Khóa luận: Khảo sát thành phần hóa học cây phèn đen Phyllanthus reticulatus Poir. họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC 

CỬ NHÂN HÓA HỌC Chuyên ngành: HÓA HỮU CƠ

ĐỀ TÀI: KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY PHÈN ĐEN PHYLLANTHUS RETICULATUS POIR., - HỌ THẦU DẦU (EUPHORBIACEAE)

Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thị Ánh Tuyết Sinh viên thực hiện : Trần Thanh Vương Lớp : Hóa Hữu Cơ 4C MSSV : 35106059

Tp Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2013

LỜI CẢM ƠN

Hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, em xin chân thành cảm ơn:

 Cảm ơn Cô Nguyễn Thị Ánh Tuyết đã theo sát, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, cung

cấp kiến thức và động viên em trong suốt thời gian thực hiện đề tài khóa luận tốt

nghiệp. Được Cô hướng dẫn là một may mắn lớn của em trong năm học cuối cùng

này tại trường Đại học Sư phạm. Em xin cảm ơn Cô!

 Cảm ơn Thầy Dương Thúc Huy, Cô Lê Thị Thu Hương đã giúp đỡ và cho em

những ý kiến quý báu để em hoàn thành đề tài của mình.

 Cảm ơn tất cả quý Thầy Cô khoa Hóa đã tận tình dạy dỗ em trong suốt bốn năm

qua để em có kiến thức hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình.

 Cảm ơn các bạn Liêu Diệp Hân, Trần Thị Kim Liên, Lương Thị Thủy đã giúp đỡ,

chia sẻ cùng em những khó khăn, vui buồn trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

 Cảm ơn ba mẹ và cả gia đình đã nuôi nấng, dạy dỗ, là chỗ dựa tinh thần vững vàng

nhất giúp em vượt qua mọi khó khăn và đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để em hoàn

thành đề tài khóa luận tốt nghiệp này.

Xin gửi lời chúc tốt đẹp nhất đến mọi người!

MỤC LỤC

MỤC LỤC ....................................................................................................................... ii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................. v

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU .......................................................................................... vi

DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................................ vii

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ........................................................................................... viii

DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................................... ix

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC ......................................................................................... x

LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................................... 3

1.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CÂY PHÈN ĐEN ..................................................... 4

1.1.1. Mô tả chung ........................................................................................................ 4

1.1.2. Vùng phân bố, thu hái ......................................................................................... 4

1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH ............................................................. 4

1.2.1. Dược tính theo y học cổ truyền .......................................................................... 5

1.2.2. Các nghiên cứu về dược tính của một số loài thuộc chi Phyllanthus ................. 5

1.3. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC ...................................... 6

1.3.1. Phyllanthus acidus .............................................................................................. 7

1.3.2. Phyllanthus acuminatus ...................................................................................... 7

1.3.3. Phyllanthus amarus L. ........................................................................................ 7

1.3.4. Phyllanthus discoides ......................................................................................... 8

1.3.5. Phyllanthus emblica L. ........................................................................................ 8

1.3.6. Phyllanthus flexuosus ......................................................................................... 8

1.3.8. Phyllanthus myrtifolius ....................................................................................... 9

1.3.9. Phyllanthus niruroides ........................................................................................ 9

1.3.10. Phyllanthus niruri L. .......................................................................................... 9

1.3.11. Phyllanthus oxyphyllus ....................................................................................... 9

1.3.12. Phyllanthus polyanthus ....................................................................................... 9

1.3.13. Phyllanthus sellowianus ................................................................................... 10

1.3.14. Phyllanthus simplex .......................................................................................... 10

1.3.15. Phyllanthus tenellus .......................................................................................... 10

1.3.16. Phyllanthus urinaria ......................................................................................... 10

1.3.17. Phyllanthus watsonii ......................................................................................... 10

CHƯƠNG II. THỰC NGHIỆM ................................................................................... 24

2.1. NGUYÊN LIỆU ............................................................................................... 25

2.1.1. Thu hái nguyên liệu .......................................................................................... 25

2.1.2. Xử lý mẫu nguyên liệu...................................................................................... 25

2.2. HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ ............................................................................. 25

2.2.1. Hoá chất ............................................................................................................ 25

2.2.2. Thiết bị .............................................................................................................. 25

2.3. PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ........................................................................ 26

2.3.1. Phương pháp phân lập các hợp chất ................................................................. 26

2.3.2. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất ...................................... 26

2.4. ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO ........................................................................... 26

2.5. CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO ETHYL ACETATE .... 27

2.5.1. Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate ........................................................ 27

2.5.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3 của bảng 1 ....................................... 28

2.5.3. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3.2 của bảng 2 .................................... 28

2.5.4. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3.3 của bảng 2 .................................... 29

CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 32

3.1. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT V3 .......................... 33

3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT V1 .......................... 35

CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................................. 41

iii

4.1 KẾT LUẬN....................................................................................................... 42

4.2 ĐỀ XUẤT ......................................................................................................... 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 44

PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 49

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Mũi đơn s Singlet

Mũi đôi d Doublet

Mũi ba t Triplet

Mũi đa m Multiplet

Mũi đơn rộng br s Broad singlet

Mũi đôi rộng br d Broad doublet

Coupling constant Hằng số ghép cặp J

Reversed Phase C-18 Pha đảo C-18 RP – 18

Một phần triệu ppm Par per million

Retention factor Rf

Chemical shift Độ dịch chuyển hóa học

δ 1H-NMR Proton (1) Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

13C-NMR

Resonance của proton (1)

Carbon (13) Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Resonancecủa carbon (13)

DEPT Distortionless Enhancement by

Polarization Transfer

HSQC Heteronuclear Single Quantum Phổ tương tác dị nhân qua một

Coherence liên kết

HMBC Heteronuclear Multiplet Bond Phổ tương tác dị nhân qua hai,

Coherence ba liên kết

H-H COSY H-H Correlation SpectroscopY Phổ tương quan giữa proton-

proton

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU

Ac Acetone

Chloroform CHCl3, C

EA Ethylacetate

ED Ether dầu hỏa

MeOH, Me Methanol

EtOH, Et Ethanol

SKC Sắc ký cột

SKLM Sắc ký lớp mỏng

g Gam

mg Miligam

Hz Herzt

MHz Mega Herzt

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1. Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate (EA) .............................................. 30

Bảng 2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3 của bảng 1 ..................................... 30

Bảng 3. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3.4 của bảng 2 .................................. 31

Bảng 4. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3.3 của bảng 2 .................................. 32

Bảng 5. Số liệu phổ NMR của V3 ................................................................................. 42

Bảng 6. Số liệu phổ NMR của V1 ................................................................................. 43

vii

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1. Qui trình điều chế cao ether dầu hoả và ethyl acetate (EA) ........................... 29

Sơ đồ 2. Sơ đồ cô lập các chất hữu cơ trong cao ethyl acetate của cây Phèn đen ........ 33

viii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1. Trái phèn đen ..................................................................................................... 4

Hình 2. Thân, lá phèn đen ............................................................................................... 4

Hình 3. Tương quan HMBC của hợp chất V3 ............................................................... 37

Hình 4. Tương quan HMBC của hợp chất V1 ............................................................... 41

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Phổ 1H-NMR của hợp chất V3 Phụ lục 2. Phổ 13C-NMR của hợp chất V3

Phụ lục 3. Phổ DEPT của hợp chất V3

Phụ lục 4. Phổ COSY của hợp chất V3

Phụ lục 5. Phổ HSQC của hợp chất V3

Phụ lục 6. Phổ HMBC-NMR của hợp chất V3 Phụ lục 7. Phổ 1H-NMR của hợp chất V1 Phụ lục 7a. Phổ 1H-NMR của hợp chất V1 Phụ lục 7b. Phổ 1H-NMR của hợp chất V1 Phụ lục 8. Phổ 13C-NMR của hợp chất V1 Phụ lục 8a. Phổ 13C-NMR của hợp chất V1 Phụ lục 8b. Phổ 13C-NMR của hợp chất V1

Phụ lục 9. Phổ DEPT của hợp chất V1

Phụ lục 10. Phổ COSY của hợp chất V1

Phụ lục 11. Phổ HSQC của hợp chất V1

Phụ lục 11a. Phổ HSQC của hợp chất V1

Phụ lục 11b. Phổ HSQC của hợp chất V1

Phụ lục 12. Phổ HMBC của hợp chất V1

Phụ lục 12a. Phổ HMBC của hợp chất V1

Phụ lục 12b. Phổ HMBC của hợp chất V1

Phụ lục 13. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất V1

LỜI MỞ ĐẦU

Ngày nay, cùng với sự phát triển vượt bậc của khoa học kỹ thuật, ngành hóa học

đóng một vai trò rất quan trọng trong sự phát triển của xã hội. Bằng những con đường

khác nhau, các nhà hóa học đã tạo ra những sản phẩm có ứng dụng trong các lĩnh vực

như: y học, dược học, sinh học và nông nghiệp,… Tuy nhiên, những sản phẩm được tạo

ra bằng cách tổng hợp mặc dù có kết quả nhưng lại gây ra nhiều tác dụng phụ cho con

người và môi trường. Vì thế, hóa học các hợp chất thiên nhiên ngày càng được quan tâm

hơn. Các nhà hóa học đã tiến hành tách chiết, cô lập, bán tổng hợp ngày càng nhiều

những hợp chất có hoạt tính sinh học để tạo ra những sản phẩm hữu ích từ cây cỏ để

nâng cao chất lượng cuộc sống.

Các nghiên cứu trước đây cho thấy những loài thuộc chi Phyllanthus chứa nhiều

loại hợp chất có hoạt tính sinh học như: alkaloid, triterpenoid, tannin, lignan,

sesquiterpen,…Ngoài ra, Y học dân gian đã phát hiện khoảng 20 loại cây cỏ có khả năng

chữa trị viêm gan, đặc biệt trong đó là các loài thuộc chi Phyllanthus (họ Thầu dầu,

Euphorbiaceae) [4].

Cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir.) là thực vật thuộc chi Phyllanthus

được dùng trong Y học cổ truyền của Việt Nam và nhiều nước trên thế giới. Các bộ phận

của cây đều được sử dụng làm thuốc: rễ Phèn đen thường được dùng trị lỵ, viêm ruột,

ruột kết hạch, viêm gan, viêm thận và trẻ em bị cam tích… Lá thường dùng chữa sốt, kiết

lỵ, tiêu chảy, phù thũng, ứ huyết do đòn ngã, huyết nhiệt sinh đinh nhọt… Vỏ thân được

dùng để chữa lên đậu có mủ và tiểu tiện khó khăn…

Với mong muốn đi sâu hơn làm sáng tỏ kinh nghiệm sử dụng trong dân gian, nâng

cao tính hiệu quả, an toàn của dược liệu, đưa dược liệu vào sử dụng một cách khoa học

hơn và có thể đẩy mạnh khai thác sử dụng cây thuốc này vào việc phòng và chữa bệnh

cho nhân dân trong cộng đồng nên chúng tôi quyết định chọn cây Phyllanthus reticulatus

Poir. để làm đề tài nghiên cứu. Hy vọng rằng kết quả nghiên cứu sẽ mang lại những hiểu

biết mới về mặt hóa thực vật của cây Phèn đen, cũng như qua đó góp phần làm tăng giá

trị ứng dụng của cây vào thực tế cuộc sống.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CÂY PHÈN ĐEN [2]

Tên thông thường: Phèn đen

Tên gọi khác: Nỗ, Sáp tràng thảo, Tảo phàn diệp, Diệp hạ châu mạng.

Thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)

Tên khoa học: Phyllanthus reticulatus Poir.

Hình 1: Trái phèn đen Hình 2: Thân, lá phèn đen

1.1.1. Mô tả chung [2]

Phèn đen là cây bụi mọc tự nhiên ở bờ bụi, ven đường, ven rừng, cây cao 2-4m,

cành gầy mảnh đen nhạt, đôi khi họp từ 2 đến 3 cành trên cùng một đốt dài 10-20cm.

Lá có hình dạng thay đổi, hình trái xoan, hình bầu dục hay hình trứng ngược nhọn,

hay tù ở hai đầu, phiến lá rất mỏng, dài 1,5 - 3cm, rộng 6 - 12mm, mặt trên có màu sẫm

hơn mặt dưới, lá kèm hình tam giác hẹp.

Cụm hoa hình chùm, mọc dưới nách lá, riêng lẻ hay xếp 2-3 cái một. Quả hình

cầu, khi chín màu đen, dài 5 mm, rộng 3 mm. Hạt hình 3 cạnh, màu nâu, có những đốm

rất nhỏ. Cây ra hoa kết quả từ tháng 8 -10 hàng năm.

1.1.2. Vùng phân bố, thu hái [2]

Phèn đen là loài cây nhiệt đới nên có phân bố rất rộng, vùng Đông Nam Á, Nam

Trung Quốc, Tây và Nam Phi.

Ở nước ta, Phèn đen mọc thành bụi tự nhiên, có thể tìm dễ dàng ở bờ bụi ven

đường, ven rừng.

1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH

Các loài cây thuộc chi Phyllanthus (Euphorbiaceae) được sử dụng rộng rãi trong y

học dân tộc của nhiều nước như chữa bệnh thận, tiểu đường, viêm gan B,…[8]. Trong đó,

các loài được dùng làm thuốc nhiều hơn cả là Phyllanthus urinaria L., Phyllanthus

reticulatus Poir. và Phyllanthus amarus Schum et Thonn [5].

1.2.1. Dược tính theo y học cổ truyền [2,6]

Phèn đen vị đắng chát, tính mát, có tác dụng làm se, giảm đau, sát khuẩn, giải độc.

Chủ trị làm thuốc cầm máu, chữa đậu mùa, chữa viêm cầu thận, chữa lỵ, tiêu chảy. Trong

đó rễ phèn đen có vị chát, tính lạnh, có tác dụng tiêu viêm, thu liễm, chỉ tả. Lá Phèn đen

có tác dụng thanh nhiệt giải độc, sát trùng, lợi tiểu…

Chữa kiết lỵ: dùng rễ cây Phèn đen, dây mơ lông, cỏ seo gà, cỏ tranh bằng nhau,

mỗi vị 20g, gừng 2 lát 2g - sắc uống (Nam dược thần hiệu).

Chữa bị đòn máu ứ ở trong nguy cấp: lá Phèn đen giã nhỏ, chế rượu vào và vắt lấy

nước uống (Bách gia trân tàng), hoặc dùng 40g sắc rồi chế thêm một chén rượu - uống.

Chữa nhọt độc mới phát: lá Phèn đen và lá Bèo ván giã nát rồi đắp (Bách gia trân

tàng).

Chữa nhiệt tả và lỵ: cây Phèn đen cả cành và lá, đậu đen sao, mỗi thứ 40g, đổ 4 bát

nước sắc lấy 1 bát, chia ra uống làm 3 lần (Hoạt nhân toát yếu của Hoàng Đôn Hòa).

Chữa đại tiện ra máu: cây Phèn đen cả cành và lá, thái nhỏ 3 bát, sắc đặc uống

(Bách gia trân tàng).

Chữa chảy máu nướu răng: lá Phèn đen phối hợp với lá Long não và lá Xuyên

tiêu phơi khô, chế thành viên rồi ngậm.

Trị rắn cắn: lá Phèn đen tươi nhai nát nuốt hết nước rồi lấy bã đắp lên chỗ rắn cắn.

1.2.2. Các nghiên cứu về dược tính của một số loài thuộc chi Phyllanthus

Ở Quảng Tây Trung Quốc, cây Phyllanthus reticulatus Poir. (Euphorbiaceae) là

một loại thuốc được sử dụng để chống viêm khớp và điều trị bệnh thấp khớp [44].

Năm 1997, E. Omulokoki và cộng sự [14] đã sử dụng dịch chiết từ lá của loài

Phyllanthus reticulatus Poir. để khảo sát khả năng chống ký sinh trùng sốt rét

Plasmodium falciparum ở nồng độ thử nghiệm cho kết quả IC50 < 10µg/ml.

Năm 2010, một số báo cáo đã chứng minh rằng các chất chiết xuất của lá cây

Phyllanthus reticulatus Poir. có tác dụng ngăn ngừa bệnh đái tháo đường, kháng khuẩn

gây độc tế bào và bảo vệ gan [28].

• Dược tính của một số cây khác cùng chi:

Năm 1961, Phòng Đông Y - Viện Vi trùng Việt Nam, nghiên cứu tác dụng kháng

sinh của cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L.) cho thấy kết quả tác dụng kháng

sinh như sau: Tụ cầu trùng (0,5 cm), Salmonella typhi (0,9 cm), Shigella flexneri

(1,1cm), Shigella sonnei (0 cm), Shigella shigae (1cm), Bacillus subtilis (0,4 cm),

Escherichia coli (0 cm) [7].

Năm 1988, Blunberg và cộng sự [1] đã nghiên cứu tác dụng của hai loài cây chó

đẻ răng cưa là Phyllanthus amarus và Phyllanthus niruri trên các bệnh nhân viêm gan

siêu vi B. Kết quả cho thấy có 22/37 bệnh nhân âm tính sau 30 ngày điều trị bằng hai loài

chó đẻ răng cưa trên. Các tác giả còn chứng minh cây Phyllanthus amarus có chứa chất

làm ức chế men pelymerase DNA của virus viêm gan siêu vi B.

Năm 2002, Nguyễn Bá Kinh và cộng sự [3] công bố kết quả nghiên cứu lâm sàng

trên bệnh nhân viêm gan mãn tính. Chế phẩm LIV/94 được sản xuất từ 3 loại thảo dược:

chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L.), cây chua ngút (Embelia ribes Burn) và cỏ nhọ

nồi (Ecliptaprostrata L.) được dùng để điều trị cho các bệnh nhân viêm gan mãn tính

trong 2 năm (2001-2002). Kết quả nghiên cứu cho thấy thuốc có tác dụng làm giảm và

sạch HBsAg của bệnh nhân.

Bên cạnh đó, năm 2007 các nhà khoa học Ấn độ đã khảo sát khả năng chống oxi

hóa từ dịch chiết methanol của 5 loài Phyllanthus là: Phyllanthus debilis, Phyllanthus

urinaria, Phyllanthus virgatus, Phyllanthus maderaspatensis, Phyllanthus amarus. Kết

quả cho thấy các dịch chiết này đều thể hiện tính kháng oxi hóa [24].

1.3. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC

Chi Phyllanthus, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) có trên 700 loài gồm từ những cây

thân thảo đến cây bụi hay cây gỗ nhỏ. Ở Việt Nam có 44 loài, các loài đáng được chú ý

nhiều hơn cả là Phyllanthus urinaria L. (cây Chó đẻ răng cưa), Phyllanthus reticulatus

Poir. (cây Phèn đen) và Phyllanthus amarus Schum et Thonn. (cây Diệp hạ châu đắng).

Thành phần hoá học của chi này rất phong phú và đa dạng [10].

Năm 1976, Wai-Haan Hui và cộng sự [46] đã cô lập được 21-α-hydroxyfriedel-

4(23)-en-3-one (61), β-sitosterol (43), friedelin-1β,22β-diol (58) và glochidonol (60) khi

nghiên cứu trên loài Phyllanthus reticulatus Poir.

Năm 1981, Joshi và cộng sự [19] đã phân lập được các hợp chất kém phân cực

như friedelin (57), betulin (55) và β-sitosterol (43) từ rễ và thân cây Phyllanthus

reticulatus Poir.

Năm 2009, Phan Văn Dân [7] khảo sát thành phần hóa học cây Phyllanthus

reticulatus Poir. Kết quả cho thấy rằng cây Phyllanthus reticulatus Poir. có chứa các hợp

chất β-sitosterol (43), β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (44), 2-acetamido-3-

phenylpropyl 2-benzamido-3-phenylpropanoate (76).

