ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC
====== ======
NGUYỄN THỊ HUÊ
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
CITRAL TRONG TINH DẦU SẢ CHANH BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG
CAO GHÉP ĐẦU DÒ DÃY DIOD
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH DƯỢC HỌC
HÀ NỘI - 2019
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC ====== ======
NGUYỄN THỊ HUÊ
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
CITRAL TRONG TINH DẦU SẢ CHANH BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG
CAO GHÉP ĐẦU DÒ DÃY DIOD
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH DƯỢC HỌC
KHOÁ: QHY.2014
NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. NGUYỄN THỊ THANH BÌNH
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
HÀ NỘI - 2019
LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới Tiến sĩ Nguyễn Thị Thanh Bình – Bộ môn Hoá Dược và Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, là người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này.
Tôi xin cảm ơn các thầy trong bộ Bộ môn Hoá Dược và Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, đã tạo điều kiện để tôi có thể thực hiện khóa luận này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban Chủ nhiệm, các Phòng ban Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội cùng toàn thể các thầy cô giáo trong Khoa đã cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt những năm học tập, sinh hoạt và rèn luyện tại Khoa.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh, động viên tôi trong lúc khó khăn cũng như trong quá trình thực hiện khóa luận này.
Hà Nội, tháng 05 năm 2019
Sinh viên
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Nguyễn Thị Huê
CHỮ VIẾT TẮT
Acetonitril ACN
Dược điển Anh Quốc (British Pharmacopoeia) BP
Máy đo quang (Diode Array Detector) DAD
Dược điển châu Âu (European pharmacopoeia) EP
Sắc ký khí (Gas Chromatography) GC
HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High - performance liquid chromatography)
ICH
Hội nghị quốc tế về hài hoà hoá các thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng cho con người (International conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human use)
LOD Giới hạn phát hiện (Limit of detection)
Giới hạn định lượng (Limit of quantitation) LOQ
Phương pháp khối phổ (Phương pháp khối phổ) MS
Quang phổ cận hồng ngoại NIR
Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation) RSD
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Dược điển Hoa Kỳ (United States Pharmacopoeia) USP
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN .......................................................................... 2
1.1. Giới thiệu chung về cây sả chanh .............................................................. 2
1.2. Giới thiệu chung về citral ........................................................................... 4
1.2.1. Nguồn gốc ............................................................................................... 4
1.2.2. Cấu trúc và tính chất ............................................................................... 5
1.2.3. Công dụng ............................................................................................... 5
1.2.4. Các phương pháp định lượng citral ......................................................... 6
1.3. Thẩm định quy trình phân tích ................................................................... 9
1.3.1. Tính đặc hiệu ........................................................................................... 9
1.3.2. Miền giá trị ............................................................................................ 10
1.3.3. Tính tuyến tính ...................................................................................... 10
1.3.4. Giới hạn phát hiện ................................................................................. 11
1.3.5. Giới hạn định lượng .............................................................................. 11
1.3.6. Độ đúng ................................................................................................. 12
1.3.7. Độ chính xác ......................................................................................... 13
CHƯƠNG 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................... 14
2.1. Nguyên vật liệu, trang thiết bị .................................................................. 14
2.1.1. Dung môi, hoá chất ............................................................................... 14
2.1.2. Trang thiết bị ......................................................................................... 14
2.2. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................... 14
2.2.1. Tối ưu hoá điều kiện sắc ký .................................................................. 14
2.2.2. Thẩm định tính đặc hiệu ........................................................................ 15
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
2.2.3. Thẩm định tính tuyến tính và xác định miền giá trị .............................. 15
2.2.4. Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ............................. 15
2.2.5. Thẩm định độ đúng ............................................................................... 15
2.2.6. Thẩm định độ chính xác ........................................................................ 15
2.2.7. Định lượng citral trong tinh dầu sả chanh ............................................. 16
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................ 17
3.1. Xác định điều kiện phân tích .................................................................... 17
3.1.1. Khảo sát các hệ dung môi .................................................................... 17
3.1.2. Xác định bước sóng hấp thụ .................................................................. 19
3.1.3. Điều kiện sắc ký .................................................................................... 20
3.2 . Tính đặc hiệu ........................................................................................... 21
3.3. Tính tuyến tính và miền giá trị ................................................................. 23
3.3.1. Đối với đồng phân neral ........................................................................ 23
3.3.2. Đối với đồng phân geranial ................................................................... 24
3.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng .............................................. 26
3.5. Độ đúng .................................................................................................... 26
3.5.1. Đối với đồng phân neral ........................................................................ 26
7.5.2. Đối với đồng phân geranial ................................................................... 27
3.6. Độ lặp lại .................................................................................................. 27
3.6.1. Đối với đồng phân neral ........................................................................ 28
3.6.2. Đối với đồng phân geranial ................................................................... 29
3.7. Độ chính xác trung gian ........................................................................... 29
3.7.1. Đối với đồng phân neral ........................................................................ 30
3.7.2. Đối với đồng phân geranial ................................................................... 31
3.8. Định lượng citral trong một số mẫu tinh dầu sả chanh ............................ 31
3.8.1. Sản phẩm A ........................................................................................... 31
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
3.8.2. Sản phẩm B ........................................................................................... 32
3.8.3. Sản phẩm C ........................................................................................... 33
3.8. Bàn luận .................................................................................................... 35
CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................. 38
4.1. Kết luận .................................................................................................... 38
4.2. Kiến nghị .................................................................................................. 39
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Neral (A) và Geranial (B) 5
Hình 3.1. Sắc ký đồ của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml tại bước 17 sóng 233 nm, hệ dung môi ACN : H2O = 70 : 30 (v/v/v)
Hình 3.2. Sắc ký đồ của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml tại bước sóng phát hiện 233 nm với hệ dung môi ACN : MeOH : H2O = 47 : 18 10 : 43 (v/v/v)
Hình 3.3. Phổ hấp thụ UV-VIS của Neral (A) và Geranial (B) 19
Hình 3.4. Sắc ký đồ của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml trong điều 20 kiện sắc ký được lựa chọn
Hình 3.5. Phổ hấp thụ cực đại UV-VIS của geraniol 21
Hình 3.6. Sắc ký đồ của dung dịch chứa 20 µg/ml citral và 5 µg/ml geraniol 21 tại bước sóng phát hiện 200 nm
Hình 3.7. Sắc ký đồ của dung dịch chứa 20 µg/ml citral và 5 µg/ml geraniol 22 tại bước sóng phát hiện 242 nm
Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn sự tương quang giữa nồng độ dung dịch và diện 24 tích pic của đồng phân neral
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn sự tương quang giữa nồng độ dung dịch và diện 25 tích pic của đồng phân geranial
Hình 3.10. Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp đối với đồng phân 28 neral
Hình 3.11. Sắc ký đồ dung dịch mẫu A nồng độ 100 µg/ml 32
Hình 3.12. Sắc ký đồ dung dịch mẫu B nồng độ 100 µg/ml 33
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Hình 3.13. Sắc ký đồ dung dịch mẫu C nồng độ 50 µg/ml 34
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Tên gọi cây sả chanh tại một số nước 2
Bảng 1.2. Hàm lượng citral trong một số loại tinh dầu 4
Bảng 3.1. Thông số pic của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml tại bước sóng phát hiện 233 nm với hệ dung môi ACN : H2O = 70 : 30 (v/v) 18
Bảng 3.2. Thông số pic của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml tại bước sóng phát hiện 233 nm với hệ dung môi ACN : MeOH : H2O = 47 : 19 10 : 43 (v/v/v)
Bảng 3.3. Thông số các pic của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml
trong điều kiện sắc ký được lựa chọn 20
Bảng 3.4. Thông số các pic của dung dịch citral 20 µg/ml và dung dịch geraniol 5 µg/ml tại bước sóng phát hiện 200 nm 22
Bảng 3.5. Kết quả phân tích hồi quy mối tương quan giữa nồng độ dung dịch 23 và diện tích pic của đồng phân neral
Bảng 3.6. Kết quả phân tích hồi quy mối tương quan giữa nồng độ dung dịch 25 và diện tích pic của đồng phân geranial
Bảng 3.7. Kết quả xác định tỷ lệ phục hồi của đồng phân neral 26
Bảng 3.8. Kết quả xác định tỷ lệ phục hồi của đồng phân geranial 27
Bảng 3.9. Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp đối với đồng phân
geranial 29
Bảng 3.10. Kết quả xác định độ chính xác trung gian của phương pháp đối với 30 đồng phân neral
Bảng 3.11. So sánh một số phương pháp định lượng citral 35
Bảng 4.1. Các yêu cầu đảm bảo quy trình định lượng đối với neral 38
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Bảng 4.2. Các yêu cầu đảm bảo quy trình định lượng đối với geranial 39
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
MỞ ĐẦU
Sả chanh (Cymbopogon citratus) còn được gọi là cỏ sả, lá sả, hương mao, thuộc họ Lúa có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới. Cây cao khoảng 1,5 m sống lâu năm mọc thành bụi, phân nhánh nhiều. Sả không những được sử dụng làm gia vị trong chế biến các món ăn mà còn được sử dụng ở nhiều nước trên thế giới [16]. Tại Việt Nam, cây sả chanh dễ trồng, thích hợp với nhiều loại đất ở các vùng trung du, miền núi và mang lại hiệu quả kinh tế cao.
