57
Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Số 9
5. Trần Thiện Trung, Nguyễn Hoàng Bắc,
Lê Châu Hoàng Quốc Chương, Đỗ Trọng
Hải, Đỗ Trọng Khanh, Nguyễn Tấn Cường
(2007), “Kết quả sớm của phẫu thuật điều
trị nang đường mật ở người lớn”, Y học TP
Hồ Chí Minh, 11(1), tr. 146-153.
6. Phạm Anh Vũ (2002), Nghiên cứu
đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và
kết quả điều trị bệnh giãn đường mật bẩm
sinh ở trẻ em tại Bệnh viện Trung ương Huế,
Luận văn thạc sĩ y học, Đại học Y Dược Huế
- Đại học Huế, Huế.
7. Abramson L.P., Superina R., Radhakrishnan
J. (2009), “Choledochal cyst”, Pediatric
surgery, 2nd edition, pp. 306-310.
8. Brunicardi F.C. (2002), “Gallbladder and
the Extrahepatic biliary system”, Schwartz’s
principles of surgery, 8th edition, pp. 2556-
2573.
9. Karrer F.M. (2009), “Complications of
hepatobiliary surgery”, Compli53. Tiao G.M.
(2007), “Operative treatment of Choledochal
cysts”, Mastery of surgery, 5th edition,
pp. 2788-2799.
HAI HỢP CHẤT POLYOXYGENATED STEROID PHÂN
LẬP TỪ LOÀI SAN HÔ MỀM SINULARIA CRUCIATA
Võ Quốc Hùng, Nguyễn Thị Hoài
Khoa Dược, Trường Đại học Y Dược Huế
Tóm tắt
Đặt vấn đề: Sinh vật biển là một nguồn dự trữ hợp chất chuyển hóa hết sức phong phú và
phức tạp, đồng thời thể hiện nhiều hoạt tính sinh học có giá trị. Trong số đó, San hô mềm cũng
là một đối tượng nhiều năng nhưng chưa được nghiên cứu đầy đủ. Nghiên cứu này tiếp tục xác
định cấu trúc các thành phần hóa học được phân lập từ loài Sinularia cruciata. Đối tượng và
phương pháp nghiên cứu: Mẫu San hô mềm Sinularia cruciata, được thu thập tại Khu Bảo
tồn biển Cồn Cỏ - Quảng Trị. Phân lập các chất bằng sắc ký cột silica gel pha thường, pha đảo,
sắc ký lớp mỏng điều chế, Sephadex LH 20, sắc ký lớp mỏng pha thường và pha đảo. Xác định
cấu trúc bằng số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR, phổ khối lượng ESI-MS. Kết quả -
Kết luận: Đã phân lập và xác định được cấu trúc của 2 hợp chất thuộc nhóm polyoxygenated
steroid là: (1) ergosta-3β,5α,6β,11α-tetraol (sarcoaldesterol B) và (2) ergosta-1β,3β,5α,6β-
tetraol. Hiện chưa có báo cáo nào về tác dụng sinh học của 2 chất này nhưng nhiều nghiên cứu
về polyoxygenated steroid cho thấy nhóm chất này sở hữu nhiều tác dụng sinh học quý, trong
đó có hoạt tính chống ung thư.
Từ khóa: Sinularia cruciata, sarcoaldesterol B , polyoxygenated steroid, San hô mềm, ung thư.
Abstract:
TWO POLYOXYGENATED STEROIDS FROM SOFT CORAL
SINULARIA CRUCIATA
Vo Quoc Hung, Nguyen Thi Hoai
Faculty of Pharmacy, Hue University of Medicine and Pharmacy
Background: Marine organisms are rich sources of complicated and various secondary
metabolites which have a lager number of valuable bioactivities. Among those, although soft
DOI: 10.34071/jmp.2012.3.10
58 Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Số 9
corals are potential materials, they have not been deeply investigated yet. This is an ongoing
research to determine the chemical constituents of Vietnamese octocorals Sinularia cruciata.
