡ được tính theo công thức:

𝐵𝑜

Tỉ lệ bào tử phá vỡ (%) = (1 - ) x 100

- Trong đó:

+ B0: số bào tử còn nguyên vẹn trung bình của 4 ô W trong buồng đếm Neubauer

ngày 0 (ngày đầu tiên, khi vừa cho hỗn hợp enzyme vào bảo tử nấm Linh chi sau xử lý

lạnh đông).

Đồ án tốt nghiệp

+ Bn: số bào tử còn nguyên vẹn trung bình của 4 ô W trong buồng đếm

Neubauer ngày n ( 2 ≤ n ≤ 10).

200 ml nước cất

20 g bào tử nấm Linh chi

Lạnh đông nito lỏng

Lạnh đông

Lạnh đông đá khô -700C/ 12 giờ

-1960C/ 12 giờ

-200C/ 12 giờ

2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng chế độ tiền xử lí bào tử

Rã đông ở nhiệt độ phòng

Ly tâm 4000 vòng/phút * 15 phút

Nước

Thu bào tử

Ủ bào tử trong hỗn hợp enzyme 500C, có khuấy đảo, pH 5, 10 ngày

Siêu âm 500W, 100%, 5 phút

Xác định tỉ lệ phá vỡ bào tử

Lạnh đông -40C/ 12 giờ

Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng chế độ tiền xử lí bào tử

Phương pháp tiến hành: Ở các chế độ lạnh đông - 40C, - 200C, - 700C (đá khô), -

1960C (nitơ lỏng), tiến hành cân 20 g bào tử nấm Linh chi vào cốc, thêm 200 ml nước

cất vào cốc, để lạnh đông bào tử trong 12 giờ. Sau thời gian lạnh đông, bào tử rã đông

ở nhiệt độ phòng, khi đá đã tan hết, ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút để tách nước,

thu bào tử.

Đồ án tốt nghiệp

Chế phẩm enzyme gốc được pha loãng thu được dung dịch enzyme C20032 10%,

dịch trích ly enzyme thu được từ phương pháp tăng sinh rắn nấm Trichoderma

harzianum T2. Thu bào tử cho vào cốc 1000 ml bổ sung thêm hỗn hợp 300 ml enzyme

C20032 10%, 300 ml dịch nuôi cấy Trichoderma harzianum T2 và 400 ml đệm acetate

pH 5. Đặt cốc trên bếp khuấy từ ở 500C và khuấy liên tục trong 10 ngày để tăng hiệu

suất phá vỡ bào tử.

Sau 10 ngày ủ enzyme tiến hành siêu âm hỗn hợp bào tử ở mỗi chế độ lạnh đông

với công suất máy là 500 W, độ khuếch đại 100% và siêu âm trong 5 phút.

Hút 15 ml dịch ngâm bào tử pha với 15 ml đệm acetate pH 5 và chạy siêu âm.

Phương pháp xác định tỉ lệ phá vỡ tiến hành theo mục 2.2.1.5.

2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của siêu âm lên thành phần hóa học và hoạt tính sinh

200 ml nước cất

20 g bào tử nấm Linh chi

Lạnh đông -40C / 12 giờ

Rã đông ở nhiệt độ phòng

Ly tâm 4000 vòng/phút * 15 phút

Nước

Thu bào tử

Ủ bào tử trong hỗn hợp enzyme ở 500C có khuấy đảo, pH 5, 10 ngày

Không siêu âm

Siêu âm 500W, 100%, 5 phút

học

Ly tâm 4000 vòng/phút * 15 phút

Dịch ly tâm

Bào tử

Trích ly bằng hexane

Trích ly bằng cồn 960

Trích ly bằng diethyl ether

Thu dịch chiết

Khả năng kháng oxy hóa

Đồ án tốt nghiệp

Định tính saponin, protein, polysaccharide, triterpenoid

Định lượng polisaccharite tổng số, lipid tổng số

Thử độc tính tế bào trên artemia nauplii

Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của siêu âm lên thành phần hóa

học và hoạt tính sinh học

Cân 20 g bào tử nấm Linh chi vào cốc, thêm 200 ml nước cất vào cốc, để vào

trong tủ đá làm lạnh đông bào tử ở - 40C trong 12 giờ. Sau thời gian lạnh đông, bào tử

rã đông ở nhiệt độ phòng, khi đá đã tan hết, ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút để

tách nước, thu bào tử.

Chế phẩm enzyme gốc được pha loãng thu được dung dịch enzyme C20032 10%,

dịch trích ly enzyme thu được từ phương pháp tăng sinh rắn nấm Trichoderma

harzianum T2. Thu bào tử cho vào cốc 1000 ml bổ sung thêm hỗn hợp 300 ml enzyme

Đồ án tốt nghiệp

C20032 10%, 300 ml dịch nuôi cấy Trichoderma harzianum T2 và 400 ml đệm acetate

pH 5. Đặt cốc trên bếp khuấy từ ở 500C và khuấy liên tục trong 10 ngày để tăng hiệu

suất phá vỡ bào tử.

Hỗn hợp dịch ngâm bào tử được chia làm hai phần: không siêu âm và siêu âm

với công suất máy là 500 W, độ khuếch đại 100%. Sau đó ly tâm 4000 vòng/phút trong

15 phút để tách pha lỏng là dịch phá vỡ bào tử và pha rắn là phần bào tử phá vỡ.

Tiến hành trích ly dịch phá vỡ bào tử bằng diethyl ether và hexane, trích ly bào

tử bằng ethanol 960. Thu hai pha trích ly của dịch phá vỡ bào tử và pha lỏng khi trích

ly phần bào tử. Tiến hành khảo sát các hoạt tính sinh học, thành phần hóa học.

2.2.4.1 Quy trình trích ly hoạt chất có trong bào tử nấm Linh chi

Pha lỏng được trích ly lỏng lỏng bằng diethyl ether và hexane. Pha rắn (bào tử

200 ml nước cất

20 g bào tử nấm Linh chi

Lạnh đông -40C / 12 giờ

Rã đông ở nhiệt độ phòng

Ly tâm 4000 vòng/phút * 15 phút

Nước

Thu bào tử

Ủ bào tử trong hỗn hợp enzyme ở 500C có khuấy đảo, pH 5, 10 ngày

Không siêu âm

Siêu âm 500W, 100%, 5 phút

phá vỡ) được trích ly bằng ethanol 960, cụ thể như sau:

Ly tâm 4000 vòng/phút * 15 phút

Dịch ly tâm

Vỏ bào tử

Trích ly bằng hexane

Trích ly bằng cồn 960

Trích ly bằng diethyl ether

Ly tâm 4000 vòng /phút*15 phút

Đồ án tốt nghiệp

Pha lỏng

Pha nước

Pha hữu cơ

Định tính

Pha rắn

Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm quy trình trích ly bào tử sau khi phá vỡ

a. Quy trình trích ly dịch phá vỡ bào tử:

Lấy 100 ml dịch ngâm phá vỡ bào tử trong ngày thứ 10 đem ly tâm và cho vào

bình chiết:

- 100 ml dịch ngâm phá vỡ bào tử.

- 100 ml diethyl ether (hexane).

Dốc ngược bình chiết và xả hơi. Khóa van, lắc nhẹ sau đó lắc mạnh dần (chú ý

định kì dốc ngược bình và kết hợp mở khóa để xả hơi trong bình) trong 5 phút.

Để yên trong 30 phút, trong bình trích ly chia dung dịch thành hai lớp:

- Phần bên dưới là pha nước.

- Phần bên trên là pha hữu cơ.

Đồ án tốt nghiệp

Thu cả hai phần để thực hiện định tính.

b. Quy trình trích ly lỏng rắn phần bào tử còn lại sau khi phá vỡ: Cho phần vỏ

bào tử còn lại (20 g) vào trong 500 ml ethanol 960 ủ 12 giờ ở 500C, ly tâm

4000 vòng/phút trong 15 phút thu pha lỏng để thực hiện định tính.

2.2.4.2. Định tính một số hoạt chất có trong bào tử nấm Linh chi.

a. Định tính Protein

Thử nghiệm Biuret

Thuốc thử:

NaOH 10%: Cân 10 g NaOH hòa tan trong nước cất và định mức lên đến vạch

CuSO4 3%: Cân 3 g CuSO4 hòa tan trong nước cất và định mức lên đến vạch

Phương pháp tiến hành:

Hút 1 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm. Đun nóng ống nghiệm có chứa mẫu và

làm nguội ở nhiệt độ phòng. Bổ sung thêm từ 5 - 8 giọt NaOH 10% và tiếp tục thêm 1

- 2 giọt CuSO4 3%.

Phản ứng cho màu tím đỏ chứng tỏ sự có mặt của protein (liên kết peptide).

b. Định tính Saponin

Có hai cách để định tính Saponin trong mẫu bào tử Linh chi sau khi đã xử lý phá

vách:

Cách 1:

Thử nghiệm Fontan-Kaudel

- Hút 10ml dịch mẫu sau khi trích ly cho vào cốc 100ml và cô đặc đến còn khoảng

2 ml. Chuẩn bị 2 ống nghiệm:

+ Ống 1: thêm vào 5 ml HCl 0.1 N (pH = 1)

+ Ống 2: thêm vào 5 ml NaOH 0.1 N (pH = 13) Thêm vào mỗi ống nghiệm 2 ml

mẫu.

- Dùng ngón tay cái bịt miệng ống nghiệm và lắc ống nghiệm theo chiều dọc ống

nghiệm trong 1 phút. Để yên và quan sát cột bọt trong cả hai ống nghiệm:

+ Nếu cột bọt trong cả hai ống có độ cao bằng nhau và độ bền như nhau, có thể có

saponin triterpenoid

Đồ án tốt nghiệp

+ Nếu cột bọt trong ống pH 13 cao hơn nhiều so với cột bọt trong ống pH 1 thì có

thể có saponin steroid

Cách 2:

Thử nghiệm tính tạo bọt: Hút 5 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm. Dùng ngón

tay cái bịt chặt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm trong 1

phút. Để yên ống nghiệm và quan sát cột bọt trong ống nghiệm.

Trong cả hai cách kể trên đều quan sát độ bền của cột bọt:

- Bọt bền trong 15 phút: +

- Bọt bền trong 30 phút: ++

- Bọt bền trong 60 phút: +++

c. Định tính polysaccharide

Thuốc thử:

α-naphthol trong ethanol 960: cân 1 g bột α-naphthol pha trong 19 ml ethanol

960. Phương trình phản ứng:

Hình 2.8. Phương trình phản ứng định tính polysaccharide

Phương pháp tiến hành:

- Hút 10 ml dịch chiết cho vào cốc 100 ml và cô cách thủy cho đến cặn ở 700C.

Hòa tan cặn với 10 ml nước. Sau đó lọc thu 2 ml dịch cho vào ống nghiệm.

- Thêm vào ống nghiệm 1 – 2 giọt α – naphthol. Lắc đều ống nghiệm cho thuốc

thử phản ứng với mẫu.

- Tiếp tục thêm cẩn thận 2 ml H2SO4 vào đáy ống nghiệm

Đồ án tốt nghiệp

- Quan sát thấy có vòng màu đỏ hoặc tím chứng tỏ sự có mặt của polysaccharide

trong mẫu.

d. Định tính Triterpenoid

Dịch trích ly đem đi cô cặn cách thủy ở 700C. Sau đó lấy một ít mẫu đã cô cặn

đặt trên miếng lame kính. Dàn đều mẫu thành một lớp mỏng trên lame. Dùng pipet

Pasteur hút dung dịch anhydride acetic. Trộn đều mẫu với ahydride acetic và để bay

hơi ở nhiệt độ phòng. Tiếp tục thêm từ 1 - 2 giọt H2SO4 đậm đặc lên mẫu.

Quan sát sự đổi màu của mẫu trên lame:

- Nếu mẫu trên lame chuyển sang màu hồng chứng tỏ sự có mặt của Triterpenoid.

- Nếu mẫu trên lame chuyển sang màu xanh lá chứng tỏ sự có mặt của Steroid.

2.2.4.3. Định lượng một số hoạt chất có trong bào tử nấm Linh chi sau khi bị phá vỡ

a. Định lượng polysaccharide tổng số bằng phương pháp Phenol – Sulfuric

Dựa vào phản ứng thủy phân polysaccharide thành các monosaccharide, tạo màu

với phenol, dung dịch tạo thành có độ hấp thụ cực đại tại bước sóng A = 490 nm. Từ

đường chuẩn xây dựng từ D-glucose tinh khiết, ta xác định hàm lượng polysaccharide

có trong mẫu (Brennan và cộng sự, 2008).

Tiến hành:

Cân chính xác 0,25 g D-glucose hòa tan bằng nước cất và định mức bằng nước

cất lên đến vạch trong bình định mức 250 ml, ta được dung dịch A. Nồng độ dung dịch

là 1 mg/ml (1000 µg/ml).

Lấy 50 ml dung dịch A pha thành 500 ml, thu được dung dịch D-glucose có nồng

độ 0,1 mg/ml (100 µg/ml), ta được dung dịch B.

Lần lượt lấy 0, 20, 40, 60, 80, 100 ml dung dịch B pha thành 100 ml, ta thu được

dung dịch có nồng độ lần lượt là 0, 20, 40, 60, 80, 100 µg/ml.

Mỗi mẫu lấy 1 ml cho vào ống nghiệm có nắp vặn, thêm vào mỗi ống nghiệm 1

ml dung dịch Phenol 5%, và 5 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc, lắc đều các ống nghiệm.

Đặt các ống nghiệm vào nước sôi trong 2 phút rồi làm nguội ở nhiệt độ phòng

trong 30 phút.

Đồ án tốt nghiệp

Đo độ hấp thụ quang (A) của các dung dịch này ở bước sóng 490 nm, thu được

các giá trị độ hấp thụ quang.

Từ các kết quả thu được ta xây dựng đường chuẩn xác định polysaccharide trong

mẫu.

Hút 1 ml dịch trích ly của các mẫu trong diethyl ether cho vào ống nghiệm có

nắp vặn, thêm 1 ml Phenol 5% tiếp tục cho thêm 5 ml H2SO4 đậm đặc và lắc đều ống

nghiệm.

Đặt các ống nghiệm vào nước sôi trong 2 phút, sau đó làm lạnh ở nhiệt độ phòng

trong 30 phút.