Năm 2012, J. Xiong Ma và cộng sự [21] đã phân lập được hai arylnaphthalene

lignan glycoside từ dịch chiết methanol của cây Phyllanthus reticulatus Poir., đó là

reticulatusides A (40) và reticulatusides B (41). Ngoài ra, tác giả còn đề cập tới sự hiện

diện của syringaresinol (42) trong cây này.

Do chưa có nhiều công trình nghiên cứu trên cây Phèn đen (Phyllanthus

reticulatus Poir.) nên chúng tôi chỉ trình bày thành phần hoá học của một số cây khác

cùng chi.

1.3.1. Phyllanthus acidus

Năm 1966, Sengupta và cộng sự [37] phân lập được hai pentacyclic triterpenoid,

đó là: phyllanthol (74) và olean-12-en-3β-ol (β-amyrin) (51).

1.3.2. Phyllanthus acuminatus

Năm 1984 - 1985, Pettit và cộng sự [31,32] đã tách được phyllanthostatin 1 (32),

phyllanthostatin 2 (33), phyllanthostatin 3 (34), phyllanthostatin 4 (35) và

phyllanthostatin 5 (36).

Năm 1990, Pettit và cộng sự [30] cũng đã cô lập được phyllanthostatin 6 (37) .

1.3.3. Phyllanthus amarus L.

Năm 1995, Yeap Foo [25] phân lập được acid amariinic (45).

Năm 1996, Peter J. Houghton và cộng sự [29] đã tách được 2 alkaloid mới là

isobubbialine (4) và epibubbialine (2) cùng với 3 alkaloid đã biết là phyllanthine (11),

securinine (13) và nor-securinine (9). Cấu trúc của chúng được xác định dựa vào phân

tích các dữ liệu phổ UV, IR, phổ MS và NMR.

Năm 2005 và 2007, Herbert Kolodziej và Farah Naaz [15,17] cô lập được acid

shikimic (88) và epigallocatechin gallate (16).

Năm 2008, Thales R.Cipriani và cộng sự [43] phân lập được acid thiobarbituric

(14) và acid ascorbic (77).

1.3.4. Phyllanthus discoides

Năm 1973, Manske và cộng sự [26] đã tách được phyllanthin (38) và 2 alkaloid là

phyllanthine (11) và phyllantidine (12).

Năm 1983, Aripova và cộng sự [38] đã cô lập được phyllalbine (10).

Năm 1988, Calixto và cộng sự [10] phân lập được 14,15-dihydroallosecurinine-

15β-ol (1) tinh thể màu vàng da cam.

1.3.5. Phyllanthus emblicaL.

Năm 1992, Kumar Roy và cộng sự [23] đã cô lập được acid ascorbic (77).

Năm 1995, Mekkawy [13] phân lập được putranjivain A (50).

Năm 1996, Ghosal [16] đã tách được phyllanemblinin A (48) là chất bột màu

trắng, emblicanin-A (46) và emblicanin-B (47).

Năm 1988, Calixto và cộng sự [10] đã cô lập được acid 2-O-galloylgalactaric (80)

và acid galloylmalic (81).

Năm 2000, Zhang và cộng sự [53] đã tách được prodelphinidin A1 (49).

Năm 2002, Zang và cộng sự [54] đã phân lập được 1-([2-O-β-D-glucopyranoside]-

4,6-dihydroxyphenyl)-2-metylpropan-1-one (82) ở dạng tinh thể và 1-({2-O-[D-

apiofuranosyl)-(16)-D-glucopyranoside]}-4,6-dihydroxyphenyl)-2-metylpropan-1-one

(83) là chất vô định hình màu vàng.

Năm 2006, Ying-Jun Zhang [51] đã tách được acid phyllaemblic (87).

Năm 2008, Xiaoli Liu và cộng sự [49] đã phân lập từ dịch chiết methanol được

quercetin (22) và catechin (15), đây là hai chất có hoạt tính chống oxi hóa cao.

1.3.6. Phyllanthus flexuosus

Năm 1993, Tanaka và các cộng sự [42] đã phân lập được 5 triterpenoid có tên gọi

như sau: olean-12-en-3β,15α-diol (70); lup-20(29)-en-3β,24-diol (66); olean-12-en-3β,

24-diol (71); oleana-11,13(18)-dien-3β,24-diol (73), olean-12-en-3β,15α,24-triol (72),

betulin (55) và lup-20(29)-en-3β,15α-diol (67).

1.3.7. Phyllanthus fratermus

Năm 1988, Shunyo Matsunaga và cộng sự [40] công bố đã tách được acid

trichadenic B (75).

Năm 1997, Rajasubramaniam cùng các cộng sự [33] đã tách được acid indole-3-

butyric (5) và acid 1-naphthaleneacetic (84).

1.3.8. Phyllanthus myrtifolius

Năm 1999, Chen Lui và cộng sự [12] đã phân lập và nhận danh được 4-O-

brevifolincarbonyl-1-O-galloyl-3,6-O-hexahydroxydiphenoyl-D-glucopyranos (78) .

1.3.9. Phyllanthus niruroides

Năm 1996, Babady Bila và cộng sự [9] đã phân lập được một hợp chất mới thuộc

nhóm alkaloid là niruroidine (2,7-diepimer) (8).

1.3.10. Phyllanthus niruri L.

Năm 1986, Joshi và cộng sự [20] đã tách được nirurine (7) và 4-methoxy-nor-

securinine (6).

Năm 1991, Satyanarayana và Venkateswarlu [36] đã tách được 4 diarylbutane

lignan: 2,3-desmethoxy seco-isolintetralin (24), 5-desmethoxyniranthin (25), linnanthin

(39) và cuối cùng là demethylenedioxyniranthin (26).

Năm 2007, tại vùng Đình Bảng, Từ Sơn, Bắc Ninh từ phần dịch chiết ethyl acetate

đã phân lập được hai chất là: 2,4,6-cyclohepta-trien-2,3,7-trihydroxy-5-ethoxy-1-one (79)

và 5,7,8-trihydroxy-9,10-peroxy-4-ethoxybenzo[2,3-d]coumarin (89) [5].

Năm 2008, Shakil và Pankaj [39] đã tách được 2 flavanone: 8-(3- methyl-but-2-

enyl)-2-phenylchroman-4-one (21) và 2-(4-hydroxyphenyl)-8-(3-methyl-but-2-enyl)-

chroman-4-one (19) có khả năng làm thuốc chữa bệnh gút (gout) và bệnh thận.

1.3.11. Phyllanthus oxyphyllus

Năm 2003, Sutthivaiyakit và cộng sự [41] đã tách được: acid 29-nor-3,4-seco-

friedelantriterpen (68) và guaiane (85). Những hợp chất này được đánh giá là có khả năng

chống oxi hóa tốt ở nồng độ IC50= 0.017 ± 0.001 mM.

1.3.12. Phyllanthus polyanthus

Năm 2008, Vuyelwa J.N. và cộng sự [45] đã tìm ra được một số triterpenoid gồm:

(20S)-3β-acetoxy-24-methylenedammaran-20-ol (54), lupenone (63) và (20S)-3α-

acetoxy-24-methylenedammaran-20-ol (53).

1.3.13. Phyllanthus sellowianus

Năm 2002, Hnatyszyn [18] đã phân lập được rutin (23) và isoquercitrin (20).

1.3.14. Phyllanthus simplex

Năm 1998, Rajkishor S. Negi và Thawra M. Fakhir [34] đã phân lập được (14-

hydroxy-4-methoxy-13,14-dihydronorsecurinine) (3) và phyllanthin (38). Chất (3) đã và

đang được sử dụng làm thuốc Tây y dạng viên nén (sản phẩm có tên là simplexin), phổ

biến trên thị trường.

1.3.15. Phyllanthus tenellus

Theo luận văn cao học của Phan Văn Dân [7], năm 1971, 1972, 1974, các tác giả

lần lượt là Asakawa, Bick và Bilia đã phân lập được tenellus-1 (17) và tenellus-2 (18).

1.3.16. Phyllanthus urinaria

Năm 2000, Zhang L.Z. và cộng sự [52] đã tách được một số triterpenoid như:

lupeol acetate (64), β-amyrin (51), β-amyrylglucosid (52) và lupeol (62).

Năm 2003, Chang và cộng sự [11] đã cô lập được 2,3-desmethoxy seco-

isolintetralin diacetate (27), linnanthin (39), phyllanthin (38), hypophyllanthin (28),

niranthin (29), nirtetralin (30) và phyltetralin (31). Cấu trúc của các hợp chất này được

xác định bằng cách thuỷ giải và dựa vào các dữ liệu phổ khối lượng và phổ cộng hưởng

từ hạt nhân.

Năm 2005, Wanxing Wei và cộng sự [47] đã phân lập được acid

pentahydroxybenzoic (86).

1.3.17. Phyllanthus watsonii

Năm 1992, Matsunaga và Tanaka [27] đã tách được hợp chất triterpen: 26-nor-

D:A-friedooleanane (69) cùng với một số hợp chất khác là: lupenyl palmitate (65),

friedelin (57), epi-friedelanol (56), glochidone (59), glochidonol (60), lupeol (62) và lup-

20(29)-en-3β,24-diol (66).