Materials and method: The whole bodies of soft coral Sinularia cruciata collected from Con
Co, Quang Tri province. Pure compounds were isolated by using column chromatography normal
phase and inverse phase, preparative thin layer chromatography, thin layer chromatography
and Shephadex LH-20. Structures of them were determined by spectral data of nuclear
magnetic resonance (NMR), electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS). Results &
Conclusion: Structures of 2 polyoxygenated steroids were identified: (1) ergosta-3β,5α,6β,11α-
tetraol (sarcoaldesterol B) and (2) ergosta-1β,3β,5α,6β-tetraol. Till now, there are no reports
about biological effects of these compounds. However, this steroidal group has shown many of
precious bioactivities, especially anti-cancer.
Key words: Sinularia cruciata, sarcoaldesterol B, polyoxygenated steroid, soft coral, cancer.
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Bề mặt Trái Đất được bao phủ đến 3/4
diện tích bởi các đại dương rộng lớn, nơi
nuôi dưỡng và phát triển mạnh mẽ những
hệ sinh thái đa dạng về chủng loại và phong
phú về số lượng trong sinh quyển. Môi
trường sinh thái biển với đặc thù riêng tiềm
tàng những nguồn hợp chất chuyển hóa
phức tạp, đồng thời thể hiện nhiều hoạt tính
sinh học quý giá. Tuy nhiên, cho đến thời
điểm này, số loài sinh vật biển được nghiên
cứu vẫn rất khiêm tốn và còn nhiều đối
tượng tiềm năng nhưng chưa được khám
phá. San hô mềm chính là một trong số
những đối tượng như vậy. San hô mềm
phát triển rộng khắp tại nhiều nơi trên thế
giới. Ở Việt Nam, chúng phân bố nhiều ở các
đảo Cát Bà (Hải Phòng), Cồn Cỏ (Quảng Trị),
Nha Trang… San hô mềm tập trung ở độ sâu
từ 5 - 30 m và có 3 giống chiếm ưu thế nhất
trong quần thể rạn là Sinularia, Sarcophyton
và Lobophytum [3], [6].
Trong nghiên cứu của chúng tôi về thành
phần hoá học loài Sinularia cruciata, 4
hợp chất bao gồm 5,8-epidioxycholest-
6-en-3-ol, Cholesterol, 1-O-hexadecyl-
glycerol (Chimyl alcohol) và Glycerol
1-O-octadecyl ether (Batyl alcohol) đã
được thông báo [2]. Bài báo này tiếp tục
công bố quá trình chiết xuất và phân lập
2 hợp chất thuộc nhóm polyoxygenated
steroid từ phân đoạn ethyl acetat của
Sinularia cruciata.
2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Nguyên liệu là toàn thân San hô mềm – tên
khoa học Sinularia cruciata - họ Alcyoniidae.
Mẫu thu tại Khu bảo tồn biển Cồn Cỏ - Quảng
Trị vào tháng 5 năm 2011. Tên khoa học được
xác định bởi PGS.TS. Đỗ Công Thung – Viện
Tài nguyên Môi trường biển Hải Phòng. Mẫu
được rửa sạch, thái nhỏ, phơi sấy ở 50 – 60oC,
xay thành bột thô và bảo quản nơi khô thoáng.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp
Tạo dịch chiết toàn phần bằng phương
pháp ngâm và chiết siêu âm với máy Amsco
Reliance Sonic 550.
Chiết xuất phân đoạn bằng các phương
pháp chiết lỏng-lỏng, rắn-lỏng.
