Khóa luận tốt nghiệp đại học: Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan Hài Mốc Hồng (Paphiopedilum micranthum) bằng phương pháp in vitro

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

DƯƠNG THỊ THU HOÀI

Tên đề tài:

“NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LAN HÀI MỐC HỒNG

(PAPHIOPEDILUM MICRANTHUM) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Khoa : CNSH-CNTP

Khoá học : 2015-2019

Thái Nguyên, năm 2019

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

DƯƠNG THỊ THU HOÀI

Tên đề tài

“NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LAN HÀI MỐC HỒNG

(PAPHIOPEDILUM MICRANTHUM) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Lớp : K47 - CNSH

Khoa : CNSH-CNTP

Khoá học : 2015-2019

Giảng viên hướng dẫn : ThS. Nguyễn Thị Tình

Thái Nguyên, năm 2019

LỜI CẢM ƠN

Được sự đồng ý của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công

nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trong thời gian thực tập tốt nghiệp em đã

thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan Hài Mốc Hồng

(Paphiopedilum micranthum) bằng phương pháp in vitro ”.

Trang đầu tiên của khoá luận này em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu

nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm

cùng các thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề

tài nghiên cứu này.

Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân

thành tới cô giáo ThS. Nguyễn Thị Tình, giảng viên khoa Công nghệ Sinh học và

Công nghệ Thực phẩm đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và hướng dẫn em trong thời gian

thực hiện đề tài.

Đồng thời, em xin cám ơn ThS. Ma Thị Hoàn đã giúp đỡ và tạo điều kiện

tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp.

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất và luôn là chỗ

dựa tinh thần cho em trong suốt thời gian thực tập, cảm ơn bạn bè đã hết lòng động

viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.

Trong quá trình thực tập, cũng như là quá trình làm báo cáo thực tập thời

gian có hạn không tránh khỏi những sai sót. Em rất mong nhận được những ý kiến

đóng góp của thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn.

Lời cuối em xin kính chúc các thầy, cô giáo trong nhà trường, trong khoa

Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm, cùng các bạn đồng nghiệp sức khoẻ,

thành công trong cuộc sống.

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày 03 tháng 6 năm 2019

Sinh viên thực hiện

Dương Thị Thu Hoài

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ chức Bảo tồn

Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) [1] ............................................................... 8

Bảng 3.1. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu .................................................................... 25

Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian khử trùng của dung

dịch HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng (sau 7 ngày nuôi cấy) .... 35

Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái

sinh chồi lan Hài P. micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy) ........................ 37

Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng nhân nhanh chồi

lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy). ...................................... 39

Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh lan Hài

P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy) .................................................... 41

Bảng 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Giberellin đến khả

năng nhân nhanh chồi lan P. micranthum ( sau 20 ngày nuôi cấy ) ........ 44

Bảng 4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả năng nhân

nhanh lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy) ............................ 47

Bảng 4.7. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn

chỉnh của lan Hài P.micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy ) ....................... 49

Bảng 4.8. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn

chỉnh của lan Hài P. micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy) ....................... 51

iii

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1. Hình ảnh về cây lan Hài Paphiopedilum micranthum tại nhà lưới khoa

CNSH-CNTP ........................................................................................... 11

Hình 2.2. Sơ đồ quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào thực vật ...... Error!

Bookmark not defined.

Hình 3.1. Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến

khả năng tái sinh, nhân nhanh chồi và ra rễ của cây lan Hài

P.micranthum ........................................................................................... 28

Hình 4.1. Biểu đồ kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của HgCl2

đến khả năng tạo vật liệu vô trùng (sau 7 ngày nuôi cấy) ....................... 36

Hình 4.2. Một số hình ảnh tạo vật liệu vô trùng. ...................................................... 37

Hình 4.3. Biểu đồ kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến

khả năng tái sinh đoạn thân mang mầm ngủ lan Hài P. micranthum ...... 38

Hình 4.4. Hình ảnh ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh

chồi lan Hài P. micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy) .............................. 39

Hình 4.5. Biểu đồ kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng

nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy). .......... 40

Hình 4.6. Hình ảnh ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng nhân nhanh chồi

lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy). ...................................... 41

Hình 4.7. Biêu đồ ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh lan Hài P.

micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy) ........................................................ 42

Hình 4.8. Hình ảnh ảnh nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh

chồi lan hài P. micranthum ( sau 20 ngày nuôi cấy ). ............................. 43

Hình 4.9. Biểu đồ ảnh hưởng của BA tốt nhất kết hợp với Giberellin đến khả năng

nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy) ............ 45

Hình 4.10. Hình ảnh ảnh hưởng của BA kết hợp với Giberellin đến khả năng nhân

nhanh chồi lan Hài P. micranthum ( sau 20 ngày nuôi cấy ) ................... 46

Hình 4.11. Biểu đồ ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả năng nhân nhanh chồi

lan Hài P. micranthum(sau 20 ngày nuôi cấy ) ....................................... 47

Hình 4.12. Hình ảnh ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả năng nhân nhanh chồi

lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy) ....................................... 48

Hình 4.13. Biểu đồ ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của

lan Hài P. micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy) ....................................... 50

Hình 4.14. Hình ảnh ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của

lan Hài P. micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy ) ...................................... 51

Hình 4.15. Biểu đồ ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của

lan Hài P. micranthum(sau 40 ngày nuôi cấy ) ....................................... 52

Hình 4.16. Hình ảnh ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của

lan Hài P. micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy ) ...................................... 53

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

: Gamborg cs, 1976 : 6-Benzyl amino purine : Cộng sự : Công thức : Coeficient of Variation – Hệ số biến động : Đối chứng : Least Singnificant DifferenceTest B5 BAP CS CT CV Đ/C LSD

: Murashighe và Skoog, 1962 : Môi trường : Gibberellic acid : α-Napthalene acetic acid MS MT GA3 NAA

IAA IBA IUCN

: Indole-3-acetic acid : Indole-3-butyric acid : International Union for Conservation of Nature and Natural Resources - Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế : Paphiopedilum micranthum : Paphiopedilum malipones : Woody Plant Medium – Lioyd và Mc Cown, 1980 P. micranthum P. malipoens WPM

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ..............................................................................................................i

DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. ii

DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................ v

MỤC LỤC ..................................................................................................................vi

Phần 1. MỞ ĐẦU ...................................................................................................... 1

1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................ 1

1.2. Mục đích nghiên cứu ............................................................................................ 2

1.3. Yêu cầu của đề tài ................................................................................................ 3

1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ............................................................. 3

1.4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài .............................................................................. 3

1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn ............................................................................................... 3

Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................... 4

2.1. Giới thiệu về lan Hài (Paphiopedilum) ................................................................ 4

2.1.1. Phân loại và nguồn gốc ..................................................................................... 4

2.1.2. Đặc điểm hình thái ........................................................................................... 5

2.1.3. Sinh thái ............................................................................................................ 6

2.1.4. Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam ...................................................................... 7

2.2. Tổng quan về lan Hài P. micranthum ................................................................ 10

2.2.1. Nguồn gốc và sự phân bố lan Hài P. micranthum ở Việt Nam ...................... 10

2.2.2. Hình thái .......................................................................................................... 10

2.2.3. Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng giống lan hài P. micranthum .................. 11

2.2.4. Các phương pháp nhân giống vô tính lan Hài Mốc Hồng .............................. 12

2.3. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật .......... Error! Bookmark not defined.

2.3.1. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật........... Error! Bookmark not defined.

2.3.2. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật .............. Error!

Bookmark not defined.

2.3.3. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................... 13

vii

2.3.4. Môi trường dinh dưỡng ................................................................................... 14

2.3.5. Các công đoạn của nuôi cây mô tế bào ........................................................... 18

2.4. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài trên thế giới và trong nước ....... 19

2.4.1. Trên thế giới .................................................................................................... 19

2.4.2. Trong nước ...................................................................................................... 21

Phần 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 25

3.1. Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu ............................................................ 25

3.1.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu ........................................................................ 25

3.1.2. Hoá chất sử dụng ............................................................................................. 25

3.1.3. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu ........................................................................... 25

3.2. Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu ........................................................ 26

3.2.1. Phạm vi nghiên cứu ......................................................................................... 26

3.2.2. Địa điểm nghiên cứu ....................................................................................... 26

3.2.3. Thời gian nghiên cứu ...................................................................................... 26

3.3. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................... 26

3.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian cuả dung dịch khử

trùng HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng. ....................................................... 26

3.3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng

tái sinh mầm ngủ lan Hài P. micranthum. ................................................................. 26

3.3.3. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng và

hợp chất hữu cơ đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum từ đoạn thân

mang mầm ngủ. ......................................................................................................... 26

3.3.4. Nội dung 4: Nghiên cứu môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan Hài P.

micranthum. .............................................................................................................. 27

3.4. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 27

3.4.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro ............................................................ 27

3.4.2. Phương pháp nghiên cứu quy trình nhân giống .............................................. 28

3.4.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm ........................................................................ 28

3.5. Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu .............................................................. 33

viii

3.5.1. Thu thập số liệu ............................................................................................... 33

3.5.3. Phương pháp sử lý số liệu ............................................................................... 34

Phần 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ....................................... 35

4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của dung dịch khử trùng

HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng ................................................................. 35

4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái

sinh đoạn thân mang mầm ngủ lan Hài P. micranthum ............................................ 37

4.3. Kết qủa nghiên cứu của một số chất kích thích sinh trưởng và hợp chất hữu cơ

tự nhiên đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum từ đoạn thân mang

mầm ngủ .................................................................................................................... 39

4.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng cuả NAA đến khả năng nhân nhanh chồi lan

Hài P. micranthum .................................................................................................... 39

4.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài

P. micranthum ........................................................................................................... 41

4.3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Giberellin đến khả năng

nhân nhanh chồi lan P. micranthum .......................................................................... 43

4.3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả năng nhân nhanh

chồi lan P. micranthum ............................................................................................. 46

4.4 .Kết quả nghiên cứu môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của lan Hài P.

micranthum từ mầm ngủ ........................................................................................... 48

4.4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn

chỉnh của lan Hài P. micranthum. ............................................................................. 49

4.4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn

chỉnh của lan Hài P.micranthum ............................................................................... 51

Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................. 54

5.1. Kết luận .............................................................................................................. 54

5.2. Kiến nghị ............................................................................................................ 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Phần 1

MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề

Việt Nam là một trong các quốc gia có tính đa dạng sinh học cao nhất trên thế

giới, được công nhận là một quốc gia ưu tiên cao cho bảo tồn toàn cầu. Hệ sinh thái

của Việt Nam giàu có và đa dạng với nhiều kiểu rừng, nhiều loài động, thực vật độc

đáo không có ở nơi nào trên thế giới [14]. Phong lan mọc khắp nơi trên thế giới tuy

nhiên tập trung những loài phong lan đẹp nhất phải kể đến hai khu vực là Châu Mỹ và

Châu Á nhiệt đới. Việt Nam nằm trong khu vực châu Á nhiệt đới - nơi phát sinh một

trong nhiều loài phong lan đẹp. Theo đánh giá của giáo sư Averyanov, Việt Nam có

158 chi và khoảng 900 loài. Theo tác giả Trần Duy Quý và cs đã thống kê và phát

hiện, ở Việt Nam có 160 chi và 1004 loài lan. Đây là quốc gia có nguồn tài nguyên

thực vật và đặc biệt là họ Lan phong phú bậc nhất trong khu vực Châu Á. Trong các

loài phong lan Việt Nam phải kể đến lan hài, lan hài Việt Nam không chỉ đẹp -phong

phú mà đặc hữu hẹp chỉ có ở Việt Nam. Theo Tác giả Trần Duy Quý không có nơi nào

mà sự đa dạng của các loài lan hài lại cao hơn ở Việt Nam.. Có thể thấy 22 loài lan hài

thuộc chi Paphiopedilum cùng với vô số các dạng lai tự nhiên của chúng đã tạo lên sự

đa dạng cho các loài lan hài Việt Nam. Các loài lan hài Việt Nam đa dạng về màu sắc

và kiểu dáng không chỉ thu hút người chơi lan trong nước mà còn hấp dẫn khách chơi

lan ngoại quốc do vậy những người đi săn lan hài sẵn sàng trèo lên những vỉa đá dốc ở

những vùng xa xôi hẻo lánh để khai thác. Việc thu hái như vậy đã gây nên những tác

động tàn phá thiên nhiên nghiêm trọng. Điều này đã đẩy các loài lan hài của Việt Nam

rơi vào nguy cơ tuyệt chủng, hoặc mức độ cực kỳ nguy cấp [18].