Các công thức cấu tạo một số hợp chất trong chi Phyllanthus

• Các alkaloid

H3CO

14,15-Dihydroallosecurinine-15-ol (1) Epibubbialine (2)

(14-Hydroxy-4-methoxy-13,14- Isobubbialine (4)

CH3

COOH

N H

dihydronorsecurinine) (3)

4-Methoxy-nor-securinine (6)

Acid indole-3-butyric (5)

Nirurine (7)

Niruroidine (8)

CH3

H3CO

nor-Securinine(9)

N H

Phyllantidine (12)

Securinine (13)

Acid thiobarbituric (14)

Phyllalbine (10) Phyllanthine (11)

• Các flavonoid

Epigallocatechin gallate (16)

Catechin (15)

Flavonoide tenellus-1 (17)

CH3

3''

2''

1''

1 O

Flavonoide tenellus-2 (18)

Isoquercitrin (20)

2-(4-Hydroxyphenyl)-8-(3-metyl- but-2-enyl)-chroman-4-one (19)

CH3

3''

2''

1''

1 O

Quercetin (22)

CH3

8-(3-Methyl-but-2-enyl)-2- phenylchroman-4-one (21)

Rutin(23)

CH2OCH3

CH2OH

CH2OCH3

CH2OH

OCH3

• Các lignan

CH2OCOCH3

CH2OCH3

CH2OCOCH3

OCH3

2,3-Desmethoxy seco-isolintetralin (24) 5-Desmethoxyniranthin (25)

Demethylenedioxyniranthin (26) 2,3-desmethoxy seco-isolintetralin

diacetate (27)

CH2OCH3

H3CO

CH2OCH3

H3CO

OCH3

CH2OCH3

H3CO

CH2OCH3

H3CO

CH2OCH3

H3CO

OCH3

Hypophyllanthin (28) Niranthin (29)

CH3

CH3 O

CH3

O OH

CH2OH

CH3

Nirtetralin (30) Phyltetralin (31)

Phyllanthostatin 1(32) Phyllanthostatin 2 (33)

CH3

O OH

CH3

CH2OH

CH3

CH2OH

CH3

Phyllanthostatin 3 (34) Phyllanthostatin 4 (35)

CH2OCH3

H3CO

CH2OCH3

OCH3

Phyllanthostatin 5 (36) Phyllanthostatin 6 (37)

Phyllanthin (38) Linnanthin (39)

HOH2C

H3CO

CH2OH

H3CO

Reticulatusides A (40)

OCH3

H3CO

Reticulatusides B (41)

Syringaresinol (42)

CH3

• Các steroid

β-Sitosterol (43)

CH3

CH2OH

β-Sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (44)

OH OH

CH3

• Các tannin

HOH2C

Acid amariinic (45) Emblicanin-A (46)

Emblicanin-B (47) Phyllanemblinin A (48)

Prodelphinidin A1 (49) Putranjivain A (50)

CH3

CH3 CH3

CH3

CH2OH

CH3

CH2OH

• Các triterpenoid

CH2

CH3

CH3 H

CH3

H CH3

β-Amyrin (51) β-Amyrylglucosid (52)

(20S)-3α-Acetoxy-24- (20S)-3β-Acetoxy-24-

methylenedammaran-20-ol (53) methylenedammaran-20-ol (54)

CH3

CH2

CH3

CH2OH

CH3

Epi-friedelanol (56)

CH3

Betulin (55)

CH3

CH2

H H

CH3

H CH3

CH3

Friedelin (57) Friedelin-1β,22β-diol (58)

CH3

CH2

CH3

CH3 CH3

CH3

CH2

21-α-Hydroxyfriedel-4(23)-en-3-one (61)

Glochidone (59) Glochidonol (60)

Lupeol (62)

CH3

CH2

CH3

CH3 CH3

CH3

H H

CH3 CH3

CH3

Lupenone (63) Lupeol acetate (64)

CH3

CH2

CH3

CH3 CH3

CH3

CH2OH

Lupenyl palmitate (65)

COOH

CH3

CH2

CH3

CH3 CH3

CH3

HOOC

CH3

CH2

CH3

Lup-20(29)-en-3β,24-diol (66) Lup-20(29)-en-3β,15α-diol (67)

Acid 29-nor-3,4-seco-friedelantriterpen (68) 26-Nor-D:A-friedooleanane (69)

CH3

CH2OH

CH3

CH3 CH3

CH3

CH2OH

CH3

Olean-12-en-3β,15α-diol (70) Olean-12-en-3β, 24-diol (71)

CH3

HOOC

CH3

Olean-12-en-3β,15α,24-triol (72) Oleana-11,13(18)-dien-3β,24-diol (73)

Phyllanthol (74) Acid trichadenic B (75)

CH3

• Các chất khác

Acid ascorbic (77)

2-Acetamido-3-phenylpropyl 2- benzamido-3-phenylpropanoate (76)

4-O-brevifolincarbonyl-1-O-galloyl-3,6-O-hexahydroxydiphenoyl-

OC2H5

D-glucopyranos (78)

Acid 2-O-galloylgalactaric (80)

CH3

2,4,6-cyclohepta-trien-2,3,7-trihydroxy-5- ethoxy-1-one (79)

Acid galloylmalic (81)

CH3

1-([2-O-β-D-glucopyranoside]-4,6- dihydroxyphenyl)-2-metylpropan-1-one (82)

Acid 1-naphthaleneacetic (84)

1-({2-O-[(D-apiofuranosyl)-(1-6)-D- glucopyranoside]}-4,6-dihydroxyphenyl)- 2-metylpropan-1-one (83)

CH3

OCH2CH3

COOH

Guaiane (85) Acid pentahydroxybenzoic (86) Acid phyllaemblic (87)

Acid shikimic (88) 5,7,8 - trihydroxy-9,10-peoxy-4-

ethoxybenzo[2,3-d] coumarin (89)

CHƯƠNG II

THỰC NGHIỆM

2.1. NGUYÊN LIỆU

2.1.1. Thu hái nguyên liệu

Mẫu cây dùng trong khảo sát thành phần hóa học là lá, thân và rễ cây Phèn đen

(Phyllanthus reticulatus Poir.) được thu hái tại huyện Tân Uyên, Bình Dương, vào tháng

7/2012.

Mẫu cây đã được GS.TS Võ Văn Chi nhận danh tên khoa học là “Phyllanthus

Reticulatus Poir.”, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae).

2.1.2. Xử lý mẫu nguyên liệu

Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, phơi khô trong bóng râm,

rồi xay thành bột mịn, đem sấy đến khối lượng không đổi. Sau đó tiến hành ngâm chiết

và phân lập các hợp chất.

2.2. HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ

2.2.1. Hoá chất

Silica gel: silica gel 60, 0,04-0,06 mm, Merck dùng cho cột sắc ký.

Silica gel pha đảo, RP-18, Merck dùng cho sắc ký cột.

Sắc ký bảng mỏng loại 25DC – Aflufolein 20×20, Kiesel gel 60F254, Merck;

sắc ký bảng mỏng loại 25DC, RP-18, Merck.

Dung môi dùng cho quá trình thí nghiệm gồm: ether dầu hoả, ethanol, chloroform,

ethyl acetate, acetone, methanol và nước cất.

Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên bảng mỏng: sử dụng H2SO4 30%.

2.2.2. Thiết bị

Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu.

Các cột sắc ký.

Máy cô quay chân không hiệu Heidolph.

Bếp cách thuỷ.

Đèn soi UV: bước sóng 254 nm và 365 nm.

Cân điện tử hiệu Sartorius max 620 g.

2.3. PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

2.3.1. Phương pháp phân lập các hợp chất

- Sử dụng kỹ thuật SKC silica gel pha thường, pha đảo Rp-18 kết hợp SKLM.

- Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng

thuốc thử là dung dịch H2SO4 30%.

2.3.2. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125

MHz), 2D-NMR đo trên máy Bruker Avance tại Phòng thí nghiệm Phân tích trung tâm,

Đại học Khoa học Tự nhiên, số 227 Nguyễn Văn Cừ, Q.5, Tp.Hồ Chí Minh.

- Khối phổ phân giải cao HR-ESI-MS đo trên máy Bruker micrOTOF Q-II.

2.4. ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO

Lá, thân và rễ cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir.) được phơi khô, chặt

nhỏ và nghiền thành bột mịn, sấy khô đến khối lượng không đổi (m = 26.00 kg).

Nguyên liệu bột mịn được tận trích với ethanol 960 bằng phương pháp ngâm dầm,

sau đó đem lọc và cô quay loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cao ethanol thô

(534.00 g).

Cao ethanol thô được chiết lỏng – lỏng với ether dầu hoả, ethyl acetate thu được

cao ether dầu hoả (52.00 g), cao ethyl acetate (118.00 g). Quá trình thực hiện được tóm

tắt theo sơ đồ 1.

Bột lá, thân và rễ phèn đen

m = 26.00 kg

- Ngâm dầm trongethanol

- Lọc

Bã khô

Sơ đồ 1. Qui trình điều chế cao ether dầu hoả và ethyl acetate (EA)

Dịch ethanol

Cô quay thu hồi dung môi

Ethanol

Cao ethanol

còn lại

(534.00 g)

- Chiết lỏng-lỏng với ether

dầu hoả, ethyl acetate

- Cô quay thu hồi dung môi

Cao ether dầu hoả ED

Cao ethyl acetate EA

(52,00 g)

(118,00 g)

2.5. CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO ETHYL

ACETATE

2.5.1. Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate

Thực hiện SKC silica gel trên cao ethyl acetate (118,00 g) với hệ dung môi rửa

giải ED:EA có độ phân cực tăng dần từ 20% - 100% ethyl acetate. Dịch giải ly qua cột

được hứng vào các lọ.

Theo dõi quá trình giải ly bằng sắc kí lớp mỏng. Những lọ cho kết quả sắc kí lớp

mỏng giống nhau được gộp chung thành 1 phân đoạn. Kết quả thu được 4 phân đoạn

(EA.1 - EA.4), được trình bày trong bảng 1.

Bảng 1. Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate (EA)

Sắc ký lớp mỏng Ghi chú Phân đoạn Dung môi giải ly

ED:EA = 4:1 ED:EA = 7:3 ED:EA = 1:1 EA = 100% EA.1 EA.2 EA.3 EA.4 Trọng lượng (g) 86,00 7,90 2,53 2,65 Vệt dài Nhiều vết, tách không rõ Nhiều vết, tách rõ Nhiều vết Chưa khảo sát Chưa khảo sát Khảo sát Chưa khảo sát

Ghi chú: ED (ether dầu hỏa), EA(ethyl acetate)

2.5.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3 của bảng 1

Sắc kí lớp mỏng trên phân đoạn EA.3 (2.53 g, bảng 1) cho nhiều vết, các vết tách

rõ nên phân đoạn EA.3 được SKC silica gel với hệ dung môi rửa giải ED:C có độ phân

cực lần lượt tăng dần từ 80 – 90% C. Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ.

