Khóa luận Dược học: Sàng lọc hoạt tính ức chế acetylcholinesterase của cao chiết Dương Xỉ bản địa chữa sa sút trí tuệ, Alzheimer

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC



BÙI TRUNG ĐỨC

SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE CỦA

CAO CHIẾT DƢƠNG XỈ BẢN ĐỊA LÀM NGUỒN NGUYÊN LIỆU CÓ

KHẢ NĂNG CHỮA BỆNH SA SÚT TRÍ TUỆ VÀ ALZHEIMER

KHÓA LUẬN T T NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC

HÀ NỘI – 2023

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC



Ngƣời thực hiện: BÙI TRUNG ĐỨC

SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE CỦA

CAO CHIẾT DƢƠNG XỈ BẢN ĐỊA LÀM NGUỒN NGUYÊN LIỆU CÓ

KHẢ NĂNG CHỮA BỆNH SA SÚT TRÍ TUỆ VÀ ALZHEIMER

KHÓA LUẬN T T NGHIỆP ĐẠI HỌC

(NGÀNH DƢỢC HỌC)

KHOÁ: QH.2018.Y

NGƢỜI HƢỚNG DẪN: TS. HỒ NGỌC ANH

ThS. NGUYỄN THỊ MAI

HÀ NỘI – 2023

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô và các bạn. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Hồ Ngọc Anh – Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam và ThS. Nguyễn Thị Mai - Trường Đại học Y Dược đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành nghiên cứu.

Trong quá trình thực hiện khóa luận, tôi nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ các thầy cô phụ trách trong các phòng thí nghiệm của Viện Công nghệ Sinh học. Tôi xin chân thành cảm ơn Viện Công nghệ Sinh học đã tạo mọi điều kiện tốt nhất về cơ sở vật chất, các dụng cụ phòng thí nghiệm cho tôi có thể thực hiện tốt đề tài nghiên cứu.

Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới toàn bộ thầy cô trong bộ môn Dược liệu – Dược học cổ truyền cùng toàn thể các thầy cô Trường Đại học Y Dược đã giúp đỡ, trang bị cho tôi nhiều điều bổ ích và thực sự đó là những hành trang quý báu giúp tôi thêm vững bước trên con đường đi sắp tới của mình.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt và ý nghĩa nhất tới ông bà, bố mẹ, người thân và bạn bè đã luôn chỉ bảo, động viên, chia sẻ, sát cánh bên tôi để tôi vượt qua những khó khăn trong quá trình học tập và nghiên cứu.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Bùi Trung Đức

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

ACh Acetylcholine

AChE Acetylcholinesterase

ACTI Acetylthiocholine

AD Bệnh Alzheimer

BACE1 Tiền thân amyloid ở vị trí β enzyme 1

BuChE BuOH Butyrylcholinesterase Butanol

DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

DTNB Acid 5-5‟-dithiobis-2-nitrobenzoic

EtOAc Etylacetat

EtOH Etanol

HIV Bệnh suy giảm miễn dịch ở người

HupA Huperzine A

Liều ức chế 50% IC50

MeOH Metanol

MRSA nHX ROS SSTT TNF-α VaD Tụ cầu vàng kháng methicilin n-hexan Các dạng oxi hoạt động Sa sút trí tuệ Yếu tố hoạt tử khối u Sa sút trí tuệ mạch máu

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Vòng đời của Dương xỉ ........................................................................ 6

Hình 1.2. Đồng phân lập thể của huperzine A ..................................................... 8 Hình 1.3. Các hợp chất đại diện của bốn loại alkaloid Lycopodium chính từ H.

serrata: fawcettimine (A), lycodine (B), lycopodine (C), và phlegmarine (D) ... 8

Hình 1.4. Các dẫn xuất của Pterosin phân lập được từ cây Dương xỉ diều hâu .. 9

Hình 1.5. Các hợp chất chính được phân lập từ cây Pteris vittata .................... 10 Hình 1.6. Các vị trí hoạt động của enzyme AChE ............................................. 14

Hình 2.1. Các mẫu dương xỉ nghiên cứu ........................................................... 18

Hình 2.2. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn Dương xỉ ................................................ 20

Hình 2.3. Quá trình phản ứng diễn ra trong phương pháp đo quang trong phản

ứng Ellman .......................................................................................................... 21 Hình 3.1. Sắc ký đồ của các cao chiết phân đoạn DX04 với hệ dung môi

Hexan: etylacetat 1:1 .......................................................................................... 25

Hình 3.2. Sắc ký đồ của các cao chiết phân đoạn DX04 với hệ dung môi

diclometan: MeOH 8:2 ....................................................................................... 26

Hình 3.3. Sắc ký đồ của các cao chiết phân đoạn DX04 với hệ dung môi diclometan: MeOH:H2O 65:30:5………………………………………………22

Hình 3.4. Sắc ký đồ của các cao chiết phân đoạn DX04 với hệ dung môi

diclometan: MeOH 6:4……………………………………………………… 22

Hình 3.5. Phân đoạn chất trên cột khảo sát bằng TLC…………………….. 26

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Các mẫu dược liệu dương xỉ nghiên cứu ................................. 16 Bảng 3.1. Khối lượng cao chiết phân đoạn với các dung môi khác nhau của các mẫu Dương xỉ thử nghiệm ........................................................... 23 Bảng 3.2. Các hệ dung môi chạy sắc ký lớp mỏng .................................. 24 Bảng 3.3. Hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase của các mẫu thử ................................................................................................................... 28 Bảng 3.4. Kết quả ức chế gốc tự do DPPH của phân đoạn dịch chiết trên cột..27

MỤC LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG MỤC LỤC MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN .......................................................................... 3 1.1. Tổng quan về Dương xỉ và ứng dụng ........................................................ 3 1.1.1. Đặc điểm phân bố và thực vật [11] ........................................................ 4 1.1.2. Thành phần hoá học ................................................................................ 7 1.1.3. Hoạt tính sinh học ................................................................................. 10 1.2. Acetylcholine, enzym Acetylcholinesterase và giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer .................................................... 13 1.2.1. Acetylcholine ........................................................................................ 13 1.2.2. Enzym Acetylcholinesterase ................................................................. 15 1.2.3. Giả thuyết về vai trò hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer ............... 15

CHƢƠNG 2- Đ I TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........ 16 2.1. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................. 16 2.2. Hóa chất, thiết bị ...................................................................................... 18 2.2.1. Hóa chất ................................................................................................ 18 2.2.2. Thiết bị .................................................................................................. 18 2.3. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 19 2.3.1. Phương pháp xử lí và chiết xuất dược liệu ........................................... 19 2.3.2. Phương pháp sàng lọc hoạt tính ức chế Acetylcholinesterase của các cao chiết .......................................................................................................... 21

CHƢƠNG 3- KẾT QUẢ ............................................................................... 23 3.1. Quy trình chiết xuất dương xỉ của các mẫu dược liệu ............................. 23 3.2. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế enzyme Acetylcholinesterase ............ 27

CHƢƠNG 4- BÀN LUẬN ............................................................................ 33 4.1. Về kết quả tạo cao chiết phân đoạn dương xỉ .......................................... 33 4.2. Về kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase của các mẫu cao chiết dương xỉ ............................................................................. 33

KẾT LUẬN, ĐỀ XUẤT ................................................................................ 37 Kết luận ........................................................................................................... 37 Đề xuất ............................................................................................................ 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 38

MỞ ĐẦU

Sa sút trí tuệ (SSTT, dementia) là một thuật ngữ chung cho sự suy giảm khả năng nhận thức đủ nghiêm trọng để cản trở cuộc sống hàng ngày. Bệnh Alzheimer (AD) chiếm gần 3/4 các trường hợp SSTT, với phần còn lại do SSTT mạch máu (VaD), hỗn hợp Alzheimer và VaD, SSTT với thể Lewy, và SSTT vùng trán. SSTT là nguyên nhân chính gây ra tình trạng khuyết tật và phụ thuộc ở những người lớn tuổi trên toàn thế giới, đặt ra gánh nặng to lớn cho cá nhân, gia đình, cộng đồng và xã hội [1]. Nó chiếm 11,9% số năm sống với tình trạng tàn tật do bệnh không lây nhiễm. Các đánh giá gần đây ước tính rằng trên toàn cầu có gần 8 triệu người phát triển chứng SSTT mỗi năm, dịch chuyển sang một trường hợp mới sau mỗi bốn giây.

Việt Nam, khi chính thức bước vào giai đoạn già hóa dân số từ năm 2011 khi có 11% số dân là những người trên 60 tuổi và là một trong 10 nước có tốc độ già hóa nhanh nhất. Tốc độ già hóa nhanh trong bối cảnh vẫn là một nước có mức thu nhập trung bình thấp đã đặt ra rất nhiều vấn đề cần giải quyết, nhất là trong công tác chăm sóc sức khỏe, khi trung bình mỗi người cao tuổi thường mắc các bệnh sau: Tim mạch, đái tháo đường, viêm phổi tắc nghẽn... điển hình nhất là SSTT [2]. Năm 2001 Viện Sức khỏe Tâm thần Quốc gia nghiên cứu ở Thái Nguyên cho biết tỷ lệ hiện mắc sa sút trí tuệ là 7,9%. Năm 2005, Phạm Thắng và cộng sự thấy ở Ba Vì thuộc Hà Tây (cũ), tỷ lệ hiện mắc suy giảm nhận thức nhẹ là 1,4% và sa sút trí tuệ là 4,63% [3]. Theo điều tra dân số năm 2017, nước ta đã có 95,57 triệu người, tuổi thọ trung bình của Việt Nam đã tăng từ 68,6 tuổi năm 1999 lên tới 73,2 tuổi năm 2014, và dự báo sẽ lên 78 tuổi vào năm 2030. Năm 2014, tại Bệnh viện Tâm thần Trung ương 1, tỷ lệ mắc 10 chứng rối loạn tâm thần phổ biến là 14,2%, trong đó riêng rối loạn trầm cảm chiếm 2,45%. Tỷ lệ tự sát trong năm 2015 là 5,87 trên 100.000 dân. Tính đến hết năm 2017, cả nước có 11 triệu người trên 60 tuổi chiếm khoảng 11,95% dân số, trong đó có khoảng gần 2 triệu người từ 80 tuổi trở lên [4]. Gần đây nhiều nghiên cứu đã cho thấy SSTT xuất hiện rất sớm trước 65 tuổi và thực tế triệu chứng bệnh đã xuất hiện trước 20 năm cho đến khi mất trí nhớ: lặp lại bản thân, lạc lối và thể hiện kỹ năng suy nghĩ mờ nhạt đều xuất hiện sau khi quá trình bệnh Alzheimer đã bắt đầu trong não. Căn bệnh này có thể bắt đầu gây ra những thay đổi về thể

1

chất trong nhiều năm hoặc nhiều thập kỷ trước khi các triệu chứng xuất hiện: việc quên một cuộc họp là một dấu hiệu cảnh báo nếu sự mất trí nhớ tạm thời lặp lại nhiều lần hoặc quên các sự kiện lớn hoặc cảm giác về không thời gian, địa điểm [5-7].