Hài Mốc Hồng hay Hài ngọc nữ (Paphiopedilum micranthum) là một trông số

loài lan có hoa to, màu sắc sặc sỡ, kiểu dáng đặc biệt với hình dáng của cánh hoa giữa

hình túi sâu trông giống như một chiếc hài nằm ở vị trí thấp nhất của hoa và môi là

điều hấp dẫn nhất đối với những người trồng và lai tạo Lan Hài. Hoa thường nở vào

dịp tết. Vùng phân bố của loài hẹp hiện chỉ tìm thấy ở miền Bắc Việt Nam (tập trung

tại các tỉnh Cao Bằng, Hà Giang, Tuyên Quang, Thái Nguyên) và vùng Quảng Tây,

Quý Châu, Vân Nam (Trung Quốc). Là loài Hài rất quý mới được phát hiện và được

ưa chuộng ở thị trường trong và ngoài nước [30].

Giống như thực trạng các loài lan Hài khác loài lan Hài P.micranthum cũng bị

khai thác ồ ạt, cộng với phá nương rẫy khiến chngs mất nơi sinh sống vì vậy lan Hài

Mốc Hồng cũng bị đe dọa tiêu diệt và đang biến mất nhanh chóng khỏi nơi sống tự

nhiên của chúng. Trước thực trạng bị đe doạ nghiêm trọng như vậy việc bảo tồn, phát

triển loài lan này hết sức cần thiết.

Đặc thù riêng của lan Hài P. micranthum là cây sinh trưởng chậm, tỷ lệ nảy

mầm của hạt trong tự nhiên thấp người dân khai thác ồ ạt đã đẩy lan Hài Mốc Hồng có

nguy cơ rơi vào danh mục các loài nguy cấp cần phải bảo tồn. Vì vậy việc nghiên cứu

nhân giống lan Hài rất được chú trọng nhằm mục đích thương mại và bảo tồn nguồn

gen thực vật quý hiếm. Trước đây, các nhà nghiên cứu đã tiến hành nhân giống các

loài lan Hài bằng nhiều phương pháp khác nhau như gieo hạt, tách mầm nhưng những

phương pháp này vẫn còn nhiều nhược điểm như chất lượng cây không đồng đều, chất

lượng cây thấp và số lượng cây ít…Để khắc phục được điều này, phương pháp nhân

giống in vitro đã ra đời nhằm khắc phục những hạn chế trên. Phương pháp này cho số

lượng cây lớn, chất lượng cao, đồng đều và sạch bệnh. Đây là điều mà phương pháp

truyền thống không thực hiện được. Hiện nay, nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in

vitro đang phát triển mạnh mẽ có thể tạo ra số lượng cây con lớn, sạch bệnh, ổn định

về mặt di truyền trong một thời gian ngắn và đáp ứng được giá cả phải chẳng của thị

trường được coi là một giải pháp lý tưởng để bảo tồn loài lan Hài khỏi nguy cơ bị tuyệt

chủng. Trước thực trạng đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả

năng nhân nhanh lan Hài Mốc Hồng (Paphiopedilum micranthum) bằng phương

pháp in vitro ”.

1.2. Mục đích nghiên cứu

Nhân giống thành công chồi lan Hài P. micranthum từ mầm ngủ bằng kĩ thuật

nuôi cấy in vitro.

1.3. Yêu cầu của đề tài

- Xác định nồng độ và thời gian khử trùng mẫu trong dung dịch HgCl2 đến hiệu

quả tạo vật liệu vô trùng.

- Xác định ảnh hưởng của môi trường khoáng đến khả năng tái sinh mầm ngủ

lan Hài P. micranthum.

- Xác định môi trường nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum tái sinh từ mầm

ngủ.

- Xác định môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan Hài P. micranthum.

1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

1.4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài

- Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học và bổ sung vào

kiến thức lý thuyết được học thông qua hoạt động thực tiễn.

- Giúp bản thân sinh viên học hỏi kiến thức, tích lũy được kinh nghiệm thực tế

cũng như tác phong làm việc, nghiên cứu khoa học phục vụ cho cho công tác sau này.

- Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dữ liệu khoa học mới về nhân

giống cây lan Hài P. micranthum bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, góp

phần làm phong phú cơ sở dữ liệu về kỹ thuật nuôi cấy mô.

1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn

Đề xuất được quy trình nhân nhanh giống lan Hài P. micranthum bằng phương

pháp nuôi cấy in vitro, tạo ra số lượng lớn cây lan Hài P. micranthum góp phần bảo

tồn giống hoa quý hiếm trước nguy cơ tuyệt chủng đồng thời tạo nguồn vật liệu cho

nghiên cứu khoa học.

Phần 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu về lan Hài (Paphiopedilum)

2.1.1. Phân loại và nguồn gốc

2.1.1.1. Phân loại

Lan Hài (Paphiopedium) là một nhánh của họ Lan (Orchidaceae) thuộc bộ Lan

(Orchidales), phân lớp hành (Liliidae), lớp một lá mầm (Monocotyledoneae), nghành

hạt kín (Angiospermatophyta). Lan Hài là một nhóm rất đặc trưng trong họ lan. Chúng

dễ dàng nhận ra bởi cấu trúc hoa đặc biệt khác thường với một cánh hoa giữa hình túi

sâu trông giống như một chiếc Hài, nằm ở vị trí thấp nhất của hoa, tạo nên một vẻ

ngoài đặc sắc có thể dễ dàng phân biệt với các loại lan khác.

Về mặt thực vật học, các loài lan Hài thuộc vào 5 chi là:

- Chi Cypripedium có khoảng 50 loài, thường được gọi là Hài Vệ nữ, phân bố ở

các vùng ôn đới và núi của bán cầu bắc.

- Chi Mexipedium, chi Phragmipedium và chi Selenipedium gồm khoảng 25

loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Mĩ.

- Chi Paphiopedilum có khoảng 75 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á từ

Nam Ấn Độ và Đông Hymalaya đến Philippine, New Guinea và Quần đảo Solomon.

Ở Việt Nam các loài lan Hài đều thuộc chi Paphipedilum, thuộc tông,

Cypripedioideae, họ phụ Epidendroideae, họ Lan (Orchidaceae), bộ lan (Orchidales),

phân lớp Hành (Liliidae), lớp một lá mầm (Monocotyledoneae), ngành hạt kín

(Angiospermatophyta), giới thực vật (Plantae) [1].

2.1.1.2. Nguồn gốc

Chi Paphiopedilum có nguồn gốc từ vùng lục địa Đông Nam Á, trong đó có Việt

Nam. Các loài nguyên thuỷ nhất của chi này được tìm thấy chủ yếu ở Trung Quốc và

miền Bắc Việt Nam, mỗi loại trong chi này đều có khu phân bố rất hạn chế.

Hầu như tất cả các loài lan đều bắt nguồn từ các tổ tiên kiểu hypoxis có sáu

mảnh bao hoa (ba mảnh bao vòng ngoài gọi là ba lá đài và ba mảnh bao vòng trong gọi

là ba cánh hoa) và sáu nhị đực (ba nhị đực ở vòng ngoài và ba nhị đực ở vòng trong).

Xu hướng tiến hoá của họ Lan là giảm số lượng nhị đực và sự dính liền giữa nhị đực

hữu thụ với nhị cái là sự biến đổi hoa cơ bản nhất dẫn đến sự tiến hoá của họ Lan. Sự

giảm liên tục số lượng nhị đực dẫn đến sự hình thành các nhóm lan có ba, hai hay một

nhị đực tồn tại trong hoa. Trong họ Lan, chi lan Hài (thuộc tông Cypripedioideae) là

dòng tiến hoá có hai nhị đực còn tồn tại trong hoa [1], [19].

2.1.2. Đặc điểm hình thái

Các loài lan Hài (Paphiopedilum) ở Việt Nam có thể có hình dạng bên ngoài rất

đa dạng tuy nhiên chúng đều mang những đặc điểm hình thái:

- Dạng cây: Là các loài thân cỏ có kích thước trung bình với thân mang nhiều lá

mọc thành hai hàng xếp thành hình quạt, đôi khi có dạng thân bò. Tất cả các loài đều

có thân rễ nhưng đa số rất ngắn [1].

- Lá: Thường có dạng lá dài gấp đôi, hình trứng ngược hay bầu dục thuôn và

mở rộng. Mỗi lá có đốt ở gốc, dưới đó là bẹ lá hình chữ V xếp lợp xít lên nhau trên

thân. Độ dài của lá có thể từ 3- 50 cm. Mặt trên của lá có thể có màu xanh lá cây hoặc

khảm bởi các mảng đậm nhạt không đều với các gân màu xanh lá nổi rõ. Mặt dưới lá

có các đốm tím dày đặc hoặc vết tím xỉn chỉ thấy rõ ở gần gốc lá. Lá của các loài điển

hình cho điều kiện sống khô đều dày, mọng nước và cứng [1].

- Cụm hoa: Thường thẳng đứng hay cong. Một số loài có cuống hoa nằm

ngang, một số loài lại có cuống hoa chúc xuống, nhưng hầu hầu các loài đều có cuống

hoa dựng đứng. Phần lớn các loài chỉ có một hoa riêng lẻ. Tuy nhiên cũng có loài có

cụm hoa mang hai hoa, xong rất hiếm. Trục cụm hoa có lông tơ dầy và ngắn hay có

lông nhung hoặc nhẵn. Lá hoa của cụm hoa gấp đôi và có hình dạng rất khác nhau tùy

từng loài, từ hình múi giáo hay hình trứng và có chóp nhọn đến hình bầu dục tròn. Lá

hoa thường có ít lông tơ hơn các phần khác của cụm hoa nhưng nói chung thường có

lông ở mép và lông cứng gần giữa ở mặt ngoài lá, ở một số loài có lá hoa nhẵn.