Đo độ hấp thụ quang (A) của các dung dịch này ở bước sóng 490 nm, kết hợp với

phương trình đường chuẩn suy ra được hiệu suất thu hồi polysaccharide tổng ( là hàm

lượng polysaccharide có trong 100 g mẫu bào tử).

Tính toán kết quả:

*100

𝑋.10−6.𝑘.𝑉 𝑚

Hiệu suất thu hồi (%) =

Trong đó X: hàm lượng đường tương ứng trên đường chuẩn (µg/ml)

k: hệ số pha loãng

V: thể tích dịch chiết thu được(ml)

m: khối lượng mẫu (g)

b. Định lượng tổng chất béo có trong mẫu bào tử Linh chi phá vỡ theo phương

pháp Adam Rose Gottlieb

Nguyên lý: trong môi trường cồn ammoniac, chiết xuất lipid bằng ether và ether

dầu hỏa, để bay hơi hết ether và ether dầu hỏa, cân lipd và từ đó tính hàm lượng lipid/

Dụng cụ - hóa chất:

- Phễu chiết

- Ether và ether dầu hỏa

- Dung dịch cồn ammoniac (208,5 ml cồn + 7,5 ml dung dịch NH4OH đậm đặc,

định mức bằng nước cất lên đến vạch trong bình định mức 250 ml)

- Dung dịch phenolphtalein 1%

Đồ án tốt nghiệp

- Cốc thủy tinh sấy khô đã biết trước khối lượng

Phương pháp thực hiện

Cho vào phễu chiết:

20 ml mẫu sau khi ly tâm

20 ml dung dịch cồn ammoniac

22 ml diethyl ether

1-2 giọt phenolphthalein

Lắc trong 5 phút, sau đó thêm 20 ml dung dịch ether dầu hỏa, lắc mạnh trong 5

phút, để tách lớp trong 30 phút.

Các chất không phải chất béo sẽ lắng xuống dưới, chất béo cùng lớp ether sẽ ở

lớp trên.

Xả bỏ lớp bên dưới, thu lớp trên vào cốc thủy tinh đã biết trước khối lượng.

Tráng bình bằng ether 2 lần. Mỗi lần 5 ml và trút hết vào cốc.

Để bay hơi ở nhiệt độ phòng, sau đó cho vào tủ sấy ở 1000C trong 30 phút.

Lấy cốc thủy tinh có chứa chất béo đã được sấy ở 1000C đặt vào bình hút ẩm

cho nguội.

Tiến hành xác định hiệu suất thu hồi lipid tổng, tức là khối lượng chất béo có

trong mẫu bào tử nấm Linh chi. Tính toán kết quả:

(𝑚2−𝑚1)

Hàm lượng chất béo có trong 100 g bào tử nấm Linh chi

∗ 100

𝑣

X (%) =

Trong đó:

m1: Khối lượng cốc thủy tinh (g)

m2: Khối lượng cốc thủy tinh chứa mẫu (g)

v: trọng lượng mẫu ban đầu (ml).

2.2.4.4. Phương pháp kháng oxy hóa DPPH

Về nguyên tắc, các chất kháng oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho

hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng,

Đồ án tốt nghiệp

nhạt dần, chuyển từ màu tím sang màu vàng nhạt. Giá trị mật độ quang OD càng thấp

chứng tỏ khả năng bắt gốc tự do DPPH càng cao (Brand – Williams và cộng sự, 1995).

Hoạt tính kháng oxy hóa quét gốc tự do DPPH được khảo sát trên bốn mẫu thí

nghiệm: pha hữu cơ của mẫu không siêu âm (PHC KSA), pha hữu cơ của mẫu siêu âm

(PHC SA), bào tử không siêu âm (BT KSA) và bào tử siêu âm (BT SA) dựa theo mô

tả của Xingyi Zhu và cộng sự (2002).

- Dựng đường chuẩn Trolox: Dãy nồng độ của Trolox ( 0,002145, 0,006435,

0,010725, 0,015015, 0,019305 mg/ml) được xây dựng. Tiến hành dựng đường chuẩn

Trolox:

Mẫu trắng: 2 ml Methanol

Mẫu Control (A0) : 1 ml Methanol + 1 ml DPPH

Mẫu Standard (A1) ở các nồng độ : 1 ml DPPH 0,2 mM và 1 ml mẫu thí nghiệm

Trolox đối chứng dương

𝐴0− 𝐴1

Tính toán kết quả:

∗ 100

𝐴0

% Ức chế (I%) =

Các thí nghiệm được tiến hành trong 3 lần lặp lại.

Từ tỉ lệ % Ức chế (I%), chúng tôi xây dựng phương trình tương quan tuyến tính,

từ đó chúng tôi xác định giá trị IC50 (là nồng độ mà tại đó bắt 50% gốc tự do DPPH).

- Dựng đường chuẩn mẫu thí nghiệm: Cân 70 mg dầu bào tử hòa vào 7 ml

methanol, votex đến khi nào mẫu hòa tan hết vào dung môi. Dãy nồng độ của dầu bào

tử nấm Linh chi ( 0,1, 0,75, 1,5, 2,25, 3,0 mg/ml) được xây dựng. Tiến hành dựng

đường chuẩn mẫu thí nghiệm:

Mẫu trắng: 2 ml Methanol

Mẫu Control (A0) : 1 ml Methanol và 1 ml DPPH

Mẫu thí nghiệm (A1): 1 ml DPPH 0,2 mM và 1 ml mẫu thí nghiệm ở các nồng độ

Mẫu thí nghiệm (A2): 1 ml Methanol và 1 ml mẫu thí nghiệm ở các nồng độ

Hỗn hợp được ủ trong tối ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Khả năng quét được đo

bằng máy đo quang phổ ở bước sóng λ = 517 nm.

Tính toán kết quả:

𝐴0 – (𝐴1−𝐴2)

Đồ án tốt nghiệp

∗ 100

𝐴0

% Quét gốc tự do DPPH =

Các thí nghiệm được tiến hành trong 3 lần lặp lại.

Từ tỉ lệ % quét gốc tự do DPPH, chúng tôi xây dựng phương trình tương quan

tuyến tính, từ đó chúng tôi xác định giá trị IC50 (là nồng độ mà tại đó bắt 50% gốc tự

do DPPH) để làm cơ sở so sánh khả năng kháng oxy hóa giữa các mẫu. Mẫu nào có

giá trị IC50 càng thấp thì hoạt tính kháng oxy hóa càng cao.

2.2.4.5. Phương pháp thử độc tính tế bào trên Artemia

- Bước 1: Ấp nở trứng Artemia nauplii: Trứng bào xác Artemia nauplii được ấp nở

bằng nước biển có độ mặn 15 - 35‰, pH 7,5 - 8,5. Tỷ lệ 0,5 g trứng/lít nước biển.

Quá trình ấp nở trứng để nơi thoáng mát, có ánh sáng, nhiệt độ 28 - 290C, sục khí liên

tục trong 20 giờ. Trứng nở sau 20 - 36 giờ. Artemia nauplii được dùng để thử độc tính.

- Bước 2: Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu

nhiên, đơn yếu, lặp lại 3 lần ở mỗi nghiệm thức. Mỗi ô cơ sở 30 ấu trùng Artemia

nauplii được nuôi trong các cốc nhỏ V nước biển = 20 ml.

Để xác định giá trị LC50 của chế phẩm, chế phẩm được pha loãng thành dãy có 5

nồng độ khác nhau; 20, 2, 0,2, 0,02, 0,002, 0,0002 (mg/ml) (tương ứng với 5 nghiệm

thức), các nồng độ đưa ra đều được thăm dò trước đảm bảo tỷ lệ chết của ấu trùng

Artemia nauplii sau 2 – 6 giờ nằm trong khoảng 16 – 84% giúp việc xác định giá trị

LC50 sau 2 – 6 giờ có độ tin cậy cao.

Tiến hành pha dung dịch dầu bào tử gốc nồng độ ban đầu 200 mg/ml. Cân 200

mg dầu bào tử hòa tan trong 1 ml DMSO (100%). Từ nồng độ ban đầu pha loãng thành

dãy nồng độ từ 10-1 đến 10-6. Đánh dấu vạch 20 ml trên các cốc. Cho vào chính xác 30

ấu trùng Artemia trong mỗi cốc. Cho nước biển vào đến vạch 20 ml, hút bỏ lượng

nước biển trong cốc ra và bổ sung dung dịch dầu bào tử theo tỉ lệ vào cốc.

Đối chứng âm: DMSO 100%

g/ml.

Đối chứng dương: Thuốc trừ sâu Reasgant 3.6 EC pha loãng đạt nồng độ 7,5

Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm thử độc tính tế bào trên Artemia nauplii

Đồ án tốt nghiệp

ĐC âm

ĐC

Mẫu

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

DMSO

dương

Cốc chứa ấu

trùng 30 con, V

= 20 ml nước

biển

Thể tích nước

100

biển hút ra (µl)

Dung dịch dầu

100

bào tử (µl)

Đối chứng (µl)

100

Nồng độ hoạt

chất (mg/ml)

7,5

trước khi đưa

0,2

0,02

0,002

0,0002

100%

vào dung dịch

g/ml

nước muối nuôi

Artemia

Nồng độ hoạt

chất (mg/ml)

0,0375

trong dung

0,1

0,01

0,001

0,0001 0,00001 0,000001

0,5%

g/ml

dịch nuôi cấy

Artemia

- Bước 3: Xử lý số liệu: Tính tỷ lệ chết tích lũy của Artemia nauplii ở mỗi

𝑠ố 𝑐𝑜𝑛 𝑠ố𝑛𝑔 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 𝑡ℎí 𝑛𝑔ℎ𝑖ệ𝑚 𝑠𝑎𝑢 𝑥ử 𝑙í

nghiệm thức.

𝑠ố 𝑐𝑜𝑛 𝑠ố𝑛𝑔 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 đố𝑖 𝑐ℎứ𝑛𝑔 𝑠𝑎𝑢 𝑥ử 𝑙í

%H = (1 - ) * 100

Tính tỉ lệ chết sau khoảng thời gian xác định (2 - 6 giờ) của chế phẩm

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Thu enzyme chitinase trên môi trường lên men thể rắn

Để trả lời câu hỏi: Liệu có thể sử dụng bã nấm Linh chi nuôi cấy thể rắn thu

enzyme phá vỡ bào tử không? Nhóm thực hiện đề tài tiến hành khảo sát trên hai loại

cơ chất lên men thể rắn là thể quả nấm Linh chi và bã nấm Linh chi. Thu enzyme dịch

trích ly từ hai môi trường, xác định vòng phân giải chitin để đánh giá khả năng sinh

enzyme trên hai môi trường. Nhóm thực hiện đề tài thu được kết quả như sau (bảng

3.1).

Bảng 3.1. Đường kính vòng phân giải chitin của enzyme chitinase thu được từ hai môi

trường cơ chất (mm)

Thời gian MT thể quả (mm) MT bã nấm (mm)

24 giờ 18,33bc ± 1,61 15,33c ± 0,58

Ghi chú: Đường kính vòng phân giải (mm) được thể hiện dưới dạng TB ± SD. Trong cùng một cột giá trị TB theo sau bởi một chữ cái thì không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa α=0,01 theo trắc nghiệm LSD.

24 giờ

48 giờ 27,33a ± 0,58 22,33b ± 2,31

)

m m

48 giờ

(

MT thể quả

MT bã nấm

Hình 3.1. Đường kính vòng phân giải chitin của enzyme chitinase thu được từ hai môi

trường cơ chất (mm)

Đồ án tốt nghiệp

a)

b)

Hình 3.2. Khả năng phân giải chitin của enzyme thu được

từ hai môi trường sau 24 giờ

a) Enzyme thu được từ môi trường bã nấm

b) Enzyme thu được từ môi trường thể quả

Dựa vào kết thể quả hiện ở bảng 3.1, ta rút ra nhận xét trên môi trường thể quả

nấm Linh chi sau 48 giờ thu được enzyme chitinase có khả năng phân giải chitin cao

nhất với đường kính 27,33 mm. Trong khi đó ở cùng điều kiện thời gian, trên môi

trường bã nấm có đường kính phân giải chitin là 22,33 mm. Có thể thấy rằng enzyme

thu được trên bả nấm bằng 81,7% enzyme thu được trên thể quả. Trong nghiên cứu

này nhóm thực hiện đề tài sử dụng cơ chất là thể quả. Tuy nhiên, bã nấm Linh chi có

tiềm năng là cơ chất thay thế cho thể quả, tiết kiệm đáng kể chi phí sản xuất enzyme.

Sau khi xác định được môi trường cơ chất thay thế thể quả để thu enzyme

chitinase, nhóm thực hiện đề tài tiếp tục khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến tỉ lệ phá vỡ

bào tử nấm Linh chi từ đó thiết lập quy trình phá vách bào tử nấm Linh chi kết hợp

enzyme và siêu âm.

3.2. Ảnh hưởng của siêu âm lên tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi

Theo các nghiên cứu trước đó (Nguyễn Thanh Liên Khương, 2017), ngoài việc

sử dụng enzyme phá vỡ bào tử nhiều tác giả còn sử dụng siêu âm. Để làm rõ vai trò

của siêu âm đối với khả năng phá vỡ bào tử, 3 nghiệm thức được tiến hành: Đối chứng

Đồ án tốt nghiệp

xử lý enzyme không siêu âm, siêu âm trước xử lý enzyme và siêu âm sau xử lý

enzyme.

Trước khi khảo sát ảnh hưởng của siêu âm đến khả năng phá vỡ bào tử, nhóm

thực hiện đề tài khảo sát độ khuếch đại sóng siêu âm có ảnh hưởng đến tỉ lệ phá vỡ

bào tử nấm Linh chi hay không. Nhóm tiến hành siêu âm trong 1,5 phút ở hai độ

khuếch đại là 75% và 100% sau đó ủ với hỗn hợp enzyme trong 2, 4, 6, 8, 10 ngày có

khuấy từ gia nhiệt ở 500C, pH 5. Thực hiện thu kết quả đếm số bào tử nguyên vẹn lần

lượt ở 2, 4, 6, 8 và 10 ngày để xác định tỉ lệ phá vỡ bào tử. Kết quả được trình bày ở

bảng 3.2.