Phân lập các chất tinh khiết bằng sắc ký
cột silica gel pha thường (silica gel 60 0,040-
0,063mm (230-400 mesh ASTM), Merck);
silica gel pha đảo YMC (30-50 µm, FuJisilisa
Chemical Ltd.); Sephadex LH-20, sắc ký
lớp mỏng điều chế sử dụng bản mỏng tráng
sẵn silica gel 60G F254 (Merck). Theo dõi
các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng pha
thường, pha đảo (TLC-Silicagel 60 F254
Merck). Phát hiện vết chất bằng đèn tử ngoại
ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng
thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% phun đều
lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến
khi hiện màu [1].
Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập
59
Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Số 9
được dựa trên các phương pháp phổ bao
gồm: phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều
(1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều
(HMBC, HSQC); phổ khối lượng ESI-MS
[4]. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân đo trên
máy Bruker Avance AM500 FT-NMR tại
Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ
Việt Nam, chất chuẩn nội là tetramethyl
silan. Phổ khối lượng đo trên máy LC-
MSD-Trap-SL tại Viện Hóa học các hợp
chất thiên nhiên, Viện Khoa học và Công
nghệ Việt Nam.
2.2.2. Tiến hành
Bột San hô mềm (SHM) khối lượng 11,2 kg
được chiết siêu âm 3 đợt với methanol tuyệt
đối, mỗi đợt 3 lần, cách nhau 15 phút, mỗi
lần trong 1giờ ở 56oC. Dịch chiết thu được
đem cô quay hút chân không ở 56oC thành
cắn ở dạng cao đặc. Phân tán cắn trong
nước, sau đó lắc với các dung môi có độ
phân cực tăng dần là n-hexan, chloroform,
ethyl acetat và n-butanol. Cô quay cất thu
hồi các phân đoạn dung môi dưới áp suất
giảm được các cắn, ký hiệu theo thứ tự từ
SHM-A đến SHM-D, phần dịch nước còn
lại ký hiệu SHM-E. Tiến hành chiết pha rắn
cắn SHM-C với hệ dung môi chloroform :
aceton lần lượt với tỷ lệ 100:1, 50:1, 25:1,
10:1, 5:1, 1:1 và aceton 100%, thể tích 0,5
lít mỗi hệ, thu được 7 phân đoạn ký hiệu từ
C1 đến C7.
Phân đoạn C4 được triển khai trên sắc ký
cột pha đảo với hệ dung môi aceton : nước
(7,5:1). Theo dõi quá trình khai triển bằng
sắc ký lớp mỏng, các phân đoạn tương tự
nhau được gộp chung. Sau khi cô quay cất
loại dung môi được 5 phân đoạn ký hiệu lần
lượt từ C4A đến C4E. Phân đoạn C4D được
phân tích trên cột Sephadex LH-20 bằng
methanol 80 % (v/v, pha trong nước cất) lần
lượt thu được 6 phân đoạn ký hiệu từ C4D1
đến C4D6. Sắc ký cột pha thường được sử
dụng để phân tích C4D5 với hệ dung môi
rửa giải là chloroform : aceton : methanol
(12:8:0,5) cho các phân đoạn từ C4D5A đến
C4D5D. Tiếp tục phân tách C4D5B bằng
sắc ký cột pha đảo với hệ methanol : nước
(8:1) được 2 phân đoạn tương đối sạch là
C4D5B1 và C4D5B2. C4D5B1 được tinh
chế tiếp bằng sắc ký lớp mỏng điều chế
triển khai bằng hệ dung môi chloroform :
methanol: formic acid (5:1:0,1). Cắt rìa
bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch
H2SO4 10% trong ethanol, hơ nóng. Ghép
bản mỏng lại như cũ để xác định vùng chất,
sau đó cạo lớp silica gel tương ứng, giải hấp
phụ bằng methanol, thu được 7,6 mg chất,
ký hiệu C4D5B1 (1). Kiểm tra bằng sắc ký
lớp mỏng với 3 hệ dung môi là chloroform:
methanol (5:3), chloroform : aceton (2:3) và
ethyl acetat : methanol (8,5:3) cho thấy đây
là một chất sạch.