Tinh dầu sả chanh được các nhà khoa học quan tâm bởi khả năng ức chế hoạt động sống của một số nhóm vi sinh vật gây bệnh và hoạt tính dược lý của nó. Priyanka Singh và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của tinh dầu sả chanh đến sự phát triển và khả năng sản sinh độc tố của Aspergillus flavus. Kết quả cho thấy tinh dầu sả chanh ức chế hoàn toàn sự phát triển của nấm mốc A. flavus [38] và ức chế sự hình thành của các biofilm gây nên bởi Candida albicans, Listeria monocytogenes (biofilm là nguyên nhân chính gây nhiễm khuẩn trong công nghiệp sản xuất thực phẩm bởi chúng rất khó bị loại trừ trong quá trình vệ sinh hệ thống trang thiết bị) [21,27]. Một số công trình nghiên cứu về thành phần tinh dầu sả chanh (Cymbopogon citratus) cho thấy thành phần chính của tinh dầu sả chanh là citral, bao gồm hai đồng phân geranial (citral-A) và neral (citral-B) [6].
Tại Việt Nam, tinh dầu sả chanh khá phổ biến trên thị trường nhưng chất lượng chưa được kiểm soát chặt chẽ. Nhằm kiểm soát chất lượng của tinh dầu sả chanh, chúng tôi tiến hành xây dựng quy trình định lượng citral trong tinh dầu sả chanh bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò dãy diod theo hướng dẫn của Hội nghị quốc tế về hài hoà hoá các thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng cho con người (International conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human use) và ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng citral trong một số sản phẩm thương mại.
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
1
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu chung về cây sả chanh
Cây sả chanh tên khoa học là Cymbopogon citratus, thuộc họ Poaceae, là một loại thảo dược ở vùng nhiệt đới và có nguồn gốc từ Ấn Độ và Sri Lanka [32]. Loài cây này được sử dụng ở nhiều nước trên thế giới với nhiều tên gọi khác nhau (bảng 1.1).
Bảng 1.1. Tên gọi cây sả chanh tại một số nước [45]
Đất nước Tên gọi
English Lemon grass, Citronella
Middle Eastern ( Arabic) شِيشَة اللَيشُِون ( Hashisha al-limun)
Chinese 草薑(Chou geung)
風茅(Fung maauh)
草薑(Chou geung)
風茅(Fung maauh)
檸檬草(Nihng mung chou)
Malaysia Serai, Serai dapur
Dutch Citroengras, Sereh
French Verveine des Indes
German Zitronengras, Citronella, Lemongras
Greek Λεμονόχορτο (Lemonochorto )
Κιτρονέλλα (Kitronella) (Cymbopogon
nardus
2
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Hebrew עשב לימון (Essef limon)
לימון גראס (Limonit rehanit)
India (Hindi) Sera, Verveine
Italian Cimbopogone
Russian Лимонное сорго(Limonnoe sorgo)
Лимонная трава(Limmonaya trava)
Spanish
Zacate de limón, Te de limón, Caña de
Limón, Citronella, Hierba de Limón
Japanese レモングラス(Remonso)
レモンソウ(Remonguraso
Turkish Limon out
Vietnamese Sả chanh, Sả (Sa chanh, Sa)
Cây được trồng rộng rãi ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và thích hợp với khí hậu ẩm ướt trong điều kiện đầy đủ ánh nắng mặt trời. Trong điều kiện được hỗ trợ, cây sẽ chịu đựng được các loại khí hậu khác. Tuy nhiên, ở khu vực ôn đới, cây không sống được vào mùa đông vì rễ bị đóng băng [49]. Loại cây nhiệt đới này phát triển nhanh thành cụm dày đặc, có thể đạt chiều cao 180 cm và chiều rộng khoảng 120 cm. Lá rộng khoảng 3 cm, dài khoảng 90 cm, đầu lá nhọn rủ xuống và có màu xanh hơi sáng [50]. Cây sả chanh có lẽ được biết đến nhiều nhất vì sự xuất hiện trong ẩm thực Thái Lan và Việt Nam. Sả chanh cũng được sử dụng trong các loại trà thảo dược và đồ uống không cồn khác, trong các món nướng và trong bánh kẹo. Sả chanh từ lâu đã được sử dụng trong y học cổ truyền Ấn Độ như một loại thuốc để hạ sốt, làm giảm ợ hơi trong đường tiêu hóa, chống nhiễm trùng và chống côn trùng rất hiệu quả [39]. Tinh dầu chiết xuất từ sả chanh được sử dụng rộng rãi như một hương thơm trong nước hoa và mỹ phẩm vì có đặc tính khử mùi tốt. Trong liệu pháp mùi hương, tinh dầu sả chanh được sử dụng như một chất chống trầm cảm, làm dịu cơn đau nhức và giảm căng thẳng [39].
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
3
Tinh dầu sả chanh có thành phần chính là citral. Chất lượng của tinh dầu sả chanh được xác định bởi hàm lượng citral, mùi thơm của tinh dầu sả chanh do thành phần aldehyd quyết định [34]. Trong tinh dầu sả chanh, đồng phân trans geranial (40 đến 62%) chiếm ưu thế so với đồng phân cis neral (25 đến 38%) [37].
1.2. Giới thiệu chung về citral
1.2.1. Nguồn gốc
Citral là thành phần chính của một số loại tinh dầu (bảng 1.2) [15,25,30].
Bảng 1.2. Hàm lượng citral trong một số loại tinh dầu
Loại tinh dầu Hàm lượng citral (%)
Backhousia citriodora 90-98
Litsea citrata 90
Litsea cubeba 70-85
Cymbopogon citratus 65-85
Leptospermum liversidgei 70-80
Ocimum gratissimum 66,5
Lindera citriodora 65
Calypranthes parriculata 62
Petitgrain 36
Eucalyptus staigeriana 26
Aloysia citriodora 30-35
Melissa officinalis 11
4
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Citral là một aldehyd có công thức C10H16O được phân lập lần đầu tiên bởi Bertram [8] từ tinh dầu Backhousia citriodora. Năm 1890, Dodge phân lập được citral từ tinh dầu sả chanh [12]. Sau đó, Tiemann và các cộng sự [23] phân lập được đồng thời hai đồng phân geranial (citral A) và neral (citral B)
của citral. Citral A dễ dàng tách khỏi citral B bằng phương pháp bisulphate natri được đề xuất bởi Tiemann [44].
1.2.2. Cấu trúc và tính chất
Citral có danh pháp quốc tế là 3,7-dimethyl-2,6-octadienal, khối lượng mol phân tử là 152,237 g/mol. Citral có số CAS là 5392-40-5, mã Pubchem là 638011 [51].
Citral là một chất lỏng màu vàng nhạt, có mùi chanh mạnh. Citral hòa tan trong nước rất kém (độ hòa tan trong nước là 0,059 g/100ml ở 250C); hòa tan được trong rượu (độ hòa tan trong rượu là 1 ml trong 7ml cồn 70%); đồng tan trong benzen benzoat, diethyl phthalate, glycerin, propylene glycol, dầu khoáng, dầu cố định và cồn 95%. Citral có khối lượng riêng 0.9 g/cm³ và nhiệt độ sôi ở 229 °C (502 K; 444 °F) [51].
Citral là hỗn hợp của hai đồng phần hình học monoterpene aldehyd có cùng công thức phân tử là C10H16O. Hai đồng phân này có tên gọi lần lượt là neral (Cis hay Z) và geranial (Trans hay E) cùng thể hiện tính chất vật lí gần giống nhau.
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Neral (A) và Geranial (B)
1.2.3. Công dụng
Geranial có mùi chanh mạnh. Mùi chanh của neral ít nồng hơn, nhưng ngọt hơn. Do đó Citral là một hợp chất hương thơm được sử dụng trong nước hoa để tạo mùi hương của họ cam quýt. Citral cũng được sử dụng như một hương liệu và làm tăng thêm mùi hương của tinh dầu sả chanh.
Citral cho thấy hoạt động kháng khuẩn đáng kể chống lại vi khuẩn Gram dương và Gram âm cũng như nấm do tinh dầu có tính chất kỵ nước, có thể tấn công và phá vỡ màng tế bào, gây ảnh hưởng đến hệ thống enzym dẫn đến ức chế hô hấp và gây chết tế bào. Do đó, citral được sử dụng như một
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
5
chất bảo quản trong các ngành công nghiệp thực phẩm, xà phòng và mỹ phẩm [30].
Mặc dù citral trong tinh dầu sả chanh có khả năng xua đuổi côn trùng, tuy nhiên tinh dầu sả chanh lại có tác dụng hấp dẫn và được sử dụng như "mồi nhử" để thu hút ong mật. Vì một trong những chất pheromone từ ong chúa tiết ra giống như mùi của tinh dầu sả chanh. Do đó trong kỹ thuật nuôi ong mật người ta dùng tinh dầu sả chanh như chất gọi đàn khi đàn ong mới được chuyển vùng [24,33].