Bảng 3.2 Bảng so sánh ảnh hưởng của độ khuếch đại đến tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh

chi qua các ngày ủ enzyme

Ngày

SA 75%

SA 100%

2

1,50de ± 1,18

5,25cd ± 2,09

4

12,93b ± 2,19

4,50cd ± 1,62

6

6,87c ± 1,54

6,89c ± 1,89

8

11,96b ± 1,08

11,45b ± 0,54

10

0,55e ± 0,35

28,56a ± 1,67

Ghi chú: Tỉ lệ% phá vỡ được thể hiện dưới dạng TB ± SD. Trong cùng một cột giá trị TB theo sau bởi một chữ cái thì không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa α=0,01 theo trắc nghiệm LSD.

)

( ỡ v á h p

ệ l ỉ

Ngày

SA 75 %

SA 100 %

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.3. Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của độ khuếch đại đến tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm

Từ bảng 3.2 đưa ra nhận xét: ở cùng thời gian siêu âm nhưng SA 75% làm

tỉ lệ phá vỡ không ổn định. Tỉ lệ phá vỡ cao nhất ở ngày 4 và ngày 10 lần lượt là

12,93% và 11,96%. Đến ngày 10, tỉ lệ phá vỡ bào tử chỉ đạt 0,55%. Trong khi

đó, SA 100% có tỉ lệ phá vỡ tăng dần theo từng ngày và đạt giá trị cao nhất ở

ngày 10 (28,56%). Vì vậy, chọn độ khuếch đại 100% cho các thí nghiệm tiếp

theo.

Khi so sánh ảnh hưởng của siêu âm đến tỉ lệ phá vỡ bào tử nhóm đề tài tiến

hành khảo sát với ba nghiệm như đã trình bày, chọn thời điểm ủ enzyme 5 ngày,

siêu âm 100%, 1,5 phút.

Tỉ lệ phá vỡ bào tử được xác định theo phương pháp đếm số bào tử còn

nguyên (Hình 3.4). Kết quả tỉ lệ phá vỡ bào tử được trình bày theo bảng 3.3.

Linh chi qua các ngày

Hình 3.4. Bào tử nấm Linh chi soi dưới kính hiển vi (X400)

a) Khi chưa bị phá vỡ

b) Khi bị phá vỡ

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.3. Bảng tổng hợp kết quả tỉ lệ phá vỡ (%) bào tử nấm Linh chi khi không siêu

âm và siêu âm (siêu âm với độ khuếch đại 100% trong 1,5 phút, ủ hỗn hợp enzyme

trong 5 ngày có khuấy từ gia nhiệt ở 500C)

Xử lí enzyme Siêu âm trước khi ủ Siêu âm sau khi ủ

Không siêu âm enzyme enzyme

)

( ỡ v á h p

ệ l ỉ

KSA

SA trước ủ

SA sau ủ

Tỉ lệ phá vỡ 16,65a ± 3,38 5,69b ± 1,60 23,81a ± 2,29 (%)

Hình 3.5. Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của siêu âm lên tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi.

Từ đó ta có thể thấy, so với việc không siêu âm có tỉ lệ phá vỡ bào tử đạt 16,65%

thì việc siêu âm trước khi ủ enzyme chỉ đạt tỉ lệ phá vỡ là 5,69%. Điều này có thể giải

thích do thực hiện siêu âm bào tử trong hỗn hợp enzyme ở độ khuếch đại 100% liên

tục trong 1,5 phút, việc này có thể làm đầu rung của máy siêu âm nóng lên và ảnh

hưởng đến hoạt tính của enzyme trong cốc. Khi đó, việc tiếp tục ủ bào tử trong hỗn

hợp enzyme hầu như không còn tác dụng đáng kể. Trong khi đó, sử dụng sóng siêu âm

sau khi ủ enzyme trong 5 ngày đạt tới 23,81%.

Khi xử lý thống kê 3 nghiệm thức thì xử lý enzyme không siêu âm và xử lý

enzyme siêu âm 1,5 phút có tỉ lệ phá vỡ sai khác không có ý nghĩa, tuy nhiên nếu chỉ

Đồ án tốt nghiệp

so sánh 2 nghiệm thức xử lý ezyme và xử lý enzyme trước siêu âm sai khác có ý nghĩa

thống kê rõ rệt (p < 0,05).

Từ những kết quả trên, có thể kết luận việc sử dụng siêu âm làm tăng tỉ lệ phá

vỡ bào tử nấm Linh chi.

3.3. Ảnh hưởng của các chế độ tiền xử lí lạnh đông

Trong các nghiên cứu trước đó, các tác giả tiền xử lý lạnh đông bào tử rồi mới

phá vỡ bằng enzyme và siêu âm. Tuy nhiên chưa rõ bước này có thực sự cần thiết

không và chế độ lạnh đông nào là thích hợp. Vì vậy nhóm đề tài thực hiện 5 nghiệm

thức, đối chứng là bào tử ngâm trong nước ở nhiệt độ phòng, bào tử ngâm trong nước

lạnh đông -40C (tủ lạnh), -200C (tủ đá), -700C (đá khô) và -1960C (nitơ lỏng) sau đó rã

đông là phương pháp giúp phá vỡ tế bào được áp dụng rộng rãi trong công nghệ vi

sinh.

Sau đó ủ với hỗn hợp enzyme trong 10 ngày kết hợp siêu âm công suất 500 W,

độ khuếch đại 100% trong 5 phút thu được kết quả như sau (Bảng 3.4):

Bảng 3.4: Kết quả so sánh ảnh hưởng của các chế độ tiền xử lí lạnh đông

Nhiệt độ tiền xử lí

33 -4

-20

-70

-196

(0C)

8,73b

60,23a

73,70a

64,22a

67,07a ±

Tỉ lệ phá vỡ%

±5,51

±10,02

±8,27

±2,74

4,63

)

( ỡ v

á h p

ệ l ỉ

KLĐ

-4

-20

-70

-196

Nhiệt độ (0C)

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.6. Biểu đồ so sánh tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi qua các chế độ tiền xử lí.

Bảng 3.4 và hình 3.6 cho thấy nếu không tiền xử lý bào tử bằng lạnh đông tỉ lệ

phá vỡ bào tử là không đáng kể (8,73%). Khi tiền xử lý bằng lạnh đông ở các chế độ

khác nhau sau 12 giờ trong buồng lạnh đông tủ lạnh (-40C), tủ âm (-200C), đá khô (-

700C) và nitơ lỏng (-1960C) thì tỉ lệ phá vỡ của các chế độ thay đổi từ 60,23% -

73,70% cao nhất đạt được ở -700C trong đá khô là 73,70%, tuy nhiên sự sai khác

không có ý nghĩa thống kê so với các chế độ tiền xử lý khác (p>0,01). Như vậy có thể

chọn chế độ tiền xử lý lạnh đông qua đêm sau 12 giờ sử dụng buồng lạnh đông tủ lạnh

-40C vì lý do tiện lợi và kinh tế.

Việc tiền xử lí lạnh đông ảnh hưởng nhiều đến việc phá vỡ bào tử nấm Linh chi,

do chúng góp phần làm thay đổi cấu trúc lớp vách bào tử, tạo điều kiện dễ dàng cho

các bước phá vỡ tiếp theo.

Từ đó có thể xây dựng quy trình phá vỡ bào tử như sau: tiền xử lí lạnh đông bào

tử ở -40C trong 12 giờ, sau đó rã đông và ủ với hỗn hợp enzyme DTL và enzyme

thương mại trong 10 ngày. Cuối cùng là siêu âm 500 W, độ khuếch đại 100% trong 5

phút. Khi kết hợp enzyme và siêu âm, bào tử bị phá vỡ được ghi nhận là chiếm tỉ lệ

cao hơn. Tuy nhiên để kiểm tra xem giữa siêu âm và không siêu âm có ảnh hưởng đến

thành phần hoạt chất bên trong hay không, nhóm thực hiện đề tài tiến hành các thí

nghiệm khảo sát tiếp theo.

Đồ án tốt nghiệp

3.4. Định tính thành phần hóa học sau khi phá vỡ bào tử nấm Linh chi

Kết quả phá vỡ bào tử chỉ được chứng minh khi các hoạt chất bên trong bào tử

được giải phóng. Nhóm đề tài tiến hành định tính các thành phần hóa học có trong

dịch phá vỡ bào tử. Các thành phần hóa học cơ bản có trong bào tử nấm Linh chi được

nghiên cứu là có chứa: polysaccharide, triterpenoid, protein và acid béo,… Trong thể

quả, triterpenoid tồn tại dưới dạng triterpenoid saponin vì vậy saponin cũng được định

tính.

Nhóm đề tài xử lý huyền phù bào tử sau khi phá vỡ như sau: tiến hành ly tâm thu

được pha lỏng là dịch phá vỡ bào tử và pha rắn tạm gọi là vỏ bào tử. Mặc dù phần bào

tử sau khi siêu âm vẫn còn những bào tử chưa bị phá vỡ hoàn toàn do tỉ lệ phá vỡ chưa

đạt 100% nhưng tạm thời nhóm thực hiện đề tài kí hiệu phần bào tử đã phá vỡ sau khi

tách khỏi phần dịch lỏng là vỏ bào tử để thuận tiện cho việc gọi tên ở các thí nghiệm

tiếp theo.

Với mong muốn thu được hiệu quả các sản phẩm trong pha lỏng, nhóm thực hiện

đề tài thực hiện trích ly lỏng lỏng dịch phá vỡ bào tử chủ yếu bằng dung môi diethyl

ether. Vì đó là dung môi không phân cực. Nếu xếp trong dãy dung môi có độ phân cực

từ thấp đến cao thì ditehylether là một trong những loại dung môi có độ phân cực ở

mức trung gian, cao hơn hexane, benzen và thấp hơn các dung môi phân cực:

methanol, aceton...có thể trích ly được chất béo cũng như các chất hòa tan trong nước

như polysaccharide. Bên cạnh đó nhóm thực hiện đề tài thử nghiệm trên dung môi

khác đó là trích ly bằng dung môi hexane. Phần pha rắn là vỏ bào tử tiến hành trích ly

bằng ethanol 960.

Sau khi trích ly dịch phá vỡ bào tử và vỏ bào tử , tiến hành thu các pha để định

tính protein, saponin, polysaccharide, triterpenoid.

3.4.1. Định tính thành phần hóa học trong dịch phá vỡ bào tử

Phần dịch phá vỡ sau khi ly tâm tách bào tử được trích ly bằng diethyl ether và

hexane thu được pha nước và pha hữu cơ (như hình 3.7): định tính protein, saponin,

polysaccharide, triterpenoid.

Đồ án tốt nghiệp

Pha hữu cơ

Pha nước

Hình 3.7. Hai pha dịch trích ly lỏng lỏng bằng diethyl ether

3.4.1.1. Định tính protein

Thí nghiệm Biuret: Đây là phản ứng đặc trưng của liên kết peptide (CO-NH-).

Trong môi trường kiềm, các hợp chất có chứa từ hai liên kết peptide trở lên có thể

phản ứng với CuSO4 tạo thành phức chất màu xanh tím, tím, tím đỏ hay đỏ. Cường độ

màu thay đổi tùy thuộc vào độ dài mạch peptide.

Tiến hành thí nghiệm Biuret theo mô tả ở mục 2.2.3.2. Phản ứng có màu tím đỏ

chứng tỏ có protein. Thực hiện tương tự cho đối chứng âm là nước cất và đối chứng

dương là pepton 0,1%. Kết thể quả hiện ở bảng 3.5.

Bảng 3.5. Kết quả định tính protein theo thử nghiệm biuret khi trích ly bằng hai dung

môi

Mẫu PHC DI PN DI PHC DI PN DI PHC HE PN HE PHC HE PN

KSA KSA SA SA KSA KSA SA HE

Biuret + + - + - + - +

Đồ án tốt nghiệp

Quan sát phản ứng của các mẫu dịch trong các ống nghiệm và so với đối chứng

âm, dương có thể đưa ra kết luận: Đối với mẫu trích ly bằng diethlether: PHC DI KSA,

PN DI KSA và PN DI SA đều thể hiện màu tím khi cho thuốc thử chứng tỏ có sự hiện

của protein, riêng chỉ có PHC DI SA thể hiện âm tính. Đối với mẫu trích ly bằng

hexane, PN HE KSA và PN HE SA đều thể hiện màu tím khi cho thuốc thử, còn lại là

PHC HE KSA và PHC HE SA đều không chứa protein.

3.4.1.2. Định tính saponin

Một đặc tính quan trọng của Saponin là tính tạo bọt, nên đây là một trong những

phương pháp chính xác để định tính sự hiện diện của Saponin.

Thí nghiệm định tính saponin thực hiện theo mô tả ở mục 2.2.3.2

Cách 1: Thử nghiệm tạo bọt

- Quan sát độ bền của cột bọt:

 Bọt bền trong 15 phút: +

 Bọt bền trong 30 phút: ++

 Bọt bền trong 60 phút: +++

- Thực hiện tương tự cho đối chứng âm là nước cất và đối chứng dương là viên

Linh chi OPC.

Cách 2: Thử nghiệm Fontan – Kaudel

- Quan sát cột bọt trong cả hai ống nghiệm pH = 1 và pH =13 và độ bền cột bọt

trong 15 phút, 30 phút, 60 phút:

 Nếu cột bọt trong cả hai ống có độ cao bằng nhau và độ bền như nhau, có thể có

saponin triterpenoid.

 Nếu cọt bọt trong ống pH 13 cao hơn nhiều so với cột bọt trong ống pH 1 thì có

thể có saponin steroid.

Kết quả thử nghiệm tạo bọt ghi nhận được là:

- Mẫu trích ly bằng diethyl ether: không có sự tạo bọt ở PN DI KSA, PN DI

SA và có sự tạo bọt sau khi lắc ống nghiệm ở mẫu PN DI SA, PHC KSA,

độ cao cột bọt ở PN SA là 1,4 cm và độ cao cột bọt ở PHC SA là 0,9 cm.

Sau khi để yên trong thời gian 15 phút độ cao cột bọt ở PN DI SA là 0,7

Đồ án tốt nghiệp

cm và độ cao cột bọt ở PHC DI SA là 0,2 cm và sau 60 phút nhận thấy cột

bọt của cả hai ống đều không còn. Từ đó có thể đưa ra kết luận tất cả các

mẫu không có sự hiện diện của saponin.