- Hoa: Gồm hai lá đài ở vòng ngoài, một lá đài lưng, một lá đài hợp và ba cánh

hoa ở vòng trong. Lá đài lưng thường lớn, hướng thẳng lên trên và thường nổi bật với

các vạch hay chấm ở mặt trong. Lá đài lưng nằm đối diện với lá đài hợp ở vị trí thấp

hơn và hướng xuống phía dưới. Lá đài hợp nằm phía sau của môi thường có một màu

tối xỉn và kém nổi bật hơn so với lá đài lưng. Cả hai lá đều thường có lông tơ dày ở

mặt ngoài [1].

Hai cánh hoa bên đều dễ dàng nhận thấy ở hai bên lá đài và thường hơi xoè

xuống dưới theo chiều ngang. Chúng có thể có hình thìa, bầu dục, trứng rộng hay tròn.

Cánh hoa hình mũi giáo hẹp, xoắn ốc hẹp dần từ gốc lên đến đỉnh. Cánh hoa giữa thứ

ba biến dạng rõ rệt thành một môi giống như cái bao hoặc hình chiếc hài. Môi dạng túi

sâu và phồng lên, hình giầy, có lông ở mặt trong và nhẵn ở mặt ngoài.

Nhị bất thụ của vòng ngoài và nhuỵ cái hợp thành cột nhị- nhuỵ. Hai nhị đực

hữu thụ của vòng trong có chỉ nhị ngắn dính liền ở phía sau núm nhuỵ và hai bên cuốn

cột. Bầu dưới, một ô, đỉnh noãn bên là điểm đặc trưng của chi này. Hầu hết các loài

lan Hài, bầu có lông tơ, hình trụ, màu xanh lá cây hay đỏ tía xỉn [1].

- Quả: Dạng quả nang, khô, dài, có một ô với ba van rộng và ba van hẹp. Quả

mở ở gần đỉnh bằng 6 rãnh nứt. Quả thường chín trong điều kiên tự nhiên sau khi thụ

phấn từ sáu đến mười tháng [1].

- Hạt: Có hình bầu dục, hình con suốt chỉ ngắn dạng thuôn dài hay hẹp và

thường có chiều dìa từ 0,4 – 1,1 mm. Phôi nhỏ, dài từ 0,3 – 0,4 mm. Hạt không có nội

nhũ do đó rất khó nảy mầm trong điều kiện tự nhiên [1].

2.1.3. Sinh thái

Các loài lan Hài ở Việt Nam có thể chia thành hai nhóm riêng. Một nhóm phân

bố ở vùng núi đá vôi phía Bắc Việt Nam từ độ cao mặt nước biển lên đến 1600m,

nhóm còn lại phân bố ở khu vực có đá mẹ silicat, đá phiến và cát kết ở độ cao từ 700-

2200m. Ngoài ra, có một vài cá thể trong nhóm này còn mọc bám ở các khe nứt hay

rìa của các vách núi dựng đứng đá granit.

Lan Hài của Việt Nam có thể sống trên đất, bám đá và phụ sinh mùn. Các loài

sống trên đất thường mọc ở nơi có ít ánh sáng của tán cây rừng, ở nơi sườn núi dốc,

các nền đất có nhiều lá rơi bị phân huỷ mạnh và giàu chất mùn. Các loài lan Hài mọc

trên đá thường mọc dưới bóng cây của kiểu rừng ít khép tán, chủ yếu là các mỏm đá

và ngay bên dưới các đường đỉnh. Các loài phụ sinh mùn chủ yếu sống bám trên vỏ

cây gỗ trong các vùng rừng mây mù ẩm độ cao 1200-1500m.

Tại Việt Nam, lan Hài thường phân bố ở vùng có lượng mưa lớn, ẩm độ cao.

Tuy nhiên do đặc trưng là vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên chúng thường phải trải

qua một giai đoạn khô hạn. Sự xuất hiện lá dày, dai và mọng nước là hướng thích nghi

tốt để cây có thể sống sót được qua đợt khô hạn định kỳ và chúng sẽ nhanh chóng

phục hồi khi mùa mưa trở lại. Độ ẩm xung quanh rễ, kiểu đất và độ pH, sự có mặt của

các nấm rễ, tác nhân thụ phấn và cường độ ánh sáng là các nhân tố quan trọng trong sự

hình thành và phát triển của quần thể lan Hài.

Trong rừng nguyên sinh, lan Hài phân bố đều nhau ở các hướng của sườn núi.

Nhưng trong các vùng rừng đã bị xuống cấp, lan Hài có khuynh hướng phát triển ở các

sườn núi phía Bắc, đông Bắc và tây Bắc của núi. Ngày nay, thường chỉ tìm thấy lan

Hài mọc thành từng đám nhỏ. Các nơi sống tự nhiên bị phá huỷ bởi con người,sự thay

đổi các điều kiện môi trường và việc thu hái lan để bán là những nguyên nhân chính

gây ra sự tuyệt chủng nhanh chóng của lan Hài trên khắp các vùng của Việt Nam [1].

2.1.4. Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam

Hiện nay, nhu cầu về hoa tươi nói chung và hoa lan nói riêng trên thế giới cũng

như trong nước đang ngày càng gia tăng. Vì vậy, việc trồng lan đã trở thành một ngành

kinh tế của nhiều nước trên thế giới và nhiều nước đang phát triển khu vực Đông Nam

Á.

Lan Hài là chủng họ lan có giá trị thương mại cao nhất, được yêu chuộng, sưu tầm,

tìm kiếm nhiều nhất thế giới. Với sự hiện hữu của hơn 22 loài thuộc chi Paphiopedilum,

Việt Nam là một trong các quốc gia có nguồn lan Hài tự nhiên phong phú nhất. Không

những phong phú về chủng loại, Việt Nam còn có nhiều loài lan đặc hữu có giá trị thẩm

mĩ cao, được thế giới ưa chuộng [5]. Điều này đã tạo nên tình trạng thu thập và xuất khẩu

lan Hài một cách ồ ạt, không kiểm soát, dẫn đến việc lan Hài ngày càng hiếm trong tự

nhiên. Đồng thời với tình trạng môi trường tự nhiên bị khai thác cạn kiệt như hiện nay, lan

Hài càng biến mất nhanh chóng [6].

Dựa trên những nghiên cứu thực địa gần đây, tình trạng bảo tồn các loài lan Hài

trong tự nhiên theo tiêu chuẩn các thứ hạng về mức độ đe doạ tuyệt chủng của tổ chức

bảo tồn thiên nhiên Quốc tế (IUCN) được tổng kết ở bảng 2.1.

Bảng 2.1. Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ chức Bảo

tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) [1]

Tình trạng

Tên loài (tiếng Latinh)

Tên loài (tiếng Việt)

P. vietnamense

Hài Việt

Đã bị tuyệt chủng ngoài thiên nhiên

p. delenatii

Hài Đỏ

Đang bị tuyệt chủng trầm trọng

Đang bị tuyệt chủng

Sắp bị tuyệt chủng

P.  aspersum P. barbigerum var. lokianum P. callosum P. dianthum P. emersonii P. gratrixianum P. hangiannum P. helenae P. henryanum P.  herrmannii P. malipoense var. jackii P. malipoense P. micranthum P. purpuratum P. tralienianum P. appletonianum P. concolor P. hirsutissimum var. chiwuawnum P. hirsutissimum var. esquirolai P. villosun var. annamense

Chưa rõ tên gọi Hài Lộc Hài Vân Hài Xoắn Hài Hương Lan Hài Đuôi công Hài Hằng Hài hê len Hài Henry Hài Herman Hài Jack Hài Giáp Hài Mốc Hồng Hài Tía Hài Trần liên Hài Cánh Sen Hài Gia Định Hài Tiên biến dị Hài Tiên Hài Lông

Thiếu dẫn liệu

P.  affine P.  datalanse P. villosum var. boxalli

Hài Hoà Chưa rõ tên gọi Chưa rõ tên gọi

Trên thực tế, mức độ đe doạ tuyệt chủng đối với tất cả các loài lan Hài Việt

Nam được chỉ ra ở bảng trên đây đã bị thay đổi nhiều trong thời gian gần đây do sự

suy giảm nhanh các quần thể được biết. Trong những năm gần đây, qua các đợt điều

tra thực địa đã phát hiện ra tốc độ phá huỷ mạnh mẽ trên diện rộng của những khu

rừng còn sót lại của Việt Nam, chủ yếu trên các đỉnh núi đá vôi [17], [18], [19].

Sự thay đổi môi trường sống do con người gây nên và việc thu mua với số

lượng lớn để buôn bán hiện nay là nhân tố chính làm suy giảm nhanh chóng số lượng

các loài lan Hài. Tất nhiên, việc phá huỷ nơi sống tự nhiên của chúng có liên quan đến

tốc độ phát triển kinh tế và sự gia tăng dân số của Việt Nam. Các loài lan Hài rất nhạy

cảm với sự thay đổi của môi trường nên bị đe doạ tuyệt chủng nhiều hơn và sẽ biến

mất trước tiên sau khi nơi sống tự nhiên của chúng bị suy thoái.

Yếu tố thứ hai dẫn đến sự tuyệt chủng của các loài lan Hài ở Việt Nam trong

những năm gần đây là việc thu hái trên diện rộng của người dân địa phương để bán và

xuất khẩu một lượng lớn các loài lan Hài mọc trong tự nhiên ra nước ngoài. Do không

có biện pháp quản lý có hiệu quả việc thu mẫu các loài thực vật hoang dã với sự giàu

có nổi bật của lan Hài đặc hữu của Việt Nam đã khuyến khích việc thu thập các loài

lan từ thiên nhiên với số lượng lớn trên toàn bộ lãnh thổ [1].

Nếu không có các biện pháp bảo vệ các khu rừng nguyên sinh khẩn cấp và hiệu

quả thì chắc chắn các sinh vật sẽ phải đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng trong tương lai

gần. Điều này sẽ kéo theo sự tuyệt chủng của một số lượng lớn các loài hiếm và đặc

hữu.

Trước tình hình lan Hài cạn kiệt ngoài thiên nhiên, nhiều chương trình quốc gia

về bảo tồn loài hoa quý này đã được triển khai,chủ yếu là thu thập, phân loại, nghiên

cứu về các loài lan Hài và bảo tồn môi trường sống tự nhiên của chúng. Một công trình

hợp tác quốc tế về lĩnh vực này là mô tả các giống lan Hài ở Việt Nam của nhóm tác

giả Leonid Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc và Nguyễn Tiến Hiệp năm 2004

[1].

Một mạng lưới rộng khắp các khu bảo tồn đã được thành lập ở Việt Nam. Đặc

biệt hàng loạt các khu bảo tồn đã đang bảo tồn các loài lan Hài như:

- Khu bảo tồn Ngọc Linh (Kon Tum), Chue Yang Sinh (Đắk Lắk), Núi Bà

(Lâm Đồng) bảo tồn loài P. appletonianum.

- Khu bảo tồn Mom Ray (Kon tum), Thung Đa Nhim (Lâm Đồng) đang bảo tồn

loài P. callosum.

- Vườn Quốc Gia Ba Bể, khu bảo tồn Cát Bà (Hải Phòng), Hữu Liên (Lạng Sơn), Pà

Cò (Hòa Bình), khu bảo tồn Thượng Đa Nhim (Lâm Đồng) đang bảo tồn P. dalatensis.