Citral còn được dùng để tổng hợp vitamin A, ionone và methylionone.
Citral đã được thử nghiệm lâm sàng rộng rãi, không gây biến đổi gen
hay gây ung thư [40].
1.2.4. Các phương pháp định lượng citral
Phương pháp chuẩn độ (theo dược điển Anh)
Tiến hành lấy 25 mẫu tinh dầu sả chanh nguyên chất và trộn mỗi mẫu với ethanol tuyệt đối. Sau đó, thêm vào hỗn hợp trên dung dịch hydroxylamine hydrochloride và dung dịch xanh promophenol. Thêm axit clohydric, hiệu chỉnh lượng axit clohydric theo phản ứng của hydroxylamine với citral. Axit clohydric đã phản ứng được chuẩn độ từ từ với dung dịch kali hydroxit etanolic chuẩn cho đến khi màu 19 chuyển từ màu vàng sang màu xanh ô liu. Hàm lượng citral được tìm thấy trong mẫu tinh dầu sả chanh là 69,89-76,95%.
Phương pháp quang phổ cận hồng ngoại
6
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Phương pháp quang phổ cận hồng ngoại được Wilson và các cộng sự xây dựng để xác định hàm lượng citral trong tinh dầu sả chanh vào năm 2002 [17]. Phương pháp quang phổ cận hồng ngoại dựa trên sự hấp thụ bức xạ điện tử ở các bước sóng trong phạm vi 750 – 2500 nm: Khi có một chùm ánh sáng tới chiếu qua các mẫu, vùng ánh sáng cận hồng ngoại (bước sóng 750 – 2500 nm) được các liên kết C-H, N-H, O-H có trong các chất hữu cơ hấp phụ. Ghi nhận phổ ánh sáng phản xạ từ các mẫu sẽ thu được các thông tin về thành phần hóa học của mẫu đó. Phổ thu được sẽ được phân tích bằng phần mềm
máy tính. Áp dụng mô hình thống kê nhiều biến sẽ mô tả được mối quan hệ giữa phổ hấp phụ và thành phần hóa học; mối quan hệ này là cơ sở để xác định thành phần hóa học tại các máy phân tích (máy NIR) [46].
Các tác giả tiến hành lấy 26 mẫu tinh dầu sả chanh và quét phổ trong khoảng 1100-2500 nm trên máy Foss NIR- System 6500 Rapid Content Sample. Mỗi mẫu thu lấy 3 phổ (mỗi phổ là trung bình của 32 lần quét). Quang phổ sau đó được tính trung bình bằng phần mềm NSAS phiên bản 3.52. Kết quả thu được hàm lượng citral trung bình trong mẫu tinh dầu sả chanh là 75,77% (w/w) có độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của độ chính xác trung gian là 1,00% và RSD của độ đúng là 0,23% [46].
Tham chiếu với phương pháp định lượng citral trong tinh dầu sả chanh quy định trong Dược điển Anh, phương pháp NIR có độ chính xác tương đương. Tuy nhiên, phương pháp NIR có ưu điểm hơn so với phương pháp của Dược điển Anh là thực hiện đơn giản hơn, không cần xử lý mẫu và thời gian định lượng nhanh hơn [46].
Phương pháp sắc ký khí
Phương pháp được Gaonkar và các cộng sự [49] xây dựng để định lượng đồng thời 2 đồng phân hình học của citral có trong mẫu tinh dầu sả chanh. Phân tích được thực hiện trên máy Agilent technologies 5975 Inert Mass Selective Detector GC–MS. Sử dụng cột sắc ký HP-5MS với chiều dài 30 mm, đường kính trong (ID) = 0,25 mm, lớp phim mỏng 0,25 µm. Heli được sử dụng làm khí mang với tốc độ dòng 1ml/phút. Nhiệt độ buồng bơm mẫu 250oC. Nhiệt độ bộ phận phát hiện 260oC. Chương trình nhiệt độ buồng điều nhiệt: duy trình nhiệt độ 75oC trong 2 phút, tăng 4oC/phút cho đến 250oC, dừng ở nhiệt độ này trong 10 phút. Kết quả thu được hàm lượng citral trong mẫu tinh dầu sả chanh là 72,57%.
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ là tuỳ thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng. Khi phân tích
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
7
sắc ký, các chất được hòa tan trong dung môi thích hợp và hầu hết sự phân tách đều xảy ra ở nhiệt độ thường. Chính vì thế mà các chất không bền với nhiệt không bị phân hủy khi sắc ký [3,11,22,29].
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha thuận
Phương pháp được Rauber và các cộng sự [50] xây dựng để xác định hàm lượng citral có trong tinh dầu sả chanh. Phân tích sử dụng pha động là n- hexane : ethanol (85:15, v/v) với tốc độ dòng 0,3 ml/phút, ghép với đầu dò UV được cài đặt ở bước sóng 233nm để phát hiện citral. Phương pháp sử dụng cột pha thuận CN. Kết quả thực nghiệm cho thấy, thời gian lưu của citral là 13,8 phút. Trong khoảng nồng độ tiến hành có sự tương quan chặt chẽ với độ lệch chuẩn se slopes là 1,78 và hệ số xác định R2 = 0,9991. Phương pháp đảm bảo tính đặc hiệu với citral, có độ đúng và độ chính xác tốt với tỷ lệ phục hồi ≤ 100 ± 2%, RSD của độ lặp lại ≤ 1,37%.
Ứng dụng phương pháp trên, xác định được hàm lượng citral trong mẫu
tinh dầu sả chanh là 75,20%.
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Phương pháp được Gaonkar và các cộng sự [49] xây dựng để định lượng đồng thời 2 đồng phân hình học của citral có trong một số mẫu tinh dầu. Phân tích sử dụng cột silicagel pha đảo Enable C - 18G (250 × 4,6 mm, 5 µ), pha động là acetonitril : nước (70: 30, v/v) với tốc độ dòng 1 ml/phút; ghép với đầu dò DAD được đặt ở bước sóng 233nm để phát hiện citral. Nhiệt độ cột 22oC, đầu dò có nhiệt độ 40oC và độ rộng khe 1,2 nm. Kết quả thực nghiệm cho thấy, thời gian lưu của neral và geranial tương ứng là 7,246 phút và 7,680 phút. Trong khoảng nồng độ citral từ 3 – 100 µg/ml, có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic y (mAU.min) và nồng độ dung dịch x (µg/ml) theo phương trình đối với đồng phân neral là y = 230540x – 100165 (hệ số xác định R2 = 0,9996), phương trình đối với đồng phân geranial là y = 260014x + 23521 (hệ số xác định R2 = 0,9964). Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) đối với đồng phân neral lần lượt là 0,062 µg/ml và 0,205 µg/ml, đối với đồng phân geranial lần lượt là 0,059 µg/ml và 0,198 µg/ml. Phương pháp đảm bảo tính đặc hiệu với citral, có độ 8
đúng và độ chính xác tốt với tỷ lệ phục hồi ≤ 100 ± 2%, RSD của độ lặp lại ≤ 1,74%, RSD của độ chính xác trung gian ≤ 1,93%.
Ứng dụng phương pháp để định lượng citral có trong tinh dầu của cây sả chanh, tinh dầu lá chanh ta và tinh dầu vỏ quả chanh tây. Kết quả xác định được hàm lượng citral trong mẫu tinh dầu sả chanh là 74,98%, trong mẫu tinh dầu lá chanh ta là 2.09% và trong mẫu tinh dầu từ vỏ quả chanh tây là 0,3%.
1.3. Thẩm định quy trình phân tích
(International
Theo tài liệu “Thẩm định quy trình phân tích: nội dung và phương pháp”(Validation of analytical procedures: text and methodology) của ICH conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human use) ban hành vào tháng 11 năm 2005 [43], các yếu tố của một quy trình phân tích định lượng cần thẩm định gồm: độ đúng, độ chính xác, tính đặc hiệu, tính tuyến tính và miền giá trị. LOD và LOQ là các thông số không bắt buộc phải có trong quy trình thẩm định.
1.3.1. Tính đặc hiệu
Phương pháp HPLC được coi là chọn lọc đối với chất phân tích nếu:
- Sắc ký đồ các mẫu thử cho pic có thời gian lưu khác nhau không có
ý nghĩa thống kê với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ mẫu chuẩn.
- Sắc ký đồ các mẫu trắng, mẫu nền không xuất hiện pic ở trong
khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu chất chuẩn [1,2,14,43].
Phương pháp xác định
Trong phương pháp HPLC với đầu dò DAD hoặc khối phổ, việc sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết của pic sẽ giúp tránh nhầm lẫn với các hợp chất có cấu trúc tương tự và chứng minh sắc ký không phải là pic của hai thành phần trở lên.