Phân đoạn C6 sau khi khai triển bằng
sắc ký cột pha thường với hệ ethyl acetat :
methanol : nước (5:1:0,5) thu được 6 phân
đoạn từ C6A đến C6F. C6B được phân tích
bằng sắc ký cột pha đảo bởi hệ methanol :
nước (6:1) cho 4 phân đoạn từ C6B1 đến
C6B4. Quá trình rửa giải C6B3 trên cột sắc
ký pha thường với hệ chloroform : methanol
(3:2) thu được 5 phân đoạn từ C6B3A đến
C6B3E. Trong đó, tại phân đoạn C6B3B
nhận thấy có các tinh thể hình kim màu
trắng xuất hiện. Lọc rửa tinh thể bằng nước
cất, hòa tan hoàn toàn trong hệ chloroform:
methanol (3:2) rồi cho dung môi bay hơi
để kết tinh tự nhiên. Quá trình trên được lặp
lại 2 lần, sau cùng thu được một hợp chất kết
tinh ký hiệu C6B3B (2), khối lượng 21,3 mg.
Kiểm tra trên sắc ký lớp mỏng với 3 hệ dung
môi khác nhau cho thấy đây là một hợp chất
tinh khiết.
3. KẾT QUẢ
3.1. Nhận dạng hợp chất C4D5B1 (1)
Hợp chất C4D5B1 có dạng chất bột màu
trắng. Công thức phân tử được xác định là
C28H50O4 bằng các dữ kiện phổ khối lượng
(positive ESI-MS: m/z 473,1 [M + Na]+, 433,1
[M - H2O + H]+, 415,1 [M - 2H2O + H]+, 397,1
[M - 3H2O + H]+).
Phổ 1H-NMR của C4D5B1 đặc trưng cho
60 Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Số 9
một hợp chất steroid. Trong đó, sự xuất hiện
của ba nhóm oximethin được khẳng định bởi
các tín hiệu cộng hưởng tại δ 3,84 (1H, m,
H-3), 3,46 (1H, br s, H-6) và 4,01 (1H, m,
H-11). Ngoài ra các tín hiệu cộng hưởng tại
δ 0,75 (3H, s, H-18), 1,29 (3H, s, H-19), 0,99
(3H, d, J = 7,0 Hz, H-21), 0,83 (3H, d, J = 7,0
Hz, H-26), 0,90 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-27) và
0,82 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-28) khẳng định sự
tồn tại của nhóm methyl và gợi ý cho cấu trúc
nhánh bên dạng ergosterol.
Phổ 13C-NMR của C4D5B1 xuất hiện các
tín hiệu đặc trưng cho một hợp chất steroid có
28 carbon. Trong đó sự xuất hiện tín hiệu của 6
nhóm methyl tại δ 13,40 (C-18), 17,56 (C-19),
19,39 (C-21), 18,12 (C-26), 20,96 (C-27) và
16,00 (C-28) khẳng định sự tồn tại của nhánh
bên dạng ergosterol. Ngoài ra, sự có mặt của
ba nhóm oximethin và một carbon bậc bốn nối
với nguyên tử oxy cũng được xác định bởi các
tín hiệu cộng hưởng tương ứng tại δ 69,43 (C-
3), 76,55 (C-6), 68,17 (C-11) và 77,45 (C-5).
Các tín hiệu carbon được gán với các tín hiệu
proton tương ứng thông qua phổ HSQC.
Như vậy có thể sơ bộ xác định, C4D5B1
là một steroid dạng ergosterol chứa 3 nhóm
oximethin và một carbon bậc bốn nối với
nguyên tử oxy. Nhóm β-hydroxyl tại vị trí C-3
dễ dàng được xác định qua tín hiệu proton đặc
trưng tại 3,84 (1H, m, H-3). Phổ cộng hưởng
từ hạt nhân hai chiều tương tác xa HMBC
được đo nhằm xác định vị trí của các nhóm
hydroxyl còn lại.