- Mẫu trích ly bằng hexane: không có sự tạo bọt ở mẫu PHC HE SA và có

sự tạo bọt sau khi lắc ống nghiệm ở mẫu PN HE KSA, PHC KSA, PN HE

SA và có độ cao cột bọt lần lượt là 0,9; 0,3; 1,4 cm. Sau khi để yên trong

thời gian 30 phút, bọt không bền ở ống PHC HE KSA, độ cao cột bọt ở

PN HE KSA là 0,3 cm và độ cao cột bọt ở PN HE SA là 0,7 cm và sau 60

phút nhận thấy cột bọt của cả hai ống đều không còn.

Bảng 3.6. Bảng ghi nhận kết quả chiều cao cột bọt (cm) bền theo thời gian khi định

tính saponin theo thử nghiệm Fontan – Kaudel trích ly bằng diethyl ether

Mẫu pH = 1 (HCl 0,1N) pH = 13 (NaOH 0,1N)

Sau khi lắc

PN DI KSA 1,7 4,2

PHC DI KSA 0,3 0,4

PN DI SA 1,7 4,1

PHC DI SA 0,0 0,0

Sau 60 phút thử nghiệm

PN DI KSA 1,0 0,3

PHC DI KSA 0,0 0,0

PN DI SA 1,0 0,4

PHC DI SA 0,0 0,0

Quan sát cột bọt sau khi lắc trong ống PN KSA ở pH=1 và pH = 13 có chiều cao

lần lượt là: 1,7 cm, 4,2 cm. Ở ống PHC KSA, pH = 1 và pH = 13 có chiều cao cột bọt

lần lượt là 0,3 cm và 0,4 cm và PN SA có chiều cao lần lượt là 1,7 cm; 4,1 cm. PHC

SA không thấy có sự tạo bọt sau khi lắc.

Sau 60 phút thử nghiệm, cột bọt bền trong ống pH = 1 của PN DI KSA và PN DI

SA có chiều cao là 1,0 cm. Cột bọt bền trong ống pH = 13 của PN DI KSA và PN DI

Đồ án tốt nghiệp

SA có chiều cao lần lượt là 0,3 cm; 0,4 cm. Sự tạo bọt không bền trong 60 phút thử

nghiệm ở cả hai ống pH = 1 và pH = 13 của mẫu PHC DI KSA và PHC DI SA.

Bảng 3.7. Bảng ghi nhận kết quả chiều cao cột bọt (cm) bền theo thời gian khi định

tính saponin theo thử nghiệm Fontan – Kaudel trích ly bằng hexane

Mẫu pH = 1 (HCl 0,1 N) pH = 13 (NaOH 0,1 N)

Sau khi lắc

PN HE KSA 1,7 0,8

PHC HE KSA 0,5 0,5

PN HE SA 1,9 1,5

PHC HE SA 0,4 0,1

Sau 30 phút thử nghiệm

PN HE KSA 1,0 0,5

PHC HE KSA 0,3 0,0

PN HE SA 1,2 0,4

PHC HE SA 0,3 0,4

Quan sát cột bọt sau khi lắc trong ống PN HE KSA ở pH = 1 và pH = 13 có chiều

cao lần lượt là 1,7 cm và 0,8 cm. Ở ống PHC HE KSA, pH = 1 và pH = 13 có chiều

cao cột bọt lần lượt là 0,5 cm và 0,5 cm và PN HE SA có chiều cao lần lượt là 1,9 cm

và 1,5 cm. PHC HE SA ở pH = 1 và pH = 13 có chiều cao lần lượt là 0,4 cm và 1,1

cm.

Sau 30 phút thử nghiệm mẫu sự tạo bọt trong ống pH = 1 bền của PN HE KSA,

PHC HE KSA, PN HE SA và PHC HE SA có chiều cao là 1,0 cm; 0,3 cm; 1,2 cm, 0,3

cm. Sự tạo bọt trong ống pH = 13 bền ở PN HE KSA, PN HE SA và PHC HE SA có

chiều cao cột bọt lần lượt là 0,3 cm; 0,4cm và 0,4 cm. Sự tạo bọt không bền trong 30

phút thử nghiệm ở cả ống pH = 13 của mẫu PHC HE KSA. Sau 60 phút nhận thấy cột

bọt của các ống đều không còn.

Đồ án tốt nghiệp

Quan sát phản ứng tạo bọt và độ bền của cột bọt ở tất cả các mẫu thử nghiệm hai

dung môi và so với đối chứng âm, dương có thể đưa ra kết luận tất cả các mẫu không

có sự hiện diện của saponin.

Kết quả định tính saponin được tổng hợp ở bảng 3.8

Bảng 3.8. Kết quả định tính saponin khi trích ly bằng hai dung môi

PHC PN PHC DI PN DI PHC DI PN DI PN HE PHC HE HE Mẫu KSA KSA SA SA KSA HE SA KSA SA

Tạo - - - - - - - - bọt

Fontan

- - - - - - - - –

Kaudel

3.4.1.3. Định tính polysaccharide

Thử nghiệm định tính polysaccharide được thực hiện theo thử nghiệm Molisch

như đã mô tả ở mục 2.2.3.2.

Nguyên tắc: các loại polysaccharide đều cho phức màu tím với dung dịch α-

naphthol trong acid H2SO4 đậm đặc.

Thực hiện tương tự cho đối chứng âm là nước cất và đối chứng dương là CMC

1%. Quan sát thấy có vòng màu đỏ hoặc tím chứng tỏ sự có mặt của polysaccharide

trong mẫu. Kết quả ghi nhận ở bảng 3.9.

Bảng 3.9. Kết quả định tính polysaccharide khi trích ly bằng hai dung môi

PHC PN PHC DI PN DI PHC DI PN DI PN HE PHC Mẫu HE HE KSA KSA SA SA KSA HE SA KSA SA

Molisch + + + + + + + +

Đồ án tốt nghiệp

Kết quả quan sát phản ứng của các mẫu thử nghiệm trên hai dung môi và so với

đối chứng âm, dương nhận thấy có sự xuất hiện vòng đỏ và tím ở các mẫu, có thể đưa

ra kết luận có sự hiện diện polysaccharide ở tất cả các mẫu.

3.4.1.4. Định tính Triterpenoid:

Tiến hành định tính Triterpenoid theo thử nghiệm Liebermann – Burchard được

mô tả ở mục 2.2.3.2. Thực hiện tương tự cho đối chứng âm là nước cất và đối chứng

dương là viên Linh chi OPC. Quan sát sự đổi màu của mẫu trên lam:

 Nếu mẫu trên lam chuyển sang màu hồng chứng tỏ sự có mặt của Triterpenoid.

 Nếu mẫu trên lam chuyển sang màu xanh lá chứng tỏ sự có mặt của Steroid.

Kết quả ghi nhận được khi quan sát trên lame của các mẫu thử nghiệm trên hai

dung môi và so với đối chứng âm, đối chứng dương nhận thấy các mẫu có sự chuyển

sang màu hồng nhạt từ đó có thể đưa ra kết luận có sự hiện diện triterpenoid ở tất cả

các mẫu (bảng 3.10).

Bảng 3.10. Kết quả định tính triterpenoid khi trích ly bằng hai dung môi

PHC PN PHC PN PN PN DI PHC PHC DI DI HE HE HE Mẫu KSA DI SA HE SA KSA SA KSA KSA SA

Liebermann + + + + + + + + – Burchard

Qua các thử nghiệm định tính thành phần hóa học có trong hai pha của dịch trích

ly từ hai dung môi của các mẫu không siêu âm và siêu âm, kết quả tổng hợp được trình

bày ở Bảng 3.11.

Bảng 3.11. Bảng tổng kết các thử nghiệm định tính thành phần hóa học trong dịch phá

vỡ bằng hai dung môi

Thử nghiệm Protein Saponin Polysaccharide Triterpenoid

Mẫu

Pepton 0.1% (+) +

Đồ án tốt nghiệp

Viên Linh chi (+) + +

CMC 1% (+) +

Nước cất (-) - - - -

PN DI KSA + - + +

PHC DI KSA + - + +

PN DI SA + - + +

PHC DI SA - - + +

PN HE KSA + - + +

PHC HE KSA - - + +

PN HE SA + - + +

PHC HE SA - - + +

Từ bảng 3.11, có thể rút ra nhận xét: sau khi định tính thành phần hóa học hai

pha dịch trích ly từ hai dung môi của dịch phá vỡ bào tử không siêu âm và siêu âm

nhận thấy chỉ có polysaccharide và triterpenoid.

3.4.2. Định tính thành phần hóa học còn lại trong vỏ bào tử phá vỡ

Để xác định thành phần hóa học còn lại trong vỏ bào tử, sau khi trích ly lỏng rắn

phần vỏ bào tử trong ethanol 960 ly tâm thu pha lỏng và tiến hành định tính protein,

saponin, polysaccharide, triterpenoid.

3.4.2.1. Định tính protein

Tiến hành thí nghiệm Biuret theo mô tả ở mục 2.2.3.2. Phản ứng có màu tím đỏ

chứng tỏ có protein. Thực hiện tương tự cho đối chứng âm là nước cất và đối chứng

dương là pepton 0.1%.

Quan sát thấy không có sự chuyển đổi màu như đối chứng dương, kết luận không

có sự hiện diện protein ở tất cả các mẫu. Kết quả được ghi nhận theo bảng 3.12.

Bảng 3.12. Kết quả định tính protein theo thử nghiệm biuret khi trích ly vỏ bào tử

Mẫu BT SA BT KSA

Biuret - -

Đồ án tốt nghiệp

3.4.2.2. Định tính Saponin

Thí nghiệm định tính saponin thực hiện theo mô tả ở mục 2.2.3.2.

Kết quả quan sát ở thử nghiệm tạo bọt nhận thấy không có sự tạo bọt các mẫu thử

nghiệm, có thể đưa ra kết luận không có sự hiện diện saponin ở các mẫu bào tử sau khi

phá vỡ.

Ở thử nghiệm Fontan – Kaudel quan sát phản ứng tạo bọt và độ bền của cột bọt

của các mẫu dịch trong các ống nghiệm thấy không có sự tạo bọt các mẫu thử nghiệm

do đó có thể đưa ra kết luận không có sự hiện diện saponin ở các mẫu bào tử. Kết quả

được trình bày ở bảng 3.13.

Bảng 3.13. Kết quả định tính saponin theo thử nghiệm tạo bọt, Fontan - Kaudel khi

trích ly vỏ bào tử

Mẫu BT KSA BT SA

Tạo bọt - -

Fontan - Kaudel - -

3.4.2.3. Định tính Polysaccharide

Thử nghiệm định tính polysaccharide được thực hiện theo thử nghiệm Molisch.

Thực hiện tương tự cho đối chứng âm là nước cất và đối chứng dương là CMC 1%.

Sau khi quan sát phản ứng của các mẫu thử nghiệm trong các ống nghiệm và so

với đối chứng âm, dương có sự xuất hiện vòng đỏ tím ở các mẫu thử nghiệm chứng tỏ

có sự hiện diện của polysaccharide. Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.14.

Bảng 3.14. Kết quả định tính polysaccharide theo thử nghiệm Molisch khi trích ly vỏ

bào tử

Mẫu BT KSA BT SA

Molisch + +

3.4.2.4. Định tính Triterpenoid

Tiến hành định tính Triterpenoid theo thử nghiệm Liebermann-Burchard. Quan

sát sự đổi màu của mẫu trên lam:

Đồ án tốt nghiệp

 Nếu mẫu trên lam chuyển sang màu hồng chứng tỏ sự có mặt của Triterpenoid.

 Nếu mẫu trên lam chuyển sang màu xanh lá chứng tỏ sự có mặt của Steroid.

Thực hiện tương tự cho đối chứng âm là nước cất và đối chứng dương là viên

Linh chi. Kết quả quan sát phản ứng của các mẫu dịch trong các ống nghiệm và so với

đối chứng âm, dương có xuất hiện màu hồng nhạt trên lame chứng tỏ có sự hiện diện

của triterpenoid. Kết quả ghi nhận ở bảng 3.15.

Bảng 3.15. Kết quả định tính triterpenoid theo thử nghiệm Liebermann-Burchard khi

trích ly vỏ bào tử

Mẫu BT KSA BT SA

Liebermann – + + Burchard

Kết quả tổng hợp thử nghiệm định tính các thành phần còn lại trong bào tử bị

phá vỡ được trình bày ở bảng 3.16.

Bảng 3.16. Bảng tổng kết các thử nghiệm định tính phần vỏ bào tử

Thử nghiệm Protein Saponin Cacbohydrate Triterpenoid

Mẫu

Pepton 0.1% (+) +

+ Viên Linh chi (+) +

+ CMC 1% (+)

- - Nước cất (-) - -

+ + BT E96 KSA - -

+ + BT E96 SA - -

Bảng 3.17. Bảng tổng kết các thử nghiệm tất cả các pha khi trích ly dịch phá vỡ bào tử

và vỏ bào tử

Thử nghiệm Protein Saponin Polysaccharide Triterpenoid

Mẫu

Đồ án tốt nghiệp

Pepton 0.1% (+) +

Viên Linh chi (+) + +

CMC 1% (+) +

Nước cất (-) - - - -

PN DI KSA + + + -

PHC DI KSA + + + -

PN DI SA + + + -

PHC DI SA - + + -

PN HE KSA + + + -

PHC HE KSA - + + -

PN HE SA + + + -

PHC HE SA - + + -

BT E96 KSA - + + -

BT E96 SA - + + -

Như vậy qua các kết quả thu được từ mục 3.4.1 và 3.4.2, sau khi phá vỡ bào tử

bằng enzyme hoặc enzyme kết hợp siêu âm và ly tâm tách pha, phần dịch thu hồi chứa

protein, polysaccharide và triterpenoid, tuy nhiên saponin không được phát hiện.

Protein chủ yếu nằm trong pha nước. Khi trích ly lỏng lỏng bằng diethyl ether, protein

không được phát hiện trong pha hữu cơ khi có siêu âm, nhưng vẫn còn khi không siêu

âm.