Khi chế phẩm chưa xác định có sản phẩm phân huỷ hay không thì tự tạo ra mẫu có sản phẩm phân huỷ và so sánh với một mẫu không có sản phẩm phân huỷ.
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
9
1.3.2. Miền giá trị
Khái niệm
Miền giá trị của một quy trình phân tích là khoảng giữa nồng độ cao và nồng độ thấp nhất của chất cần phân tích có trong mẫu thử với bất kì nồng độ nào trong khoảng này đều phải đáp ứng về độ chính xác lẫn độ đúng và tính chất tuyến tính của phương pháp [1,2,14,43].
Phương pháp xác định
- Khảo sát và đánh giá tính tuyến tính của một khoảng nồng độ nhất
định.
- Sau đó thiết lập bằng cách khẳng định là khoảng này có đáp ứng độ
tuyến tính có thể chấp nhận, độ đúng, độ lặp lại hay không.
Yêu cầu
Với quy trình định lượng nguyên liệu và thuốc, yêu cầu tối thiểu của
miền giá trị là phải đạt 80% - 120% nồng độ của mẫu thử [1,2,14,43].
1.3.3. Tính tuyến tính
Khái niệm
Tính tuyến tính của quy trình phân tích là khả năng luận ra các kết quả của phương pháp dựa vào đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ đáp ứng của đại lượng đo được như chiều cao hoặc diện tích pic (y) và nồng độ (x).
Tính tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax+b với
hệ số tương quan tuyến tính R2 [1,2,14,43].
Phương pháp xác định
- Khảo sát ở ít nhất 5 [43] hoặc 6 [14] mức nồng độ khác nhau. - Nồng độ cao nhất và thấp nhất phải nằm trong khoảng xác định của
phương pháp.
10
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
- Các mẫu được pha loãng từ mẫu chuẩn ban đầu. - Đánh giá tính tuyến tính bằng các phương pháp thống kê thích hợp: trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa các hệ số a, b; trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp của phương trình.
Yêu cầu
Hệ số hồi quy tuyến tính: 0,99 ≤ R2 ≤ 1 [1, 2].
1.3.4. Giới hạn phát hiện
Khái niệm
Giới hạn phát hiện của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể phát hiện được và không cần phải xác định chính xác hàm lượng [1,2,14,43].
Phương pháp xác định
- Pha loãng nồng độ đến mức tín hiệu nhỏ nhất: LOD được xác định bằng cách phân tích mẫu có hàm lượng biết trước và thiết lập mức nồng độ nhỏ nhất nào đó còn có thể phát hiện bằng quy trình phân tích đang thực hiện. - Lập tỷ số phát hiện của mẫu trắng và mẫu thử: Áp dụng cho phương pháp có sử dụng thiết bị và có hiện tượng nhiễu đường nền. Giả sử tín hiệu thu được từ mẫu trắng là N, tín hiệu thu được từ mẫu chuẩn là S. LOD là nồng độ mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị 2 - 3.
- Phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn và độ dốc:
Trong đó: a là độ dốc của đường chuẩn định lượng
SD độ lệch chuẩn của độ đáp ứng.
SD được tính bằng hai cách: dựa vào độ lệch chuẩn của mẫu trắng hoặc
dựa vào đường chuẩn định lượng.
1.3.5. Giới hạn định lượng
Khái niệm
Giới hạn định lượng (LOQ) của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể định lượng với độ đúng và độ chính xác phù hợp [1,2,14,43].
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
11
Phương pháp xác định
- Pha loãng nồng độ đến mức tín hiệu vẫn đáp ứng độ đúng và độ chính xác: giới hạn phát hiện được xác định bằng cách phân tích mẫu có hàm lượng biết trước và thiết lập mức nồng độ nhỏ nhất mà khi đó tiến hành bằng quy trình phân tích đang thẩm định vẫn đáp ứng độ đúng và độ chính xác chấp nhận.
- Lập tỷ số phát hiện của mẫu trắng và mẫu thử: áp dụng cho phương pháp có sử dụng thiết bị và có hiện tượng nhiễu đường nền. Giả sử tín hiệu thu được từ mẫu trắng là N, tín hiệu thu được từ mẫu chuẩn là S. LOQ là nồng độ mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị khoảng 10.
- Phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn và độ dốc:
Trong đó: a là độ dốc của đường chuẩn
độ SD độ lệch chuẩn của độ đáp ứng.
SD được tính bằng hai cách: dựa vào độ lệch chuẩn của mẫu trắng hoặc
dựa vào đường cong chuẩn độ.
1.3.6. Độ đúng
Khái niệm
Độ đúng của một quy trình phân tích là mức độ sát gần của các giá trị tìm thấy so với giá trị thực, khi áp dụng quy trình đề xuất trên cùng với một mẫu thử dã được làm đồng nhất trong cùng một điều kiện xác định [1,2,10,42].
Phương pháp xác định
Độ đúng được thực hiện bằng cách tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần mẫu thử ở tối thiểu ba nồng độ của miền giá trị trong quy trình phân tích (3 lần phân tích/nồng độ × 3 nồng độ khác nhau).
Đại lượng đặc trưng cho độ đúng là tỷ lệ phục hồi được xác định theo
12
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
công thức sau:
𝑋
µ
Tỉ lệ phục hồi = × 100%
Trong đó: là giá trị mẫu đo được
µ là giá trị mẫu theo lý thuyết.
Yêu cầu
Tỷ lệ phục hồi được chấp thuận dựa vào mẫu phân tích, quy trình xử lý mẫu và nồng độ phân tích. Trong các định lượng thường quy, tỷ lệ phục hồi thường được chấp thuận với giá trị 100 ± 2% [1,2]. Tỷ lệ phục hồi càng gần giá trị 100% quy trình có độ đúng càng cao.
1.3.7. Độ chính xác
Khái niệm
Độ chính xác của phương pháp là mức độ sát gần giữa các kết quả thử riêng biệt so với giá trị trung bình thu được khi áp dụng phương pháp đề xuất cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng một điều kiện [1,2,14,43].
Phương pháp xác định
Độ lặp lại: tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần mẫu thử trong miền giá trị của quy trình phân tích (3 lần phân tích/ nồng độ × 3 nồng độ) hoặc định lượng tối thiểu 6 lần ở nồng độ 100%.
Độ chính xác trung gian: tuỳ thuộc vào từng trường hợp cụ thể. Phân tích nhiều lần, nhiều mẫu với các yếu tố như thời gian, địa điểm, hệ thống máy thay đổi.
Yêu cầu
Tiêu chuẩn cho giá trị RSD phụ thuộc nhiều vào loại phân tích mẫu phân tích. Đối với các quy trình định lượng thường quy, RSD dễ dàng đạt trên dưới 2%. Đối với phân tích các mẫu sinh học, độ chính xác ở khoảng 20% ở giới hạn định lượng dưới và 15% ở các nồng độ khác cao hơn. Giá trị RSD càng nhỏ, quy trình càng có độ chính xác cao [1,2].
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
13
CHƯƠNG 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, trang thiết bị
2.1.1. Dung môi, hoá chất
Chất chuẩn citral tinh khiết 96% có tỷ lệ neral : geranial là 50:50, chất chuẩn geraniol tinh khiết 98%, methanol (MeOH), acetonitrile (ACN) đạt tiêu chuẩn HPLC, kali hydroxit (KOH) được mua từ nhà sản xuất Merck KGaA, Đức. Nước được tinh chế bằng thiết bị Thermo Scientific GenPure UV-TOC đạt điện trở suất 18,2 M Ω.m. Các mẫu tinh dầu: Caroline (mẫu A), Julyhouse (mẫu B), Ngọc Tuyết (mẫu C) mua từ trang thương mại điện tử Tiki.vn.
2.1.2. Trang thiết bị
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Model Ultimate 3000 – Dionex, Thermo Scientific Hoa Kỳ ghép thiết bị phát hiện đa sóng DAD - 3000 Dionex. Cột silica gel pha đảo Eclipse XDB – C18 (4,6 x 250mm, 5µm). Xử lý tín hiệu bằng máy vi tính với hệ điều hành Microsoft Windows 7 trang bị phần mềm điều khiển Chromeleon Dionex phiên bản 7.1.2.1478.
Máy siêu âm Ultrasonic Cleaners AC - 150H, MRC Ltd, Isareal. Cân phân tích Shimadzu AUW220, Nhật Bản. Pipetman Finnpipette F3, Thermo Scientific, Hoa Kỳ,…
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Trong quá trình nghiên cứu, mỗi mẫu được phân tích 3 lần, lấy giá trị
trung bình. Xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Exel.
2.2.1. Tối ưu hoá điều kiện sắc ký
14
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Tiến hành sắc ký dung dịch citral chuẩn, sử dụng cột silica gel pha đảo C18 (5 µm, 120 Å, 4,6×250 nm), tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 µl, thời gian sắc ký 25 phút. Quét phổ hấp thụ trong khoảng 190-300 nm để tìm bước sóng hấp thụ cực đại. Khảo sát các pha động khác nhau, xác định
pha động cho các pic neral và geranial có độ phân tách tốt, đạt độ cân xứng tốt, tỷ lệ diện tích pic trên nồng độ và chiều cao pic trên nồng độ lớn nhất.