Tín hiệu tương tác HMBC từ proton H-19
sang C-5 khẳng định vị trí của nhóm hydroxyl
tại C-5. Nhóm hydroxyl C-6 được xác định
bởi các tín hiệu tương tác HMBC từ proton
của nó sang carbon C-5, C-8 và C-10. Cuối
cùng các tín hiệu tương tác từ proton H-12
sang C-11 và từ proton H-11 sang C-10 cho
biết vị trí của nhóm hydroxyl tại C-11.
Từ các phân tích nêu trên và sự phù hợp
hoàn toàn về số liệu phổ NMR của C4D5B1
với các số liệu đã được công bố [5], có thể
khẳng định cấu trúc hóa học của nó là ergosta-
3β,5α,6β,11α-tetraol hay còn được gọi là
sarcoaldesterol B.
OH
HO
OH
HO
1
35
9
10
11 13
17
18
19
20
21
24
25
26
27
28
7
Hình 1. Cấu trúc hóa học của C4D5B1(1)
3.2. Nhận dạng hợp chất C6B3B (2)
Hợp chất C6B3B có dạng tinh thể hình kim
màu trắng. Công thức phân tử được xác định
trùng với công thức phân tử của C4D5B1 bằng
các dữ kiện phổ khối lượng (positive ESI-MS:
m/z 473,1 [M + Na]+, 450,9 [M + H]+).
Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của C6B3B
tương tự như số liệu của C4D5B1. Tuy nhiên,
có sự thay đổi dễ nhận thấy là tín hiệu carbon
oximethin C-11 trong phân tử của C4D5B1
tại δ 68,17 đã bị dịch chuyển lên vùng trường
thấp tại δ 74,33 trong phân tử của C6B3B.
Điều này cho biết nhóm oximethin C-11 đã bị
thay đổi vị trí. Phổ HMBC được đo nhằm xác
định vị trí của nhóm hydroxyl này. Tín hiệu
tương tác HMBC giữa proton H-19 và carbon
C-1 (δ 74,33) cho phép khẳng định vị trí thế
của nhóm hydroxyl ở C-1.
Những phân tích đã nêu cùng với sự phù
hợp hoàn toàn về số liệu phổ NMR tại các vị
trí tương ứng của C6B3B so với các số liệu
đã công bố [10], cho phép khẳng định cấu
trúc hóa học của nó là ergosta-1β,3β,5α,6β-
tetraol.
OH
HO
OH
1
3 5
9
10
11 13
17
18
19
20
21
24
25
26
27
28
7
OH
Hình 2. Cấu trúc hóa học của C6B3B (2)
61
Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Số 9
4. BÀN LUẬN
Hai hợp chất đề tài phân lập được đều thuộc
nhóm polyoxygenated steroid. Đây là nhóm
hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học có giá trị.
Có thể kể đến các hoạt tính như: ức chế tổng
hợp cholesterol, ức chế enzym 5α-reductase,
khả năng điều hòa miễn dịch và đáng chú ý
nhất là tác dụng kháng tế bào khối u [8].
Các nghiên cứu về hợp chất thuộc nhóm
polyoxygenated steroid phân lập từ giống
Sinularia đã cho thấy hoạt tính kháng tế bào
ung thư chọn lọc trên dòng ung thư biểu mô
(KB) và kết tràng (HT-29) với các giá trị ED50
tương ứng rất thấp 1,9 và 1,5μg/ml [9]. Nghiên
cứu khác về những hợp chất thuộc nhóm này
đã chứng minh chúng khả năng ức chế mạnh
trên cả 3 dòng tế bào ung thư là ung thư máu
ở người (HL60), u sắc tố da ác tính (M14) và
tế bào ung thư vú (MCF7) với các giá trị EC50
có ý nghĩa (2,8; 4,3 và 4,9μg/ml) [7]. Điểm
đáng chú ý là khi hợp chất thuộc nhóm này
được thử tác dụng trên tế bào lympho người
bình thường ở máu ngoại vi (PBLs), kết quả
cho thấy độc tính đối với tế bào lympho là tối
thiểu, nghĩa là đã có sự tác dụng chọn lọc đối
với tế bào khối u [7].