Cho đến nay đã có một số loài Dương xỉ được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học trên thế giới. Nhưng tại Việt Nam, với một nguồn lực tự nhiên phong phú về ngành thực vật này lại chưa hề được chú trọng. Trong khi đó, có tối thiểu 4 loài Dương xỉ là đặc hữu của Việt Nam vẫn chưa hề được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. Ngành Dương xỉ có chất lượng và số lượng đáng kể của polysaccharid, steroid, terpenoid, flavonoid, alkaloid đặc thù của các chi thuộc ngành này nhưng chưa hề được công bố và phát hiện ở Việt Nam. Các nhóm chất này, thường có những hoạt tính sinh học có giá trị. Dương xỉ ở Việt Nam còn rất ít được nghiên cứu, đặc biệt ít về nghiên cứu tác dụng ức chế enzyme Acetylcholinesterase nhằm tạo cơ sở cho các sản phẩm hỗ trợ điều trị SSTT và Alzheimer. Chính vì vậy, tôi thực hiện đề tài:

“Sàng lọc hoạt tính ức chế acetylcholinesterase của cao chiết Dƣơng Xỉ bản địa làm nguồn nguyên liệu có khả năng chữa bệnh sa sút trí tuệ và Alzheimer” với các mục tiêu sau:

- Nghiên cứu tạo cao chiết phân đoạn các dung môi khác nhau với các

mẫu Dương xỉ.

- Sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme Acetylcholinesterase của các cao chiết

Dương xỉ.

2

CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về Dƣơng xỉ và ứng dụng

Dương xỉ là một trong những ngành thực vật được nghiên cứu khá kỹ của Việt Nam về đa dạng sinh học, chiếm khoảng 6% của tổng số các loài thực vật. Đã có ba nghiên cứu chính trong việc lập danh mục và phân loại hệ thực vật rừng dương xỉ ở Việt Nam. M.L. Tardicu-Blot & C. Christensen (1939-1951) đã báo cáo 587 loài trong 116 chi và 14 họ trong đợt nghiên cứu đầu tiên [8]. Năm 1999, Phạm Hoàng Hộ đã thống kê và minh họa 633 loài thuộc 137 chi và 27 họ [9]. Năm 2001, Phan Kế Lộc đã mô tả 700 loài bản địa trong 138 chi và 30 họ. Trong các công trình này, các tác giả đã sử dụng các hệ thống phân loại khác nhau. Gần đây nhất, năm 2010, Phan Kế Lộc đã thực hiện nghiên cứu tổng quát về danh mục các loài dương xỉ tại Việt Nam theo sơ đồ phân loại của A. Smith cho các lớp, các bộ, các họ và các chi. Tổng cộng có 717 các loài bản địa, 135 chi và 28 họ đã được trình bày. Các họ có số lượng chi lơn nhất là Polypodiaecae, Pteridaceae và Dryopteridaceae và với số lượng loài phong phú nhất là Polypodiaeeae, Dryoptcridaceae, Pteridaceae, Woodsiaceae, Thelypteridaceae, Aspleniaceae và Tectariaceae. Chi có số lượng loài nhiều nhất là Asplenium, Diplazium, Tectaria, Cyclosorus và Pteris [10].

Sử dụng có chọn lọc các chất chiết xuất từ thực vật thô đã là nghi thức lâu đời nhất trong hệ thống Dược liệu Ấn Độ cổ đại „Ayurveda‟, cũng như trong hệ thống Y học Cổ truyền Trung Quốc trong hàng nghìn năm. Các loài thực vật thuộc ngành dương xỉ đã được được ghi chép rõ ràng từ các loại thuốc thảo dược của người Trung Quốc, Ấn Độ, Hàn Quốc và thổ dân Mỹ. Kể từ thời cổ đại, hầu hết các loài dương xỉ đã mang lại nhiều lợi ích sức khỏe cho các nền văn minh cổ đại, những người đã sử dụng chúng làm thực phẩm, trà và thuốc [1].

Cho đến nay đã có một số loài Dương xỉ được nghiên cứu về thành phần hóa học và được sử dụng trong hỗ trợ điều trị SSTT và Alzheimer trên thế giới. Nhưng những nghiên cứu này hoặc đang dừng ở bước khảo sát dịch chiết hoặc lại chỉ công bố về thành phần hóa học mà thiếu đi những minh chứng cơ bản về hiệu quả hay khả năng trị bệnh của chúng. Trên thế giới sự ứng dụng của ít nhất 3 loài Dương xỉ đã được thống kê là Huperzia sertata, Pteridium aquivilum, Pteris vittata đã trở nên phổ biến, một số trở thành thực phẩm chức năng và sản

3

phẩm thuốc dưới dạng cao chiết trong phòng và điều trị bệnh SSTT và Alzheimer.

Trong khi đó, 2 loài Dương xỉ mới được phát hiện tại Việt Nam là Leptochilus oblongus (Polypodiaceae), Pteris langsonensis (Pteridaceae) và 2 loài Dương xỉ thân gỗ bản địa của Việt Nam là Alsophila sallettii và Sphaeropteris glauca (Cyatheaceae) lại chưa hề được nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của chúng. Mặc dù trên thế giới các loài trong cùng chi của những loài này đã rất nổi tiếng như một nguồn các cây được liệu quý hiếm.

1.1.1. Đặc điểm phân bố và thực vật [11]

1.1.1.1. Phạm vi kích thƣớc và môi trƣờng sống

Dương xỉ vô cùng đa dạng về môi trường sống, hình thức và phương thức sinh sản. Riêng về kích thước, chúng bao gồm từ những cây có màng nhỏ chỉ cao 1–1,2 cm (0,39–0,47 inch) đến những cây dương xỉ khổng lồ cao từ 10 đến 25 mét (30 đến 80 feet). Một số xoắn lại và giống như dây leo; số khác nổi trên mặt ao. Phần lớn dương xỉ sống ở những vùng ấm áp và ẩm ướt trên Trái đất. Phát triển mạnh mẽ ở các vùng nhiệt đới, dương xỉ giảm dần về số lượng khi vĩ độ ngày càng cao hơn và nguồn cung cấp độ ẩm ngày càng giảm. Rất ít được tìm thấy ở những nơi khô, lạnh.

Một số loài dương xỉ đóng vai trò trong quá trình diễn thế sinh thái, phát triển từ các khe hở của đá trơ trụi và trong các đầm lầy và đầm lầy lộ thiên trước khi thảm thực vật rừng xuất hiện. Chi dương xỉ nổi tiếng nhất trên thế giới, Pteridium được tìm thấy đặc trưng ở những cánh đồng cũ hoặc những khu rừng đã bị chặt phá, nơi mà ở hầu hết các nơi, nó thường được thành công bởi thảm thực vật thân gỗ.

1.1.1.2. Phân phối và phong phú

Về mặt địa lý, dương xỉ có nhiều nhất ở vùng nhiệt đới. Vùng Bắc Cực và Nam Cực có ít loài. Mặt khác, một quốc gia nhiệt đới nhỏ như Costa Rica có thể có hơn 900 loài dương xỉ-hiều gấp đôi số lượng được tìm thấy ở tất cả Bắc Mỹ phía bắc Mexico. Sự đa dạng của dương xỉ thể hiện rõ nhất ở các khu rừng mưa nhiệt đới, nơi mà chỉ trong vài hecta có thể bắt gặp hơn 100 loài, một số loài

4

trong số đó có thể tạo thành yếu tố chi phối của thảm thực vật. Ngoài ra, nhiều loài phát triển như thực vật biểu sinh trên thân và cành cây. Một số họ hầu như chỉ có ở vùng nhiệt đới (ví dụ: Marattiaceae, Gleicheniaceae, Schizaeaceae, Cyatheaceae, Blechnaceae và Davalliaceae). Hầu hết các họ khác xuất hiện ở cả vùng nhiệt đới và ôn đới. Chỉ một số chi chủ yếu là ôn đới và Bắc cực (ví dụ: Athyrium, Cystopteris, Dryopteris và Polystichum) và thậm chí những chi này có xu hướng mở rộng sang vùng nhiệt đới, được tìm thấy ở độ cao lớn trên các dãy núi và núi lửa. Một số loài dương xỉ đã được du nhập vào các khu vực nhiệt đới hoặc cận nhiệt đới (ví dụ: miền nam Florida và Hawaii) và trong một số trường hợp đã được nhập tịch và lan rộng vào rừng nguyên sinh.

Do khả năng phân tán bằng bào tử và khả năng tạo ra cả hai cơ quan sinh dục trên cùng một giao tử và do đó có khả năng tự thụ tinh, nên có vẻ hợp lý khi cho rằng dương xỉ có khả năng phát tán và hình thành ở khoảng cách xa hơn so với hạt giống thực vật. Mặc dù các xét nghiệm di truyền đã chỉ ra rằng nhiều loài, nếu không muốn nói là hầu hết, các loài dương xỉ có xu hướng có một hệ thống sinh sản lai xa, một số loài khác có liên quan đến trường hợp dương xỉ có sự phân chia xa, các vùng sinh trưởng tách biệt. Một số mô hình khác nhau, chẳng hạn như các loại cây tương tự mọc ở châu Á và ở miền đông Bắc Mỹ, không phải là kết quả của quá trình phân tán tầm xa mà là tàn dư của một hệ thực vật liên tục cổ đại, các khu vực xen kẽ đã bị thay đổi theo thời gian.