- Vườn Quốc Gia Hoàng Liên Sơn (Lào Cai), Phong Quang (Hà Giang),Pà Cò

(Hòa Bình) đang bảo tồn loài P. dianthum, P. micranthum.

- Khu bảo tồn Na Hang (Tuyên Quang) đang bảo tồn loài P. emersoii, P.

hangianum, P. malipoense varijackii.

- Vườn quốc gia Tam Đảo, Hoàng Liên Sơn đang bảo tồn loài P.gratrixianum.

- Khu bảo tồn Trùng Khánh (Cao Bằng) đang bảo tồn loài P. helanae.

- Vườn quốc gia Ba Bể, khu bảo tồn Na Hang, Hữu Liên, Pà Cồ, Phong Nha

đang bảo tồn loài P. malipoense.

Bên cạnh đó, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và ứng dụng phương pháp nuôi

cấy mô tế bào thực vật in vitro nhằm nhân nhanh số lượng lớn lan Hài. Đầu tiên phải

kế đến PGS. TS. Dương Tấn Nhựt, người đầu tiên nuôi cấy thành công lan hài Hồng

năm 2005 [27, 28]. Sau đó đã có nhiều nhà nghiên cứu khác đã nuôi cấy in vitro thành

công nhiều loài lan Hài khác như hài Hằng, hài Tam Đảo bằng các phương pháp nuôi

cấy mô khác nhau.

2.2. Tổng quan về lan Hài P. micranthum

2.2.1. Nguồn gốc và sự phân bố lan Hài P. micranthum ở Việt Nam

2.2.1.1. Nguồn gốc

Paphiopedilum micranthum được tìm thấy từ miền bắc Việt Nam đến phía tây

và bắc Quảng Tây, đông nam Vân Nam và phía tây Quý Châu (Trung Quốc), ở độ cao

360 - 1600 m. Cây được tìm thấy trên các vách đá, kẽ nứt bao gồm xác lá mục, đá vôi

và đất sét. Khu vực này chịu sương mù vào mùa đông và mưa lớn từ cuối mùa xuân

đến mùa hè.

2.2.1.2 Phân bố

Lan Hài P.micranthum chủ yếu ở miền Bắc Việt Nam (tập trung tại các tỉnh

Cao Bằng, Hà Giang, Tuyên Quang, Bắc Kạn) và vùng Quảng Tây, Quý Châu, Vân

Nam (Trung Quốc)[20].

2.2.2. Hình thái

- Dạng thân: Thân cỏ mọc trên đất hay đá, có thân rễ ít nhiều kéo dài với đường

kính 2-3 mm.

- Dạng lá: Có 3 - 5 lá xếp thành 2 dãy; thân rễ có đường kính 2 - 3 mm, dài đến

25 cm. Lá thường hình thuôn - bầu dục, dài 5 – 12, rộng 1,5 - 2 cm, mặt trên màu lục

với các đốm to màu lục thẫm, mặt dưới có nhiều chấm màu tím - tía.

- Dạng hoa: Cụm hoa có cuống dài 9 - 25 cm, mang 1 hoa. Hoa không có mùi,

thường màu hồng hay vàng nhạt, thẫm hơn về chóp, rộng 3 cm, dò hoa dài 9 - 25 cm,

hoa như một chiếc muôi lớn dài 10 cm, rộng 5 - 6 cm có mạng gân màu đỏ tía thẫm.

Lá đài hình trứng dài 1,5 - 3,6 cm, rộng 1,7 - 3 cm, hơi uốn ngược lại ở mép

bên, từ hình bầu dục tới hình trứng ngược, nhọn và có rãnh tới chóp.

Cánh hoa hình trứng ngược rộng, chóp tròn dài 1,9 - 4,3cm, rộng 2,3 - 4,4 cm,

có lông mép và nhiều lông dài màu trắng ở mặt trong.

Môi hình trứng rộng, lõm sâu, mép cuốn vào trong dài 5 – 10, rộng 3,4 - 5,6 cm.

Nhị lép lồi, hình thuôn rộng hay hình bầu dục, dài 5 - 10 mm.

- Dạng quả: Dạng quả nang dài, 3 gờ, hình trụ, mở ở gần đỉnh bằng 6 rãnh nứt.

Quả chín trong điều kiện tự nhiên sau khi thụ phấn từ 6 đến 10 tháng.

- Dạng rễ: Rễ chùm, màu nâu.

Hình 2.1. Hình ảnh về cây lan Hài Paphiopedilum micranthum

tại nhà lưới khoa CNSH-CNTP

2.2.3. Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng giống lan hài P. micranthum

2.2.3.1. Nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng

- Nhiệt độ: Lan Hài được phân chia thành 2 nhóm chính, theo quy luật chung,

những cây có lá màu xanh thường thích sống ở nơi có nhiệt đô lạnh đến trung bình,

ban đêm là từ 13-16°C, ban ngày là 18-24°C. Các loài Hài có lá vằn thích hợp với

điều kiện nhiệt từ trung bình đến ấm, ban đêm là 16-18°C, ban ngày là 21-25°C.

- Ánh sáng: Lan Hài không cần ánh sáng mặt trời đầy đủ. Hầu hết lan Hài ưa

ánh sáng yếu, điều kiện ánh sáng nhân tạo cho các loài lan từ 11.000-22.000 lux [25].

Nếu lá bị vàng hoặc phát hoa ngắn chứng tỏ chúng đang dư ánh sáng, nếu lá màu xanh

đậm và mềm hoặc phát hoa dài, yếu, chúng đang thiếu ánh sáng

- Độ ẩm không khí: Không khí ẩm và lưu thông tốt là rất cần thiết, nhất là trong

mùa hè, giúp giảm thiểu nguy cơ nhiễm nấm bệnh và giữ cho cây không bị khô quá

nhanh. Độ ẩm có thể được nâng lên bằng cách đặt chậu cây lên trên các khay sỏi nhẹ

với 50% độ ẩm là lý tưởng.

2.2.3.2. Nhu cầu bón phân

Phân bón: Có thể bón phân NPK với tỉ lệ 20:20:20 hoặc 14:14:14, bổ sung

khoáng Ca2+ 40mg/l và Mg2+ 20-30mg/l. Tưới nước đậm trước và sau khi bón phân,

nếu thấy đầu lá bị nâu khô thì nên dừng hẳn việc tưới phân. Sang chậu khi giá thể

trồng có dấu hiệu mục nát [6].

2.2.3.3. Giá thể trồng

P. micranthum có thể trồng trên giá thể gồm đá vôi trộn thêm chất lá mục, than

củi, xỉ than tổ ong, sỏi, vỏ thông và có thể tưới thêm phân bón 2 lần/ tuần trong suốt

mùa sinh trưởng của cây lan [8].

2.2.4. Các phương pháp nhân giống vô tính lan Hài Mốc Hồng

- Phương pháp tách chiết thông thường: Lan Hài Mốc Hồng là loài đơn thân

nên chỉ có thể tách chồi non ra khỏi cây mẹ, trồng vào chính giữa chậu mới. Cần cột

chặt cây vào chậu bằng một cây tựa sau đó phun một dung dịch NAA 0,1 ppm và

vitamin B1 và treo cây vào nơi ẩm mát, thoáng. Sau khi cây bén rễ thì bổ sung thêm

chất trồng vào chậu sau đó đặt cây vào nơi có điều kiện ánh sáng thích hợp cho sự phát

triển lâu dài của cây [6].

- Phương pháp cấy mô: Đây là phương pháp duy nhất hiện nay có thể nhân giống

lan Hài trên quy mô công nghiệp, cây con được sản xuất hoàn toàn giống nhau từ một

cây bố mẹ. So với phương pháp tách chiết thông thường có tốc độ phát triển 1cây/năm

thì phương pháp nuôi cấy mô sẽ sản xuất được khoảng 4 triệu cây/năm. Các loài lan Hài

thường được nuôi cấy trên môi trường Murashige & Skoog 1962, Heller, Vacin & Went

có bổ sung chất điều hoà sinh trưởng như NAA, 2,4D, BA, TDZ, Kinetin...trong điều

kiện vô trùng hoàn toàn. Nhờ tiến bộ khoa học, ngày nay người ta có thể cấy nhiều bộ

phận khác nhau của cây lan để hình thành các thể giống protocorm như đỉnh sinh trưởng

hay chồi bên, cọng hoa, lá, đốt thân hoặc rễ [6].

2.3. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định cho sự phân

hoá tế bào và cơ quan nuôi cấy.

Nghiên cứu về môi trường nuôi cấy giữ một vị trí quan trọng trong lịch sử phát

triển nuôi cấy mô, tế bào thực vật. Vào thời kì Haberlandt tiến hành các thí nghiệm

nuôi cấy tế bào biệt lập, hiểu biết về nhu cầu dinh dưỡng khoáng còn hạn chế, đặc

biệt là vai trò của các chất kích thích sinh trưởng hầu như chưa được khám phá.

Chính vì vậy mà Haberlandt đã không thành công.

2.3.1. Vật liệu nuôi cấy

Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho nuôi cấy mô tế bào thực

vật. Vật liệu dùng cho nuôi cấy mô – tế bào thực vật có thể là hầu hết các cơ quan hay

bộ phận của cây (chồi ngọn, chồi bên, phiến lá...), các cấu trúc của phôi (lá mầm, trụ lá

mầm...), các cơ quan dự trữ (củ, thân, rễ..) [16].

Tuy mang cùng lượng thông tin di truyền nhưng các cấu trúc mô khác nhau,

trên cùng cây có thể phát sinh các hình thái khác nhau trong quá trình nuôi cấy, vì vậy

việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy phải căn cứ vào trạng thái sinh lý và tuổi của mẫu, chất

lượng cây lấy mẫu, chất lượng cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu, mục đích và

khả năng nuôi cấy [16].

Mẫu nuôi cấy trước khi đưa vào nuôi cấy phải được vô trùng. Phương pháp phổ

biến nhất trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng hoá chất có khả năng tiêu diệt vi

sinh vật. Hoá chất được lựa chọn để vô trùng mẫu phải đảm bảo 2 điều kiện: Có khả

năng tiêu diệt vi sinh vật tốt và không hoặc ít độc đối với mẫu. Hiệu 1quả vô trùng tuỳ

thuộc vào thời gian, nồng độ và khả năng xâm nhập để tiêu diệt vi sinh vật của hoá

chất. Một số hoá chất thường được sử dụng hiện nay để vô trùng mẫu là: Ca(OCl)2-

hypoclorit canxi, NaClO-hypoclorit natri, oxy già, HgCl2- thuỷ ngân clorua, chất

kháng sinh(gentamicin, ampixilin...) [16].

2.3.2. Điều kiện nuôi cấy

- Điều kiện vô trùng: Trong nuôi cấy mô – tế bào thực vật, các thao tác với

mẫu cấy được tiến hành trong điều kiện vô trùng gồm buồng cấy vô trùng, các dụng cụ

cấy vô trùng và môi trường cấy vô trùng nhằm đảm bảo mẫu cấy sẽ không bị nhiễm vi

sinh vật. Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô in

vitro. Để tạo điều kiện vô trùng, buồng cấy phải dùng đèn tử ngoại chiếu trong 30 phút

sau đó được lau sạch bằng cồn 90°, dụng cụ và môi trường nuôi cấy thường được khử

trùng ở 121°C trong 25-30 phút có khả năng diệt nấm và vi khuẩn [6].