Theo dõi quá trình giải ly bằng sắc kí lớp mỏng. Những lọ cho kết quả sắc kí lớp

mỏng giống nhau được gộp chung thành 1 phân đoạn. Kết quả thu được 4 phân đoạn

(EA.3.1 - EA.3.4), được trình bày trong bảng 2.

Bảng 2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3 của bảng 1

Sắc ký lớp mỏng Ghi chú Phân đoạn Dung môi giải ly Trọng lượng (mg)

20 mg EA.3.1 ED:C = 1:4 Nhiều vết, kéo dài

EA.3.2 ED:C = 1:4 116 mg Vết tím rõ, lẫn dơ

EA.3.3 ED:C = 1:4 119 mg Vết tím rõ, lẫn dơ

EA.3.4 ED:C = 1:9 167 mg Nhiều vết, lẫn dơ Chưa khảo sát Khảo sát thu được V3 Khảo sát thu được V1 Chưa khảo sát

Ghi chú: C (chlorofom), ED (ether dầu hỏa)

2.5.3. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3.2 của bảng 2

Thực hiện SKC silica gel trên phân đoạn EA.3.2 (116 mg) của bảng 2 với hệ dung

môi rửa giải ED:C có độ phân cực tăng dần từ 60-90% C. Dịch giải ly qua cột được hứng

vào các lọ.

Theo dõi quá trình giải ly bằng sắc kí lớp mỏng. Những lọ cho kết quả sắc kí lớp

mỏng giống nhau được gộp chung thành 1 phân đoạn. Kết quả thu được 3 phân đoạn

(EA.3.2.1 - EA.3.2.3), được trình bày trong bảng 3.

Bảng 3. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3.4 của bảng 2

Sắc ký lớp mỏng Ghi chú Phân đoạn Dung môi giải ly Trọng lượng (mg)

32 mg EA.3.2.1 ED:C = 2:3 Nhiều vết dơ, mờ

EA.3.2.2 ED:C = 1:4 21 mg Vết tím, tách rõ

EA.3.2.3 ED:C = 1:9 29 mg Vết dơ, mờ Chưa khảo sát Khảo sát, thu được V3 Chưa khảo sát

Ghi chú: C (chlorofom), ED (ether dầu hỏa)

Nhận xét:

Từ phân đoạn EA.3.2 của bảng 2, sắc kí cột thu được 3 phân đoạn sắp xếp theo

thứ tự EA.3.2.1 - EA.3.2.3.

Trong đó, phân đoạn B.3.2.2 có sắc kí lớp mỏng cho vết rõ đẹp màu tím ẩn dưới

vết dơ mờ. Thực hiện sắc kí cột silica gel pha thường nhiều lần kết hợp với sắc ký điều

chế trên phân đoạn này thu được chất ở dạng gum, không màu (8.0 mg).

Kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng với nhiều hệ dung môi, hiện hình bằng H2SO4

30%, đun nóng chỉ thu được 1 vết rõ, màu tím, Rf = 0,4 (dung môi giải ly C100%). Hợp

chất này được ký hiệu là V3.

2.5.4. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3.3 của bảng 2

Thực hiện SKC silica gel trên phân đoạn EA.3.3 (119 mg) của bảng 2 với hệ dung

môi rửa giải ED:C có độ phân cực lần lượt tăng dần từ 60 – 100% C. Dịch giải ly qua cột

được hứng vào các lọ.

Theo dõi quá trình giải ly bằng sắc kí lớp mỏng. Những lọ cho kết quả sắc kí lớp

mỏng giống nhau được gộp chung thành 1 phân đoạn. Kết quả thu được 3 phân đoạn

(EA.3.3.1 - EA.3.3.3), được trình bày trong bảng 4.

Bảng 4. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3.3 của bảng 2

Sắc ký lớp mỏng Ghi chú Phân đoạn Dung môi giải ly Trọng lượng (mg)

43 mg EA.3.3.1 ED:C = 2:3 Nhiều vết dơ, mờ

EA.3.3.2 ED:C = 1:4 35 mg Vết tím, tách rõ

EA.3.3.3 C = 100% 16 mg Vết dơ, mờ Chưa khảo sát Khảo sát, thu được V1 Khảo sát

Ghi chú: C (chlorofom), ED (ether dầu hỏa)

Nhận xét:

Từ phân đoạn EA.3.3 của bảng 2, sắc kí cột thu được 3 phân đoạn sắp xếp theo

thứ tự EA.3.3.1 - EA.3.3.3.

Trong đó, phân đoạn EA.3.3.2 có sắc kí lớp mỏng cho vết rõ đẹp màu tím ẩn dưới

vết dơ mờ. Thực hiện sắc kí cột silica gel pha thường nhiều lần trên phân đoạn này thu

được hợp chất dạng bột, màu trắng (25.0 mg).

Kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng với hệ dung môi khác nhau, hiện hình bằng H2SO4

30%, đun nóng chỉ thu được một vết rõ, màu tím, Rf = 0,35 (dung môi giải ly C100%).

Kết tinh lại trong MeOH thu được hợp chất ký hiệu là V1.

Sơ đồ 2. Sơ đồ cô lập các chất hữu cơ trong cao ethyl acetate của cây Phèn đen

Cao ethyl acetate EA (118,00 g)

- Sắc ký cột silica gel - Giải ly: ED:EA - Cô quay thu hồi dung môi

Phân đoạn EA.1 86,00 g

Phân đoạn EA.2 7,90 g

Phân đoạn EA.4 2,65 g

Phân đoạn EA.3 2,53 g

- Sắc ký cột silica gel - Giải ly: ED:C - Cô quay thu hồi dung môi

Phân đoạn EA.3.4

Phân đoạn EA.3.2

Phân đoạn EA.3.3

20.00 mg

167.00 mg

Phân đoạn EA.3.1

116.00 mg

119.00 mg

- Sắc ký cột silica gel - Giải ly: ED:C, C100% - Cô quay thu hồi dung môi

- Sắc ký cột silica gel - Giải ly: ED:C - Cô quay thu hồi dung môi

Phân đoạn EA.3.2.3 29.00 mg

Phân đoạn EA.3.3.1 43.00 mg

Phân đoạn EA.3.3.3 16.00 mg

Phân đoạn EA.3.2.2 21.00 mg

Phân đoạn EA.3.3.2 35.00 mg

Phân đoạn EA.3.2.1 32.00 mg

- Sắc ký cột silica gel nhiều lần - Giải ly: ED:C

V3 (8.0 mg)

V1 (25.0 mg)

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT V3

Hợp chất V3 (8.0 mg) thu được từ phân đoạn EA.3.2.2 của sơ đồ 2 có những đặc

điểm sau:

- Chất ở dạng gum, không màu.

- Sắc ký lớp mỏng cho một vết duy nhất với Rf = 0.4 trong hệ giải ly C100%, hiện

hình bằng đèn UV; sau đó phun thuốc thử H 2SO4 30%, đun nóng, cho vết màu tím.

- Phổ 1H-NMR (CDCl3), (phụ lục 1 và bảng 5), δH 6.58 (2H, s, H-2, H-6); 4.73

(1H, d, J=3.5Hz, H-7); 4.28 (2H, dd, J=9.0/7.0 Hz, H-9); 3.09 (1H, m, H-8).

- Phổ 13C-NMR kết hợp với DEPT (CDCl3), (phụ lục 2, 3 và bảng 5), δC 147.3

(=C<, C-3, C-5); 134.5 (=C<, C-4); 132.3 (=C<, C-1); 102.9 (>CH-, C-2, C-6); 86.2

(>CH-, C-7); 71.9 (-CH2-, C-9); 54.5 (>CH-, C-8). Độ chuyển dịch hóa học của các

carbon khác được trình bày cụ thể trong bảng 5.

- Phổ COSY, HSQC, HMBC (CDCl3) (phụ lục 4, 5, 6)

 BIỆN LUẬN CẤU TRÚC:

Phổ 1H-NMR của V3 xuất hiện mũi đơn tại δH 6.58 (2H, s, H-2, H-6) của một vòng

benzene mang 4 nhóm thế tại 1, 3, 4 và 5. Tín hiệu mũi đơn tại δH 5.49 (1H, s) không cho

tương quan HSQC đến carbon nào, thể hiện đó là proton của 1 nhóm hydroxyl. Tín hiệu

mũi đơn tại δH 3.90 (6H, s) thể hiện có sự hiện diện của 2 nhóm methoxy.

Ngoài ra, phổ 1H-NMR còn thể hiện các tín hiệu proton bão hòa, đặc trưng của

khung diepoxytetrahydrofuran lignan tại δH 4.73 (1H, d, J = 3.5 Hz, H-7); 4.28 (1H, dd, J

= 9.0/7.0 Hz, H-9a); 3.90 (1H, m, H-9b); 3.09 (1H, m, H-8).

Phổ 13C-NMR kết hợp với DEPT chỉ thể hiện 8 tín hiệu carbon, gồm các carbon

thơm ở vùng từ trường thấp, carbon methine mang oxygen tại δC 86.2 (C-7), carbon

methylene mang oxygen tại δC 71.7 (C-9), carbon methine bão hòa tại δC 54.5 (C-8), 2

nhóm methoxy tại δC 56.5.

Phổ COSY cho thấy sự tương quan giữa proton δH 3.09 (H-8) với proton δH 4.73

(H-7) và 4.28 (H-9).

Phổ HSQC thể hiện sự tương quan giữa proton có δH 6.58 (H-2 và H-6) với carbon

tại δC 102.9 (C-2 và C-6); proton cộng hưởng tại δH 4.73 (H-7) tương quan với carbon δC

86.2 (C-7); proton tại δH 4.28 và 3.90 (2H, H-9) tương quan với carbon δC71.9 (C-9);

proton có δH 3.09 (H-8) tương quan với carbon δC 54.5 (C-8).

Như vậy, V3 được dự đoán là một lignan có cấu trúc đối xứng loại bicyclooctane.