5 1.1.1.3. Vòng đời [12]

Vòng đời của dương xỉ cần hai thế hệ thực vật để tự hoàn thành. Điều này

được gọi là luân phiên của các thế hệ.

Một thế hệ là lưỡng bội, nghĩa là nó mang hai bộ nhiễm sắc thể giống hệt nhau trong mỗi tế bào hoặc bộ gen bổ sung đầy đủ (như tế bào người). Dương xỉ lá có bào tử là một phần của thế hệ lưỡng bội, được gọi là bào tử.

Bào tử dương xỉ không phát triển thành bào tử lá. Chúng không giống như hạt của cây có hoa. Thay vào đó, chúng tạo ra một thế hệ đơn bội. Ở thực vật đơn bội, mỗi tế bào chứa một bộ nhiễm sắc thể hoặc một nửa phần bổ sung di truyền (giống như tế bào trứng hoặc tinh trùng của con người). Phiên bản này của cây trông giống như một cây con nhỏ hình trái tim. Nó được gọi là prothallus hoặc gametophyte.

Hình 1.1. Vòng đời của Dương xỉ

Vòng đời của Dương xỉ tuân theo các bước như sau:

Thể bào tử lưỡng bội tạo ra các bào tử đơn bội bằng quá trình giảm phân, quá trình tương tự như quá trình tạo ra trứng và tinh trùng ở động vật và thực vật có hoa.

Mỗi bào tử phát triển thành một prothallus quang hợp (gametophyte) thông qua quá trình nguyên phân. Do quá trình nguyên phân duy trì số lượng

6

nhiễm sắc thể nên mỗi tế bào trong nguyên sinh chất là đơn bội. Cây con này nhỏ hơn nhiều so với cây dương xỉ bào tử.

Mỗi prothallus tạo giao tử thông qua quá trình nguyên phân. Giảm phân là không cần thiết vì các tế bào đã đơn bội. Thông thường, một sinh vật nguyên sinh sản xuất cả tinh trùng và trứng trên cùng một cây con. Trong khi thể bào tử bao gồm các lá và thân rễ thì thể giao tử có các lá chét và thân rễ. Trong giao tử, tinh trùng được tạo ra trong một cấu trúc gọi là bao phấn. Trứng được tạo ra trong một cấu trúc tương tự được gọi là archegonium.

Khi có nước, tinh trùng sử dụng Flagella của chúng để bơi đến trứng và

thụ tinh cho nó.

Trứng được thụ tinh vẫn được gắn vào prothallus. Trứng là một hợp tử lưỡng bội được hình thành do sự kết hợp của DNA từ trứng và tinh trùng. Hợp tử phát triển thông qua quá trình nguyên phân thành thể bào tử lưỡng bội, hoàn thành vòng đời.

1.1.2. Thành phần hoá học

Các công bố nghiên cứu về các loài Dương xỉ đang được ứng dụng hỗ trợ điều trị bệnh SSTT và Alzheimer cho thấy thành phần hoạt chất có tác dụng rất đa dạng bao gồm nhiều lớp chất như các alkaloid, các flavonoid, các lignan, các steroid và một số chất thuộc nhóm tinh dầu.

1.1.2.1. Thạch tùng răng cƣa (Huperzia sertata)

Việc sử dụng và phổ biến các loại thuốc thảo dược ngày càng tăng trên toàn thế giới. Trên thực tế, ngày nay, y học cổ truyền Trung Quốc cung cấp một kho tài liệu khổng lồ cho nghiên cứu dược phẩm, như trường hợp của Huperzia serrata, một thành viên của họ Huperziaceae. Điều này xem xét các báo cáo về Lycopodium alkaloid có được phân lập từ cây này. Tuy nhiên, nó chủ yếu là tập trung vào huperzine A (HupA, một lựa chọn điều trị trong một số rối loạn cấp tính và mãn tính. Mặt khác, nhóm nghiên cứu của Haudrechy và cộng sự năm 2000 và Ding và cộng sự năm 2012 đã tổng hợp toàn phần được HupA phân biệt của hai đồng phân lập thể của HupA là (-) - HupA và (+)-HupA [13] (Hình 1.2).

7 Hình 1.2. Đồng phân lập thể của huperzine A

Năm 2012, nhóm nghiên cứu của Yuan và cộng sự đã có những tiến bộ trong nghiên cứu về các thành phần hóa học của H. serrata và tác dụng dược lý của chúng [14]. Nghiên cứu này đã tinh sạch được 4 hợp chất đại diện chính của 4 loại alkaloid Lycopodium chính từ cây này phân biệt là fawcettimine (A), lycodine (B), lycopodine (C), và phlegmarine (D)

Hình 1.3. Các hợp chất đại diện của bốn loại alkaloid Lycopodium chính từ H. serrata: fawcettimine (A), lycodine (B), lycopodine (C), và phlegmarine (D)

1.1.2.2. Dƣơng xỉ diều hâu (Pteridium aquilinum)

Dương xỉ diều hâu (Pteridium aquilinum) được mô tả là một loài của

những loài thực vật phổ biến nhất trên hành tinh.

Năm 2019, Jannat và cộng sự đã chiết xuất 15 dẫn xuất pterosin (Hình 1. từ Pteridium aquilinum ức chế sự phân cắt protein tiền thân amyloid ở vị trí β

8

enzyme 1 (BACE1) và cholinesterase liên quan đến cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer. (2R) -Pterosin B ức chế BACE1, acetylcholinesterase (AChE) và butyrylcholinesterase (BChE) với IC50 là 29,6, 16,2 và 48,1 μM, tương ứng. Kết luận của nghiên cứu này gợi ý rằng một số pterosin là giá đỡ tiềm năng cho các phối tử hướng đa mục tiêu để điều trị các bênh SSTT và Alzheimer [15].

Hình 1.4. Các dẫn xuất của Pterosin phân lập được từ cây Dương xỉ diều hâu

1.1.2.3. Loài Pteris vittata

Pteris vittata là một loài thực vật có mạch trong họ Pteridaceae. Loài này được Lineus miêu tả khoa học đầu tiên năm 1753. Các công bố trước đây cho thấy loài thực vật P. vittata, thường được gọi là loài dương xỉ bản địa ở Trung Quốc, có khả năng tích lũy và chịu đựng được lượng asen (thạch tín) cao có thể giết chết các loài thực vật và động vật khác. Nhưng năm 2018, Yin và cộng sự đã đăng ký bản quyền “Ứng dụng chiết xuất P. vittata trong bào chế thuốc điều trị bệnh Alzheimer”. Đây trở thành một loại thuốc điều trị bệnh Alzheimer đóng vai trò như một chất ức chế acetylcholinesterase. Các thành phần hóa học của chiết xuất pteris vittata bao gồm apigenin, apigenin-7-O-beta-D-glucoside, luteolin, luteolin-7-O-beta-D-glucose, kaemperfol-3-O-beta-D-glucoside và beta- sitosterol (Hình 1.5). Chất ức chế acetylcholinesterase được điều chế bằng cách phối hợp các chất sau (theo trọng lượng): 10-20 phần dịch chiết P. vittata, 10-20 phần dịch chiết cây Leonurus cardiaca và 100-300 phần phụ liệu. So với kỹ thuật trước đó, sáng chế có những tác dụng có lợi sau: tỷ lệ ức chế của các thành phần hóa học khác nhau trong dịch chiết P. vittata trong việc ức chế acetylcholinesterase có thể đạt 28,9-85,1%, và tỷ lệ này hoạt động cao nhất như

9

là giá trị nhất định được cung cấp cho nghiên cứu các loại thuốc phòng ngừa và điều trị bệnh Alzheimer [16].

Hình 1.5. Các hợp chất chính được phân lập từ cây Pteris vittata

1.1.3. Hoạt tính sinh học

Tồn tại từ thời Đại Cổ sinh, từ xa xưa, các loài dương xỉ đã được sử dụng làm thuốc trong y học cổ truyền để điều trị các bệnh cảm lạnh, tiêu chảy, bỏng, chấn thương xuất huyết, bệnh giun đũa,… [17, 18]. Một vài ví dụ có thể kể đến như Drynaria bonii dùng trong điều trị các bệnh về xương khớp, Drynaria fortunei chữa thận hư, rối loạn tiêu hóa, Huperzia serrata dùng thanh nhiệt, điều trị các rối loạn về máu, nhiễm trùng, nhước cơ, tâm thần phân liệt, Ophioglossum vulgatum trị vàng da và viêm gan, Pteridium aquilinium được sử dụng để điều trị các bệnh về giun đường ruột, Phyllitis scolopendrium giúp lợi tiểu, long đờm, làm lành vết thương… [17, 19, 20]. Các nghiên cứu y học hiện đại đã chỉ ra các hoạt tính sinh học được ứng dụng phổ biến bao gồm chống oxi hóa, kháng khuẩn, kháng virus, giảm đau và chống viêm, chống ung thư và chống HIV [17, 21, 22].

1.1.3.1. Hoạt tính chống oxi hóa

Chất chống oxi hóa được định nghĩa là các chất có khả năng làm chậm hoặc hạn chế tổn thương gây ra bởi các dạng oxi hoạt động (reactive oxygen species – ROS) [23]. Dương xỉ tiếp xúc với một số áp lực được cho là tác nhân chống oxy hóa hiệu quả để chống lão hóa và các bệnh mãn tính. Hoạt tính chống oxi hóa được thể hiện bằng việc loại bỏ các gốc tự do DPPH được phát hiện ở

10

dịch chiết từ lá và thân rễ của một số chi thuộc nhiều họ khác nhau, trong đó Dryopteridaceae, Osmundaceae, Woodsiaceae thể hiện hoạt tính mạnh hơn cả [24]. Nghiên cứu năm 2015 của Carine và cộng sự đã các định được sự xuất hiện của các chất chống oxi hóa (acid chlorogenic, kaempferol, axit p-coumaric,…) trong rễ của Osmunda japonica và Pteridium aquilinum [25], Ding và cộng sự năm 2008 cũng chứng minh dương xỉ có hàm lượng phenolic cao, thể hiện hoạt tính oxi hóa mạnh tiêu biểu ở các dịch chiết Polystichum semifertile, Nothoperanema hendersonii và Braomea insignis [21].