2.2.2. Thẩm định tính đặc hiệu
Tính đặc hiệu của phương pháp được xác định dựa vào khả năng phân
tách của citral với tạp geraniol.
Tiến hành sắc ký dung dịch geraniol, quét phổ hấp thụ của dung dịch trong khoảng 190-300 nm để xác định bước sóng hấp thụ cực đại của geraniol.
Tiến hành sắc ký dung dịch chứa đồng thời citral và geraniol tại bước sóng hấp thụ cực đại của citral và bước sóng hấp thụ cực đại của geraniol để xác định khả năng phân tách của citral với geraniol.
2.2.3. Thẩm định tính tuyến tính và xác định miền giá trị
Chuẩn bị dung dịch citral có nồng độ 10.000 µg/ml trong ACN. Pha loãng dung dịch này trong dung môi ACN : H2O (60:40, v/v) để thu được dãy 5 dung dịch có nồng độ citral lần lượt là 100, 80, 60, 40, 10 µg/ml . Khi đó nồng độ của neral hay geranial lần lượt là 50, 40, 30, 20, 5 µg/ml. Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn, phân tích mối tương quan giữa diện tích pic y (mAu.min) và nồng độ dung dịch (µg/ml).
2.2.4. Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
LOD và LOQ được xác định bằng phương pháp pha loãng dung dịch chuẩn. LOD là nồng độ thấp nhất cho pic có chiều cao gấp 2-3 lần đường nền ở tất cả 3 lần sắc ký. LOQ là nồng độ cho pic có chiều cao gấp 10 lần đường nền ở tất cả 3 lần sắc ký.
2.2.5. Thẩm định độ đúng
Đánh giá tỷ lệ phục hồi của dãy nồng độ trong khoảng tuyến tính đã phân tích. Tỷ lệ phục hồi được tính bằng tỷ lệ phần trăm giữa nồng độ xác định được từ thực nghiệm so với nồng độ dung dịch chuẩn.
2.2.6. Thẩm định độ chính xác
Độ lặp lại: tiến hành phân tích 3 mẫu có nồng độ 100, 60 và 10 µg/ml,
mỗi mẫu 3 lần trong cùng một ngày. Xác định giá trị RSD giữa các lần đo.
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
15
Độ chính xác trung gian: tiến hành phân tích 3 mẫu có nồng độ 100, 60 và 10 µg/ml, mỗi mẫu 3 lần trong 3 ngày khác nhau. Xác định giá trị RSD giữa các lần đo.
2.2.7. Định lượng citral trong tinh dầu sả chanh
Chuẩn bị các mẫu tinh dầu để định lượng. Cân chính xác khoảng 0,123 mg tinh dầu cho vào bình định mức 10 ml, thêm ACN đến vạch, siêu âm 1 phút và lọc qua màng PTFE 0,2 μm. Pha loãng dung dịch trên theo tỉ lệ thích hợp trong dung môi ACN : H2O (60:40, v/v) rồi tiêm vào hệ thống sắc ký. Xác định diện tích pic dưới đường cong (AUC) dựa vào đường chuẩn định lượng và hệ số pha loãng để xác định hàm lượng neral, geranial và citral toàn phần trong mẫu tinh dầu.
16
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Kết quả định lượng chỉ có giá trị đối với mẫu được phân tích.
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Xác định điều kiện phân tích
3.1.1. Khảo sát các hệ dung môi
Tiến hành sắc ký dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml tại bước sóng 233 nm (tham khảo nghiên cứu của Gaonkar và cộng sự) [49], sử dụng cột silica gel pha đảo C18 (5 µm, 120 Å, 4,6×250 nm), tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 µl, thời gian sắc ký 25 phút. Khảo sát hai hệ dung môi: hệ dung môi ACN : MeOH : H2O = 47 : 10 : 43 (v/v/v) và hệ dung môi ACN : H2O = 70 : 30 (v/v). Kết quả thu được như sau:
Hệ dung môi ACN : H2O = 70 : 30 (v/v)
Hình 3.1. Sắc ký đồ của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml tại bước sóng 233 nm, hệ dung môi ACN : H2O = 70 : 30 (v/v/v)
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
17
Bảng 3.1. Thông số pic của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml tại bước sóng phát hiện 233 nm với hệ dung môi ACN : H2O = 70 : 30 (v/v)
STT Tên pic As
Thời gian lưu (phút) Hệ số phân giải Số đĩa lý thuyết
1 Neral 6,243 1,07 6928
0,88 2 Geranial 6,527 1,32 5659
Tại pha động ACN : H2O = 70 : 30 (v/v), hai pic neral và pic geranial không tách nhau hoàn toàn, khả năng phân tách của hai pic kém và không đạt yêu cầu (yêu cầu Rs >1).
Hệ dung môi ACN : MeOH : H2O = 47 : 10 : 43 (v/v/v)
18
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Hình 3.2. Sắc ký đồ của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml tại bước sóng phát hiện 233 nm với hệ dung môi ACN : MeOH : H2O = 47 : 10 : 43 (v/v/v)
Bảng 3.2. Thông số pic của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml tại bước sóng phát hiện 233 nm với hệ dung môi ACN : MeOH : H2O = 47 : 10 : 43 (v/v/v)
STT Tên pic As
Thời gian lưu (phút) Hệ số phân giải Số đĩa lý thuyết
1 Neral 11,017 1,02 13985
2,54 2 Geranial 12,090 1,13 13997
Khi sử dụng pha động ACN : MeOH : H2O tỷ lệ 43 : 47 : 10 (v/v/v), hai pic neral và geranial tách hoàn toàn khỏi nhau, hệ số phân tách của 2 pic tốt, hệ số bất đối xứng của các pic đều gần 1 và số đĩa lý thuyết lớn.
Từ các kết quả thực nghiệm, lựa chọn được hệ dung môi pha động là
ACN : MeOH : H2O tỷ lệ 43 : 47 : 10 (v/v/v).
3.1.2. Xác định bước sóng hấp thụ
Tiến hành sắc ký dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml với hệ pha động xác định được ở trên. Quét phổ hấp thụ trong khoảng 190-300 nm để tìm bước sóng hấp thụ cực đại.
Kết quả cho thấy bước sóng hấp thụ cực đại của neral là 241,99 nm nhỏ hơn bước sóng hấp thụ cực đại của geranial là 242,90 nm. Để đơn giản hóa phương pháp, chọn bước sóng phát hiện là 242 nm cho cả hai đồng phân.
Hình 3.3. Phổ hấp thụ UV-VIS của Neral (A) và Geranial (B)
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
19
3.1.3. Điều kiện sắc ký
Như vậy đã chọn được điều kiện sắc ký là pha tĩnh cột silica gel pha đảo C18 (4,6 x 250mm, 5µm), pha động là hỗn hợp H2O : ACN : CH3OH với tỷ lệ 43 : 47 : 10 (v/v/v), tốc độ dòng 1 ml/phút. Mẫu được tiêm với thể tích 10 µl, thời gian sắc ký 25 phút. Hệ thống sử dụng đầu dò DAD với bước sóng phát hiện với cả 2 đồng phân neral và geranial là 242 nm.
Hình 3.4. Sắc ký đồ của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml trong điều kiện sắc ký được lựa chọn
Bảng 3.3. Thông số các pic của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml trong điều kiện sắc ký được lựa chọn
STT Tên pic As
Thời gian lưu (phút) Hệ số phân giải Độ tinh khiết Số đĩa lý thuyết
Neral 11,013 1,06 999 14217 1
20
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
2,73 Geranial 12,073 1,1 990 14059 2
3.2 . Tính đặc hiệu
Tiến hành sắc ký dung dịch geraniol 5µg/ml trong điều kiện đã xác định như đối với citral, quét phổ hấp thụ của dung dịch trong khoảng 190-300 nm tìm được bước sóng hấp thụ cực đại của geraniol là 200 nm.
Hình 3.5. Phổ hấp thụ cực đại UV-VIS của geraniol
Tiến hành sắc ký dung dịch chứa đồng thời 20µg/ml citral và 5µg/ml geraniol với các bước sóng phát hiện 200 và 242 nm. Sắc ký đồ tại các bước sóng trên được thể hiện lần lượt trong hình 3.6 và hình 3.7.
Hình 3.6. Sắc ký đồ của dung dịch chứa 20 µg/ml citral và 5 µg/ml geraniol tại bước sóng phát hiện 200 nm
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
21
Hình 3.7. Sắc ký đồ của dung dịch chứa 20 µg/ml citral và 5 µg/ml geraniol tại bước sóng phát hiện 242 nm
Bảng 3.4. Thông số các pic của dung dịch citral 20 µg/ml và dung dịch geraniol 5 µg/ml tại bước sóng phát hiện 200 nm
Tên pic As Thời gian lưu (phút) Độ tinh khiết Số đĩa lý thuyết Hệ số phân giải
Geraniol 9,360 1,12 4,78 996 13967
Neral 11,017 1,25 2,68 999 13568
Geranial 12,090 1,26 990 12909
22
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Kết quả cho thấy tạp geraniol không hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 242 nm. Ở 200 nm, geraniol cho pic có thời gian lưu 9,360 phút, tách hoàn toàn khỏi các pic neral và geranial. Hệ số phân giải giữa pic geraniol và pic neral là 4,78. Các pic đều tinh khiết với độ tương xứng lớn. Suy ra phương pháp đảm bảo tính đặc hiệu.