Hợp chất ergosta-3β,5α,6β,11α-tetraol
(sarcoaldesterol B) (1) đã được phân lập từ
một số loài thuộc giống Sarcophyton [5], còn
ergosta-1β,3β,5α,6β-tetraol (2) cũng đã được
phân lập từ các loài San hô mềm Sarcophyton
glaucum và Lobophytum pauciflorum [10].
Tuy nhiên đây là lần đầu tiên chúng được
phân lập từ loài San hô mềm Sinularia
cruciata Tixier-Durivault thu thập tại vùng
biển Việt Nam. Hiện tại chưa có báo cáo nào
về tác dụng sinh học của hai hợp chất này. Tuy
nhiên, qua vài dẫn chứng trong số rất nhiều
nghiên cứu được công bố, có thể thấy rằng
polyoxygenated steroid là một nhóm hợp chất
đầy triển vọng trong việc tìm kiếm các loại
thuốc mới, đặc biệt là thuốc điều trị ung thư
hiệu quả và an toàn cho người sử dụng. Cùng
với các thành phần đã phân lập trong công bố
trước đây [2], có thể thấy San hô mềm nói
chung và loài Sinularia cruciata nói riêng
chứa đựng nguồn hợp chất chuyển hóa phong
phú và có giá trị, cần được nghiên cứu sâu hơn
trong thời gian tiếp theo.
5. KẾT LUẬN
Từ loài San hô mềm Sinularia cruciata -
Alcyoniidae, thu mẫu tại Khu bảo tồn biển
Cồn Cỏ - Quảng Trị, đã phân lập được 2 hợp
chất trong phân đoạn ethyl acetat bằng các
phương pháp sắc ký kết hợp. Cấu trúc của
chúng được xác định là ergosta-3β,5α,6β,11α-
tetraol (còn gọi là sarcoaldesterol B) (1) và
ergosta-1β,3β,5α,6β-tetraol (2).
Lời cảm ơn: Công trình nghiên cứu này
được hoàn thành với sự giúp đỡ của PGS.TS.
Phan Văn Kiệm và các đồng nghiệp tại Viện
Hóa Sinh Biển - Viện Khoa học và Công nghệ
Việt Nam - 18 Hoàng Quốc Việt - Hà Nội.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985),
Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc,
Nxb. Y học, Thành phố Hồ Chí Minh, tr.
19-23, 43-52, 58-74.
2. Võ Quốc Hùng, Đoàn Nguyễn Phương Nhi,
Nguyễn Đình Quỳnh Phú, Hồ Thị Diệu
Trâm, Nguyễn Thị Hoài (2012), Nghiên cứu
thành phần hoá học có hoạt tính chống ung
thư từ loài San hô mềm Sinularia cruciata –
Họ Alcyoniidae, Tạp chí Y học Thực hành,
818-819, 7-11.
3. Châu Văn Minh (2006), “Nghiên cứu khả
năng khai thác và sử dụng nguồn dược liệu
biển Việt Nam”, Tuyển tập các kết quả chủ
yếu của chương trình “Điều tra cơ bản và
nghiên cứu ứng dụng công nghệ biển”,
Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, tr.
176-293.
4. Trần Văn Sung (2002), Phổ cộng hưởng từ
hạt nhân trong hoá hữu cơ, Nxb. Đại học
Quốc gia, Hà Nội, tập 1.
5. Akemi Umeyama, Noboru Shoji, Mai
Ozeki, Shigenobu Arihara (1996),
“Sarcoaldesterols A and B, Two New