Ngược lại khi trích ly bằng hexane là dung môi phân cực kém. Pha hữu cơ chứa

protein ở cả hai trường hợp siêu âm và không siêu âm. Khác với protein,

polysaccharide và triterpenoid được phát hiện ở cả hai pha nước và hữu cơ khi sử dụng

diethyl ether và hexane để trích ly dù hai dung môi này có độ phân cực khác nhau,

ngoài ra ở phần vỏ bào tử cũng biểu hiện dương tính với hai hoạt chất này. Phân tích

định lượng đối với polysaccharide và triterpenoid là cần thiết để đánh giá các hoạt chất

chính thu hồi trong pha lỏng sau ly tâm tách bào tử phá vỡ.

3.5. Định lượng các hoạt chất thu được từ dịch bào tử và bào tử bị phá vỡ

Đồ án tốt nghiệp

3.5.1. Định lượng polysaccharide trong dịch trích ly và bào tử của mẫu không siêu

âm và mẫu kết hợp siêu âm bằng phương pháp Phenol – Sulfuric

Phương pháp Phenol – Sulfuric giúp định lượng polysaccharide qua đường chuẩn

D-glucose.

Ta có phương trình đường chuẩn D-glucose:

y = 0,0064x – 0,0308 với R2 = 0,991

Trong đó:

x: nồng độ dung dịch cần xác định giá trị mật độ quang (µg/ml)

y: giá trị mật độ quang

R2 : hệ số tương quan

Sau khi trích ly thu được các hoạt chất trong bào tử bị phá vỡ, nhận thấy có sự

hiện diện của polysaccharide từ đó tiến hành định lượng polysaccharide tổng xác định

hiệu suất thu hồi, tức là hàm lượng polysaccharide tổng có trong khối lượng bào tử ban

đầu thu được kết quả như bảng sau (bảng 3.18).

Bảng 3.18. Hàm lượng polysaccharide có trong dịch phá vỡ bào tử và vỏ bào tử từ

100g bào tử phá vỡ vách bằng enzyme kết hợp siêu âm và không siêu âm

Mẫu Hiệu suất thu hồi polysaccharide (%)

Dịch KSA 12,03b±1,00

Dịch SA 16,80a±1,15

BT KSA 0,04c±0,00

Ghi chú: Hiệu suất thu hồi (%) được thể hiện dưới dạng TB ± SD. Trong cùng một cột giá trị TB theo sau bởi một chữ cái thì không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa α=0,01 theo trắc nghiệm LSD.

BT SA 0,03c±0,01

)

(

BT KSA

BT SA

Dịch KSA

Dịch SA

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.8. Biểu đồ polysaccharide tổng (%) có trong dịch phá vỡ bào tử và vỏ bào tử từ

100g bào tử phá vỡ vách bằng enzyme kết hợp siêu âm và không siêu âm

Từ bảng 3.18 cho thấy kết quả polysaccharide chủ yếu được tìm thấy trong pha

lỏng sau ly tâm (Dịch SA 16,80%). Bào tử phá vỡ còn chứa rất ít polysaccharide, so

với trong pha lỏng chỉ chiếm 0,3% và 0,17% lần lượt cho BT KSA và SA. Siêu âm

giúp tăng hàm lượng polysaccharide thu hồi từ 12,03% lên 16,80% (có ý nghĩa thống

kê).

Bảng 3.19. Bảng phân tích hàm lượng polysaccharide trong hai pha khi trích ly lỏng

lỏng dịch phá vỡ bào tử bằng diethyl ether và hexane từ 100 g bào tử không siêu âm và

siêu âm

PHC (%) PN (%)

DI KSA 0.25c ± 0,02 11,77b ± 0.99

DI SA 0,30c ± 0,01 16,50a ± 1,15

HE KSA 0,23c ± 0,01 11,79b ± 1.01

Ghi chú: Hàm lượng (%) được thể hiện dưới dạng TB ± SD. Trong cùng một cột giá trị TB theo sau bởi một chữ cái thì không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa α=0,01 theo trắc nghiệm LSD.

HE SA 0,21c ± 0,01 16,58a ± 1,15

Từ bảng 3.19, phân tích định lượng cho thấy pha nước thu hồi sau trích ly lỏng lỏng

chứa phần lớn polysaccharide. Đối với dung môi diethyl ether pha hữu cơ chỉ chứa 2,1%

khi không siêu âm và 1,81% khi siêu âm. Đối với dung môi hexane pha hữu cơ chỉ chứa

Đồ án tốt nghiệp

1,95% khi không siêu âm và 1,26% khi siêu âm. Không thấy sự khác biệt giữa 2 dung

môi.

3.5.2. Định lượng lipid trong dịch trích ly và bào tử của mẫu không siêu âm và mẫu

siêu âm bằng phương pháp Adam – Rose – Gottlieb

Thành phần lipid trong bào tử gồm triterpenoid và acid béo. Tuy nhiên do không

đủ hóa chất nên triterpenoid không được phân tích.

Bảng 3.20. Hàm lượng lipid có trong dịch phá vỡ bào tử và vỏ bào tử từ 100g bào tử

phá vỡ vách bằng enzyme kết hợp siêu âm và không siêu âm.

Mẫu Hiệu suất thu hồi lipid (%)

Dịch KSA 50,50b ± 1,32

Dịch SA 86,17a ± 10,41

BT KSA 1,08c ± 0,63

120

100

BT SA 6,75c ± 1,75

)

%

(

BT KSA

BT SA

Dịch KSA

Dịch SA

Hình 3.9. Hàm lượng lipid có trong dịch phá vỡ bào tử và vỏ bào tử từ 100g bào tử

phá vỡ vách bằng enzyme kết hợp siêu âm và không siêu âm.

Đồ án tốt nghiệp

Từ bảng 3.20, ta có thể đưa ra nhận xét hàm lượng lipid tổng số thu được đạt giá

trị cao nhất là 86,17% đối với mẫu dịch SA, cao hơn mẫu không siêu âm (50,50%). Có

thể nói, nhờ kết hợp enzyme và siêu âm đã nâng hàm lượng lipid thu được lên 1,7 lần

so với không siêu âm. Bên cạnh đó, ở dịch trích ly bào tử siêu âm đã thu được hàm

lượng lipid là 6,75%, cao hơn mẫu bào tử không siêu âm (1,08%) tuy nhiên không có

ý nghĩa về mặt thống kê.

Bảng 3.21. Giả sử hàm lượng polysaccharide tổng và lipid trong mẫu không siêu âm là

100% từ đó tính ra được % polysaccharide tổng và lipid của các mẫu còn lại nhằm so

sánh ảnh hưởng của siêu âm lên hàm lượng polysaccharide và lipid trong bào tử nấm

Linh Chi

Mẫu Tỉ lệ phần trăm Polysaccharide tổng (%) Tỉ lệ phần trăm Lipid tổng (%)

100 100 Dịch KSA

170,63 139,67 Dịch SA

2,15 0,34 BT KSA

170,63

180

160

139,67

140

120

100

)

100

(

13,37

2,15

0,34

0,23

13,37 0,23 BT SA

Dịch KSA

Dịch SA

BT KSA

BT SA

Carbohydrate tổng số

Lipid tổng số

Hình 3.10. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của siêu âm đến hàm lượng polysaccharide

tổng số và lipid có trong bào tử nấm Linh chi sau khi phá vỡ

Quan sát bảng 3.21, ta có nhận xét như sau việc dùng dung môi hữu cơ chủ yếu

để thu hồi lipid trong đó có triterpenoid, thành phần này có phần khác biệt với thể quả.

Đồ án tốt nghiệp

Theo Li JJ và cộng sự (2014), hàm lượng triterpenoid trong thể quả nấm chiếm 0,44%

- 1,42%, trong khi đó ở bào tử phá vỡ chiếm 1,89% - 3,15%.

Từ đó kết luận rằng phương pháp siêu âm làm tăng tỉ lệ phá vỡ và vì vậy tăng

hàm lượng polysaccharide cũng như lipid thu hồi trong phần dịch phá vỡ bào tử hơn là

trong vỏ bào tử. Hình 3.10 cho thấy nếu xem hàm lượng polysaccharide tổng và lipid

của mẫu KSA là 100% thì hàm lượng polysaccharide tổng và lipid của mẫu dịch SA

chiếm lần lượt là 139,67% và 170,63% trong khi đó ở phần vỏ bào tử siêu âm chỉ

chiếm lần lượt là 0,23% và 13,37%. Từ đó nên thu hồi toàn bộ thành phần dịch phá vỡ

bào tử và có thể đưa ra đề nghị xử lí cô đặc sau đó sấy phun. Phần vỏ bào tử còn lại có

thể trích ly bằng ethanol để thu hồi phần hoạt chất còn sót lại.

20 gam bào tử nấm Linh chi

200 ml nước cất

Lạnh đông -40C/ 12 giờ

Rã đông ở nhiệt độ phòng

Ly tâm 4000 vòng/phút * 15 phút

Thu bào tử

Ủ bào tử trong hỗn hợp enzyme 500C, có khuấy đảo, pH 5, 10 ngày

Siêu âm 500W, 100%, 5 phút

Ly tâm 4000 vòng/phút * 15 phút

Dịch phá vỡ

Vỏ bào tử

Trích ly bằng ethanol 960

Ly tâm 4000 vòng/phút*15 phút

Bã

Pha lỏng

Cô đặc

Sấy (phun hoặc thăng hoa)

Đồ án tốt nghiệp

Cao chiết bào tử phá vỡ

Hình 3.11. Quy trình đề nghị phá vách bào tử nấm Linh chi kết hợp enzyme và siêu âm 96

Đồ án tốt nghiệp

3.6. Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa

DPPH là phương pháp phổ biến, đơn giản, rẻ tiền, được sử dụng rộng rãi để kiểm

tra khả năng loại bỏ gốc tự do và các nhóm cho hydro, phương pháp này cũng được sử

dụng để định lượng các chất oxy hóa trong hệ thống sinh học phức tạp ngày nay.

Để xác định hoạt tính kháng oxy hóa bắt gốc tự do DPPH, sau khi trích ly, pha

hữu cơ của mẫu không siêu âm (PHC KSA), pha hữu cơ của mẫu siêu âm (PHC SA),

bào tử không siêu âm (BT KSA) và bào tử siêu âm (BT SA) được cô đến cặn và tiến

hành khảo sát trên dãy nồng độ: 0,1; 0,75; 1,5; 2,25; 3,0 mg/ml. Đối chứng dương sử

dụng là Trolox 0,2145 mg/ml.

Dựa vào kết quả ghi nhận được từ máy đo quang phổ ta có tỉ lệ phần trăm quét

gốc tự do DPPH của đối chứng dương Trolox như trình bày ở bảng 3.22.

Bảng 3.22. Tỉ lệ phần trăm quét gốc tự do DPPH của đối chứng dương Trolox

0,002145 0,006435 0,010725 0,015015 0,019305 Nồng độ dầu bào tử (mg/ml)

% Quét gốc tự do DPPH 14,41 ±0,01 33,41 ±0,04 54,30 ±0,01 76,72 ±0,04 95,04 ±0,05

Từ phương trình đường chuẩn Trolox ta có giá trị IC50 của Trolox là

9,71132±0,00003 µg/ml.

Đối với các mẫu dầu bào tử, kết quả ghi nhận được về tỉ lệ phần trăm quét gốc

tự do DPPH được trình bày ở bảng 3.23.

Bảng 3.23. Tỉ lệ phần trăm (%) quét gốc tự do DPPH của các mẫu dầu bào tử

1 2 3 4 5

0,1 0,75 1,5 2,25 3,0

STT Nồng độ dầu bào tử (mg/ml)

PHC KSA 6,51 ± 0,34 25,4 ± 5,51 40,14 ± 3,86 55,15 ± 0,80 75,81 ± 7,28

PHC SA 6,28 ± 2,00 19,62 ± 0,96 33,72 ± 0,85 43,53 ± 2,41 46,18 ± 0,85

BT KSA 8,70 ± 5,44 28,01 ± 2,83 41,70 ± 3,62 51,91 ± 4,85 66,83 ± 2,02

BT SA 11,28 ± 0,44 37,53 ± 2,91 50,90 ± 1,81 81,58 ± 1,81 86,59 ± 8,45

100

Đồ án tốt nghiệp

H P P D o d ự t c ố g t é u Q %

0.1

0.75

2.25

1.5 Nồng độ (mg/ml)

PHC KSA

PHC SA

BT KSA

BT SA

Hình 3.12. Biểu đồ so sánh tỉ lệ phần trăm quét gốc tự do DPPH của các mẫu dầu bào

tử

Như vậy, theo sự tăng dần nồng độ từ 0,1; 0,75; 1,5; 2,25; 3.0 mg/ml, tỉ lệ % hoạt

tính bắt gốc tự do DPPH của các mẫu dầu bào tử đều tăng dần. Điều đó chứng tỏ, khả

năng kháng oxy hóa của các mẫu dầu bào tử tăng tỉ lệ thuận theo chiều tăng nồng độ.

Với nồng độ 3,0 mg/ml, tỉ lệ % khả năng bắt gốc tự do ở BT SA là 86,59%, cao hơn so

với PHC KSA (75,81%) và BT KSA (66,83%) và thấp nhất là mẫu dầu bào tử PHC

SA (46,18%).

Như đã trình bày, từ % quét gốc tự do DPPH có thể xây dựng được phương trình

tuyến tính từ đó chúng tôi xác định giá trị IC50 (là nồng độ mà tại đó bắt 50% gốc tự

do DPPH). Hiệu quả quét gốc tự do của các mẫu dầu bào tử được xác định thông qua

giá trị IC50 được trình bày ở bảng 3.24.

Bảng 3.24. Bảng giá trị IC50 (µg/ml) của các mẫu dầu bào tử

Mẫu PHC KSA PHC SA BT KSA BT SA Trolox

0,01d±0,00

IC50 (µg/ml) 1935,62b± 135,72 2946,23a± 100,05 2072,20b± 23,71 1387,99c ±48,10

Ghi chú: Giá trị IC50 được thể hiện dưới dạng TB ± SD. Trong cùng một cột giá trị TB theo sau bởi một chữ cái thì không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa α=0,01 theo trắc nghiệm LSD.