3.3. Tính tuyến tính và miền giá trị
Chuẩn bị các dung dịch citral có nồng độ lần lượt là: 100, 60, 10 µg/ml pha trong pha động; khi đó đồng phân neral (hay geranial) có nồng độ lần lượt là: 50, 30, 5 µg/ml. Tiến hành sắc ký các dung dịch trên.
3.3.1. Đối với đồng phân neral
Phân tích mối tương quan giữa diện tích pic y (mAu.min) và nồng độ
dung dịch (µg/ml) của đồng phân neral. Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.5. Kết quả phân tích hồi quy mối tương quan giữa nồng độ dung dịch và diện tích pic của đồng phân neral
STT Nồng độ lý dung dịch (µg/ml) Diện tích pic (mAU.min)
50 17,07 1
40 13,92 2
30 10,29 3
20 6,32 4
5 1,05 5
Khoảng định lượng 5 – 50 µg/ml
Độ lệch chuẩn S (se slope) 0,369823
0,9989 R2
Phương trình hồi quy y = 0,3619x - 0,7782
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
23
Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn sự tương quang giữa nồng độ dung dịch và diện tích pic của đồng phân neral
Phương trình hồi quy đối với đồng phân neral là y = 0,3619x - 0,7782, hệ số xác định R2 = 0,9989 và độ lệch chuẩn S = 0,369823. Qua trắc nghiệm Fischer, phương trình được chứng minh là tương thích (Phồi quy = 1,56E-05 < 0,05). Qua trắc nghiệm Student, hệ số a có ý nghĩa về mặt thống kê (P = 1,56E-05 < 0,05), hệ số b có ý nghĩa về mặt thống kê (P = 0,042565 < 0,05).
Như vậy, trong khoảng nồng độ từ 5 – 50 µg/ml, có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ dung dịch neral. Độ lệch của các giá trị thực nghiệm với giá trị hồi quy rất gần với 0 chứng tỏ khoảng tin cậy của phương trình hồi quy hẹp.
3.3.2. Đối với đồng phân geranial
Phân tích mối tương quan giữa diện tích pic y (mAu.min) và nồng độ
24
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
dung dịch (µg/ml) của đồng phân geranial. Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.6. Kết quả phân tích hồi quy mối tương quan giữa nồng độ dung dịch và diện tích pic của đồng phân geranial
STT Nồng độ dung dịch (µg/ml) Diện tích pic (mAU.min)
50 1 24,98
40 2 9,46
30 3 14,86
20 4 19,54
5 5 1,69
Khoảng định lượng 5 – 50 µg/ml
Độ lệch chuẩn S (se slope) 0,420443
R2 0,9996
Phương trình hồi quy y = 0,5153x - 0,838
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn sự tương quang giữa nồng độ dung dịch và diện tích pic của đồng phân geranial
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
25
Phương trình hồi quy đối với đồng phân geranial là y = 0,5153x - 0,838, hệ số xác định R2 = 0.9996 và độ lệch chuẩn S = 0.420443. Qua trắc nghiệm Fischer, phương trình được chứng minh là tương thích (Phồi quy = 2,92E-06 < 0,05). Qua trắc nghiệm Student, hệ số a có ý nghĩa về mặt thống kê (P = 2,92E-06 < 0,05), hệ số b có ý nghĩa về mặt thống kê (P = 0,020517< 0,05).
Như vậy, trong khoảng nồng độ từ 5 – 50 µg/ml, có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ dung dịch geranial. Độ lệch của các giá trị thực nghiệm với giá trị hồi quy rất gần với 0 chứng tỏ khoảng tin cậy của phương trình hồi quy hẹp.
3.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Xác định LOD và LOQ bằng phương pháp pha loãng theo mô tả trong mục 2.2.4. Kết quả thu được như sau: LOD và LOQ của neral lần lượt là 0,10 và 0,33 µg/ml; LOD và LOQ của geranial lần lượt là 0,30 và 1,00 µg/ml.
3.5. Độ đúng
Tỷ lệ phục hồi được tính bằng tỷ lệ phần trăm giữa nồng độ xác định được từ thực nghiệm so với nồng độ dung dịch chuẩn. Kết quả thu được như sau:
3.5.1. Đối với đồng phân neral
Bảng 3.7. Kết quả xác định tỷ lệ phục hồi của đồng phân neral
STT Tỷ lệ phục hồi
Nồng độ dung dịch (µg/ml) Nồng độ thực nghiệm (µg/ml)
1 50 49,32 98,10
2 40 40,61 101,10
3 30 30,58 101,60
4 20 19,61 98,10
26
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
5 5 5,05 101,00
Phương pháp đạt yêu cầu về độ đúng đối với neral với các giá trị của độ
phục hồi đều nằm trong khoảng 100±2%.
7.5.2. Đối với đồng phân geranial
Bảng 3.8. Kết quả xác định tỷ lệ phục hồi của đồng phân geranial
STT Tỷ lệ phục hồi
Nồng độ dung dịch (µg/ml) Nồng độ thực nghiệm (µg/ml)
50,10 99,40 50 1
39,55 98,40 40 2
30,46 101,70 30 3
19,98 101,20 20 4
4,91 98,10 5 5
Phương pháp đạt yêu cầu về độ đúng đối với geranial với các giá trị của
độ phục hồi đều nằm trong khoảng 100±2%.
3.6. Độ lặp lại
Chuẩn bị các dung dịch citral có nồng độ lần lượt là: 100, 60, 10 µg/ml pha trong pha động; khi đó đồng phân neral (hay geranial) có nồng độ lần lượt là: 50, 30, 5 µg/ml. Tiến hành sắc ký mỗi mẫu ba lần. Kết quả thu được như sau:
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
27
3.6.1. Đối với đồng phân neral
Hình 3.10. Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp đối với đồng phân neral
SD
STT Nồng độ dung dịch (µg/ml) Diện tích pic (mAU.min) RSD (%)
Diện tích pic trung bình (mAU.min)
15,72
50 15,32 0,35 2,29 1 15,20
15,05
10,23
30 10,24 0,24 2,34 2 10,01
10,49
0,98
5 0,99 0,02 2,08 3 1,02
0,99
28
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Kết quả cho thấy RSD giữa các lần đo đối với neral đều nhỏ hơn 2,34%.
3.6.2. Đối với đồng phân geranial
Bảng 3.9. Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp đối với đồng phân geranial
SD
STT Nồng độ dung dịch (µg/ml) Diện tích pic (mAU.min) RSD (%)
Diện tích pic trung bình (mAU.min)
24,98
50 25,12 0,13 0,50 1 25,17
25,22
11,33
30 11,38 0,14 1,24 2 11,27
11,54
1,98
5 1,91 0,05 2,48 3 1,87
1,96
Kết quả cho thấy RSD giữa các lần đo đối với geranial đều nhỏ hơn 2,48%.
3.7. Độ chính xác trung gian
Chuẩn bị các dung dịch citral có nồng độ lần lượt là: 100, 40, 20 µg/ml pha trong dung dịch pha động; khi đó đồng phân neral (hay geranial) có nồng độ lần lượt là 50, 20, 10 µg/ml. Tiến hành sắc ký mỗi mẫu ba lần. Lặp lại thí nghiệm trong ba ngày khác nhau. Kết quả thu được như sau:
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
29
3.7.1. Đối với đồng phân neral
Bảng 3.10. Kết quả xác định độ chính xác trung gian của phương pháp đối với đồng phân neral
STT Nồng độ SD
Ngày Diện tích pic (mAU.min) RSD (%)
Diện tích pic trung bình (mAU.min)
dung dịch (µg/ml)
1 15,94
1 50 15,75 0,48 3,05 2 15,20
3 16,10
1 6,34
2 20 6,16 0,18 2,92 2 5,98
3 6,17
1 2,09
3 10 2,04 0,06 3,00 2 1,97
3 2,05
30
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Kết quả cho thấy giá trị RSD đối với neral đều nhỏ hơn 3,05%
3.7.2. Đối với đồng phân geranial
Bảng 1. Kết quả xác định độ chính xác trung gian của phương pháp đối với đồng phân geranial
STT Nồng độ SD
Ngày Diện tích pic (mAU.min) RSD (%)
Diện tích pic trung bình (mAU.min)
dung dịch (µg/ml)
1 28,29
1 50 28,76 0,41 1,42 2 28,98
3 29,01
1 8,97
2 20 8,77 0,27 3,06 2 8,47
3 8,89
1 3,04
3 10 3,05 0,07 2,31 2 3,12
3 2,98
Kết quả cho thấy giá trị RSD đối với geranial đều nhỏ hơn 3,05%
3.8. Định lượng citral trong một số mẫu tinh dầu sả chanh
3.8.1. Sản phẩm A
Pha loãng dung dịch mẹ 125 lần trong dung môi ACN : H2O (60:40, v/v) thu được dung dịch có nồng độ tinh dầu là 100 µg/ml. Sắc ký dung dịch trên. Kết quả thể hiện trong hình 3.11:
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
31
Hình 3.11. Sắc ký đồ dung dịch mẫu A nồng độ 100 µg/ml
Trên sắc ký đồ ghi nhận được sự xuất hiện của 2 pic:
Pic 1 có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của neral. Diện tích pic là 8,231 mAU.min tương ứng với nồng độ 24,85 µg/ml. Như vậy mẫu A chứa 24,85% neral.