1.1.3.2. Hoạt tính chống ung thƣ

Trong những năm gần đây, đã có rất nhiều nghiên cứu chứng minh tác dụng gây độc tế bào, tiền chết theo chương trình hoặc ngăn chặn chu kỳ tế bào của các chiết xuất thực vật không đặc trưng, bao gồm một số bài báo đề cập đến các loài dương xỉ châu Á. Ví dụ, một số hoạt tính gây độc tế bào đã được chứng minh bằng xét nghiệm MTT trên các dòng tế bào ung thư khác nhau trong phần chiết xuất từ Blechnum directionale Linn (Blechnaceae), một loài bản địa ở Đông Nam Á, bắc Australia và quần đảo Thái Bình Dương [26], và Dicranopteris linearis L. (Gleicheniaceae), phổ biến ở rừng thứ sinh và các khu vực bị phá rừng ở Đông Nam Á, Úc, Quần đảo Thái Bình Dương và Châu Phi [27]. Dịch chiết hexan từ Lygodium fleuoxum (L.) Sw. (Lygodiaceae), một loài phân bố từ Đông Nam Á đến bắc Australasia, cũng ức chế khả năng tồn tại của các tế bào ung thư gan, nơi nó tiếp tục gây ra quá trình chết theo chương trình, ức chế TNF-α và kích hoạt NF-κB [28]. Devmurari và cộng sự. (2010) đã chứng minh tác dụng ức chế của chiết xuất dung dịch ethanol từ Adiantum venustum Don (Pteridaceae) trên khối u cổ trướng Ehrlich ở chuột trong cơ thể [29]. Chiết xuất metanol từ một loài dương xỉ maidenhair khác, Adiantum caudatum L., gây độc tế bào vừa phải đối với cả ung thư và các dòng tế bào nguyên bào sợi khỏe mạnh, trong khi chiết xuất nước không hiệu quả [30]. Những nghiên cứu này có thể phục vụ như một sàng lọc đầu tiên của các nguồn thực vật đầy hứa hẹn. Tuy nhiên, để đánh giá tiềm năng thực sự của thực vật, cần phải nghiên cứu thêm bao gồm cả việc điều chế các hợp chất tinh khiết cũng như đánh giá độc tính của chúng.

11

Chiết xuất nước từ loài Cheilanthes farinosa có tác dụng ức chế đáng kể phụ thuộc vào thời gian và liều lượng đối với khả năng tồn tại của tế bào ung thư Hep3B, trong khi tác dụng gây độc trên dòng tế bào thực khuẩn vĩ mô ở chuột là không đáng kể. Chiết xuất này gây ra tổn thương DNA và kích hoạt quá trình chết theo chương trình trong các tế bào Hep3B [31].

1.1.3.3. Hoạt tính chống đái tháo đƣờng

Pterosin A là một sản phẩm tự nhiên có trọng lượng phân tử thấp được phân lập từ một số loại dương xỉ khác nhau [32]. Tác dụng điều trị đái tháo đường của nó đã được nghiên cứu trên một số mô hình chuột mắc bệnh tiểu đường, trong đó nó làm giảm hiệu quả tình trạng tăng đường huyết, không dung nạp glucose, kháng insulin, rối loạn lipid máu và phì đại tiểu đảo. Hơn nữa, nó đảo ngược sự giảm liên quan đến bệnh tiểu đường trong chuyển vị GLUT-4 từ tế bào chất sang màng trong cơ xương của chuột mắc bệnh tiểu đường. Một đường truyền tín hiệu do AMPK điều chỉnh có liên quan. Việc kích hoạt GLUT-4 cơ và ức chế biểu hiện PEPCK ở gan bởi pterosin A. Pterosin A cũng làm tăng quá trình phosphoryl hóa GSK3, tăng cường hơn nữa quá trình tổng hợp glycogen nội bào trong tế bào gan. Tác dụng chống đái tháo đường của nó có liên quan đến việc ức chế quá trình tân tạo glucose ở gan và tăng cường tiêu thụ glucose ở các mô ngoại biên. Những phát hiện này chỉ ra rằng pterosin A có thể là một lựa chọn điều trị khả thi cho bệnh tiểu đường [33]. Chai et al. (2015a) báo cáo rằng chiết xuất nước của lá P. vittata thể hiện hoạt tính kháng glucosidase vừa phải, phụ thuộc vào liều (EC 50 ± 87 µg/mL) khi so sánh với myricetin (EC 50 ± 53 µg/mL).

1.1.3.4. Hoạt tính của dƣơng xỉ trong việc điều trị các bệnh sa sút trí tuệ và Alzheimer

Huperzine A từ Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata) là một alkaloid có khả năng ức chế mạnh enzyme AChE nên sự có mặt của Huperzine A làm giảm lượng enzyme AChE có trong não. Nhờ đó, hàm lượng Acetylcholine tăng

12

lên làm cải thiện trí nhớ cho bệnh nhân. Một số báo cáo lâm sàng cũng nhận định Huperzine A tạo điều kiện dẫn truyền thần kinh cholinergic bằng cách tăng nồng độ Acetylcholine trong hệ thần kinh trung ương có tác dụng bảo vệ hệ thần kinh. Nồng độ ức chế 50% (IC50) của HupA chống lại acetylcholinesterase ở vỏ não chuột in vitro được xác định là khoảng 82 nM [34]. Giá trị này lớn hơn so với (±)-donepezil (10 nM) và ít hơn so với tacrine (93 nM).

15 dẫn xuất pterosin từ Pteridium aquilinum ức chế sự phân cắt protein tiền thân amyloid ở vị trí β enzyme 1 (BACE1) và cholinesterase liên quan đến cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer. (2R) -Pterosin B ức chế BACE1, acetylcholinesterase (AChE) và butyrylcholinesterase (BChE) với IC50 là 29,6, 16,2 và 48,1 μM, tương ứng. Kết luận của nghiên cứu này gợi ý rằng một số pterosin là giá đỡ tiềm năng cho các phối tử hướng đa mục tiêu để điều trị các bênh SSTT và Alzheimer [15].

1.1.3.5. Hoạt tính kháng khuẩn

Dương xỉ cũng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn rộng, chống lại cả vi khuẩn Gram dương (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis) và Gram âm (E. coli, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa) [35, 36]. Đặc biệt, 2 loài thuộc chi Dryopteris (D. crassirhizoma và D. filix-mas) có khả năng chống lại Streptococcus aureus kháng methicillin (MRSA) [36]. D. crassirhizoma được cấp bằng sáng chế là chất chống sâu răng ở Hàn Quốc nhờ hoạt tính chống lại Streptococcus [24]. Không chỉ các loài thuộc chi Dryopteris, một số loài dương xỉ và họ hàng của dương xỉ khác cũng được báo cáo về hoạt tính kháng khuẩn tuyệt vời trên Streptococcus mutans và S. sobrinus như A. niponicum, Polystichum lepidocaulon, Pteris cretica,… [37]. Hầu hết Pteridophytes được chứng minh có chứa các chất kháng khuẩn như polyphenols và flavonoids, thể hiện tiềm năng ứng dụng sản xuất kháng sinh của dương xỉ và họ hàng [38].

1.2. Acetylcholine, enzym Acetylcholinesterase và giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer

1.2.1. Acetylcholine

Acetylcholine (ACh) là chất trung gian hóa học có mặt trong phần lớn các khe synap thần kinh trung ương, thần kinh thực vật, thần kinh-cơ. Acetylcholine

13

tìm thấy ở hành não, cầu não, thân não, não trung gian, thể vân và vỏ não mới (nhiều nhất ở vùng vận động). Trong tủy sống, các hạch thần kinh thực vật, các tận cùng thần kinh tiếp xúc với cơ quan ngoại vi đều chứa ACh.

Hình 1.6. Các vị trí hoạt động của enzyme AChE

Acetylcholine được tổng hợp từ cholin và acetyl Coenzyme A do enzyme choline acetyl transferase xúc tác phản ứng, sau đó, được lưu giữ ở vị trí cuối dây thần kinh, trong các túi. Các chất trong túi được giải phóng khi vị trí cuối dây thần kinh bị khử cực và khi đó ACh được giải phóng vào khe synap và gắn với thụ thể. ACh sau khi được giải phóng có thời gian bán thải rất ngắn vì sự có mặt của enzym AChE. Đây là enzym thủy phân dây nối este trong phân tử ACh tạo ra cholin và acid acetic. Cholin sau đó được thu nhận lại vào tế bào thần kinh để tổng hợp ACh. Do đó, những chất có tác dụng ức chế AChE sẽ kéo dài thời gian tồn tại và thời gian tác dụng của ACh [39, 40].

Trong những năm gần đây, ACh được thấy có liên quan tới nhiều chức năng khác bên cạnh chức năng dẫn truyền thần kinh. Trong đó, ACh được xem là có liên quan đến sự tiến triển của bệnh viêm dây thần kinh và quá trình sản

14

sinh sợi amyloid, những đặc điểm điển hình được thấy trong tế bào não của bệnh nhân mắc bệnh Alzheimer [41].

1.2.2. Enzym Acetylcholinesterase

AChE, với vai trò thủy phân ACh, là một protêin có hình elip chứa một rãnh sâu, được gọi là hẻm. Quá trình thủy phân ACh được xúc tác bởi AChE diễn ra ở đáy của hẻm enzym theo cơ chế khá phức tạp. Ở đáy của hẻm, nơi xảy ra sự thủy phân cơ chất ACh, có 4 vị trí hoạt động chính là vị trí este hóa, vị trí oxy-anion, vị trí anion và túi acyl [42]. AChE là một trong những enzym thủy phân nhanh nhất. Hoạt tính của nó mạnh gấp khoảng 10 lần so với serin protease hoặc butyrylcholinesterase (BuChE) (enzym thủy phân ACh chủ yếu ở tế bào thần kinh đệm) ở cùng điều kiện nhiệt độ và pH [43].