Đồ án tốt nghiệp

A0

1

2

3

4

1

2

5

3

4

5

Hình 3.13. Đường chuẩn DPPH của mẫu pha hữu cơ không siêu âm và siêu âm

a) Pha hữu cơ không siêu âm

b) Pha hữu cơ siêu âm

a)

1

2 A0

4

5 b) 3

1

2

4

3

5 A0

a)

b)

Hình 3.14. Đường chuẩn DPPH của mẫu bào tử không siêu âm và siêu âm

a) Bào tử không siêu âm

b) Bào tử siêu âm

3500

3000

2500

) l

2000

m / g µ (

1500

0 5 C

1000

500

Đồ án tốt nghiệp

PHC KSA PHC SA BT KSA

BT SA

Trolox

Hình 3.15. Biểu đồ so sánh giá trị IC50 (g/ml) của các mẫu dầu bào tử

Kết quả thu được từ bảng 3.24 cho thấy, nếu so sánh giữa các mẫu dầu bào tử

với nhau thì mẫu BT SA có giá trị IC50 thấp nhất là 1387,99 µg/ml. Do đó hoạt tính

bắt gốc tự do DPPH của BT SA là cao nhất. Ngược lại, PHC SA có giá trị IC50 cao

nhất (2946,23 µg/ml) nên nó thể hiện khả năng kháng oxy hóa là thấp nhất.

Nếu so sánh giữa pha hữu cơ trính ly từ dịch bào tử không siêu âm và siêu âm, ta

có thể thấy PHC KSA có giá trị IC50 là 1935,62 µg/ml thấp hơn IC50 của PHC SA

nên nó có khả năng kháng oxy hóa cao hơn PHC SA. Nếu so sánh giữa dịch trính ly từ

bào tử không siêu âm và siêu âm, ta thấy BT KSA có giá trị IC50 là 2072,20 µg/ml

cao hơn IC50 của BT SA nên nó có khả năng kháng oxy hóa thấp hơn BT SA.

Điều này chứng tỏ siêu âm có thể làm ảnh hưởng đến hoạt tính kháng oxy hóa

của dịch trích ly. Vì siêu âm làm ảnh hưởng đến hoạt tính kháng oxi hóa của dịch trích

ly nên nó cũng làm ảnh hưởng các hoạt chất kháng oxi hóa có trong bào tử nấm Linh

chi.

Mặc dù trong bào tử nấm Linh chi có chứa rất nhiều hợp chất có khả năng kháng

oxi hóa và theo kết quả quả định tính cũng thu hồi được phần lớn polysaccharide và

lipid trong dịch phá vỡ nhưng trong thí nghiệm này chưa thấy rõ được điều đó. Điều

này có thể giải thích do các yếu tố thí nghiệm không thuận lợi cho bước khảo sát này

100

Đồ án tốt nghiệp

cũng như việc không có máy cô quay chân không có thể ảnh hưởng đến chất lượng của

mẫu thí nghiệm.

3.7. Thử độc tính tế bào trên Artemia nauplii

Thử nghiệm khả năng gây chết ở ấu trùng Brine Shrimp (Artemia nauplii) là một

thử nghiệm sinh học phổ biến được sử dụng như là một chỉ thị để xác định độc tính.

Nó dựa trên khả năng giết chết ấu trùng của các hợp chất thử nghiệm từ đó có thể đánh

giá mức độ an toàn, ảnh hưởng đến môi trường của chế phẩm. Vì vậy việc đánh giá

mức độ an toàn để hệ sinh thái trong nước nói riêng cũng như môi trường nói chung là

cần thiết (Patrick Sorgeloos và cộng sự, 1978). Ngoài ra đây còn là tiền đề cho các

hướng nghiên cứu trên các tế bào ung thư.

Mẫu dầu bào tử PHC SA và BT SA được pha loãng bằng DMSO đến dãy nồng

độ: 20; 2,0; 0,2; 0,02; 0,002; 0,0002 mg/ml. Sau đó cho vào các c ốc nước biển có chứa

chính xác 30 ấu trùng Artemia. Đếm số ấu trùng còn sống trong cốc sau 2 giờ. Từ đó

tính được tỉ lệ phần trăm chết của ấu trùng Artemia nauplii ( Bảng 3.25).

Bảng 3.25. Tỉ lệ phần trăm chết của ấu trùng Artemia nauplii theo nồng độ hoạt chất

trong dung dịch nuôi cấy Artemia nauplii của PHC SA (mg/ml)

0,1 0,01 0,001 0,0001 DMSO 0,0000 1 0,0000 01 ĐC dương Nồng độ (mg/ml)

Ghi chú: Tỉ lệ% chết được thể hiện dưới dạng TB ± SD. Trong cùng một cột giá trị TB theo sau bởi một chữ cái thì không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa α=0,01 theo trắc nghiệm LSD.

% Tỉ lệ chết 30,12c ±5,52 30,12c ±4,17 40,96b ±4,17 20,48cd ±3,61 30,12c ±4,17 12,05d ±5,52 1,20e± 5,52 100a±0, 00

101

120

100

)

( t ế h c ệ l ỉ

log10[nồng độ]

-1

-2

-3

-4

-5

-6

DMSO

-20

ĐC dương

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.16. Phần trăm tỉ lệ chết của ấu trùng Artemia nauplii theo log nồng độ dầu bào

tử PHC SA (mg/ml)

Kết quả cho thấy, mẫu dầu bào tử PHC SA có độc tính cao nhất trong thí nghiệm

ở nồng độ 0,001 mg/ml là 40,96%. Khi tăng nồng độ thì tỉ lệ chết không tăng, đối

chứng dương Reagants 3,6EC chết 100%. Từ đó có thể kết luận mẫu thí nghiệm không

thể hiện độc tính tế bào.

Bảng 3.26. Tỉ lệ phần trăm chết của ấu trùng Artemia nauplii theo nồng độ hoạt chất

trong dung dịch nuôi cấy Artemia nauplii của BT SA (mg/ml)

DMSO 0,1 0,01 0,001 Nồng độ (mg/ml) 0,000 1 0,000 01 0,000 001 ĐC dương

7,06c ±8,88 25,53b ±7,35 10,59c ±2,04 % Tỉ lệ chết 1,18c±3, 53 100a ±0,00 2,35c ±4,08 5,88c ±5,39

3,53c ±4,08 Ghi chú: Tỉ lệ% chết được thể hiện dưới dạng TB ± SD. Trong cùng một cột giá trị TB theo sau bởi một chữ cái thì không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa α=0,01 theo trắc nghiệm LSD.

102

120

100

)

( t ế h c ệ l ỉ

-1

-2

-3

-4

-5

-6

DMSO

log10[nồng độ]

ĐC dương

-20

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.17. Phần trăm tỉ lệ chết của ấu trùng Artemia nauplii theo log nồng độ

dầu bào tử BT SA (mg/ml)

Kết quả cho thấy, mẫu dầu bào tử có độc tính cao nhất ở nồng độ 0,1 mg/ml là

25,53% và ở nồng độ 0,000001 cho tỉ lệ chết thấp nhất là 2,35% so với đối chứng

dương Reagants 3,6EC chết 100%, cho thấy không thể hiện độc tính tế bào.

103

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

- Nuôi cấy Tricoderma harzianum T2 trên môi trường bã nấm Linh chi thu

enzyme bằng 81,7% so với môi trường thể quả.

- Quy trình phá vỡ bào tử nấm Linh chi bằng enzyme và siêu âm bao gồm các

bước sau: Tiền xử lí lạnh đông (-40C) trong 12 giờ, rã đông, ủ bào tử trong

hỗn hợp enzyme dịch trích ly từ nấm Tricoderma harzianum T2 và enzyme

thương mại C20032 theo tỉ lệ 1:1 ở 500C, pH 5 trong 10 ngày, siêu âm công

suất 500 W, độ khuếch đại 100% trong 5 phút đạt tỉ lệ phá vỡ là 67,07%.

Tuy nhiên ở các nhiệt độ lạnh đông khác nhau không làm ảnh hưởng đến tỉ

lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi.

- Thành phần hóa học chủ yếu nằm trong phần dịch của bào tử nấm Linh chi

phá vỡ là polysaccharide, triterpenoid, lipid. Hàm lượng polysaccharide

tổng số trong dịch phá vỡ bào tử siêu âm là 16,80%, không siêu âm là

12,03%. Hàm lượng lipid tổng số trong dịch phá vỡ bào tử siêu âm là

86,17%, không siêu âm là 50,50%.

- Chỉ số kháng oxy hóa cao IC50 có trong cao chiết vỏ bào tử siêu âm là

1387,99 µg/ml, trong dầu bào tử thu hồi từ pha hữu cơ trích ly lỏng lỏng

siêu âm là 2956,23 µg/ml.

- Tỉ lệ chết ấu trùng Artemia nauplii của pha hữu cơ siêu âm đạt cao nhất ở

nồng độ 0,001 mg/ml là 40,96%, cao chiết vỏ bào tử siêu âm nồng độ 0,1

mg/ml là 25,53%.

4.2. Kiến nghị

- Thực hiện quy trình của đề tài với trang bị máy cô quay chân không, sấy

phun hoặc sấy đông khô.

- Tối ưu hóa các thông số trong quá trình thủy phân: tốc độ khuấy đảo, công

suất siêu âm, số vòng ly tâm,…

- Thử nghiệm các nguồn enzyme chitinase khác.

104

Đồ án tốt nghiệp

- Định lượng triterpenoid có trong dịch sau khi phá vỡ.

- Khảo sát thêm các hoạt tính sinh học khác: kháng khuẩn, độc tính trên dòng

tế bào.

105

Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU THAM KHẢO

 Tài liệu tiếng Việt

GS.TS. Ngô Tất Lợi, 2004. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Y

học.

Lê Xuân Thám (1996). Nấm Linh Chi nguồn dược liệu quý ở Việt Nam. Nhà xuất bản

Mũi Cà Mau.

Lê Xuân Thám (2005), Nấm Linh Chi Ganodermataceaea Donk. NXB Khoa học và

Kỹ thuật,

Nguyễn Kim Phi Phụng (2007). Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ. Nhà xuất bản

Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh, 2007.

Nguyễn Văn Mùi (2001). Thực hành Hóa Sinh học. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia

Hà Nội.

Nguyễn Lân Dũng (2010). Công nghệ nuôi trồng nấm. Tập 2, nhà xuất bản Nông

nghiệp.

Nguyễn Minh Khang (2005). Khảo sát sinh trưởng nấm Linh Chi đen (A mauro derm

a subresinosum, Corner) phát hiện tại vùng núi Chứa Chan - Việt Nam. Khóa luận tốt

nghiệp Kỹ sư Công nghệ Sinh học, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.

Trần Thị Huỳnh Mai. Tổng quan về quy trình phá vỡ bào tử nấm linh chi và bước đầu

nghiên cứu điều kiện nảy mầm của bào tử này. Đồ án tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ

Sinh học, Đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh.

Trần Thị Lệ Minh (2011). Giáo trình Hóa Dược ứng dụng. Bộ môn Công nghệ sinh

học, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.

 Tài liệu tiếng Anh

Bao X.F., Zhen Y., Ruan L., Fang J.N. (2002). Purification, characterization, and

modification of T klymphocyte-stimulating polysaccharide from spores of Ganoderma

lacidum. Chen Pharm Bull, 50 (5), 623 – 9.

Brand Williams, W., Cuvelier, M. E. and Berset, C. (1995), Use of free radical

method to evaluate antioxidant activity, LWT, 28, 25 – 30.

106

Đồ án tốt nghiệp

Carlos Ricardo Soccol, Lucas Yamasaki Bissoqui, Cristine Rodrigues et al. (2016).

Pharmacological Properties of Biocompounds from Spores of the Lingzhi or Reishi

Medicinal Mushroom Ganoderma lucidum (Agaricomycetes): A Review, International

Journal of Medicinal Mushrooms, 18 (9), 757–767.

Chaiyavat Chaiyasut, Chakkrapong Kruatama, Sasithom Sirilun (2010). Breaking the

spores of Ganoderma lucidum by fermentation with Lactobacillus plantarum. African

Journal of Biotechnology, 9 (43), 7379 – 7382.

Chan W.K., Lam D.T.W., Law H.K.W., Wong W.T., Koo M.W.L., Lau A.S.Y., Lau

Y.L., Chan G.C.F. (2005). Ganoderma lucidum mycelium and spore extracts as

natural adjuvants for immunotherapy. J Altern Complement Med, 11 (6), 1047 – 57.

26.

Chee Keung Chung, Siu Kan Tong (2005). External preparation for skin containing

oleaginous substances extracted from Ganoderma lucidum and method of using the

same.

Chen T., Li K., Chen C., Chen X., Wen Q., Lin X. (1998). Ultrastructure of

basdiospores and sporoderm of Ganoderma lucidum and G. sinense . Fujian J Agricult

Sci, 4, 33 – 8.

Chen T.Q., Wu J.G., Wu Y.B., Wang H., Mao F.H., Wu J.Z. (2012). Supercritical

fluid CO2 extraction, simultaneous determination of total sterols in the spore lipids of

Ganoderma lucidum by GC-MS/SIM methods. Chem Nat Compd, 48 (4), 657 – 821.

Chen TQ, Wu YB, Wu JG, Wang HY, Mao FH, Wu JZ (2013). Fatty acids, essential

oils, and squalene in the spore lipids of Ganoderma lucidum by GC-MS and GC-FID.

Chem Nat Compd, 49 (1), 143 – 4.

Cheng C.R., Yue Q.X., Wu Z.Y., et al. (2010). Cytotoxic triterpenoids from

Ganoderma Lucidum. Phytochemistry, 71, 1579 – 1585.

Dehui Dai, Weilian Hu, Guang-rong Huang and Wei Li. 2011. Purification and

characterization of a novel extracellular chitinase from thermophilic Bacillus sp. Hu1.

African Journal of Biotechnology, 10 (13), 2476 – 2485.

107

Đồ án tốt nghiệp

Dong Q., Wang Y., Shi L., Yao J., Li J., Ma F., Ding K. (2012). A novel water-soluble

β-D-glucan isolated from the spores of Ganoderma lucidum. Carbohydr Res., 353, 100

– 5. 19.

Du Yuguang, Bai Xuefang (1996). Method for breaking cell wall of Ganoderma

lucidum spore. CN Application, CN1165032A.