Phổ HMBC giúp kết nối các carbon hình thành cấu trúc phân tử. Tương quan

HMBC từ tín hiệu δH 4.73 (H-7 và H-7') đến tín hiệu δC 102.9 (C-2,C-6 và C-2', C-6')

cho biết vòng thơm gắn vào diepoxytetrahydrofuran tại vị trí 7 và 7'.

Các nhóm methoxy gắn vào vòng thơm được xác định bởi tương quan HMBC từ tín

hiệu δH 3.90 (6H, s) đến tín hiệu δC 147.3 (C-3, C-5).

Theo tác giả Robert S. Ward [35], trong tự nhiên, hóa học lập thể của H-8 và H-8'

trong cấu hình các epoxytetrahydrofuran lignan luôn có cấu hình cis.

Theo tác giả Kotaro Takahashi [22], hóa học lập thể tại C-7 và C-7' có thể xác định

dựa vào hằng số ghép giữa H-7/H-8 và H-7'/H-8'. Nếu J7,8 < 5.5 Hz thì H-7 và H-8 ở vị

trí trans với nhau.

Trong trường hợp của hợp chất V3, hằng số ghép J7,8 = 3.5 Hz nên H-7 và H-8 ở vị

trí trans với nhau. Hóa học lập thể tại 2 vị trí C-7 và C-7' giống nhau do V3 có cấu trúc

đối xứng, phổ nghiệm chỉ thể hiện một nửa phân tử.

Việc phân tích các dữ liệu phổ nghiệm của V3 và so sánh với số liệu phổ nghiệm

của syringaresinol [48] được trình bày trong bảng 5 cho thấy có sự tương đồng. Vì vậy,

OCH3

H3CO

OCH3

H3CO

OCH3

H3CO

OCH3

V3 được đề nghị là syringaresinol.

H3CO

OCH3

H3CO

OCH3

H3CO

OCH3

H3CO

Hình 3. Tương quan HMBC của hợp chất V3

(+)-Syringaresinol (-)-Syringaresinol

3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT V1

Hợp chất V1 (25.0 mg) thu được từ phân đoạn EA.3.2.3 của sơ đồ 2 có những đặc

điểm sau:

- Chất bột, màu trắng.

- Sắc ký lớp mỏng cho 1 vết duy nhất với Rf = 0.35 trong hệ giải ly C100%, hiện

hình bằng đèn UV; sau đó phun thuốc thử H 2SO4 30%, đun nóng, cho vết màu tím.

- Phổ 1H-NMR (CDCl3), (phụ lục 7, 7a, 7b và bảng 6), δH 7.92 (1H, s, H-6);

7.03/7.01(1H, s, H-3); 6.91 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5'); 6.77/6.73 (1H, br s, H-2'); 6.71

(1H, s, H-6'); 6.06/6.02 (2H, s, H-10'); 5.48 và 5.43 (2H, d, J = 15.0/15.0 Hz, H-9); 5.29

(1H, br, s, H-4"); 4.96 (1H, dd, J = 10.0/3.5 Hz, H-3"); 4.82 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-1");

4.25 (1H, m, H-2"); 4.03/3.58 (2H, m, dd, J = 12.0/1.5 Hz, H-5").

- Phổ 13C-NMR kết hợp với DEPT (CDCl3), (phụ lục 8, 8a, 8b, 9 và bảng 6), δC

170.7 (>C=O); 170.3 (>C=O); 170.0 (>C=O); δC 152.1 (=C<, C-5); 150.0 (=C<, C-4);

144.3 (=C<, C-7); 131.2 (=C<, C-8); 130.8 (=C<, C-1); 127.1 (=C<, C-2); 106.3 (>CH-,

C-3); 101.3 (C-6); δC 147.6 (=C<, C-3', C-4'); 136.7/136.8 (=C<, C-7'); 128.3 (=C<, C-

1'); 123.6/123.7 (=CH-, C-6'); 119.1/119.2 (=C<, C-8'); 110.7 (=CH-, C-2'); 108.2 (=CH-,

C-5'); δC 105.4 (>CH-, C-1"); 69.9 (>CH-, C-2"); 68.1 (>CH-, C-4"); 73.2 (>CH-, C-3");

64.7 (-CH2-, C-5"); 110.0 (-O-CH2-O-); 67.5 (-CH2-, C-9). Độ chuyển dịch hóa học của

các carbon khác được trình bày trong bảng 6.

- Phổ COSY, HSQC, HMBC (CDCl3) (phụ lục 10, 11, 11a, 11b, 12, 12a, 12b).

- Phổ HR-ESI-MS (phụ lục 13) cho mũi ion giả phân tử ở m/z = 619.1430

[M+Na]+.

 BIỆN LUẬN CẤU TRÚC:

Phổ 1H-NMR của hợp chất V1 thể hiện tín hiệu cộng hưởng của 5 proton vòng thơm

trong vùng δH 7.92 – 6.71. Trong đó, hai proton cộng hưởng dưới dạng mũi đơn tại δH

7.92 (1H, s, H-6); 7.03/7.01 (1H, s, H-3). Tín hiệu cộng hưởng của vòng benzene mang 3

nhóm thế ở vị trí 1, 3 và 4 [ δH 6.91 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5'); 6.77 và 6.73 (1H, br s, H-

2'); 6.71 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-6')].

Hai proton tại δH 6.06 (1H, s) và 6.02 (1H, s) cho tương quan với HSQC carbon δC

101.0.

Hai proton không tương đương của nhóm methylen mang oxygen cộng hưởng tại δH

5.48 (1H, m, H-9a) và 5.43 (1H, m, H-9b). Một proton anomer cộng hưởng tại δH 4.82

(1H, d, J = 8.0 Hz, H-1"). Các proton >CH-O- của phân tử đường cộng hưởng trong vùng

δH 5.29 – 3.19.

Phổ 13C-NMR kết hợp với DEPT (CDCl3) cho thấy V1 có 3 carbon >C=O cộng

hưởng tại δC 170.7; 170.3; 170.0; 5 carbon vòng benzene mang oxygen xuất hiện ở δC

152.1 (C-5), 150.3 (C-4), 147.6 (C-3' và C-4') và 119.1/119.2 (C-8') và nhóm

methylendioxy tại δC 101.0 (-O-CH2-O-).

Tín hiệu cộng hưởng của phân tử đường 5 carbon gồm một carbon anomer ở δC

105.4 (C-1"); ba carbon mang oxygen của phân tử đường cộng hưởng tại δC 73.2 (C-3");

68.1 (C-4"); 64.7 (C-5") và một carbon methylen mang oxygen tại δC 67.5 (C-9).

Ngoài ra, phổ 13C và DEPT còn cho thấy có 2 nhóm methoxy tại δC 56.4 và 55.9;

hai carbon methyl của nhóm acetoxy ở δC 21.0 (-CH3-, 4"-OAc) và 20.9 (-CH3-, 3"-

OAc).

Phổ HSQC thể hiện sự tương quan giữa proton δH 7.92 (1H, s, H-6) với carbon ở δC

101.3 (C-6); proton ở δH 7.03 (1H, s, H-3) tương quan với carbon δC 106.3 (C-3).

Ba proton của vòng benzene còn lại ở δH 6.91 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5'); 6.77 (1H,

br s, H-2'); 6.71 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-6') tương quan HSQC lần lượt với các carbon ở δC

108.2 (C-5'); 110.7 (C-2') và 123.6/123.7 (C-6').

Phổ 13C, DEPT và HSQC còn cho thấy một số tín hiệu cộng hưởng của carbon xuất

hiện cặp đôi như δC 136.8/136.7 (C-7'); 123.6/123.7 (C-6'); 119.1/119.2 (C-8').

Phổ HMBC cho thấy sự tương quan từ hai proton ở δH 5.49; 5.42 (H-9) đến carbon

tại δC 170.0 (>C=O, C-9') và δC 119.2 (=C<, C-8'). Proton ở δH 6.06 (1H, s); 6.02 (1H, s)

tương quan đến carbon δC 147.6 (=C<, C-3' và C-4').

Từ các dữ liệu phổ trên cho phép dự đoán V1 là một lignan dạng arynaphthalen có

gắn 1 phân tử đường 5 carbon.

Sự tương quan từ proton đến carbon trong phổ HMBC giúp xác định thêm cấu trúc

của V1.

Proton ở δH 7.03 (1H, s, H-3) có tương quan HMBC đến δC 150.3 (C-4) và 127.1

(C-2). Tương tự, proton ở δH 7.92 (1H, s, H-6) có tương quan HMBC đến carbon δC

152.1 (C-5) và 136.8 (C-1). Hai nhóm methoxy ở δH 4.00 (3H, s); 3.77 (3H, s) tương

quan HMBC đến carbon δC 152.1 (C-5) và 150.3 (C-4). Như vậy, 2 nhóm methoxy gắn

tại vị trí C-4 và C-5.

Từ các dữ liệu phổ nghiệm trên, kết hợp so sánh với số liệu phổ của các dẫn xuất

của diphyllin cho thấy có sự tương đồng nên chúng tôi đề nghị V1 là glycoside có phần

aglycon là diphyllin.

Proton anomer ở δH 4.82 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-1") của phân tử đường tương quan

HMBC tới carbon δC 144.3 (C-7) khẳng định phân tử đường gắn vào aglycon qua vị trí

C-7.

Phổ COSY cho thấy sự tương quan giữa proton ở δH 4.25 (1H, m, H-2") với proton

anomer tại δH 4.82 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-1"). Các tương quan khác trong phổ COSY giúp

xác định vị trí các proton và carbon của phân tử đường.

Phổ HMBC cho thấy tương quan từ proton tại δH 4.96 (1H, dd, J = 10.0/3.5 Hz, H-

3") đến carbon ở δC 170.3 (4"-OAc); proton tại δH 5.29 (1H, br, s, H-4") tương quan đến

carbon δC 170.7 (3"-OAc), nên tại vị trí C-3" và C-4" của phân tử đường đã bị acetyl hóa.