1.2.3. Giả thuyết về vai trò hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer

15

CHƢƠNG 2- Đ I TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là mẫu cây Dương xỉ có đủ thân, lá, cơ quan sinh sản được thu hái tại Tam Đảo, Vĩnh Phúc và Quảng Bình. Sau đó, các mẫu sẽ được chuyên gia thực vật trong đề tài là Lữ Thị Ngân và Trần Thị Xuyến định danh, phân loại. Kết quả định danh các mẫu như bảng:

Bảng 2.1. Các mẫu dƣợc liệu dƣơng xỉ nghiên cứu

STT Tên mẫu dược liệu Mã mẫu dược liệu

1 Cyrtomium hemionitis DX01

2 Cyrtomium hemionitis DX02

3 Drynaria bonni DX03

4 Cyathea Podophylla DX04

5 Cyathea Podophylla DX06

6 Cyclosorus parasiticus DX07

7 Cyclosorus parasiticus DX08

Tiếp theo đó, mẫu được cố định và làm tiêu bản lưu tại Bảo tàng thiên

nhiên Việt Nam để làm cơ sở điều tra thực vật các loài nghiên cứu.

16

A B

D

17 E

Hình 2.1. Các mẫu dương xỉ nghiên cứu

(Ghi chú: A: DX01, B: DX02, C: DX03, D: DX04, E: DX06)

2.2. Hóa chất, thiết bị

2.2.1. Hóa chất

- Hóa chất dùng trong định tính: Thuốc thử vanilin/H2SO4 (Sigma-Aldrich,

Singapore)

- Dung môi: Metanol (MeOH), Etanol (EtOH), n-Hexane, Etylacetate

(EtOAc), n-butanol (BuOH) (Trung Quốc)

- Dung dịch H2SO4 10% trong MeOH 30% để phát hiện vết chất trên bản

mỏng.

- Bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1.05715) và bản mỏng

pha đảo RP-18 F254s (Merck).

- Dung dịch đệm phosphat (200mM, pH 7.7) (Sigma, Singapore)

- Enzyme Acetylcholinesterase (Merck, Đức)

- Acetylthiocholine (ACTI) (Merck, Đức)

- Acid 5-5‟-dithiobis-2-nitrobenzoic (DTNB) (Merck, Đức)

- Chất chuẩn dopenezil (Merck)

2.2.2. Thiết bị

- Cân phân tích 4 chữ số (Shimadzu, Nhật Bản)

18

- Máy siêu âm

- Đèn UV Agilent (Mỹ)

- Hệ thống máy cô quay

- Tủ sấy

- Các dụng cụ thí nghiệm thường quy: Ống nghiệm, bình nón, bình gạn,

phễu thủy tinh, cốc có mỏ, pipet...

- Các thiết bị khác: Tủ hút, bếp điện, máy chụp ảnh UV

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp xử lí và chiết xuất dược liệu

Mẫu dược liệu được thái nhỏ, sấy khô ở nhiệt độ 70oC đến khối lượng

không đổi và bảo quản trong túi nilon để nơi khô ráo, tránh ẩm.

Sau khi sấy khô, xay nhỏ, mẫu dược liệu được ngâm chiết với EtOH 80% ở nhiệt độ 40oC trong bể siêu âm trong vòng 1 giờ. Thực nghiệm chiết bằng siêu âm này được thực hiện lặp lại 3 lần với mỗi mẫu vật và gộp chung dịch chiết. Sau đó lọc loại bã dược liệu, gộp dịch chiết và cô quay dưới áp suất giảm để loại bỏ các dung môi dễ bay hơi, thu được cao dược liệu toàn phần, tiến hành cân khối lượng cao toàn phần trên cân phân tích.

Cao dược liệu toàn phần được hòa tan trong 200ml nước cất, chiết phân đoạn lần lượt với các dung môi có độ phân cực khác nhau như n-Hexane, Etylacetate, n-butanol theo tỉ lệ 1:1, mỗi dung môi thực hiện chiết 3 lần. Với mỗi mẫu vật tổng cộng sẽ có 4 loại dịch chiết sau phân lớp (3 loại dịch chiết với dung môi tương ứng và dịch cuối cùng là dịch nước sau khi chiết phân lớp với butanol). Quy trình chiết phân đoạn Dương xỉ được tóm tắt như ở hình 2.

19 Dược liệu Dương xỉ

- Etanol 80% - Chiết 3 lần

Dịch chiết

Cô quay áp suất

giảm

Cao dược liệu EtOH toàn phần

- Hòa tan trong nước

cất

- Chiết phân đoạn - Cô quay áp suất

giảm

Cắn EtOAC

Cắn BuOH

Cắn n- hexan

Hình 2.2. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn Dương xỉ

Các cao chiết sau đó được sàng lọc, định tính sơ bộ bằng phương pháp sắc

ký lớp mỏng, cụ thể như sau:

Cao chiết các phân đoạn được hòa tan với dung môi thích hợp, khảo sát các hệ dung môi chạy sắc ký lớp mỏng phù hợp để phân tách các chất trong cao chiết. Tiến hành chấm lượng khoảng 5μl cao chiết đã hòa tan trong dung môi lên bản sắc ký lớp mỏng trắng sẵn DC-Alufolien 60 F254 và RP-18 F254s.

Các chất sau đó được phát hiện bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử vanillin/H2SO4 10% trong MeOH 30% phun đều lên bản mỏng rồi sấy ở nhiệt độ cao trong vài phút cho đến khi hiện màu.

20 2.3.2. Phương pháp sàng lọc hoạt tính ức chế Acetylcholinesterase của các cao chiết

Phương pháp đo quang in vitro dùng để đánh giá tác dụng ức chế AChE được xây dựng và sử dụng trong nghiên cứu rất phổ biến hiện nay theo phương pháp của Ellman và cộng sự (1961) [44].

Nguyên tắc:

Cơ chất acetylthiocholin iodid (ACTI) bị thủy phân nhờ xúc tác của AChE tạo thiocholin. Sản phẩm thiocholin phản ứng với thuốc thử acid 5-5‟- dithiobis-2-nitrobenzoic (DTNB) tạo thành hợp chất acid 5-thio-2-nitro benzoic có màu vàng. Lượng hợp chất màu được tạo thành này tỷ lệ thuận với hoạt độ của AChE. Phương trình phản ứng được trình bày như ở hình 2:

Hình 2.3. Quá trình phản ứng diễn ra trong phương pháp đo quang trong phản ứng

Ellman

Cách tiến hành:

Thêm lần lượt từng dung dịch gồm: dung dịch đệm phosphat (200 mM, pH 7.7) + 15 µl dịch thử nghiệm + 80 µl DTNB (3.96 mg DTNB và 1,5 mg NaHCO3 hòa tan trong 10 mL phosphate đệm pH 7,7) + 10 µl AChE (2 U/mL), trộn đều hỗn hợp, ủ trong 5 phút ở 25oC. Sau đó, thêm 15 µL acetylthiocholine iodide (10,85 mg trong 5 mL phosphate buffer) và ủ lại trong 5 phút. Lắc đều, đo ngay ở bước sóng 412 nm. Hoạt độ enzym AchE được tính toán dựa trên độ hấp thụ tại bước sóng 412 ở trên. Phản ứng được thực hiện trên đĩa 96 giếng ở nhiệt độ phòng (25oC).

21

Mỗi thử nghiệm được làm lặp lại 3 lần, mỗi lần được làm trên 3 giếng. Giá trị tính toán là % giảm hoạt độ enzym so với nhóm đối chứng thông qua đo hoạt độ enzym AchE theo công thức:

I% = x 100

Trong đó: I%: phần trăm hoạt tính AChE bị ức chế

Ac: độ hấp thu của mẫu chứng

At: độ hấp thu của mẫu thử

Ao: độ hấp thu của mẫu trắng

Để có cơ sở đánh giá tác dụng ức chế AChE in vitro của mẫu nghiên cứu, dopenezil được sử dụng làm mẫu chứng dương. Hợp chất này đã được nghiên cứu và chứng minh tác dụng ức chế AChE khá mạnh được sử dụng làm mẫu chứng dương trong nhiều nghiên cứu.

22

CHƢƠNG 3- KẾT QUẢ

3.1. Quy trình chiết xuất dƣơng xỉ của các mẫu dƣợc liệu

Với mỗi mẫu dương xỉ, tôi tiến hành cân 100g bột dược liệu, ngâm chiết với EtOH 80% ở nhiệt độ 40oC trong bể siêu âm trong vòng 1 giờ. Thực nghiệm chiết bằng siêu âm này được thực hiện lặp lại 3 lần với mỗi mẫu vật và gộp chung dịch chiết. Sau đó lọc loại bã dược liệu, gộp dịch chiết và cô quay dưới áp suất giảm để loại bỏ các dung môi dễ bay hơi, thu được cao dược liệu toàn phần, tiến hành cân khối lượng cao toàn phần trên cân phân tích.

Cao dược liệu toàn phần được hòa tan trong 200ml nước cất, chiết phân đoạn lần lượt với các dung môi có độ phân cực khác nhau như n-Hexane, Etylacetate, n-butanol theo tỉ lệ 1:1, mỗi dung môi thực hiện chiết 3 lần. Với mỗi mẫu vật tổng cộng sẽ có 4 loại dịch chiết sau phân lớp (3 loại dịch chiết với dung môi tương ứng và dịch cuối cùng là dịch nước sau khi chiết phân lớp với butanol). Kết quả các cao chiết phân đoạn của các mẫu dương xỉ được thể hiện ở bảng:

Bảng 3.1. Khối lƣợng cao chiết phân đoạn với các dung môi khác nhau của các

mẫu Dƣơng xỉ thử nghiệm

STT Mẫu Khối lượng

1 DX01-nHx 1.0771g

2 DX01-EtOAc 1.0748g

3 DX02-nHX 1.0868g

4 DX02-EtOAc 1.0833g

5 Dx02-BuOH 1.0842g

6 DX03-nHX 1.0943g

7 DX03-EtOAc 1.0800g

8 DX03-BuOH 1.0788g

9 DX04-nHx 1.1180g

10 DX04-EtOAc 1.0905g

23

DX04-BuOH 1.0761g 11

DX06-nHx 1.0747 12

DX06-EtOAc 1.0273 13

DX06-BuOH 1.1004 14

DX07-nHx 1.0939g 15

DX07-EtOAc 1.0765g 16

DX07-BuOH 1.0764g 17

DX08-nHx 1.0801g 18

DX08-EtOAc 1.0785g 19

20 DX08-BuOH 1.0700g

Sau khi chiết phân đoạn, cao chiết n-hexan của mẫu dược liệu DX04 cho khối lượng lớn nhất với 1.1180g, cao chiết BuOH của mẫu DX08 cho khối lượng nhỏ nhất với 1.0700g. Điều này lý giải do các chất có độ tan khác nhau trong các dung môi, và lượng chất trong các mẫu dược liệu khác nhau. Kết quả khối lượng cao chiết sẽ được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo đối với các mẫu Dương xỉ.