Fu Y.J., Liu W., Zu Y.G., Shi X.G., Liu Z.G., Schwarz G., Efferth T. (2009). Breaking

the spores of the fungus Ganoderma lucidum by supercritical CO 2. Food Chem. 2009,

112 (1), 71 – 6.

Fukuzawa M., Yamaguchi R., Hide I., Chen Z., Hirai Y., Sugimoto A., Yasuhara T.,

Nakata Y. (2008). Possible involvement of long chain fatty acids in the spores of

Ganoderma lucidum (Reishi Houshi) to its anti-tumor activity. Bio Pharm Bull, 31

(10), 1933 – 7. 25.

Gao Y., Gao H., Chan E., Tang W., Xu A., Yang H., Huang M., Lan J., Li X., Duan

W., Xu C., Zhou S. (2005). Antitumor activity and underlying mechanisms of

ganopoly, the refined polysaccharides extracted from Ganoderma lucidum, in mice.

Immunol. Invest, 34, 171 – 198.

Gao P., Hirano T., Chen Z., Yasuhara T., Nakata Y., Sugimoto A. (2012). Isolation

and identification of C-19 fatty acids with anti-tumor activity from the spores of

Ganoderma lucidum (reishi mushroom), Fitoterapia, 83 (3), 490 – 9. 22.

Gao J.J., Nakamura N., Min B.S., Hirakawa A., Zuo F., Hattori M. (2004).

Quantitative determination of bitter principles in specimens of Ganoderma lucidum

using high-performance liquid chromatography and its application to the evaluation of

Ganoderma products. Chem Pharm Bull, 52 (6), 688 – 95. 30.

Guo L., Xie J., Ruan Y., Zhou L., Zhu H., Yun X., Jiang Y., Lu L., Chen K., Min Z.,

Wen Y., Gu J. (2009). Characterization and immunostimulatory activity of a

polysaccharide from the spores of Ganoderma lucidum. Int Immunopharmcol, 9 (10),

1175 – 82. 17.

Hansen L. (1958). On the anatomy of the Danish species of Ganoderma . Bot.

Tidsskrifft, 54, 333 – 352.

108

Đồ án tốt nghiệp

Hikino H., et al. (1989). Mechanisms of hypoglycemic activity of ganoderan B: a

glycan of Ganoderma lucidum fruit bodies. Planta Med.

Hou C.Y., Sun Y.T., Yan L., et al. (1988). Studies on the chemical constituents of the

spores from Ganoderma Lucidum. Acta Bot Sin, 30 (1), 66 – 70.

Hsu P.Y., Chen J.L., Chen H.Y., Yang S.H. (2012). Extract of sporoderm-broken

germinating spores of Ganoderma lucidum activates human polymorphonuclear

neutrophils via the P38 mitogen-activated protein kinase pathway. Chang Gung Med

J, 35 (2), 140 – 7. 28.

Jinghua L., Liling D., Jiang H., Yongping D. (2015). Ganoderma lucidum spore

powder wall breaking method. CN Application, CN105125595A.

Jue Wang, Bin Cao, Haiping Zhao, Juan Feng (2017). Emerging Roles of Ganoderma

Lucidum in Anti-Aging. PMC5758346.

Kenneth Dave B. Borja, Vhebs Terez L. Buhion and Everlita E. Canalita (2016),

Toxicity test on different brands of food seasonings using Brine Shrimp (Artemia

salina) lethality test, Science Signpost Publishing - Biological and Chemical Research,

3, 227 – 233.

Kino K. et al. (1990). An immunomodulating protein, Ling Zhi—8(LZ—8) prevents

insulitis an non—obese diabetic mice; Diabetolgia, vol. 33, 713 – 718.

Lee Seung Y. (1990). Cardiovascular Effects of Mycelium Extract of Ganoderma

lucidum: Inhibition of Sympathetic Outflow as a Mechanism of Its Hypotensive Action ,

Chem Pharm Bull, 38, 1359 – 1364.

Li J.J., Hu X.Q., Zhang X.F., Liu J.J., Cao L.S. (2014). Study on variation of main

ingredients from spores and fruiting bodies of Ganoderma lucidum, Article in

Chinese.

Liu G.T., Bao X., Niu S., et al. (1979). Some pharmacological actions of the spores of

Ganoderma lucidum and the mycelium of Ganoderma capense (Lloyd) Teng cultivated

by submerged fermentation. Chin Med J, 92, 469-500.

Liu X., Yuan J.P., Chung C.K., Chen X.J. (2002). Antitumor activity of the sporoderm-

broken germinating spores of Ganoderma lucidum. Cancer Lett, 182 (2), 155–61.

109

Đồ án tốt nghiệp

Liu X., Xu S.P., Wang J.H., Yuan J.P., Guo L.X., Li X., Huang X.N. (2007).

Characterization of Ganoderma spore lipid by stable carbon isotope analysis:

implications for authentication. Anal Bioanal Chem, 388 (3), 723–31.

Liu X., Huang X.N., Zhong Z.Q (2000). Extracting method for effective active matter

of lucid ganoderma spore. CN Grand, CN1114446C.

Liu X., Huang X.N., Zhong Z.Q (2000). Process for extracting intracapsular lipid

matter from ganoderma ectosporium. CN Application, CN00130883.

Liu X., Huang X.N., Zhong Z.Q (2000). Process for extracting lipid of Ganoderma

lucidum spore by immersing. CN Application, CN1099455C.

Liu X., Huang X.N., Peter - Chung C.K. (2001). Method for extracting oleaginous

substances from germination activated Ganoderma lucidum spores. US Grand.

US6440420B1.

Lui X. J. (1994). Hepatopathy and uterofunctional Bleeding mainly Treated with

Ganoderma lucidum. Proc. 94 Inter. Sym. On Ganoderma Res, Beijing, China, 58-9.

Ma L., Wu F., Chen R.Y. (2003). Analysis of triterpene constituents from Ganoderma

lucidum. Acta Pharm Sin, 38, 50 - 52.

Ma J., Fu Z., Ma P., Su Y., Zhang Q. (2007). Breaking and characteristics of

Ganoderma lucidum spores by high speed entrifugal shearing pulverizer. J W uhan

Univ Technol, 22 (4), 617 – 21.

Ma C., Guan S.H., Yang M., Liu X., Guo D.A. (2008). Differential protein expression

in mouse splenic mononuclear cells treated with polysaccharides from spores of

Ganoderma lucidum. Phytomedicine, 15 (4), 268–76.

Mau J.L., Lin H.C., Chen C.C. (2001). Antioxidant properties of several medicinal

mushrooms. JAgric Food Chem.

Min B.S., Nakamura N., Miyashiro H., et al. (1998). Triterpenes from the spores of

Ganoderma Lucidum and their inhibitory activity against HIV-1 protease. Chem

Pharm Bull, 46 (10), 1607-1612.

110

Đồ án tốt nghiệp

Min B.S., Gao J.J., Nakamura N., et al. (1998). Triterpenes from the spores of

Ganoderma Lucidum and their cytotoxicity against meth-A and LLC tumor cells.

Chem Pharm Bull, 48 (7), 1026-1033.

Min B.S., Gao J.J., Hattori M., Lee H.K., Kim Y.H. (2001). Anticomplement activity

of terpenoids from the spores of Ganoderma lucidum. Planta Med, 67(9), 811 – 4. 23.

Nguyen Minh Thuy, Nguyen Thi My Tuyen (2015). Extraction of bioactive

compounds and spore powder collection from Ganoderma lucidum. Can Tho

University Journal of Science Vol 1, 53-60.

Patrick Sorgeloos, Claire Remichi – Van der Wielan, Guido Persoone (1978). The use

of Artemia Nauplii for Toxicity tests – A critical Analysis. Ecotoxicology and

environmental safety 2, 249 – 255.

Shimizu, Akria et al. (1985). Isolation of an Inhibitor of Platelet Aggregation from a

Fungus, Ganoderma lucidum; Chem Pharm Bull, 33, 3012 - 3015.

Sliva D., Labarrere C., Slivova V., Sedlak M., Lloyd F.P., Ho N.W.Y. (2002).

Ganoderma lucidum suppresses motility of highly invasive breast and prostate cancer

cells. Biochem Biophys Res Commun, 298(4), 603 – 12. 29.

Sye W.T. (1991). Improvement method of extraction and high performance liquid

chromatographic separation of ganoderic acid from Ganoderma Lucidum. Journal of

the Chinese Chemical Society, 38, 179.

T. Mizuno (1991). Antitumor Active Substances of Mushroom Fungi, Based Science

and Latest Technology on Mushroom, Nohson Bunka Sha, Tokyo, , 121-135.

Thyagarajan, A.; Jiang, J.; Hopf, A.; Adamec, J.; Sliva, D. (2006). Inhibition of

oxidative stress-induced invasiveness of cancer cells by Ganoderma lucidum is

mediated through the suppression of interleukin 8 secretion. Int. J. Mol. Med. 2006,

18, 657-664.

Wachtel Galor S., Choi S.W., Benzie I.F. (2005). Effect of Ganoderma lucidum on

human DNA is dose dependent and mediated by hydrogen peroxide . Redox Rep, 10(3),

145-9.

111

Đồ án tốt nghiệp

Weng Y., Xiang L., Matsuura A., Zhang Y., Huang Q., Qi J. (2010) Ganodermasides

A and B, two novel anti-aging ergosterols from spores of a medicinal mushroom

Ganoderma lucidum on yeast via UTH1 gene. Bioorg Med Chem, 18(3), 999 - 1002

Xing Xiaohe, Zhu Shujun, Mingzhong W. (1995). Producing method for sporoderme-

broken ganoderma lucidum sporopollen and its product. CN Application,

CN1134306A.

Yizheng Xie, Shenzhu Li, Burton B. Yang. Chong Li, Zhi Zhang, Qingping Wu,

Guanzhou Chen, Biao Luo (2006). Process For Preparing Ganoderma Spore Oil. US

Application, US20110244556A1.

Yuan J.P., Wang J.H., Liu X., Kuang H.C., Huang X.N. (2006). Determination of

ergosterol in Ganoderma spore lipid from the germinating spores of Ganoderma

lucidum by high-performance liquid chromatography. J Agric Food Chem, 54(17),

6172 – 6.

Yue G.G.L., Fung K.P., Leung P.C., Lau C.B.S. (20058). Comparative studies on the

immunomodulatory and antitumor activities of the different parts of fruiting body of

Ganoderma lucidum and Ganoderma spores. Phytother Res, 22 (10), 1282 - 91.

Zhao D., Chang M.W., Li J.S., Suen W., Huang J. (2014). Investigation of ice-assisted

sonication on the microstructure and chemical quality of Ganoderma lucidum spores .

J Food Sci, 79 (11), 2253 – 65.

Zhao Hui (1996). Wall-breaking method of ganoderma lucidum spore. CN

Application, CN101596220A.

Zhang G. L., Wang Y. H., Ni W., Teng, H. L.; Lin, Z. B. (2002). Hepatoprotective

role of Ganoderma lucidum polysaccharide against BCG-induced immune liver injury

in mice. World J. Gastroenterol, 8, 728-733.

Zhu H.S., Yang X.L., Wang L.B,. Zhao D.X., Chen L. (2000). Effects of extracts from

sporoderm-broken spores of Ganoderma lucidum on HeLa cells. Cell Bio Toxicol,

16(3), 201 – 6.

112

Đồ án tốt nghiệp

Zhu X., Chen X., Xie J., Wang P., Su W. (2012). Mechanochemical-assisted

extraction and antioxidant activity of polysaccharides from Ganoderma lucidum

spores. Int J Food Technol, 47 (5), 927 – 32.

113

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC A

1. Định tính protein dịch trích ly

Hình 1. Thử nghiệm biuret của mẫu trích ly bằng diethyl ether

a) Ống nghiệm trước khi bỏ thuốc thử Biuret

b) Ống nghiệm sau khi bỏ thuốc thử Biuret

Hình 2. Thử nghiệm biuret của mẫu trích ly bằng hexane

a) Ống nghiệm trước khi bỏ thuốc thử Biuret

b) Ống nghiệm sau khi bỏ thuốc thử Biuret

2. Định tính saponin dịch trích ly

Đồ án tốt nghiệp

2.1. Thử nghiệm tạo bọt

Hình 3. Thử nghiệm tạo bọt của mẫu trích ly bằng diethyl ether

a) Ống nghiệm trước khi lắc

b) Ống nghiệm sau khi lắc

c) Ống nghiệm sau 15 phút để yên

Đồ án tốt nghiệp

Hình 4: Thử nghiệm tạo bọt của mẫu trích ly bằng hexane

a) Ống nghiệm trước khi lắc

b) Ống nghiệm sau khi lắc

c) Ống nghiệm sau 15 phút để yên

2.2. Thử nghiệm Fontan-Kaudel

Đồ án tốt nghiệp

Hình 5. Thử nghiệm Fontan – Kaudel mẫu trích ly bằng dithyl ether

a) Ống nghiệm trước khi lắc

b) Ống nghiệm sau khi lắc

c) Ống nghiệm sau khi để yên 60 phút

Đồ án tốt nghiệp

Hình 6. Thử nghiệm Fontan – Kaudel mẫu trích ly bằng hexane

a) Ống nghiệm trước khi lắc

b) Ống nghiệm sau khi lắc

c) Ống nghiệm sau khi để yên 60 phút

3. Định tính polysaccharide dịch trích ly

Đồ án tốt nghiệp

Hình 7. Thử nghiệm Molisch mẫu trích ly bằng diethyl ether

a) Ống nghiệm trước khi bỏ thuốc thử

b) Ống nghiệm sau khi bỏ thuốc thử

Đồ án tốt nghiệp

Hình 8. Thử nghiệm Molisch mẫu trích ly bằng hexane

a) Ống nghiệm trước khi bỏ thuốc thử

b) Ống nghiệm sau khi bỏ thuốc thử

4. Định tính triterpenoid dịch trích ly

Hình 9. Thử nghiệm Liebermann-Burchard mẫu trích ly bằng diethyl ether

a) Mẫu trước khi bỏ thuốc thử

b) Mẫu sau khi bỏ thuốc thử

a)

Đồ án tốt nghiệp

b)