Proton anomer (H-1") và proton (H-3") có hằng số ghép lần lượt bằng 8.0 Hz và

10.0/3.5 Hz, kết hợp với proton (H-4") cho cộng hưởng dưới dạng mũi đơn rộng nên

phân tử đường là α-L-arabinose.

Phổ HR-ESI-MS cho phân tử ion giả ở m/z = 919.1430 [M+Na]+, phù hợp với công

thức phân tử (C30H28O13 + Na) với M = 619.1428, sai số 0.0002.

Qua việc phân tích các dữ liệu phổ nghiệm của hợp chất V1 và so sánh việc phân

tích các dữ liệu phổ của 4-O-arabinopyranosydiphyllin [50] cho thấy có sự tương đồng,

ngoại trừ hợp chất V1 có 2 nhóm –OAc gắn vào vị trí 3", 4" của phân tử đường

arabinose, nên V1 được đề nghị là 4,5-dimethoxy-3',4'-methylenedioxy-7-O-(3",4"-di-O-

acetyl arabinopyranosyl)-2,7'-cyclolign-7,7'-dien-9,9'-lactone.

Đây là hợp chất mới trong tự nhiên đã được xác định bằng phần mềm Scifinder vào

ngày 20/05/2013 tại Đại học Leuven, Bỉ.

CH3

4''

5''

2''

1''

CH3

3''

H3CO

5 4

H3CO

CH3

4''

5''

2''

1''

CH3

3''

H3CO

Hình 4. Tương quan HMBC của hợp chất V1

4,5-dimethoxy-3',4'-methylenedioxy-7-O-(3",4"-di-O-acetyl

arabinopyranosyl)-2,7'-cyclolign-7,7'-dien-9,9'-lactone

Bảng 5. Số liệu phổ NMR của V3

Hợp chất V3 (CDCl3)

Vị trí

Hợp chất so sánh [48] (CDCl3)

δC (ppm)

1 2 3 4 5 6 7 8

Loại carbon =C< >CH- =C< =C< =C< >CH- >CH- >CH-

HMBC 1H13C - C-7,C-3,C-4 - - - C-7,C-3,C-4 C-8,C-9,C-2,C-6,C-8' C-1

132.1 102.7 147.2 134.3 147.2 102.7 86.1 54.3

132.3 102.9 147.3 134.5 147.3 102.9 86.2 54.5

C-8,C-7

71.8

71.9

-CH2-

1' 2' 3' 4' 5' 6' 7' 8'

=C< >CH- =C< =C< =C< >CH- >CH- >CH-

- C-7',C-3',C-4' - - - C-7',C-3',C-4' C-8',C-9',C-2',C-6',C-8 C-1'

132.1 102.7 147.2 134.3 147.2 102.7 86.1 54.3

132.3 102.9 147.3 134.5 147.3 102.9 86.2 54.5

C-8',C-7'

71.8

71.9

-CH2-

- -

δH (ppm) (J-Hz) - 6.58, s - - - 6.58, s 4.73, d(3.5) 3.09, m 4.28, dd, (9.0/7.0) 3.90, m - 6.58, s - - - 6.58, s 4.73, d(3.5) 3.09, m 4.28, dd,(9.0/7.0) 3.90, m 5.49, s 5.49, s 3.90, s 3.90, s 3.90, s 3.90, s

- - C-3 C-3' C-5 C-5'

- - 56.5 56.5 56.5 56.5

4-OH 4'-OH 3-OCH3 3'-OCH3 5-OCH3 5'-OCH3

Hợp chất V1 (CDCl3)

Vị trí

Hợp chất so sánh [50] (DMSO-d6)

δC (ppm)

1 2 3 4 5 6 7 8

130.8 127.1 106.3 150.3 152.1 101.3 144.3 131.2

HMBC 1H13C C-2,C-5,C-7 C-1,C-7',C-4

Loại cacbon =C< =C< =CH- =C< =C< =CH- =C< =C<

129.6 126.6 107.9 149.9 151.4 101.8 144.5 128.9

67.5

C-7,C-8,C-8',C-9'

67.0

-CH2-

δH (ppm) (J-Hz) - - 7.03, s /7.01, s - - 7.92, s - - 5.49, d, (15.0) 5.42, d, (15.0)

1' 2' 3' 4' 5' 6' 7' 8' 9' 1" 2" 3" 4"

128.3 110.7 147.6 147.6 108.2 123.6/123.7c 136.7/136.8c 119.1/119.2c 170.0 105.4 69.9 73.2 68.1

C-3',C-4',C-7',C-6' C-1',C-3',C-4' C-2',C-4',C-7' C-7 C-1",C-3" C-2",3"-OAc 4"-OAc

=C< =CH- =C< =C< =CH- =CH- =C< =C< >C=O >CH- >CH- >CH- >CH-

128.2 110.7 146.8 146.9 104.8 123.5 134.4 118.6 169.0 105.4 70.8 72.2 67.2

64.7

C-1",C-3",C-4"

65.7

-CH2-

- 6.77/6.73, br s - - 6.91, d, (8.0) 6.71, d, (8.0) - - - 4.82, d, (8.0) 4.25, mb 4.96, dd, (10.0/3.5) 5.29, br s 4.03, mb 3.58, dd, (12.0/1.5)

C-3',C-4'

101.0

-OCH2O-

-CH2-

4-OCH3 5-OCH3

C-4 C-5

3"-OAc

4"-OAc

-CH3 -CH3 -CH3 >C=O -CH3 >C=O

6.06, s 6.02, s 3.77, s 4.00, s 2.21, s - 2.11, s -

55.9 56.4 21.0a 170.3 20.9a 170.7

a: Tín hiệu có thể trao đổi lẫn nhau b: Tín hiệu bị chồng chập c: Tín hiệu xuất hiện do phân tử xoay quay trục C-7 và C-7'

Bảng 6. Số liệu phổ NMR của V1

CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

4.1 KẾT LUẬN

Việc khảo sát thành phần hóa học của cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir.)

thu hái tại Tân Uyên – Bình Dương đã thu được những kết quả như sau:

Từ phân đoạn EA.3.2.2 (sơ đồ 2) cao ethyl acetate, sử dụng các phương pháp trích

ly, chiết xuất, đã cô lập được hợp chất với kí hiệu V3. Sử dụng các phương pháp phân

tích hóa lí hiện đại NMR, kết hợp so sánh với các tài liệu tham khảo đã đề nghị cấu trúc

H3CO

OCH3

H3CO

OCH3

H3CO

OCH3

H3CO

V3 như sau:

(+)-Syringaresinol (-)-Syringaresinol

Từ phân đoạn EA.3.2.3 (sơ đồ 2) cao ethyl acetate, sử dụng các phương pháp trích

ly, chiết xuất, đã cô lập được hợp chất với kí hiệu V1. Sử dụng các phương pháp phân

tích hóa lí hiện đại NMR, kết hợp so sánh với các tài liệu tham khảo đã đề nghị cấu trúc

CH3

4''

5''

2''

1''

CH3

3''

H3CO

V1 như sau:

4,5-dimethoxy-3',4'-methylenedioxy-7-O-(3",4"-di-O-acetyl arabinopyranosyl) -2,7'-cyclolign-7,7'-dien-9,9'-lactone

4.2 ĐỀ XUẤT

Do hạn chế về thời gian nên còn rất nhiều phân đoạn chúng tôi chưa nghiên cứu.

Trong khóa luận này, chúng tôi chỉ mới tiến hành phân lập với cao ether dầu hỏa và ethyl

acetate. Ngoài ra, còn phần cao methanol chúng tôi chưa khảo sát. Vì vậy, thời gian tới

chúng tôi sẽ tiếp tục nghiên cứu những loại cao và phân đoạn còn lại, đồng thời tiến hành

thử hoạt tính sinh học đối với các loại cao và các hợp chất đã cô lập được.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

[1] Đỗ Tất Lợi (1997), “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, NXB Y học Hà Nội,

65-67.

[2] Đỗ Tất Lợi (2000), “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, NXB Y học, 550-551.

[3] Nguyễn Thượng Phong (2001), “Khảo sát công dụng làm thuốc của một số loài

Phyllanthus ở Việt Nam”, Tạp chí dược liệu, 6, 72-75.

[4] Nguyễn Văn Đậu, Lưu Hoàng Ngọc, Nguyễn Đình Chung (2003), “Nghiên cứu hoạt

chất sinh học từ cây chó đẻ thân xanh (Phyllanthus niruri L. Euphorbiaceae)”, Tạp chí

Dược học, 9 , 12-15.

[5] Nguyễn Văn Đậu, Trần Thị Thu Hà (2007), “Nghiên cứu hóa thực vật cây chó đẻ

răng cưa (Phyllanthus urinaria L. Euphorbiaceae)”. Tạp chí dược học, 369, 15-18.

[6] Lê Trần Đức (1997),“Cây thuốc Việt Nam”, NXB Nông nghiệp Hà Nội, 724-725.

[7] Phan Văn Dân (2009), “Nghiên cứu thành phần hoá học có trong cây Phèn đen

(Phyllanthus Reticulatus Poir. Euphorbiaceae)”, Luận văn cao học, Trường Đại học Sư

phạm Thái Nguyên, 12-40.

[8] Trần Đình Thắng, Bùi Quang Chính, Hoàng Văn Lựu, Nguyễn Xuân Dũng (2007),

“Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất phenolic từ cây chó đẻ răng cưa”, Tạp chí

Dược học, 371, 14-17.

 TÀI LIỆU TIẾNG ANH

[9] Babady-Bila (1996), “Niruroidine, a norsecurinine type alkaloid from

Phyllanthusniruroides”, Phytochemistry, 41(5), 1441-1443.

[10] Calixto J. B., Santos A. R. (1998), “A review of the plants of the genus

Phyllanthus”, Pharmacology, Medicinal Research Reviews, 18(4), 225-258.

[11] Chang, C.-C., Lien, Y.-C, Liu, K.C.S.C., and Lee, S.-S.(2003), “Lignans from

Phyllantus urinaria”, Phytochemistry, 63(7), 825-833.