Pic 2 có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của geranial. Diện tích pic là 10,138 mAU.min tương ứng với nồng độ 21,54 µg/ml. Như vậy mẫu A chứa 21,54% geranial.
Như vậy tổng hàm lượng citral trong mẫu A là 46,39 µg/ml, tương
đương với 46,39%.
3.8.2. Sản phẩm B
32
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Pha loãng dung dịch mẹ 125 lần trong dung môi ACN : H2O (60:40, v/v) thu được dung dịch có nồng độ tinh dầu là 100 µg/ml. Sắc ký dung dịch trên. Kết quả thể hiện trong hình 3.12:
Hình 3.12. Sắc ký đồ dung dịch mẫu B nồng độ 100 µg/ml
Trên sắc ký đồ ghi nhận được sự xuất hiện của 2 pic:
Pic 1 có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của neral. Diện tích pic là 12,793 mAU.min tương ứng với nồng độ 37,35 µg/ml. Như vậy mẫu B chứa 37,35% neral.
Pic 2 có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của geranial. Diện tích pic là 17,738 mAU.min tương ứng với nồng độ 35,96 µg/ml. Như vậy mẫu B chứa 35,96% geranial.
Như vậy tổng hàm lượng citral trong mẫu B là 73,31 µg/ml, tương
đương với 73,31%.
3.8.3. Sản phẩm C
Pha loãng dung dịch mẹ 150 lần trong dung môi ACN : H2O (60:40, v/v) thu được dung dịch có nồng độ tinh dầu là 50 µg/ml. Sắc ký dung dịch trên trong điều kiện đã chọn. Kết quả thể hiện trong hình 3.13:
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
33
Hình 3.13. Sắc ký đồ dung dịch mẫu C nồng độ 50 µg/ml
Trên sắc ký đồ ghi nhận được sự xuất hiện của 2 pic:
Pic 1 có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của neral. Diện tích pic là 6,017 mAU.min tương ứng với nồng độ 18,78 µg/ml. Như vậy mẫu C chứa 37,56% neral.
Pic 2 có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của geranial. Diện tích pic là 8,795 mAU.min tương ứng với nồng độ 18,69 µg/ml. Như vậy mẫu C chứa 37,38% geranial.
Như vậy tổng hàm lượng citral trong mẫu C là 36,47 µg/ml, tương
34
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
đương với 74,94%.
3.8. Bàn luận
So sánh phương pháp xây dựng với một số phương pháp định lượng citral
Bảng 3.11. So sánh một số phương pháp định lượng citral
LOD
LOQ
R2
RSD của
RSD của độ
Tỷ lệ phục
Thông số
(µg/ml)
(µg/ml)
hồi
độ lặp lại
chính xác
(%)
(%)
trung gian
Phương pháp
(RSD %)
NIR [17]
100±2
≤ 1,00
_
_
_
_
Pha thuận [50]
0,99 100±2 ≤ 1,37
_
_
_
Pha đảo, sử dụng
Neral
0,99
0,062
0,205
hệ dung môi ACN : H2O = 70 : 30, tốc độ dòng là 1
100±2
≤ 1,74
≤ 1,93
ml/phút, thể tích tiêm mẫu là 15 µl,
Geranial
0,99
0,059
0,198
bước sóng phát là 233nm, hiện
HPLC
miền giá trị 3-100 µg/ml citral [49]
Neral
0,99
_
_
_
_
_
Pha đảo, hệ dung môi ACN : H2O : CH3OH=47:43:10 , tốc độ dòng 1,4
ml/phút, thể tích tiêm mẫu 15 µl ,
Geranial
bước sóng phát hiện là 240 nm,
0,99
_
_
_
_
_
miền giá trị 50-90
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
35
µg/ml citral [51]
Phương pháp xây dựng: pha đảo, hệ
Neral
0,99
100±2
≤ 2,34
≤ 3,05
0,10
0,33
dung môi ACN : H2O:CH3OH = 47 : 43 :10 , tốc độ dòng là 1 ml/phút,
Geranial
0,99
100±2
≤ 2,48
≤ 3,06
0,30
1,00
thể tích tiêm mẫu 10 µl , bước sóng
phát hiện là 240 nm, miền giá trị là
10 - 100 µg/ml citral
Chú thích: ( - ) chưa xác định.
Từ bảng kết quả so sánh cho thấy phương pháp xây dựng có độ chính xác, độ lặp lại thấp hơn so với các phương pháp khác. Tuy nhiên phương pháp xây dựng lại có các ưu điểm vượt trội hơn như:
- So với phương pháp NIR: phương pháp xây dựng hiện đại hơn, có khả năng định lượng đồng thời 2 đồng phân của citral và tiến hành xác định được thêm các thông số (độ lặp lại, LOD và LOQ).
- So với phương pháp HPLC pha thuận: phương pháp xây dựng có khả năng định lượng đồng thời 2 đồng phân của citral và có tính đặc hiệu hơn, tiến hành xác định được thêm các thông số (độ chính xác trung gian, LOD và LOQ).
36
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
- So với các phương pháp HPLC pha đảo khác: phương pháp xây dựng xác định đầy đủ được các thông số (tỷ lệ phục hồi, độ chính xác trung gian, độ lặp lại, LOD, LOQ) và có miền giá trị rộng.
Như vậy phương pháp xây dựng có những ưu điểm nổi bật: có khả năng tách các chất ra hoàn toàn nên tính đặc hiệu cao, độ chính xác cao và nhạy với các nồng độ nhỏ.
Chất lượng của các mẫu tinh dầu sả chanh
Qua kết quả định lượng citral trong ba sản phẩm tinh dầu sả chanh trên thị trường. Kết quả xác định được hàm lượng citral trong các sản phẩm tương đương với hàm lượng citral ghi trên nhãn bao bì sản phẩm. Sản phẩm A và B có hàm lượng citral lần lượt là 73,31% và 74,94%, đạt yêu cầu chất lượng về hàm lượng citral trong tinh dầu sả chanh. Sản phẩm C có hàm lượng citral thấp (46,39%), không đạt yêu cầu chất lượng về hàm lượng citral trong tinh dầu sả chanh.
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
37
CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận
Dựa trên các tài liệu về thẩm định quy trình phân tích của ICH, nghiên cứu này đã xây dựng và thẩm định thành công quy trình định lượng đồng thời hai đồng phân hình học của citral bằng hệ thống HPLC - DAD với các thông số: pha tĩnh là silicagel C18 trong cột 5 μm, 4,6×250 mm, pha động nước : acetonitril : nước : methanol tỷ lệ 43 : 47 : 10, thể tích tiêm mẫu là 10 µl, thời gian sắc ký là 25 phút, tốc độ dòng 1 ml/phút, đầu dò DAD tại bước sóng 242 nm.
Bằng các quá trình thực nghiệm đã chứng tỏ được quy trình định lượng đồng thời hai đồng phân hình học của citral đạt các yêu cầu về tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ đúng và độ chính xác (bảng 4.1 và bảng 4.2) theo hướng dẫn chung của ICH.
- Đối với neral
Bảng 4.1. Các yêu cầu đảm bảo quy trình định lượng đối với neral
5 – 50 µg/ml Miền giá trị
y = 0,3619x - 0,7782 Tính tuyến tính
0,9989 Hệ số tương quan R2
100±2% Độ đúng
RSD ≤ 2,34% Độ lặp lại
RSD ≤ 3,05% Độ chính xác trung gian
38
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
0,369823 Độ lệch chuẩn S
- Đối với geranial
Bảng 4.2. Các yêu cầu đảm bảo quy trình định lượng đối với geranial
5 – 50 µg/ml Miền giá trị
y = 0,5153x - 0,838 Tính tuyến tính
0,9996 Hệ số tương quan R2
100±2% Độ đúng
RSD ≤ 2,48% Độ lặp lại
RSD ≤ 3,06% Độ chính xác trung gian
0,420443 Độ lệch chuẩn S
Phương pháp được ứng dụng để định lượng citral trong 3 mẫu tinh dầu
sả chanh trên thị trường.
4.2. Kiến nghị
Ứng dụng phương pháp để góp phần vào việc kiểm soát chất lượng tinh dầu sả chanh trên thị trường. Phương pháp cũng là cơ sở để lựa chọn nguyên liệu bào chế các sản phẩm chống côn trùng từ tinh dầu sả chanh.