Hình 10. Thử nghiệm Liebermann-Burchard mẫu trích ly bằng hexane

a) Mẫu trước khi bỏ thuốc thử

b) Mẫu sau khi bỏ thuốc thử

5. Định tính protein vỏ bào tử

Hình 11. Thử nghiệm biuret của mẫu trích ly vỏ bào tử

a) Ống nghiệm trước khi bỏ thuốc thử Biuret

b) Ống nghiệm sau khi bỏ thuốc thử Biuret

Đồ án tốt nghiệp

6. Định tính saponin vỏ bào tử

Hình 12. Thử nghiệm tạo bọt của mẫu trích ly vỏ bào tử

a) Ống nghiệm trước khi lắc

b) Ống nghiệm sau khi lắc

Đồ án tốt nghiệp

Hình 13. Thử nghiệm Fontan – Kaudel của mẫu trích ly vỏ bào tử

a) Ống nghiệm trước khi lắc

b) Ống nghiệm sau khi lắc

7. Định tính polysaccharide vỏ bào tử

Đồ án tốt nghiệp

Hình 14. Thử nghiệm Molisch của mẫu trích ly vỏ bào tử

a) Ống nghiệm trước khi bỏ thuốc thử

b) Ống nghiệm sau khi bỏ thuốc thử

8. Định tính triterpenoid vỏ bào tử

Hình 15. Thử nghiệm Liebermann-Burchard mẫu trích ly vỏ bào tử

a) Mẫu trước khi bỏ thuốc thử

b) Mẫu sau khi bỏ thuốc thử

Bảng 1. Bảng mật độ quang của dịch D-glucose chuẩn

Nồng độ (µg/ml) Độ hấp thụ quang A490 nm

0 0

20 0,072

40 0,2083

Đồ án tốt nghiệp

0,3589 60

0,4643 80

0.7

y = 0,0064x - 0,0308 R² = 0,991

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

100

120

-0.1

Nồng độ (µg/ml)

0,6294 100

Hình 16. Đường hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng

độ Glucose

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC B

KẾT QUẢ XỬ LÍ ANOVA

KHA NANG PHAN GIAI CHITIN CUA 2 MOI TRUONG’

XỬ LÍ ANOVA ĐƯỜNG KÍNH VÒNG PHÂN GIẢI CHITIN CỦA ENZYME CHITINASE THU ĐƯỢC TỪ HAI MÔI TRƯỜNG CƠ CHẤT

The ANOVA Procedure Class Level Information

Class Levels

Values

MAU 4

BNAM24 BNAM48 NAM24 NAM48

Number of Observations Read 12

Number of Observations Used 12 The ANOVA Procedure

Dependent Variable: VPG

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

3 243.0000000

81.0000000 37.75 <.0001

Error

8 17.1666667

2.1458333

Corrected Total 11 260.1666667

R-Square Coeff Var Root MSE VPG Mean

0.934017 5.670450 1.464866 25.83333

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

MAU 3

243.0000000 81.0000000 37.75

<.0001

The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for VPG

Note:

This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate.

Alpha

0.01

Error Degrees of Freedom 8

Đồ án tốt nghiệp

Error Mean Square

2.145833

Critical Value of t

3.35539

Least Significant Difference 4.0132

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N MAU

32.333 3 NAM48

27.333 3 BNAM48

23.333 3 NAM24

20.333 3 BNAM24

‘ANH HUONG CUA SA’

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: SL

XỬ LÍ ANOVA TỈ LỆ PHÁ VỠ (%) BÀO TỬ NẤM LINH CHI KHI KHÔNG SIÊU ÂM VÀ SIÊU ÂM

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

499.5277556 249.7638778

39.03 0.0004

Error

38.3944667

6.3990778

Corrected Total

537.9222222

R-Square Coeff Var Root MSE SL Mean

0.928625 16.44284

2.529640 15.38444

Source DF

Anova SS Mean Square F Value Pr > F

MAU

2 499.5277556 249.7638778

39.03 0.0004

The ANOVA Procedure

The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for SL

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate.

Đồ án tốt nghiệp

Alpha

0.01

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

6.399078

Critical Value of t

3.70743

Least Significant Difference

7.6575

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N MAU

23.810 3 SASA

16.650 3 KSA

5.693 3 SATR

‘SO SANH SA VA KSA’

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: SL

XỬ LÍ ANOVA SO SÁNH GIỮA SIÊU ÂM VÀ KHÔNG SIÊU ÂM

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

76.8984000

9.24 0.0384

Error

33.2860000

8.3215000

Corrected Total

110.1844000

R-Square Coeff Var Root MSE SL Mean

0.697906 14.25952

2.884701 20.23000

Source DF

Anova SS Mean Square F Value Pr > F

MAU

1 76.89840000 76.89840000

9.24 0.0384

The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for SL Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate.

0.05

Đồ án tốt nghiệp

Alpha

Error Degrees of Freedom

8.3215

Error Mean Square

2.77645

Critical Value of t

Least Significant Difference 6.5395

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N MAU

23.810 3 SASA

16.650 3 KSA

XỬ LÍ ANOVA ẢNH HƯỞNG CỦA ĐỘ KHUẾCH ĐẠI SA 75% SA 100% QUA CÁC NGÀY

D2: ngày 2, D4: ngày 4, D6: ngày 6, D8: ngày 8, D10: ngày 10

S75: siêu âm độ khuếch đại 75 %, SA100: siêu âm độ khuếch đại 100 %

‘TY LE PHA VO THEO NGAY VOI DO KHUECH DAI SIEU AM 75 VA 100’ The GLM Procedure

Dependent Variable: TL

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

1754.294743

159.481340

64.91 <.0001

Error

44.228007

2.457111

Corrected Total 29

1798.522750

R-Square Coeff Var Root MSE TL Mean

0.975409 17.33021

1.567518 9.045000

Source DF

Type I SS Mean Square F Value Pr > F

K

2.727060

1.363530

0.55 0.5836

D

4 446.487333

111.621833

45.43 <.0001

S

1 156.545363

156.545363

63.71 <.0001

D*S

4 1148.534987

287.133747

116.86 <.0001

Đồ án tốt nghiệp

Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F

K

2.727060

1.363530

0.55 0.5836

D

4 446.487333

111.621833

45.43 <.0001

S

1 156.545363

156.545363

63.71 <.0001

D*S

4 1148.534987

287.133747

116.86 <.0001

The GLM Procedure t Tests (LSD) for TL Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate.

Alpha

0.05

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

2.457111

Critical Value of t

2.10092

Least Significant Difference

1.9013

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N D (Ngày)

14.5533 6

11.7083 6

8.7133 6

6.8767 6

3.3733 6

The GLM Procedure t Tests (LSD) for TL Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate.

Alpha

0.01

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

2.457111

Đồ án tốt nghiệp

Critical Value of t

2.87844

Least Significant Difference

1.6476

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean

N S (Độ khuếch đại)

11.3293

100

6.7607

N

TL

Level of D

Level of S

Mean

10 100

28.5600000

<.0001

10 75

0.5466667

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

1754.294743

159.481340

64.91 <.0001

Error

44.228007

2.457111

Corrected Total 29

1798.522750

R-Square Coeff Var Root MSE TL Mean

0.975409 17.33021

1.567518 9.045000

Source DF

Type I SS Mean Square F Value Pr > F

2.727060

1.363530

0.55 0.5836

K

9 1751.567683

194.618631

79.21 <.0001

DS

Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F

2.727060

1.363530

0.55 0.5836

K

9 1751.567683

194.618631

79.21 <.0001

DS

The GLM Procedure Duncan's Multiple Range Test for TL Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate.

Alpha

0.01

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

2.457111

Number of Means

2

3

4

5

6

7

8

9

10 Critical Range

3.684 3.843 3.947 4.023 4.080 4.126 4.164 4.195 4.221

Đồ án tốt nghiệp

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N DS

28.560 3 D10S100

12.927 3 D4S75

11.963 3 D8S75

11.453 3 D8S100

6.887 3 D6S100

6.867 3 D6S75

5.247 3 D2S100

4.500 3 D4S100

1.500 3 D2S75

0.547 3 D10S75

‘KET QUA DEM BAO TU NGAY 5’

The ANOVA Procedure

XỨ LÍ ANOVA ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẾ ĐỘ TIỀN XỬ LÍ

Class Level Information

Class Levels Values

MAU 5 A196 A20 A4 A70 KLD

Number of Observations Read 15

Đồ án tốt nghiệp

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: TYLE

Number of Observations Used 15

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 4 8246.230907 2061.557727 45.17 <.0001

Error 10 456.407267 45.640727

Corrected Total 14 8702.638173

R-Square Coeff Var Root MSE TYLE Mean

0.947555 12.33064 6.755792 54.78867

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for TYLE

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate.

MAU 4 8246.230907 2061.557727 45.17 <.0001

Alpha 0.01

10 Error Degrees of Freedom

Error Mean Square 45.64073

Critical Value of t 3.16927

Least Significant Difference 17.482

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N MAU

A 73.703 3 A70

A 67.067 3 A4

A 64.220 3 A196

Đồ án tốt nghiệp

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N MAU

60.227 3 A20 A

8.727 3 KLD B

Polysacchide tong’

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: SL

XỬ LÍ ANOVA CARBOHYDRATE TỔNG

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

654.1475667 218.0491889

375.98 <.0001

Error

4.6396000

0.5799500

Corrected Total 11

658.7871667

R-Square Coeff Var Root MSE SL Mean

0.992957 10.54527

0.761544 7.221667

Source DF

Anova SS Mean Square F Value Pr > F

MAU

3 654.1475667 218.0491889

375.98 <.0001

The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for SL Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate.

Alpha

0.01

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

0.57995

Critical Value of t

3.35539

Least Significant Difference 2.0864

Đồ án tốt nghiệp

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N MAU

16.7933 3 SA

12.0267 3 KSA

0.0400 3 BTKSA

0.0267 3 BTSA

‘polysaccharite tong 2 pha 2 dung moi’

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: KQ

XỬ LÍ ANOVA POLYSACCHARIDE TỔNG TRONG HAI PHA CỦA HAI DUNG MÔI

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

1229.619063

175.659866

301.96 <.0001

Error

9.307733

0.581733

Corrected Total 23

1238.926796

R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean

0.992487 10.58652

0.762714 7.204583

Source DF

Anova SS Mean Square F Value Pr > F

MAU

7 1229.619063

175.659866

301.96 <.0001

The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for KQ Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate.

Alpha

0.01

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

0.581733

Đồ án tốt nghiệp

Number of Means

2

3

4

5

6

7

8 Critical Range

1.819 1.897 1.948 1.985 2.013 2.035 2.053

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

16.5833 3 PNHESA

16.5000 3 PNDISA

11.7933 3 PNHEKSA

11.7700 3 PNDIKSA

0.2933 3 PHCDISA

0.2533 3 PHCDIKSA

0.2300 3 PHCHEKSA

0.2133 3 PHCHESA

‘LIPID’

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: SL

XỬ LÍ ANOVA LIPID TỔNG

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

14404.85417

4801.61806

169.16 <.0001

Error

227.08333

28.38542

Corrected Total 11

14631.93750

Đồ án tốt nghiệp

R-Square Coeff Var Root MSE SL Mean

0.984480 14.74823

5.327797 36.12500

Source DF

Anova SS Mean Square F Value Pr > F

MAU

3 14404.85417

4801.61806

169.16 <.0001

The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for SL Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate.

Alpha

0.01

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

28.38542

Critical Value of t

3.35539

Least Significant Difference

14.596

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N MAU

86.167 3 DTLSA

50.500 3 DTLKSA

6.750 3 BTSA

1.083 3 BTKSA

DPPH’

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: SL

XỬ LÍ ANOVA GIÁ TRỊ IC50 CỦA CÁC MẪU DẦU BÀO TỬ

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

14188443.36

3547110.84

566.53 <.0001

Error

62611.31

6261.13

Đồ án tốt nghiệp

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Corrected Total 14

14251054.67

R-Square Coeff Var Root MSE SL Mean

0.995607 4.742670

79.12731 1668.413

Source DF

Anova SS Mean Square F Value Pr > F

MAU

4 14188443.36

3547110.84

566.53 <.0001

The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for SL Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate.

Alpha

0.01

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

6261.131

Critical Value of t

3.16927

Least Significant Difference

204.76

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N MAU

2946.23 3 PHCSA

2072.21 3 BTKSA

1935.62 3 PHCKSA

1387.99 3 BTSA

0.01 3 Trolox

‘ARTEMIA PHC SA

The ANOVA Procedure

XỨ LÍ ANOVA ĐỘC TÍNH TẾ BÀO TRÊN ARTEMIA NAUPLII CỦA PHC SA

Dependent Variable: SL

Đồ án tốt nghiệp

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

18551.46953

2650.20993

135.22 <.0001

Error

313.58927

19.59933

Corrected Total 23

18865.05880

R-Square Coeff Var Root MSE SL Mean

0.983377 13.36201

4.427113 33.13208

Source DF

Anova SS Mean Square F Value Pr > F

MAU

7 18551.46953

2650.20993

135.22 <.0001

The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for SL Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate.

Alpha

0.01

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

19.59933

Critical Value of t

2.92078

Least Significant Difference

10.558

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N MAU

100.000 3 DCDUONG

40.960 3 A3

30.123 3 A1

30.120 3 A2

30.120 3 A5

Đồ án tốt nghiệp

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N MAU

20.483 3 A4

12.047 3 A6

1.203 3 DMSO

ARTEMIA BT SA’

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: SL

XỬ LÍ ANOVA ĐỘC TÍNH TẾ BÀO TRÊN ARTEMIA NAUPLII CỦA BT SA

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

23400.27245

3342.89606

126.34 <.0001

Error

423.34133

26.45883

Corrected Total 23

23823.61378

R-Square Coeff Var Root MSE SL Mean

0.982230 26.69916

5.143815 19.26583

Source DF

Anova SS Mean Square F Value Pr > F

MAU

7 23400.27245

3342.89606

126.34 <.0001

The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for SL Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate.

Alpha

0.01

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

26.45883

Critical Value of t

2.92078

Least Significant Difference

12.267

Đồ án tốt nghiệp

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N MAU

100.000 3 DCDUONG

23.527 3 A1

10.587 3 A3

7.060 3 A2

5.883 3 A5

3.533 3 A4

2.357 3 A6

1.180 3 DMSO