Sau đó, tôi tiến hành chấm sắc ký bản mỏng với mẫu Dương xỉ thử

nghiệm là DX04, cụ thể như sau:

Cao chiết các phân đoạn được hòa tan với dung môi thích hợp, khảo sát các hệ dung môi chạy sắc ký lớp mỏng có độ phân cực phù hợp để phân tách các chất trong cao chiết. Tiến hành chấm lượng khoảng 5μl cao chiết đã hòa tan trong dung môi lên bản sắc ký lớp mỏng trắng sẵn DC-Alufolien 60 F254. Các hệ dung môi chạy sắc ký lớp mỏng có độ phân cực tăng dần như ở bảng:

Bảng 3.2. Các hệ dung môi chạy sắc ký lớp mỏng

Dung môi Tỷ lệ (v/v, v/v/v) STT

Hexane:EtOAc 1:1 1

Diclometan:MeOH 8:2 2

24

3 65:30:5 Diclometan:MeOH:H2O

4 Diclometan:MeOH 6:4

Kết quả chấm sắc ký lớp mỏng của các cao chiết phân đoạn DX04 được

thể hiện ở hình 3.1, 3.2, 3.3, 3.4:

Hình 3.1. Sắc ký đồ của các cao chiết phân đoạn DX04 với hệ dung môi Hexan:

etylacetat 1:1

(A: UV 365nm, B: UV 254nm)

25 Hình 3.2. Sắc ký đồ của các cao chiết phân đoạn DX04 với hệ dung môi diclometan:

MeOH 8:2

(A: UV 365nm, B: UV 254nm)

Hình 3.3. Sắc ký đồ của các cao chiết phân đoạn DX04 với hệ dung môi diclometan: MeOH:H2O 65:30:5

(A: UV 365nm, B: UV 254nm)

26 Hình 3.4. Sắc ký đồ của các cao chiết phân đoạn DX04 với hệ dung môi diclometan:

MeOH 6:4

(A: UV 365nm, B: UV 254nm)

Kết quả thu được cho thấy, khi tăng độ phân cực của hệ dung môi chạy sắc ký bản mỏng, sự phân tách chất của cao chiết giảm dần. Hệ dung môi n- hexane:etylacetate cho thấy sự phân tách tốt nhất, sắc ký đồ rõ ràng. Đối với các hệ dung môi có MeOH và H2O, sắc ký đồ kéo vết, không phân tách tốt. Đặc biệt, trong các hệ dung môi đó, cao chiết BuOH bị loe, kéo dài vết, không phân tách tốt.

Như vậy, kết quả khảo sát hệ dung môi chạy sắc ký bản mỏng sẽ được sử

dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.2. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế enzyme Acetylcholinesterase

Các cắn dược liệu sau khi chiết phân đoạn với các dung môi khác nhau

được bảo quản để tiến hành các thử nghiệm tiếp theo

Tiến hành đo quang theo phương pháp Ellman:

Dung dịch đệm phosphat (200 mM, pH 7.7) + 15 µl dịch thử nghiệm + 80 µl DTNB (3.96 mg DTNB và 1,5 mg NaHCO3 hòa tan trong 10 mL phosphate đệm pH 7,7) + 10 µl AChE (2 U/mL), trộn đều hỗn hợp, ủ trong 5 phút ở 25oC.

27

Sau đó, thêm 15 µL acetylthiocholine iodide (10,85 mg trong 5 mL phosphate buffer) và ủ lại trong 5 phút. Lắc đều, đo ngay ở bước sóng 412 nm. Hoạt độ enzym AchE được tính toán dựa trên độ hấp thụ tại bước sóng 412nm ở trên. Phản ứng được thực hiện trên đĩa 96 giếng ở nhiệt độ phòng (25oC).

Mỗi thử nghiệm được làm 3 lần, mỗi lần làm trên 3 giếng.

Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzyme AChE của các phân đoạn dịch

chiết của các mẫu và chất đối chứng dopenezil.

Chất chuẩn dopenezil có IC50 là 0,028 ± 0,003 μg/ml.

Các phân đoạn dịch chiết của các mẫu được trình bày trong bảng 3.3:

Bảng 3.3. Hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase của các mẫu thử

Nồng độ % ức chế tương ứng STT Tên mẫu µg/ml 128 32 8 2

1 DX01-n-Hx 23 0 0 0

2 DX01-EtoAc 21 0 0 0

3 DX02-nHx 12 0 0 0

4 DX02 - EtoAc 30 0 0 0

5 DX02-BuOH 39 25 0 0

6 DX03-nHx 15 0 0 0

7 DX03-EtoAc 21 0 0 0

8 DX03-BuOH 35 21 0 0

9 DX04-nHx 45 36 25 0

10 DX04-EtOAc 35 25 0 0

11 DX04-BuOH 30 22 0 0

12 DX06-nHx 0 0 0 0

13 DX06-EtoAc 0 0 0 0

14 DX06-BuOH 0 0 0 0

28

15 DX07-nHx 35 16 0 0

16 DX07-EtoAc 0 0 0 0

17 DX08-nHx 0 0 0 0

18 DX08-EtoAc 10 0 0 0

Kết quả cho thấy, trong 18 mẫu được thử hoạt tính ức chế AChE, có 5 mẫu không có sự ức chế enzyme, đó là các mẫu DX06 - EtOAc, DX06 – nHx, DX06 – BuOH, DX07 – EtOAC, DX08 – nHX tương ứng với các cao chiết với dung môi khác nhau của mẫu DX06, cao chiết EtOAc của mẫu DX07, cao chiết n-hexan của mẫu DX08. Như vậy, các mẫu Dương xỉ này đều không có hoạt tính.

Ở nồng độ mẫu là 2µg/ml, tất cả các mẫu đều không ức chế enzyme AChE. Nồng độ 8µg/ml có 01 mẫu thể hiện sự ức chế đối với enzyme là DX04 – nHx tương ứng với cao chiết n-hexan của mẫu DX04 với 25% hoạt tính enzyme bị ức chế. Khi tăng nồng độ mẫu gấp 4 lần, lượng mẫu có sự ức chế enzyme AChE tăng lên 06 mẫu lần lượt là DX07 – nHx, DX03 – BuOH, DX04 – BuOH, DX04-EtOAc, DX02 – BuOH, DX04 – nHX, với 16%, 21%, 22%, 25% 25%, 36% hoạt tính AChE bị ức chế. Trong đó mẫu DX04 – nHx tương ứng với cao chiết n-hexan của mẫu cây DX04 có hoạt tính tốt nhất.

Ở nồng độ 128µg/ml, lượng mẫu thể hiện hoạt tính ức chế enzyme AChE là 13 mẫu, lần lượt là DX07 – nHx, 3 mẫu cao chiết BuOH, EtOAc, n-hexan của DX02, DX03, DX04 DX08 – EtOAc. Trong đó, cao chiết n-hexan của mẫu DX04 vẫn thể hiện hoạt tính ức chế tốt nhất với 45% hoạt tính AChE bị ức chế, tiếp theo sau là cao chiết BuOH của DX02 với 39%. Trong 13 mẫu, cao chiết EtOAc của DX08 thể hiện hoạt tính thấp nhất với chỉ 10% hoạt tính AChE bị ức chế.

Như vậy, trong tất cả các mẫu được thử hoạt tính ức chế enzyme AChE, mẫu DX04 cho kết quả tốt nhất ở cả va cao chiết với các dung môi khác nhau là BuOH, n-hexan, EtOAc ở nồng độ từ 8µg/ml đến 128µg/ml. Cao chiết n-hexan của DX04 đều có hoạt tính ức chế enzyme AChE ở cả ba nồng độ. Mẫu DX08 có hoạt tính thấp nhất trong các mẫu có hoạt tính ức chế.

29

Sau khi có kết quả, chúng tôi đã tiến hành phân tách các mẫu cao chiết bằng sắc ký cột với chất hấp hụ là silicagel pha thường. Chúng tôi nhận thấy, khi phân tách mẫu, phân đoạn dịch chiết có một vết hiển thị trên bản mỏng TLC như hình, chúng tôi dự đoán có khả năng có chất sạch trong phân đoạn.