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
39
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
[1] Bộ Y tế (2012), Kiểm nghiệm thuốc (dùng cho đào tạo dược sĩ đai học),
Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam, pp.135-184.
[2] Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm (2010), Thẩm định
phương pháp trong phân tích hoá học và vi sinh vật, NXB Khoa học và
Kỹ thuật,pp.10-59.
[3] Vụ khoa học và đào tạo – Bộ Y tế (2005), Kiểm nghiệm dược phẩm,
NXB Y học, pp.68-84.
Tiếng anh
[4] Adams, R. Identification of Essential Oils Compounds by Gas
Chromatography – Mass Spectroscopy. Allured Publishing Co. : IL, 1997.
[5] Barbier; Bouveault. Comp. Rend. 1894, 118, 983, 1050 ; 1895, 121,
1159; 1896, 122, 293.
[6] Bassolé, I. H., A. Lamien-Meda, B. Bayala, L.C. Obame, A. J. Ilboudo,
C. Franz, J. Novak, R. C. Nebié, M. H. Dicko, 2011. Phytomedicine,
18(12): 1070-1074.
[7] Bermejo, P.; Abad, M.; Silvon Sen, A.; Sonchez Contreras, S.; Diaz
lanza, A. Life Sci. 1998, 63, 1147- 1156.
[8] Bertram. Schimmel’s Report. 1888, 17.
[9] Bilal Yilmaz, Emrah Alkan (2015), “Spectrofluorometric and
Spectrofluorometric and UV Spectrofluorometric Methods for the
[10] Chenghan Mei, Bin Li, et al (2015), "Liquid chromatography-tandem
mass spectrometry for the quantification of flurbiprofen in human
plasma and its application in a study of bioequivalence", Journal of
Chromatography B, 993-994, pp.69-74.
[11] Determination of Flurbiprofen in Pharmaceutical Preparations”, Journal
of Pharmaceutical Analysis, 4(4).
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
[12] Dodge. Amer. Chem J. 1890, 12, 553.
[13] Epstein, W.; McGee, L.; Poulter,C.; Marsh, J. Chem. Eng. Data. 1976,
21, 500.
[14] European Medicines Agency (2011), Guideline on bioanalytical
method validation, pp.9-10.
[15] Fenaroli, G., Furia, T.E., Bellanca, N., Handbook of Flavor Ingredients,
ISBN 0-87819-532-7
[16] Gbenou, J. D., J. F. Ahounou, H. B. Akakpo, A. Laleye, E. Yayi, F.
Gbaguidi, L. BabaMoussa, R. Darboux, P. Dansou, M. Moudachirou, S.
O. Kotchoni, 2013. Molecular Biology Reports, 40 (2): 1127-1134.
[17] Hattori, T.; Ito, M.; Suzuki, Y. Nippon Yakurigaku Zasshi. 1991, 97, 13-21.
[18] Husek, P.; Mack, K. J. Chromatgr. 1975, 133, 139-230.
[19] Jennings, W.; Shibamoto, T. Qualitative Analysis of Flavor and
Fragrance Volatile by Capillary Gas Chromatography. Academic
Press: New York, 1980.
[20] Joulain, D.; Konig, A.; Verlag, E. The Atlas of Spectral Data of
Sesquiterpene Hydrocarbons Hamburg, Germany, 1998.
[21] Khan, M. S., I. Ahmad, 2012. Journal of Ethnopharmacology, 140 (2): 416-423.
[22] Kokane Vikrant , Naik Sonali (2014), “Formulation and evaluation of
topical flurbiprofen gel using different gelling agents”, World Journal
of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 3(9),pp. 654-663.
[23] Kruger; Stiehl; Tiemann. J. Pr. Chem. 1898, 58, 51; 1899, 59, 497.
[24] Kuwahara, Y., Suzuki, H., Matsumoto, K. & Wada, Y. (1983).
“Pheromone study on acarid mites. XI. Function of mite body as
geometrical isomerization and reduction of citral (the alarm
pheromone) Carpoglyphus lactis”. Appl. Entomol. Zool. 18: 30–39.
[25] Lawless, J., The Illustrated Encyclopedia of Essential Oils, ISBN 1-
85230-661-0
[26] Libbey, L.; Essent, J. Oil Res. 1991, 3, 192.
[27] Maíra Maciel Mattos de Oliveiraa, Danilo Florisvaldo Brugneraa,
Maria das Graças Cardosob, Eduardo Alvesc and Roberta Hilsdorf
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Piccoli, 2010. Food Control, 2010. 21(4): 549-553.
[28] Motoo, Y.; Sawabu, N. Cancer Lett. 1994, 86, 91-95.
[29] Murray, Kermit K., et al (2013), "Definitions of terms relating to mass
spectrometry (IUPAC Recommendations 2013)", Pure and Applied
Chemistry, 85(7),1515-1609.
[30] Onawunmi, G.O. (1989). “Evaluation of the antimicrobial activity of
citral”. Lett. Appl. Microbial. 9 (3): 105–108
[31] Pala-Paul, J.; Perez-Alonso, M.; Velasco-Negueruela, A.; Sanz, J.
“Analysis by Gas Chromatography – Mass Spectroscopy of the
Volatile Components of Ageratina Adenophora Spreng., Growing in
the Canary Islands.” J. of Chromatography. 2002, 947, 327-331.
[32] Parry, E.J. The Chemistry of Essential Oils and Artificial Perfumes.
4th Ed.; Scott, Greenwood and Son: London, UK, 1921; Vol. 1, pp 63,
270, 71-73, 270
[33] Robacker, D.C. & Hendry, L.B. (1977). “Neral and geranial:
components of the sex pheromone of the parasitic wasp, Itoplectis
conquisitor”. J. Chem. Ecol. 3 (5): 563–577
[34] Schimelpfenig, C.W. J. Chem. Ed. 1978, 55, 306.
[35] Semmler, F. W. Ber. Dtsch. Chem. Ges. 1891, 24, 201.
[36] Semmler, F.W. Ber. Dtsch. Chem. Ges. 1890, 23, 2965-3556.
[37] Simonsen, J.L. The Terpenes. 2nd Ed. Cambridge University Press:
Cambridge, 1947; Vol. 1, pp 42 - 45, 70 - 85.
[38] Singh, P., R. Shukla, A. Kumar, B. Prakash, S. Singh, N. K. Dubey,
2010. Mycopathologia, 170(3): 195-202.
[39] Sofowora, A. Medicinal Plants and Traditional Medicine in Africa.
John Wiley & Sons Inc. : New York, 1982; pp 71-72.
[40] Survey and health assessment of chemical substances in massage oils
Archived 28 June 2007 at the Wayback Machine
[41] Swinger, A.; Silverstein, R. Aldrich Chemical Co. Milwaukee, WI, 1981.
[42] The Europaean Pharmacopieal Commission (2010), Pharmacopoeia
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
Europaea 7th Edition vol 2, pp.2056-2057.
[43] The International Council for Harmonisation of Technical
Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (2005), Validation
of analytical procedures: text and methodology Q2(R1), pp.6-13.
[44] Tiemann. Ber. DTSCH. Chem. Ges. 1899, 32, 117.
[45] Wilson, C.M. Grass and People. University of Florida Press:
Gainesville, 1961; pp 75.
[46] Wilson, N.; Ivanova, M.; Watt, R.; Moffat, A. “The quantification of
Citral in Lemon Grass and Lemon Oils by Near-Infrared Spectroscopy.”
The Journal of Pharmacy And Pharmacology. 2002, 54, 1257-1263.
[47] Xiuqin, L.; Jia, Y.; Song, A.; Chen, X. ; Bi, K. “Analysis of the Essential
Oil from Radix Bupleuri Using Capillary Gas Chromatography.” The
Pharmaceutical Society of Japan. 2005, 125, 815-819.
[48] Zeitshel. Ibid. 1906, 39, 1787.
[49] Gaonkar, R., Yallappa, S., Dhananjaya, B. L., & Hegde, G. (2016).
Development and validation of reverse phase high performance liquid
chromatography for citral analysis from essential oils. Journal of
Chromatography B, 1036-1037, 50–56.
[50] Rauber, C.; Guterres, S.; Schapoval, E. “LC Determination of Citral in
Cymbopogon Citratus Volatile Oil.” J. of Pharmaceutical And
Biomedical Analysis. 2004, 37, 597-601.
[51] Miron, D., Battisti, F., Schwengber Ten Caten, C., Mayorga, P., & Eva
Scherman Schapoval, E. (2012). Spectrophotometric Simultaneous
Determination of Citral Isomers in Cyclodextrin Complexes with
Partial Least Squares Supported Approach. Current Pharmaceutical
Analysis, 8(4), 401–408.
Trang web
[52] http://www.uni-graz.at/~katzer/engl/Cymb_cit.html. 2005
[53] http://edis.ifas.ufl.edu. 2005.
[54] https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Citral#section=Chemical-
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark
and-Physical-Properties