- Ánh sáng: Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu

tố như: thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng. Thời gian

chiếu sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy. Thời gian chiếu sáng

thích hợp với đa số các loài cây là 12- 18h/ngày. Cường độ ánh sáng tác động đến sự

phát sinh hình thái mô nuôi cấy [13].

Theo Ammirato (1986): Cường độ ánh sáng cao kích thích sự sinh trưởng của

mô sẹo. Ngược lại, cường độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo chồi. Nhìn chung cường

độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000 - 7000(lux), ngoài ra chất lượng ánh

sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh hình thái của mô thực vật in vitro: Ánh sáng đỏ

làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng. Nếu mô nuôi cấy trong

ánh sáng xanh thì sẽ ức chế vươn cao nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng

của mô sẹo. Hiện nay trong các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô để cung cấp nguồn ánh

sáng có cường độ 2000 - 2500(lux) người ta sử dụng các đèn huỳnh quang đặt cách

bình nuôi cấy từ 35 – 40(cm).

- Nhiệt độ: Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng

ảnh hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hoá trong cây. Tuỳ thuộc vào

xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp. Nhìn chung nhiệt độ

thích hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loài cây là 25±20C [13].

2.3.3. Môi trường dinh dưỡng

Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật thay đổi tuỳ theo loài, bộ phận,

các giai đoạn phát triển, phân hoá khác nhau của mẫu cấy và mục đích nuôi cấy như

duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mầm hoặc tái sinh cây hoàn chỉnh [11].

Thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật bao gồm các

thành phần chính sau:

2.3.3.1. Nguồn Cacbon

Mô cấy trong môi trường nuôi cấy in vitro không cón khả năng tự dưỡng do

không tiến hành quang hợp đầy đủ. Vì vậy, việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy

nguồn cacbon hữu cơ là điều kiện bắt buộc. Nguồn Cacbon cung cấp cho môi trường

nuôi cấy thường là các loại đường, phổ biến nhất là saccharose với hàm lượng từ 20-

30 g/l. Ngoài ra còn có thể sử dụng các loại đường khác như fructose, rafinose,

sorbitol, glucose, maltose, lactose,....những loại đường này chỉ dùng trong những

trường hợp cá biệt [13].

2.3.3.2. Các nguyên tố khoáng đa lượng, vi lượng

Các chất vô cơ bao gồm thành phần khoáng đa lượng và khoáng vi lượng có

trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật được sử dụng như là thành phần cơ bản

để tổng hợp chất hữu cơ [11]. Các dạng ion của muối khoáng đóng vai trò quan trọng

trong quá trình vận chuyển xuyên màng, điều hoà áp suất thẩm thấu và điện thế màng

[15].

- Nguyên tố đa lượng:

Quan trọng nhất là các nguyên tố: N, P, K, Mg, Ca, Na, S [14]

+ Nitơ: Thường được sử dụng ở dạng NO3- hoặc NH4+, hầu hết các loại thực vật

sẽ sử dụng nguồn nitơ này để đồng hoá và tổng hớp nên các sản phẩm hữu cơ.

+ Phospho: Nhu cầu phospho của mô và tế bào nuôi cấy là rất cao, P có tác

dụng như hệ thống đệm giúp ổn định pH môi trường.

+ Kali: Thường dùng ở dạng KNO3, KH2PO4, KCl.6H2O

+ Canxi: Sử dụng chủ yếu là CaNO3.4H2O, CaCl2.6H2O, CaCl2.2H2O

+ Magie: Sử dụng chủ yếu là MgSO4

+ Lưu huỳnh: Chủ yếu là SO4

- Nguyên tố vi lượng: Chủ yếu là Fe, B, Mn, Cu, Zn, I, Ni... các nguyên tố vi

lượng bổ sung với lượng nhỏ vào môi trường nhưng có vai trò quan trọng đối với quá

trình trao đổi chất, tổng hợp protein, hoạt động phân bào của mô, tế bào nuôi cấy.

2.3.3.3. Vitamin

Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Đại đa số

tế bào thực vật nuôi cấy đều có thể tự tổng hợp vitamin cần thiết, nhưng số lượng thấp,

có thể không đủ duy trì sự sinh trưởng của nó. Các vitamin thường được sử dụng nhiều

nhất trong nuôi cấy mô là: Thiamin (vitamin B1), nicotinic acid, pyridoxine (vitamin

B6) và myo-inositol. Vitamin có tác dụng thúc đẩy sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy

và trong nhiều trường hợp nó có vai trò như nguồn cacbon của môi trường nuôi cấy

[8].

- Vitamin B1 (Thiaminee HCl): Là chất bổ sung rất cần thiết cho môi trường

nuôi cấy, có vai trò trong trao đổi hydratcacbon và sinh tổng hợp amino acid [16].

- Vitamin B6 (Pyridocinen): Là coenzzyme quan trọng trong nhiều phản ứng

trao đổi chất [16].

- Vitamin B3 (Nicotinic acid): Tham gia tạo coenzyme của chuỗi hô hấp [16].

- Myo-inositol: Có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào, màng tế bào, tham

gia vận chuyển đường, các nguyên tố khoáng, trao đổi hyđratcacbon [16].

2.3.3.4. Các chất hữu cơ tự nhiên

- Nước dừa: Chứa nhiều chất dinh dưỡng như inositol, các amino acid, đường,

các chất thuộc nhóm cytokinin, các chất có hoạt tính auxin [16].

- Dịch thuỷ phân casein: Chứa nhiều amino acid [16].

- Dịch chiết nấm men: Có hàm lượng khá cao các vitamin nhóm B [16].

- Nước ép các loại củ quả: Nước ép cà chua, cà rốt, nước ép chuối xanh… [16]

2.3.3.5. Các thành phần khác

- Agar: Chiết xuất từ rong biển, thành phần của agar gồm một số chất hữu cơ

như acid hữu cơ, acid béo, cùng một số nguyên tố vô cơ như Cu, Fe, Zn... Ngoài tác

dụng tạo gel cho môi trường, agar cũng cung cấp một số chất dinh dưỡng cho tế bào,

mô nuôi cấy [8].

- Than hoạt tính: Dùng để hấp thụ chất màu, các hợp chất thứ cấp gây ức chế

sinh trưởng của mẫu nuôi cấy. Ngoài ra, có thể sử dụng một số chất chống oxy hoá

khác như polyvinyl pyrolodon (PVP), acid ascobic [16].

2.3.3.6. pH của môi trường

Độ pH của môi trường ảnh hưởng đến khả năng tiếp nhận chất dinh dưỡng của

mẫu từ môi trường nuôi cấy. Đa số pH của môi trường được điều chỉnh trong khoảng

từ 5,5-6,0. Trong quá trình nuôi cấy, pH của môi trường có thể giảm do mẫu nuôi cấy

sản sinh ra các acid hữu cơ.

2.3.3.7. Các chất điều hoà sinh trưởng

Các chất điều hoà sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môi trường

nuôi cấy, có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật. Hiệu quả

của chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào: Nồng độ, hoạt tính của chất điều hoà

sinh trưởng và yếu tố nội sinh của mẫu cấy [16].

Dựa vào hoạt tính sinh lý có thể phân chất điều hoà sinh trưởng làm 2 nhóm:

Nhóm chất kích thích sinh trưởng và nhóm ức chế sinh trưởng. Trong nuôi cấy mô, tế

bào thực vật, nhóm chất kích thích sinh trưởng là nhóm thường được sử dụng [16].

- Nhóm Auxin: Được phát hiệ lần đầu tiên bởi Charles Darwin và con trai là

Francis Darwin khi thử nghiệm tính hướng sáng trên cây yến mạch, Sau đó, nhiều nhà

khoa họv đã nghiên cứu và dần mở rộng hiểu biết về nhóm chất này. Auxin trong cơ

thể thực vật tập trung nhiều ở các chồi, lá non, hạt nảy mầm, trong phấn hoa. Auxin có

nhiều tác động tới các hiệu ứng sinh trưởng và phát triển trên cơ thể thực vật. Cụ thể

như sau: Auxin có ảnh hưởng tới tính hướng động của thực vật, tiêu biểu là tính hướng

sáng và hướng đất. Auxin gây ra hiện tượng ưu thế đỉnh (sự sinh trưởng của chồi đỉnh

sẽ ức chế chồi nách). Auxin khởi động việc hình thành rễ bên và rễ phụ do auxin kích

thích sự phân chia của tế bào trụ bì – nơi rễ sẽ sinh trưởng xuyên qua vỏ biểu bì, Ngoài

ra, auxin còn tác động đến việc hình thành chồi hoa, sự phát triển của quả và làm chậm

sự rụng lá [16].

Các auxin thường được sử dụng là: NAA, IBA, 2,4D (các auxin nhân tạo), IAA

(các auxin tự nhiên). Hoạt tính bcuat các chất này được xếp theo thứu tự từ yếu đến

mạnh như sau: IAA, IBA, NAA, 2,4D. IAA nhạy cảm với nhiệt độ và dễ phân huỷ

trong quá trình hấp khử trùng do đó không ổn định trong môi trường nuôi cấy môi,

NAA và 2,4D không bị biến tính ở nhiệt độ cao. Tuy nhiên chất 2,4D là chất dễ gây

độc nhưng có tác dụng nhạy đến sự phân chia tế bào và hình thành callus [6].

- Nhóm Cytokinin: Được phát hiện từ những năm 50 của thế kỷ XX, chất đầu

tiên là Kinetin bắt nguồn từ tinh dịch cá trích. Tiếp đó, đến zeatin tách từ nội nhũ của

hạt ngô non. Đã phát hiện cytokinin ở vi sinh vật, tảo silic, rêu, dương xỉ, cây lá kim.

Zeain có nhiều trong thực vật bậc cao và trong một số vi khuẩn. Trong thực vật,

cytokinin có nhiều trong hạt, quả đang lớn, mô phân sinh. Cytokinin kích thích hoặc

ức chế nhiều quá trình sinh lý, trao đổi chất. Cùng với auxin, cytokinin điều khiển sự

phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô. Tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽ kích thích tạo rễ,

ngược lại sẽ hình thành chồi. Cytokinin cảm ứng sự hình thành chồi bên và ức chế ưu

thế đỉnh. Quá trình sinh trưởng dãn dài của tế bào cũng chịu ảnh hưởng của cytokinin.

Ngoài ra cytokinin còn làm chậm sự già hoá [10].

Trong các chất thuộc nhóm cytokinin thì Kinetin và BAP được sử dụng phổ

biến vì hoạt tính mạnh: Kinetin (phối hợp cùng auxin vơi tỷ lệ thích hợp có khả năng

kích thích phân chia tế bào), BAP (hoạt tính mạnh, bền nhiệt), ngoài ra có thể sử dụng

TDZ, Diphenylurea... [10].

- Nhóm Gibberellin: Được tách chiết lần đầu từ dịch tiết của nâm bởi các nhà

khoa học Nhật Bản vào những năm 1935-1938. Giberellin được tổng hợp trong các mô

đỉnh, tồn tại trong cả hạt non và quả đang phát triển. Giberellin có tác dụng chính

trong việc hoạt hoá phân bào của mô phân sinh lóng, kéo dài lóng cây. Nó cũng kích

thích sự kéo dài của tế bào, tăng kich thước của chồi nuôi cấy. GA3 là loại gibberellin

được sử dụng nhiều nhất [10].