[12] Chen Lui (1999), “A new flavanone isolated from Rhizoma Smilacis Glabrae and

the structural requirements of its derivatives for preventing immunological hepatocyte

damage”, Planta Med., 65, 43-46.

[13] El-Mekkawy (1995), “Inhibitory effects of Egyptian folk medicines on human

immunodeficiency virus (HIV) reverse transcriptase”. The Chemical and Pharmaceutical

Bulletin, 43, 641-648.

[14] E. Omulokoli, B. Khan, S.C. Chhabra (1997), “Antiplasmodial activity of four

Kenyan medicinal plants”, Journal of Ethnopharmacology, 56, 133-137.

[15] Farah Naaz, Saleem Javed, M.Z. Abdin (2007), “Hepatoprotective effect of

ethanolic extract of Phyllanthus amarus Schum. et Thonn”, Ethnopharmacology,

113(3), 503-509.

[16] Ghosal (1996), “Active constituents of Emblica Officinalis: part 1. The chemistry

and antioxidative effcts of two new hydrolysable tannins, emblicanin A and B”, Indian

Journal of Chemistry, 35B(9), 941-948.

[17] Herbert Kolodziej (2005), “Tannins and related compounds induce nitric oxide

synthase and cytokines gene expressions in Leishmania major”, Bioorganic, 13(23),

6470-6476.

[18] Hnatyszyn, (2002), “The hypoglycemic effect of Phyllanthus sellowianus fractions”,

Phytomedicine, 9(6), 556-559.

[19] Joshi KC, Singh P, Mehra A. (1981), “Crystalline components of the roots of

Phyllanthus reticulatus”, J. Ind . Chem. Soc ,58, 102–103.

[20] Joshi (1986), “Crystalline compounds of the roots of Phyllanthus niruri”. Journal of

the Indian Chemical society, 58, 102-103.

[21] Jian-Xiong Ma, Ming-Sheng Lan, Shi-Jin Qu, Jun-Jie Tan, Hong-Feng Luo, Chang-

Heng Tan & Da-Yuan Zhu (2012),“Arylnaphthalene lignan glycosides and other

constituents from Phyllanthus reticulatus”, Journal of Asian Natural Products Research,

14, 1073-1077.

[22] Kotaro Takahashi, Toshie Nakagawa (1966), “Studies on constituents of medicinal

plants, the stereochemistry of paulowin and isopaulowin”, Chem . Pharm . Bull. , 14(6),

641-647.

[23] Kumar Roy, H. Dhir, A. Sharma (1992), “Modification of metal-induced

micronuclei formation in mouse bone marrow erythrocytes", Toxicology Letters, 62(1),

9-17.

[24] Kumaran, Karunakaran (2007), “In vitro antioxidant activities of methanol extracts

of five Phyllanthus species from India”, Food Science, 40(2), 344-352.

[25] L. Yeap Foo (1995), “Amariinic acid and related ellagitannins from Phyllanthus

amarus”, Phytochemistry, 39(1), 217-224.

[26] Manske R. H. F (1925), “The alkaloids chemistry and physiology”, Phytochemistry,

15, 428.

[27] Matsunaga, Tanaka (1992), “26-Nor-D:A-friedooleananetrit erpenes from

Phyllanthus watsonii”, Phytochemistry, 32(1), 165-170.

[28] Ming-Sheng Lana, Jian-Xiong Ma, Chang-Heng Tan, Song Wei, and Da-Yuan Zhu

(2010),“Chemical Constituents of Phyllanthus reticulatus”, Helvetica Chimica Acta, 93,

2276.

[29] Peter J. Houghton, Tibebe Z. Woldemariam (1996), “Two securinega-type alkaloids

from Phyllanthus amarus”, Phytochemistry, 43(3), 715-717.

[30] Pettit GR, Schaufelberger DE, Nieman RA, Dufresne C, Saenz-Renauld JA (1990),

“Antineoplastic agents, 177. Isolation and structure of phyllanthostatin 6”, Journal of

Organic Chemistry, 53(6), 1406-1413.

[31] Pettit GR, Cragg GM, (1984), “Antineoplastic Agents 104. Isolation and Structure

of the Phyllanthus acuminatus Euphorbiaceae Glycosides”, Journal of Organic

Chemistry, 49, 4258-4266.

[32] Pettit GR, Cragg GM, Suffness M (1985), “Phyllanthostatin 1 Phyllanthoside

Orthoacid Rearrangement”, Journal of Organic Chemistry, 50, 5060-5063.

[33] Rajasubramaniam, Pardha Saradhi (1997), “ Rapid multiplication of Phyllanthus

fraternus: a plant with anti-hepatitis viral activity”, Industrial Crops and Products, 6(1),

35-40.

[34] Rajkishor S. Negi, Thawra M. Fakhir (1998), “An alkaloid from Phyllanthus

simplex”, Phytochemistry, 27(9), 3027-3028.

[35] Robert S. Ward (1997), “Lignan, neolignan and related compounds”, Nat. Prod.

Rep. , 14, 43-74.

[36] Satyanarayana, Venkateswarlu (1991), “Isolation, structure and synthesis of new

diarylbutane lignans from Phyllanthus niruri”, Tetrahedron, 47(42), 8931-8940.

[37] Sengupta, Mukhopadhyay (1966), “Terpenoids and related compounds-VII:

Triterpenoids of Phyllanthus acidusskeels”, Phytochemistry, 5(3), 531-534.

[38] S. F. Aripova (1983), “Tropane alkaloids of two species of plants of the Phyllanthus

discoides”, 16, 677.

[39] Shakil, Pankaj (2008), “Nematicidal prenylated flavanones from Phyllanthus

niruri”, Phytochemistry, 63(3), 759-764.

[40] Shunyo Matsunaga, Reiko Tanaka, (1988), “Revised structure of trichadenic acid

B”, Tetrahedron Letters, 29(37), 4751-4754.

[41] Sutthivaiyakit, Nakorn N. (2003), “A new guaiane sesquiterpene from the roots of

Phyllanthus oxyphyllus”, Tetrahedron, 59(50), 9991-9995.

[42] Tanaka, K. Masuda and S. Matsunaga (1993), “Lup-20(29)-en-3β,15α-diol and

ocotillol-II”, Phytochemistry, 32(2), 472-474.

[43] Thales R. Cipriani, Caroline G. Mellinger (2008), “Acidic heteroxylans from

medicinal plants and their anti-ulcer activity”, Carbohydrate Polymers, 74(2), 274-278.

[44] The Health Bureau of Guangxi Province (1974), “Compilation of Medicinal Herbs

in Guangxi”, II, Guangxi People Press, Nanning, 1588.

[45] Vuyelwa J. N., Neil R. C. (2008), “Triterpenoids from the African tree Phyllanthus

polyanthus”, Phytochemistry Letters, 1(1), 11-17.

[46] Wai-Haan Hui, Man-Moon Li, Kam-Moon Wong (1976), “A new compound, 21α-

hydroxyfriedel-4(23)-en-3-one and other triterpenoids from Phyllanthus reticulatus”,

Phytochemistry, 5(15), 797-798.

[47] Wanxing Wei, Yuanjiang Pan (2005), “Carboxylic acids from Phyllanthus

urinaria”, Chemistry of Natural Compounds, 41(1), 17-20.

[48] Wisit Monthong, Siripit Pitchuanchom, Narong Nuntasaen and Wilart Pompimon

(2011), “Syringaresinol Lignan from New Species Magnolia Thailandica”, American

Journal of Applied Sciences, 8 (12), 1268-1271.

[49] Xiaoli Liu, Chun Cui, M. Zhao (5/2008), “Antioxidant activity of methanolic extract

of emblica fruit”, Journal of Food, 21(3), 219-228.

[50] Ya Zhao, Chunyan Ni, Yuting Zhang, Li Zhu (2012), “Synthesis and bioevaluation

of diphyllin glycoside as novel Anti cancer Agents”, Arch. Pharm. Chem. Life Sci, 345,

622-628.

[51] Ying-Jun Zhang (2006). “A novel highly oxygenated norbisabolane from the roots

of Phyllanthus emblica”, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Japan, 1-14.

[52] Zhang L. Z., Guo Y. J. (2000), “Studies on chemical constituents of Phyllanthus

urinaria L.”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 10(25), 615-617.

[53] Zhang, Y. J., Tanaka, T., and Iwamoto (2000), “Novel Nor-sesquiterpenoids from

the roots of Phyllanthus emblica”, Journal of Natural Products, 63(11), 1507-1511.

[54] Zhang (2002), “Two new acylated flavanone glycosides from the leaves and

branches of Phyllanthus emblica”, Chem. Pharm. Bull., 50, 841.

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Phổ 1H-NMR của hợp chất V3

Phụ lục 2. Phổ 13C-NMR của hợp chất V3

Phụ lục 3. Phổ DEPT của hợp chất V3

Phụ lục 4. Phổ COSY của hợp chất V3

Phụ lục 5. Phổ HSQC của hợp chất V3

Phụ lục 7. Phổ 1H-NMR của hợp chất V1

Phụ lục 7a. Phổ 1H-NMR của hợp chất V1

Phụ lục 7b. Phổ 1H-NMR của hợp chất V1

Phụ lục 8. Phổ 13C-NMR của hợp chất V1

Phụ lục 8a. Phổ 13C-NMR của hợp chất V1

Phụ lục 8b. Phổ 13C-NMR của hợp chất V1

Phụ lục 9. Phổ DEPT của hợp chất V1

Phụ lục 10. Phổ COSY của hợp chất V1

Phụ lục 11. Phổ HSQC-NMR của hợp chất V1

Phụ lục 11a. Phổ HSQC của hợp chất V1

Phụ lục 11b. Phổ HSQC của hợp chất V1

Phụ lục 12. Phổ HMBC của hợp chất V1

Phụ lục 12a. Phổ HMBC của hợp chất V1

Phụ lục 12b. Phổ HMBC của hợp chất V1

Phụ lục 13. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất V1

NHẬN XÉT CỦA HỘI ĐỒNG

CHỦ TỊCH

THƯ KÝ

ỦY VIÊN

..........................................................................................................................................................