30 Hình 3.5. Phân đoạn chất trên cột khảo sát bằng TLC

Ngoài sàng lọc tác dụng ức chế enzyme AChE, chúng tôi đã tìm hiểu các tài liệu và nhận thấy dương xỉ còn có tác dụng chống oxi hoá. Chính vì vậy, chúng tôi đã tiến hành sàng lọc tác dụng chống oxi hoá của các phân đoạn chất

31

trên cột thông qua khả năng ức chế gốc tự do DPPH. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.4

Bảng 3.4. Kết quả ức chế gốc tự do DPPH của phân đoạn dịch chiết trên cột

250 µg/mL 500 µg/mL 750 µg/mL 1000 µg/mL

86,86±0,5 95,86±1,2 96,06±0,3

Ascorbic acid 82,63 ±1,6 23,43±2,5 34,94±1,5 48,48±2,4 69,89±1,2 Chất 3

16,26±0,5 38,58±1,5 43,03±1,3 44,84±2,5 Chất 7

19,19±3,2 42,82±0,7 43,84±1,7 54,65±1,8 Chất 9

41,82±0,8 42,63±0,3 56,96±0,5 65,45±3,1 Chất 10

37,78±2,4 39,39±2,0 48,28±0,8 61,82±2,7 Chất 11

40±0,7 53,83±1,6 58,98±0,9 71,82±1,8 Chất 12

12,52±2,6 22,42±0,5 42,62±1,9 62,02±2,7 Chất 14

13,13±2,3 28,68±1,2 42,42±2,1 52,65±1,9 Chất 16

33,94±0,9 42,83±1,3 54,54±1,8 65,57±2,7 Chất 17

11,71±1,4 38,38±0,9 45,65±2,6 56,87±1,4 Chất 18

20,4±0,5 45,85±1,5 49,84±1,1 59,19±0,9 Chất 19

26,46±0,2 45,05±2,6 51,71±0,6 63,33±1,5 Chất 22

Nhận xét:

Kết quả bảng 3.4 cho thấy, khả năng quét gốc tự do DPPH và tác dụng chông oxi hoá khác nhau theo nồng độ Chất 12 có tác dụng ức chế gốc tự do DPPH mạnh nhất , sau đó là chất 9 và chất 10 và 580±1,2 µg/mL. Chất 7 gần như không thể hiện hoạt tính chống oxi hoá . Song song với mẫu thử tiến hành tương tự với mẫu chứng là acid ascorbic . Kết quả sàng lọc sẽ được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo

32

CHƢƠNG 4- BÀN LUẬN

4.1. Về kết quả tạo cao chiết phân đoạn dƣơng xỉ

Dược liệu ngâm chiết với EtOH 80% ở nhiệt độ 40oC trong bể siêu âm trong vòng 1 giờ. Đây là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, phù hợp với quy mô phòng thí nghiệm. EtOH là dung môi chiết được nhiều nhóm hoạt chất, an toàn với môi trường và giá thành rẻ. Cao chiết tổng sau đó được chiết thành các cao phân đoạn với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, EtOAc, BuOH để phân tách các hợp chất một cách thuận lợi. Kết quả thu được mẫu cao chiết n-hexan của mẫu dương xỉ DX04 cho khối lượng cao nhất với 1,1180g cao chiết. Điều này chứng tỏ lượng chất tan trong dung môi n-hexane của DX04 là rất lớn. Kết quả này sẽ sử dụng vào nghiên cứu tiếp theo đối với dương xỉ.

Khi chạy khảo sát sắc ký lớp mỏng đối với mẫu dương xỉ DX04, tôi sử dụng các hệ dung môi có độ phân cực tăng dần. Đây là các dung môi rẻ, thông dụng, sử dụng nhiều trong nghiên cứu. Hệ dung môi n-hexan:etylacetat cho kết quả phân tách các chất trong cao chiết tốt nhất. Điều này chứng tỏ các chất trong cao chiết dương xỉ sẽ phân tách tốt trong hệ dung môi không phân cực. Khi tăng độ phân cực của hệ dung môi chạy sắc ký lớp mỏng, sắc ký đồ của các cao chiết có sự kéo vết, không phân tách tốt. Kết quả khảo sát hệ dung môi chạy sắc ký lớp mỏng của đề tài sẽ được sử dụng để thực hiện các nghiên cứu khác về phân lập, nghiên cứu thành phần hóa học của các mẫu Dương xỉ trong đề tài.

4.2. Về kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase của các mẫu cao chiết dƣơng xỉ

Dương xỉ là một họ lớn trên thế giới. Trong đó, các loài dương xỉ đã được sử dụng làm thuốc trong y học cổ truyền để điều trị các bệnh cảm lạnh, tiêu chảy, bỏng, chấn thương xuất huyết, bệnh giun đũa,… [17, 18]. Một vài ví dụ có thể kể đến như Drynaria bonii dùng trong điều trị các bệnh về xương khớp, Drynaria fortunei chữa thận hư, rối loạn tiêu hóa, Huperzia serrata dùng thanh nhiệt, điều trị các rối loạn về máu, nhiễm trùng, nhước cơ, tâm thần phân liệt, Ophioglossum vulgatum trị vàng da và viêm gan, Pteridium aquilinium được sử dụng để điều trị các bệnh về giun đường ruột, Phyllitis scolopendrium giúp lợi tiểu, long đờm, làm lành vết thương. … [17, 19, 20]. Các nghiên cứu y học hiện

33

đại đã chỉ ra các hoạt tính sinh học được ứng dụng phổ biến bao gồm chống oxi hóa, kháng khuẩn, kháng virus, giảm đau và chống viêm, chống ung thư và chống HIV [17, 21, 22].

AChE chủ yếu có mặt trong hệ thần kinh trung ương, xúc tác thủy phân chất dẫn truyền ACh. Quá trình này cần thiết để chuyển tế bào thần kinh hệ cholinergic từ trạng thái hoạt động sang tình trạng nghỉ [40, 42]. Ở bệnh nhân Alzheimer thấy có sự giảm trầm trọng nồng độ chất dẫn truyền thần kinh ACh. Tình trạng này gây suy giảm khả năng nhận thức đối với người bệnh. Giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic trong bệnh Alzheimer được đưa ra lần đầu tiên vào năm 1982 bởi tác giả Whitehouse và cộng sự. Sau đó, giả thuyết này nhanh chóng trở thành động lực cho quá trình nghiên cứu theo hướng cải thiện chức năng hệ cholinergic trên bệnh nhân mắc bệnh Alzheimer. Theo giả thuyết này, những chất ức chế sự hoạt động của AChE làm tăng nồng độ và thời gian hoạt động của ACh ở synap thần kinh từ đó cải thiện triệu chứng bệnh [41]. Như vậy, các thuốc nhắm vào đích tác dụng là enzyme AChE đóng vai trò quan trọng trong việc điều trị bệnh Alzheimer. Thạch tùng răng cưa (Huperzia Serrata) là một loài trong họ Dương xỉ. Huperzine A được tìm thấy trong phần chiết ra của loài Thạch tùng răng cưa là một alkaloid có khả năng ức chế mạnh enzyme AChE nên sự có mặt của Huperzine A làm giảm lượng enzyme AChE có trong não. Nhờ đó, hàm lượng Acetylcholine tăng lên làm cải thiện trí nhớ cho bệnh nhân. Một số báo cáo lâm sàng cũng nhận định Huperzine A tạo điều kiện dẫn truyền thần kinh cholinergic bằng cách tăng nồng độ Acetylcholine trong hệ thần kinh trung ương có tác dụng bảo vệ hệ thần kinh. Nồng độ ức chế 50% (IC50) của HupA chống lại acetylcholinesterase ở vỏ não chuột in vitro được xác định là khoảng 82 nM [34]. Giá trị này lớn hơn so với (±)-donepezil (10 nM) và ít hơn so với tacrine (93 nM).

C.podophylla là một loài dương xỉ thân gỗ thuộc họ Cyatheaceae. Họ Cyatheaceae gồm 650 loài được chia thành 5 lớp chính. Loài C.podophyla được mô tả lần đầu tiên vào năm 1909 [45]. Cây phân bố chủ yếu ở phía nam Trung Quốc, Đài Loan, Việt Nam, Thái Lan, Lào, Campuchia. Trên thế giới, các cây trong họ Cyatheaceae đã được nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học. Năm 2008, Mariana và cộng sự đã nghiên cứu loài Cyathea phalerata thuộc họ này. 09 hợp chất đã được phân lập trong cây gồm kaempferol-3-

34

acid, caffeic 4-O-β-D-glucopyranosyl

4-O-β-D- neohesperidoside, glucopyranosyl p-coumaric acid, 3,4-spyroglucopyranosyl protocatechuic acid, sitosterol-β-D-glucoside, β-sitosterol, kaempferol, vitexin and ethylgalactoside [46]. Cao chiết etylacetat của cây cho hoạt tính chống oxi hóa tốt nhất theo phương pháp DPPH với IC50 là 7.18µg/mL. Trong nghiên cứu của Kathakali vào năm 2019, loài Cyathea gigantea cho thấy hoạt tính kháng khuẩn với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đạt 200µg/mL đối với vi khuẩn Gram dương và 400µg/ml đối với vi khuẩn Gram âm [47].

Tuy nhiên, qua tìm hiểu, tôi nhận thấy loài C.podophylla, vốn được phân bố nhiều tại Việt Nam, chưa được nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như tác dụng sinh học. Trong nghiên cứu của chúng tôi, chúng tôi đã sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme AChE của 19 mẫu cao chiết từ 8 loại dương xỉ khác nhau bằng phương pháp của Ellman [44]. Đây là phương pháp thông dụng để nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme Acetylcholinesterase hiện nay. Kết quả cho thấy, có 07 mẫu cao chiết dương xỉ không có hoạt tính, mẫu dương xỉ DX04 tương ứng với loài C. podophylla cho hoạt tính tốt nhất. Ở nồng độ 128µg/ml, sự ức chế enzyme cho kết quả cao nhất là mẫu cao chiết n-hexan của mẫu DX04 với 45% hoạt tính enzyme bị ức chế. Cao chiết n-hexan của DX04 cũng thể hiện hoạt tính ở các nồng độ khác là 32µg/ml và 8 µg/ml.

Bên cạnh liệu pháp ức chế enzyme AChE sử dụng trong điều trị bệnh Alzheimer, liệu pháp chống oxy hoá cũng là một hướng điều trị được quan tâm. Quá trình oxy hoá kéo dài là một đặc điểm điển hình của bệnh với đặc điểm là peroxid hoá lipid, oxy hoá protein và oxy hoá ADN đều tăng cao trong não [48] Các nghiên cứu đã chỉ ra nguyên nhân của quá trình oxy hoá này chủ yếu là do protein beta-amyloid gây ra trên tế bào thần kinh nên phương hướng điều trị là sử dụng các chất chống oxy hoá. Phương pháp DPPH là một trong các phương pháp được sử dụng rộng rãi trong các mô hình nghiên cứu đánh giá khả năng chống oxy hoá của các chất trong quá trình nghiên cứu phát triển thuốc mới [49]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp DPPH để sàng lọc hoạt tính chống oxy hoá của các phân đoạn chất tách trên cột của cao chiết dương xỉ. Chất đối chứng chúng tôi sử dụng là acid ascorbic thu được giá trị IC50 của acid ascorbic là rất nhỏ.