2.3.4. Các công đoạn của nuôi cây mô tế bào

Một qui trình nhân giống in vitro cơ bản gồm các giai đoạn sau:

Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây mẹ. Cây mẹ cần phải sạch bệnh và đang ở giai đoạn

tăng trưởng mạnh nhất thì khi nhân giống mới cho hiệu quả cao.

Giai đoạn 2: Khử trùng mẩu cấy, ở giai đoạn này một phần thích hợp của thực

vật được khử trùng và chuyển vào môi trường nuôi cấy trong điều kiện vô trùng.

Những mẫu cấy còn sống sau khi khử trùng sẽ được chuyển sang giai đoạn 3.

Giai đoạn 3: Tăng sinh. Mục tiêu của giai đoạn này là tăng nhanh số lượng cá

thể bằng sự tự sinh phôi soma, tăng số lượng chồi bên, tạo chồi bất định. Các chồi tăng

trưởng mạnh, đạt chiều cao thích hợp sẽ được chuyển sang giai đoạn 4.

Giai đoạn 4: Ra rễ in vitro. Ở giai đoạn này những chồi đạt chiều cao thích hợp

sẽ được chuyển sang môi trường kích thích rễ. Trong môi trường này cần phải bổ sung

auxin để cảm ứng rễ và nồng độ khoáng thường giảm so với môi trường tăng sinh.

Giai đoạn 5: Giai đoạn ra rễ in vitro, với những cây không ra rễ in vitro thì sẽ

được chuyển ra vườn ươm để ra rễ và phát triển thành cây hoàn chỉnh.

2.4. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài trên thế giới và trong nước

2.4.1. Trên thế giới

Thông thường Paphiopedilum có thể được nhân giống bằng gieo trồng hạt hay

tách cây con đã trưởng thành ra khỏi cây mẹ. Tuy nhiên, các phương pháp này cho

hiệu quả nhân giống thấp nên không đáp ứng nhu cầu của thị trường. Vì vậy, phương

pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật cho phép tạo ra một lượng lớn cây con trong thời

gian ngắn đã trở thành một giả pháp lý tưởng để bảo vệ lan Hài thoát khỏi nguy cơ

tuyệt chủng.

Các nghiên cứu đầu tiên về nuôi cấy mô lan Hài được thực hiện bởi Bubeck

năm 1973. Kể từ đó nhiều nhà nghiên cứu đã cố gắng nhân giống lan Hài bằng nhiều

phương pháp nuôi cấy sử dụng các bộ phận khác nhau của cây. Một số nghiên cứu đã

thành công:

Năm 1975, Stewart và cs tiến hành cảm ứng chồi bên để tạo ra mô sẹo, đôi khi

có sự hình thành một vài cây con trong quá trình nuôi cấy. Tuy nhiên, các mô sẹo rất

khó tái sinh, sau một thời gian nuôi cấy những mô sẹo này sẽ chết. Vì lý do này, hầu

hết các nghiên cứu về nuôi cấy mô Paphiopedilum đều sử dụng nguồn vật liệu ban đầu

từ hạt [24].

Năm 1980, Nieman đã tiến hành nuôi cấy chồi bên và cây con [26] và phương

pháp này cũng được Sampolinski sử dụng cho nghiên cứu năm 1983 [21].

Năm 1988, Huang đã tiến hành nuôi cấy kéo dài cây in vitro, sau đó cảm ứng

tạo chồi từ chồi nách của cây in vitro được nuôi cấy kéo dài [22].

Năm 2000, Lin và cs đã tiến hành nuôi cấy mô sẹo từ nguồn protocorm của hạt

một loài lan Hài lai và đã thu được một vài cây con trong ống nghiệm [25].

Năm 2001, Huang đã tiến hành nhân nhanh hạt giống lan Hài lai giữa P.

philippinese và P. susan trong môi trường MS bổ sung với BAP 13 mM [23].

Năm 2002 và 2004, Chen và các cộng sự cũng báo cáo rằng có thể cảm ứng tạo

chồi từ thân và lá của lan Hài P. philippinese khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ

sung 2,4D 4,52mM và TDZ 4,5mM [20].

Năm 2005, Dương Tấn Nhựt đã nghiên cứu thành công phương pháp nhân nhanh

giống lan Hài P. delenatii bằng phương pháp sử dụng hạt nảy mầm in vitro. Từ cây con

in vitro, các mô sẹo được cảm ứng từ protocorm có nguồn gốc từ hạt, được nuôi cấy trên

môi trường có chứa 2,4D và TDZ với nồng độ cao, những mô sẹo này có khả năng tái

sinh thành cây hoàn chỉnh thông qua bước hình thành PLB. Một phần mô sẹo có thể tái

sinh được 3-7 chồi trong 3 tháng và chúng có thể tồn tại trên môi trường nuôi cấy trong

3 năm mà không mất đi khả năng tái sinh [26]. Ngoài ra, Dương Tấn Nhựt còn nghiên

cứu thành công một phương pháp mới cho phép nhân nhanh giống lan P. delenatii là

phương pháp gây vết thương trên phần gốc thân của cây con in vitro. Phần gốc sau khi

nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung thêm TDZ, NAA, 2,4D sẽ hình thành mô sẹo

và một số ít xuất hiện protocorm [27].

Năm 2007, Dương Tấn Nhựt và cộng sự đã nghiên cứu nhân giống thành công

lan Hài Hồng qua các chồi tái sinh từ các đoạn thân của cây non được nuôi cấy kéo dài

in vitro khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung TDZ 1,5 mg/l, BA 2 mg/l, NAA

0,5 mg/l, than hoạt tính 1 g/l, đường 30 g/l, agar 9 g/l [22]. Khi nuôi cấy trong bóng tối

sẽ thu được chồi dài, màu vàng, yếu, còn khi nuôi cấy dưới ánh sáng đỏ có cường độ

thấp sẽ thu được chồi có sự giãn cách giữa các lá dọc trên thân cây.

Năm 2008, Hong và các cộng sự cũng đã tái sinh chồi từ mô sẹo của cây con

giống P. alma Gavaert khi nuôi cấy trên môi trường MS có Kinetin 4,65mM [21]

Năm 2011, Liao và các cộng sự cũng đã tái sinh chồi từ mô sẹo của cây con

hoàn chỉnh từ nụ hoa của P. deperle và P. armeni. Tuy nhiên, cần rất nhiều thời gian

để cho cây lan Hài ra hoa vì vậy phương pháp này kém hiệu quả hơn các phương pháp

khác [24].

Người ta cũng tiến hành phương pháp nuôi cấy huyền phù tế bào từ những dòng

mô sẹo có nguồn gốc từ protocorm và nuôi cấy mô sẹo từ những loại mô khác của

Paphiopedilum.

2.4.2. Trong nước

* Về các nghiên cứu điều tra, sưu tập, lưu giữ, bảo tồn lan.

- Đề tài “Điều tra tài nguyên di truyền các loài lan rừng Vườn quốc gia Cát Tiên

(VQGCT) và nghiên cứu các biện pháp nhân nhanh để bảo tồn” của Tiến sỹ Nguyễn

Văn Kết.

- Khoa Nông Lâm thuộc trường Đại học Đà Lạt. VQGCT là nơi có sự tập trung

với mật độ khá dày các loại lan rừng quý hiếm tại Việt Nam (ở đây có tới 100 chi và

gần 400 loài trên tổng số 152 chi và 897 loài lan của cả nước). Được biết, tình trạng

khai thác bừa bãi diễn ra liên tục trong thời gian dài và không có kế hoạch gây trồng

đã làm cho nhiều loài lan đứng trước nguy cơ tuyệt chủng ngay tại VQGCT. Sau hơn

01 năm nghiên cứu, đã nhân giống thành công bằng biện pháp nuôi cấy mô gần 30

giống lan đặc hữu của Vườn Quốc gia Cát Tiên (VQGCT). Trong số các giống lan đã

được nhân giống thành công tại Khoa Nông lâm Đại học Đà Lạt có nhiều loài rất quý

được nước ngoài đặt mua với số lượng lớn như kim hài, vân hài, lan P. concolor,...

(trong đó có một số loài còn có tác dụng làm thuốc chữa bệnh như Ludisia discolor,

Kim tuyến...). Việc nhân giống thành công các loài lan đặc hữu không chỉ cho phép

bảo tồn các nguồn gen quý hiếm bằng cách di thực các giống lan này trở lại trồng tại

VQGCT mà còn tạo điều kiện để nhân rộng các giống phong lan quý ở các địa bàn

khác (nhất là trồng tại vùng trồng hoa nổi tiếng Đà Lạt).

- Đề tài “Nghiên cứu chọn lọc và phát triển một số loài lan rừng có triển vọng

phục vụ cho công tác nhân giống, lai tạo và bảo tồn nguồn gien đặc hữu, quý hiếm của

Lâm Đồng” của Viện Sinh học Tây Nguyên công bố tháng 10/2008. Kết quả đã xác

định được 73 loài lan rừng có hoa to, lâu tàn, màu sắc đẹp, có giá trị kinh tế và được

nhiều người ưa chuộng có thể đưa vào nhân giống phục vụ sản xuất kinh doanh. Ngoài

ra đã xác định được tên khoa học của 189/209 loài lan rừng phân bố trên địa bàn Lâm

Đồng mà đơn vị đã thu thập, khảo sát. Trong đó có 3 loài mới và 37 loài đặc hữu thuộc

loại quý hiếm của Việt Nam như lan Hài hồng, Huyết nhung trơn, Hài vân, Hài Đà

Lạt... Hiện các loài lan thu thập được ngoài tự nhiên đều đang phát triển tốt, có khả

năng ra hoa ở điều kiện của khí hậu Đà Lạt.

- Đề tài: “Điều tra, thu thập đánh giá, bảo tồn nguồn gen cây hoa cảnh khu vực

miền Bắc Việt nam do Trung tâm Hoa cây cảnh - Viện Di truyền nông nghiệp chủ trì.

Kết quả của đề tài đã chỉ ra khu vực Tây bắc có trên 18 chi lan khác nhau, trong đó

phải kể đến các chi Hoàng thảo (Dendrobium), Dáng Hương (Aerides), Ngọc điểm

(Rhynchostylis), Kiếm (Cymbidium), Hài (Paphiopedilum), v.v,...

- Đề tài: “Thu thập đánh giá nguồn gen hoa lan Việt Nam và lưu giữ chúng ở 2

vùng: miền núi phía Bắc và đồng bằng Bắc bộ” do GS. TSKH. Trần Duy Quý – Viện

Khoa học nông nghiệp Việt Nam làm chủ nhiệm, từ năm 2007 – 2009. Kết quả đã điều

tra, thu thập, định danh và lưu giữ nguồn gen cho nhiều loài lan rừng thuộc 10 chi

khác nhau (Hài vệ nữ, Hồ điệp, lan Kiếm, Hoàng thảo, Quế lan hương, Vanđa, Catlan,

Phượng vĩ, Hạc đính và Đai châu) và lưu giữ chúng ở 2 nơi: Vùng núi Tam đảo và

vùng đồng bằng Hà nội với quy mô 2.000 dò (chậu)/ 1.500m2 vườn nuôi trồng

* Về nghiên cứu kỹ thuật trồng và nhân giống lan Hài

Lan Hài đỏ (Hài hồng - P. delenatii) của Phân Viện Sinh học Đà Lạt được nhân

giống thành công bằng phương pháp ứng dụng công nghệ tế bào thực vật. Sau nhiều

lần thử nghiệm nhân giống, từ hai năm qua, những nhà khoa học ở Phân viện sinh học

Đà Lạt đã áp dụng phương pháp mới trong nhân giống hoa lan Hài đỏ. Các cây sau khi

được kéo dài đoạn thân bằng cách sử ánh sáng trắng của đèn huỳnh quang và ánh sáng

đỏ của đèn LED, được cắt thành từng đốt rồi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung

các chất điều tiết sinh trưởng khác. Kết quả cho thấy tỷ lệ tạo chồi cao nhất (75%) khi

môi trường có bổ sung 2,0mg/l BA, còn trên môi trường có bổ sung 1,5mg Zeotin hoặc

1,5mgTDZ thì cho chất lượng chồi tốt nhất. Khi dùnhg phương pháp này, khả năng tạo

chồi rất nhanh, ,mặt khác cũng tìm được điều kiện sinh thái cho lan Hài nở hoa. Qua

đây, người ta cũng chứng minh rằng lan Hài đỏ cũng có thể sản xuất vô tính [9].

Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2005, 2007), đã nhân giống được loài lan Hài đỏ-

một loài Lan đặc hữu của Việt Nam (Paphiopedilum delenatii) bằng kỹ thuật gây vết

thương cơ giới, nuôi cấy lỏng và kéo dài đốt thân có chứa mắt để tái sinh chồi từ việc

sử dụng các hạt lan sáu tháng tuổi được nuôi cấy trên môi trường Knudson C kết hợp

với việc gây vết thương và nuôi cấy trên môi trường lỏng đã thu được 5,2 chồi/mẫu

ban đầu khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 1,0mg/l TDZ. Còn các cây sau

khi được kéo dài đoạn thân bằng cách sử dụng ánh sang trắng của đèn huỳnh quang và

ánh sáng đỏ của đèn LED, được cắt thành từng đốt rồi nuôi cấy trên môi trường MS có

bổ sung các chất diều tiết sinh trưởng khác nhau. Kết quả cho thấy tỷ lệ tạo chồi cao

nhất (75%) khi môi trường có bổ xung 2,0mg/l BA, còn trên môi trường có bổ sung

1,5mg Zeatin hoặc 1,5mg/l TDZ thì cho chất lượng chồi tốt nhất [7], [27].

Năm 2006, tác giả Đặng Xuyến Như và cộng sự đã thành công trong việc tạo ra

các cây con của hai loài lan Hài Hằng (P. hangianum) và Hài Tam Đảo (P.

gratrixianum) bằng kỹ thuật gieo hạt trong ống nghiệm và kỹ thuật gây vết thương trên

cây con trong ống nghiệm. Hai loài lan này nhân giống rất khó vì hạt nhỏ, dài chừng 1

– 2mm, rộng chừng 1mm, chứa rất ít và hầu như không có chất dinh dưỡng để tạo điều

kiện cho hạt nảy mầm. Do đó nếu gieo hạt trong môi trường đất hạt rất dễ bị mất mát

và khó nảy mầm. Từ những kết quả đạt được, nhóm nghiên cứu do PGS-TS Đặng

Xuyến Như phụ trách đã xây dựng được quy trình nhân giống hai loài lan Hài quý trên

bằng phương pháp gieo hạt trong ống nghiệm. Đồng thời họ cũng tìm ra phương pháp

tách mầm như một biện pháp bổ sung để nhân giống Hài Hằng và Hài Tam Đảo.

Không dừng tại đó, các nhà khoa học đã nghiên cứu thành công việc nuôi trồng những

cây con nói trên trong vườn ươm [12].

Hoàng thị Giang và cộng sự (2010) đã nghiên cứu nhân giống in vitro giống lan

hài Hằng (P.hangganumperner gurss) từ nguồn nguyên liệu ban đầu là hạt lấy từ quả

6-10 tháng tuổi. Môi trường nuôi cấy là RE cho tỷ lệ hạt nảy mầm cao nhất (58-67%).

Môi trường nhân nhanh là môi trường RE có bổ sung 150ml/l nước dừa và 100mg/l

chuối cho hệ số nhân cao nhất đạt 4,3 lần và cùng trên nền môi trường RE có bổ sung

0,4 – 0,6 mg/l NAA cho khả năng ra rễ tốt nhất [5].

Trong nghiên cứu của Vũ Quốc Luận và cộng sự (2014) về lan Hài Hồng cho

thấy các chồi non lan Hài Hồng có 4 lá được cấy vào môi trường SH có bổ sung 0,5

mg/l BA, 0,5 mg/l NAA, 30 g/l đường sucrose, 9,0 g/l agar, 1 g/l than hoạt tính và

được nuôi trong điều kiện che tối hoàn toàn trong 4 tháng nhằm kéo dài các đốt thân,

sau đó được đưa ra điều kiện chiếu sáng thêm 2 tháng để lá tổng hợp diệp lục tố và các

năng lượng cần thiết cho cây. Kết quả cho thấy, các chồi non được kéo dài trung bình

10.5 cm, với số lá mới hình thành trung bình 5 lá/chồi, tương ứng với 5 đốt/chồi thu

được sau 120 ngày nuôi trong điều kiện tối. Sau đó, các chồi được đưa sang điều kiện

chiếu sáng 60 ngày, các chồi non tiếp tục hình thành lá mới, tuy nhiên không nhận

thấy có sự phân đốt. Sau 180 ngày nuôi cấy, các chồi được cắt thành 5 đốt riêng biệt

với 1 lá và 1 rễ, riêng phần đỉnh chồi được giữ nguyên với 3 lá và 2 rễ. Cuối cùng, các

đốt thân được trồng trên giá thể dớn Đài Loan thu được kết quả cao nhất ở vị trí đốt

thân số 1 với tỷ lệ sống sót (100%) sau 12 tháng [7; 9].

Nguyễn Thị Tình và cộng sự (2017) đã thành công trong nhân nhanh cây lan

Hài gấm (P. concolor) từ phôi trên môi trường MS cải tiến có bổ sung BA 2mg/l và

TDZ 1,0mg/l. Cho hệ số nhân chồi đạt 2,9 lần.

Nguyễn Thị Tình và cộng sự (2018) nhân giống thành công loài lan hài giáp P.

malipoense trên môi trường MS có bổ sung BA 2mg/l và NAA 0,3mg/l cho hệ số nhân

chồi 3,28 lần.

Nguyễn Thị Tình và cộng sự (2018) nhân giống thành công loài lan hài Xuân

Cảnh Paphiopedilum Canhii) trong môi trường MS có bổ sung BA với nồng độ 2mg/l

+ Kinetine 1mg/l + TDZ 1mg/l cho hệ số nhân chồi đạt 2,93 lần.

Phần 3

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu

3.1.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: Loài lan Hài Mốc Hồng (Paphiopedilum micranthum)

được thu thập tại Khu bảo tồn thiên nhiên Thần Sa - Thái Nguyên và được lưu giữ tại

nhà lưới khoa CNSH&CNTP.

- Vật liệu nghiên cứu:

+ Một số chất kích thích sinh trưởng .

+ Một số thành phần dinh dưỡng hữu cơ (nước dừa, dịch chiết chuối ).

+ Đoạn thân mang mầm ngủ lan Hài Mốc Hồng.

3.1.2. Hoá chất sử dụng

- Hoá chất khử trùng: cồn 70°, thuỷ ngân clorua (HgCl2).

- Môi trường MS, B5, WPM đường sacharose, agar, ...

- Một số chất kích thích sinh trưởng ở thực vật thuộc nhóm auxin (IAA ,IBA,

NAA,...), nhóm cytokinin (BA,...), nhóm gibberellin (GA3)

3.1.3. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu

Bảng 3.1. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu

Thiết bị Cân phân tích Dụng cụ Pank

Máy khuấy từ Dao kéo

Máy đo PH Đèn cồn

Lò vi sóng Cốc đong, ống đong

Nồi hấp vô trùng Bình tam giác

Tủ sấy Đĩa (hạt đậu, peptri)

Hệ thống giàn đèn Chun nịt

Máy cất nước Túi nilon

Box cấy vô trùng Giấy thấm

Cùng các trang thiết bị, dụng cụ khác phục vụ nghiên cứu của Phòng Thí

nghiệm Khoa CNSH&CNTP.

3.2. Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.2.1. Phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của dung dịch khử trùng HgCl2

đến khả năng tạo vật liệu vô trùng.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường khoáng đến khả năng tái sinh mầm

ngủ lan Hài P. micranthum.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng và hợp chất

hữu cơ đến khả năng nhân nhanh chồi và ra rễ từ mầm ngủ lan Hài P. micranthum.

3.2.2. Địa điểm nghiên cứu

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật, Khoa

CNSH&CNTP, Trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên.

3.2.3. Thời gian nghiên cứu

- Thời gian: từ tháng 1/2019 – tháng 5/2019

3.3. Nội dung nghiên cứu

3.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian cuả dung dịch khử

trùng HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của dung dịch khử trùng HgCl2

đến khả năng tạo vật liệu vô trùng đoạn thân mang mầm ngủ, lan Hài P. micranthum.

3.3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng

tái sinh mầm ngủ lan Hài P. micranthum.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái

sinh mầm ngủ lan Hài P. micranthum.

3.3.3. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng và

hợp chất hữu cơ đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum từ đoạn thân

mang mầm ngủ.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P.

micranthum từ mầm ngủ.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P.

micranthum từ mầm ngủ.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với GA3 đến khả năng nhân nhanh

chồi lan Hài P. micranthum từ mầm ngủ.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả năng nhân nhanh chồi

lan Hài P. micranthum từ mầm ngủ.

3.3.4. Nội dung 4: Nghiên cứu môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan Hài P.

micranthum.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan

Hài P. micranthum.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan

Hài P. micranthum.

3.4. Phương pháp nghiên cứu

3.4.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro

- Sử dụng môi trường MS, B5, WPM bổ sung Agar 5,5 g/l, Đường 30g/l, Nước

dừa 150ml/l, Inositol 100mg/l, pH: 5,6 - 5,8.

- Các chất kích thích sinh trưởng sử dụng bổ sung vào môi trường nuôi cấy có

hàm lượng thay đổi tùy theo từng thí nghiệm.

- Môi trường hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1,0 atm trong 15 phút.

- Sau khi cấy xong đưa mẫu vào phòng nuôi với điều kiện nuôi cấy nhiệt độ

phòng từ 220C – 25oC, cường độ chiếu sáng 2000 – 2500 lux, độ ẩm: 60 – 65% quang

chu kì 16h sáng/8h tối. Tiến hành theo dõi mẫu.

3.4.2. Phương pháp nghiên cứu quy trình nhân giống

Đoạn thân mang chồi ngủ

Khử trùng (cồn 70º, HgCl2)

Tái sinh chồi

Nhân nhanh chồi

Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh

Hình 3.1. Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng

đến khả năng tái sinh, nhân nhanh chồi và ra rễ của cây lan Hài P.micranthum

3.4.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm

- Điều kiện thí nghiệm: Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng Công

nghệ sinh học thực vật (Khoa CNSH-CNTP) trong điều kiện nhiệt độ phòng (25ºC

± 2, độ ẩm 60 - 65%, thời gian chiếu sáng 16h/ngày, cường độ chiếu sáng 2000 –

2500 lux.