35

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy chất 7 phân tách từ cao chiết

dương xỉ cho tác dụng chống oxy hoá mạnh nhất so với các chất còn lại

Như vậy với kết quả thu được, đề tài sẽ là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp

theo về dương xỉ và ứng dụng trong điều trị bệnh Alzheimer trong tương lai.

36

KẾT LUẬN, ĐỀ XUẤT

Kết luận

Sau quá trình nghiên cứu thực nghiệm, đề tài khóa luận đã thu được một

số kết quả như sau:

- Đã hoàn thiện quy trình chiết dược liệu Dương xỉ và khảo sát dung môi

chạy sắc ký lớp mỏng của cao chiết phân đoạn Dương xỉ.

- Đã sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme Acetylcholinesterase của các cao

chiết Dương xỉ, loài tương ứng với mẫu DX04 cho kết quả tốt nhất.

Đề xuất

- Tiếp tục nghiên cứu sàng lọc và đánh giá hoạt tính sinh học của các mẫu

Dương xỉ để bổ sung vào cơ sở dữ liệu về loài Dương xỉ

- Tiến hành nghiên cứu phân lập, xác định thành phần hóa học của của

mẫu Dương xỉ đã sàng lọc hoạt tính.

37

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Ehab A, Ibrahim M, Magdi M, et al. Alzheimer's disease and its

current treatments; Is there a possibility for a cure? 2019.

2. Vũ Bảo Xuân, Bệnh sa sút trí tuệ ngày càng tăng, Cổng thông tin

điện tử bộ Y tế. 2019

3. Trần Công Thắng, Cập nhật chẩn đoán điều trị bệnh Alzheimer,

Tạp chí hội thần kinh học Việt Nam, 2015.

Vũ Anh Nhị, Phạm Thắng. Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị sa sút trí tuệ 2018. Hội bệnh Alzheimer và Rối loạn thần kinh nhận thức Việt Nam. 2018.

Biessels G J, Despa F. Cognitive decline and dementia in diabetes mellitus: mechanisms and clinical implications. Nat Rev Endocrinol. 2018; 14(10): 591-604.

Luchsinger J A, Ryan C, Launer L J, "Diabetes and Cognitive Impairment", Diabetes in America, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (US), Bethesda (MD) interest. Dr. Luchsinger receives honoraria from Springer for his role as co-editor of the book Diabetes and the Brain. He also receives a stipend from Wolters Kluwer for his role as Editor-in-Chief of the journal Alzheimer‟s Disease and Associated Disorders., 2018.

Pruzin J J, Nelson P T, Abner E L, et al. Review: Relationship of type 2 diabetes to human brain pathology. Neuropathol Appl Neurobiol. 2018; 44(4): 347-362. 8. Gagnepain F, Humbert H, Lecomte H. Flore générale de l'Indo-

Chine. Masson. Paris. 1939. t.1.

Hộ P H. Cây cỏ Việt Nam. NXB trẻ. 1999. 1.

9. 10. Zhang L, Lu N, Zhang L-B. Leptochilus oblongus (Polypodiaceae), a new fern species from northern Vietnam. Phytotaxa. 2015; 234: 195.

11. Mehltreter K, "Fern conservation", 2010, 323-359.

12. Conway S J, Di Stilio V S. An ontogenetic framework for functional studies in the model fern Ceratopteris richardii. Developmental Biology. 2020; 457(1): 20-29.

13. Ferreira A, Rodrigues M, Fortuna A, et al. Huperzine A from Huperzia serrata: a review of its sources, chemistry, pharmacology and toxicology. Phytochemistry Reviews. 2016; 15(1): 51-85.

14. Yuan J Q, Zhou X L, Wang S, et al. Advances in studies on chemical constituents of Huperzia serrata and their pharmacological effects. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 2012; 43: 399-407.

15.

Jannat S, Balupuri A, Ali M Y, et al. Inhibition of β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1 and cholinesterases by pterosins via a specific structure-activity relationship with a strong BBB permeability. Exp Mol Med. 2019; 51(2): 1-18.

16. Gupta K, Srivastava S, Saxena G, et al. Application of Pteris vittata L. for phytoremediation of arsenic and biomonitoring of the process through cyto-genetic biomarkers of Trigonella foenum-graecum L. Physiology and Molecular Biology of Plants. 2022; 28.

17. Ho R, Teai T, Bianchini J-P, et al. Ferns: from traditional uses to pharmaceutical development, chemical identification of active principles. Working with ferns: issues and applications. 2010: 321-346.

18. Wu C, Zhou T, Xiao P. A compendium of new China herbal

medicine. Shanghai Science and Technology Press, Shanghai. 1990; 3: 43.

19. Pham T N T, Mai Đ T, Huynh T M N, et al. Drybonioside, a new glucoside from the Drynaria bonii H. Christ Rhizomes. Natural Product Research. 2015; 29(2): 137-140.

20. Bích Đ H, Chung Đ Q, Chương B X, et al. Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam Tập II. Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật. 2004. 1252.

21. Ding Z T, Fang Y S, Tai Z G, et al. Phenolic content and radical scavenging capacity of 31 species of ferns. Fitoterapia. 2008; 79(7-8): 581- 583.

22. Bajracharya G B, Bajracharya B. A comprehensive review on

Nepalese wild vegetable food ferns. Heliyon. 2022: e11687.

23. Chang H-C, Huang G-J, Agrawal D C, et al. Antioxidant activities and polyphenol contents of six folk medicinal ferns used as “Gusuibu”. Botanical studies. 2007; 48(4): 397-406.

24. Lee C H, Shin S L. Functional activities of ferns for human

health. Working with ferns: Issues and applications. 2010: 347-359.

25. Dion C, Haug C, Guan H, et al. Evaluation of the anti- inflammatory and antioxidative potential of four fern species from China intended for use as food supplements. Natural Product Communications. 2015; 10(4): 1934578X1501000416.

26. Lai H Y, Lim Y Y, Kim K H. Blechnum orientale Linn - a fern with potential as antioxidant, anticancer and antibacterial agent. BMC Complement Altern Med. 2010; 10: 15.

27. Zakaria Z A, Mohamed A, Mohd N, et al. In vitro cytotoxic and antioxidant properties of the aqueous, chloroform and methanol extracts of Dicranopteris linearis leaves. African Journal of Biotechnology. 2011; 10.

28. Wills P J, Asha V V. Chemopreventive action of Lygodium flexuosum extract in human hepatoma PLC/PRF/5 and Hep 3B cells. Journal of Ethnopharmacology. 2009; 122(2): 294-303.

29. Viral D, Shivanand P, Jivani N P. Anticancer Evaluation of

Adiantum venustum Don. Journal of Young Pharmacists. 2011; 3(1): 48-54.

30. Uddin S J, Grice I D, Tiralongo E. Cytotoxic effects of bangladeshi medicinal plant extracts. Evid Based Complement Alternat Med. 2011; 2011: 578092.

31. Radhika N K, Sreejith P S, Asha V V. Cytotoxic and apoptotic activity of Cheilanthes farinosa (Forsk.) Kaulf. against human hepatoma, Hep3B cells. J Ethnopharmacol. 2010; 128(1): 166-171.

32. Sunkar R, Zhu J K. Novel and stress-regulated microRNAs and

other small RNAs from Arabidopsis. Plant Cell. 2004; 16(8): 2001-2019.

33. Hsu F-L, Huang C-F, Chen Y-W, et al. Antidiabetic Effects of Pterosin A, a Small-Molecular-Weight Natural Product, on Diabetic Mouse Models. Diabetes. 2012; 62.

34. Wang H, Tang X C. Anticholinesterase effects of huperzine A,

E2020, and tacrine in rats. Zhongguo Yao Li Xue Bao. 1998; 19(1): 27-30.

35. Banerjee R, Sen S. Antibiotic activity of pteridophytes.

Economic Botany. 1980; 34(3): 284-298.

36. Lee H B, Kim J C, Lee S M. Antibacterial activity of two phloroglucinols, flavaspidic acids AB and PB, from Dryopteris crassirhizoma. Archives of pharmacal research. 2009; 32: 655-659.

37. Shin S. Functional components and biological activities of Pteridophytes as healthy biomaterials. Chungbuk National University, Cheongju, Korea, PhD Diss. 2010: 75-83.

38. San Francisco M, Cooper-Driver G. Anti-microbial activity of phenolic acids in Pteridium aquilinum. American Fern Journal. 1984; 74(3): 87-96.

39. 2012 Alzheimer's disease facts and figures. Alzheimers Dement.

2012; 8(2): 131-168.

40. Phan Đ V, Hương N T G, Thông N T. Dược lý học. NXB Giáo

dục Việt Nam. 2011. 1.

41. Peng L, Rong Z, Wang H, et al. A novel assay to determine acetylcholinesterase activity: The application potential for screening of drugs against Alzheimer's disease. Biomed Chromatogr. 2017; 31(10).

42. Houghton P J, Ren Y, Howes M J. Acetylcholinesterase

inhibitors from plants and fungi. Nat Prod Rep. 2006; 23(2): 181-199.

43. Grossberg G T. Cholinesterase inhibitors for the treatment of Alzheimer's disease:: getting on and staying on. Curr Ther Res Clin Exp. 2003; 64(4): 216-235.

44. Ellman G L, Courtney K D, Andres V, et al. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochemical Pharmacology. 1961; 7(2): 88-95. 45. The plant lists. 2010. 46. Hort M A, DalBó S, Brighente I M C, et al. Antioxidant and Hepatoprotective Effects of Cyathea phalerata Mart. (Cyatheaceae). 2008; 103(1): 17-24.

47. Nath K, Talukdar A D, Bhattacharya M K, et al. Cyathea gigantea (Cyatheaceae) as an antimicrobial agent against multidrug resistant organisms. BMC Complementary and Alternative Medicine. 2019; 19(1): 279.

48. Moreno AO, Dorantes L, Galíndez J, Guzmán RI. Effect of different extraction methods on fatty acids, volatile compounds, and physical and chemical properties of avocado (Persea americana Mill.) oil. J Agric Food Chem. 2003 Apr 9;51(8):2216-21.

49. Đàm Trung Bảo. Các gốc tự do. Tạp chí dược học. 2001; 6: 29-