- Bố trí thí nghiệm: Tất cả các thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên

hoàn toàn mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 30 bình, mỗi bình 1

mẫu.

3.4.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu nồng độ và thời gian khử trùng mẫu trong dung dịch

HgCl2 đến hiệu quả tạo vật liệu vô trùng.

Các bước tiến hành vô trùng mẫu như sau:

- Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu: Mẫu lấy là các đoạn thân của cây lan Hài

P.micranthum có mang chồi ngủ, chồi nách đem rửa sạch dưới vòi nước, loại bỏ hết

phần đất bẩn, cắt bỏ phần thừa, dùng xà phòng loãng để rửa, sau đó tráng lại bằng

nước cất.

- Khử trùng mẫu: Tiến hành trong box cấy vô trùng, khử trùng sơ bộ bằng cồn

70° trong 30 giây, tráng lại 3 - 5 lần bằng nước cất vô trùng, sau đó khử trùng tiếp

bằng dung dịch HgCl2 để tiêu diệt nấm, vi khuẩn. Sau đó tráng lại bằng nước. Đặt mẫu

lên giấy thấm và để khô tự nhiên trong box. Sau đó dùng pank, dao, kéo cắt bỏ phần

mẫu ngấm hoá chất trên mẫu và cấy vào môi trường nuôi cấy.

- Sau khi cấy xong đưa mẫu vào phòng nuôi với điều kiện nuôi cấy nhiệt độ

phòng từ 220C – 25oC, cường độ chiếu sáng 2000 – 2500 lux, độ ẩm: 60 – 65% quang

chu kì 16h sáng/8h tối. Tiến hành theo dõi mẫu.

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng cuả nồng độ, thời gian khử trùng mẫu trong

dung dịch HgCl2 đến hiệu quả tạo vật liệu vô trùng.

Các công thức được bố trí như sau:

Hóa chất

Công thức CT1 (Đ/C) CT2 Thời gian (phút) 0 5

CT3 10 HgCl2 0.1%

CT4 15

CT5 5

CT6 10 HgCl2 0.15%

CT7 15

CT8 5

CT9 10 HgCl2 0.2 %

CT10 15

3.4.3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng

tái sinh đoạn thân mang mầm ngủ lan Hài P. micranthum.

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường dinh dưỡng đến khả

năng tái sinh đoạn thân mang mầm ngủ lan Hài P. micranthum.

- Mẫu vô trùng, được cấy chuyển sang các môi trường dinh dưỡng có chứa các

thành phần khoáng khác nhau với chất bổ sung Đường 30g/L + Agar 5,5g/L + Nước

dừa 150 ml/L + Inositol 100mg/l, để nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến

khả năng tái sinh chồi lan Hài P. micranthum

Công thức thí nghiệm được bố trí như sau:

CT Môi trường Chất bổ sung

1 Muashige & Skoog (MS) Đường 30g/L + Agar 5,5g/L

+ Nước dừa 150 ml/L + 2 Gamborg’s (B5)

Inositol, pH 5,6 – 5,8. 3 Woody Plant Medium (WPM)

- Mẫu có kích thước tương đồng sau khi khử trùng được đưa vào môi trường tái

sinh, sau đó đặt trong phòng nuôi cấy với điều kiện thích hợp. Tiến hành theo dõi,

quan sát chồi tái sinh và chất lượng chồi tái sinh.

3.4.3.3. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng và

hợp chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum từ

đoạn thân mang mầm ngủ.

- Chồi tái sinh được tách và cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi

trường nền (Môi trường nền gồm thành phần khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin là

thành phần của môi trường MS bổ sung: Đường 30 g/l + Nước dừa 150 ml/l + Agar

5,5 g/l + Inositol 100mg/l , pH 5,6 – 5,8.), có bổ sung chất kích thích sinh trưởng

(NAA) để theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu.

- Theo dõi, quan sát số chồi, chất lượng chồi.

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng nhân nhanh chồi lan

P.micranthum từ mầm ngủ.

Các chồi được tạo thành từ môi trường tái sinh sẽ được tách ra và cấy chuyển

sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi trường nền + NAA ở các nồng độ khác nhau

để theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu.

Thí nghiệm được bố trí như sau:

CT 1 (Đ/c): MT nền + NAA 0,0 mg/l

CT 2: MT nền + NAA 0,5 mg/l

CT 3: MT nền + NAA 1,0 mg/l

CT 4: MT nền + NAA 1,5 mg/l

CT 5: MT nền + NAA 2,0 mg/l

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi lan

P.micranthum từ mầm ngủ.

Các chồi được tạo thành từ môi trường tái sinh sẽ được tách ra và cấy chuyển

sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi trường nền + BA ở các nồng độ khác nhau để

theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu.

Thí nghiệm được bố trí như sau:

CT 1(Đ/c): MT nền + BA 0,0 mg/l

CT 2: MT nền + BA 0,5 mg/l

CT 3: MT nền + BA 1,0 mg/l

CT 4: MT nền + BA 1,5 mg/l

CT 5: MT nền + BA 2,0 mg/l

Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với GA3 đến khả năng nhân

nhanh chồi lan P. micranthum từ mầm ngủ.

Môi trường tái sinh sẽ được cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi

trường nền + A (nồng độ BA thích hợp nhất cho quá trình tái sinh chồi ở thí nghiệm 3) +

GA3 ở các nồng độ khác nhau để theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu.

Thí nghiệm được bố trí như sau:

CT 1(Đ/c): MT nền + A + GA3 0,0 mg/l

CT 2: MT nền + A + GA3 0,1 mg/l

CT 3: MT nền + A + GA3 0,3 mg/l

CT 4: MT nền + A + GA3 0,5 mg/l

CT 5: MT nền + A + GA3 1,0 mg/l

Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả năng nhân nhanh

chồi lan Hài P. micranthum từ mầm ngủ.

Môi trường tái sinh sẽ được cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi

trường nền + nồng độ dịch chiết chuối để theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu.

Thí nghiệm được bố trí như sau:

CT 1 (Đ/c): MT nền + dịch chiết chuối 0 g/l CT 2: MT nền + dịch chiết chuối 100 g/l CT 3: MT nền + dịch chiết chuối 120 g/l CT 4: MT nền + dịch chiết chuối 150 g/l CT 5: MT nền + dịch chiết chuối 180 g/l

3.4.3.4.Nội dung 4: Nghiên cứu môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của lan Hài P.

micranthum từ mầm ngủ.

Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh

của lan Hài P. micranthum.

- Chồi sinh trưởng và có từ 2-3 lá thì cấy chuyển sang môi trường ra rễ gồm: MT

nền có bổ sung IAA ở các nồng độ khác nhau để theo dõi khả năng tạo rễ của mẫu.

- Đưa mẫu vào phòng cây. Quan sát và theo dõi số rễ và chất lượng rễ.

Thí nghiệm được bố trí như sau:

CT 1 (Đ/c): MT nền + IAA 0,0 mg/l

CT 2: MT nền + IAA 0,3 mg/l

CT 3: MT nền + IAA 0,5 mg/l

CT 4: MT nền + IAA 1,0 mg/l

CT 5: MT nền + IAA 2,0 mg/l

Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh

của lan Hài P. micranthum.

- Chồi sinh trưởng và có từ 2-3 lá thì cấy chuyển sang môi trường ra rễ gồm : MT

nền có bổ sung IAA ở các nồng độ khác nhau để theo dõi khả năng tạo rễ của mẫu.

- Đưa mẫu vào phòng cây. Quan sát và theo dõi số rễ và chất lượng rễ.

Thí nghiệm được bố trí như sau:

CT 1 (Đ/c): MT nền + IBA 0,0 mg/l

CT 2: MT nền + IBA 0,3 mg/l

CT 3: MT nền + IBA 0,5 mg/l

CT 4: MT nền + IBA 1,0 mg/l

CT 5: MT nền + IBA 2,0 mg/l

3.5. Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu

3.5.1. Thu thập số liệu

- Đếm số mẫu sống, mẫu nhiễm, mẫu chết.

- Đếm số chồi: Đếm tổng số chồi và nhánh trên một mẫu nuôi cấy ban đầu.

- Đếm số lượng rễ, độ dài của rễ.

3.5.2. Các chỉ tiêu theo dõi

- Chỉ tiêu theo dõi khử trùng mẫu

+ Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm:

Tổng số mẫu sống không nhiễm (mẫu)

Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%) = × 100

Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)

+ Tỷ lệ mẫu sống nhiễm:

Tổng số mẫu sống bị nhiễm (mẫu)

Tỷ lệ mẫu sống nhiễm (%) = × 100%

Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)

+Tỷ lệ mẫu chết:

Tổng số mẫu chết (mẫu)

Tỷ lệ mẫu chết (%) = × 100%

Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)

- Chỉ tiêu theo dõi chồi:

Tổng số mẫu nảy chồi (mẫu)

Tỷ lệ tái sinh chồi (%) = × 100%

Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)

Tổng chồi thu được

Hệ số nhân chồi (lần) = × 100%

Tổng chồi nuôi cấy

Hình thái chồi:

+ Sinh trưởng tốt: Chồi mập, khỏe, xanh

+ Sinh trưởng trung bình: Chồi mập, khỏe, xanh nhạt

+ Sinh trưởng kém: Chồi nhỏ, yếu, trắng vàng

- Chỉ tiêu theo dõi ra rễ:

Tổng số chồi ra rễ (chồi)

Tỷ lệ chồi ra rễ (%) = × 100%

Tổng số mẫu nuôi cấy (mẫu)

Hình thái rễ:

+ Rễ tốt: Rễ khỏe, dài.

+ Rễ trung bình: Rễ khỏe, ngắn.

+ Rễ kém: Rễ ngắn, nhỏ.

3.5.3. Phương pháp sử lý số liệu

Các số liệu thu thập được thống kê và xử lý theo phương pháp thống kê toán

học bằng phần mềm Microsoft office Excel 2010 và phần mềm IRRISTAT 5.0.

Phần 4

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của dung dịch khử

trùng HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng

Trong quá trình nuôi cấy in vitro, vô trùng mẫu cấy là giai đoạn khởi đầu và

quyết định sự thành công của quá trình nuôi cấy. Để có được vật liệu khởi đầu sạch

nấm và vi khuẩn, việc lựa chọn chất khử trùng, nồng độ, thời gian rất quan trọng. Qua

quá trình nghiên cứu và tìm hiểu khả năng tạo mô sạch trong nuôi cấy in vitro trên đối

tượng Phong lan nói chung và lan Hài nói riêng, chúng tôi nhận thấy có nhiều chất hóa

học có hoạt tính diệt nấm và vi khuẩn mạnh như Calcium hypochlorid Ca(OCl)2, thuỷ

ngân clorua (HgCl2), hydroxid (H2O2),....Tuy nhiên HgCl2 được nhiều nhà nghiên cứu

sử dụng bởi chúng có hoạt lực cao trong việc tiêu diệt nấm và vi khuẩn, cho tỷ lệ mẫu

sống vô trùng cao [12]. Vì vậy, cần lựa chọn được nồng độ, thời gian khử trùng thích

hợp nhất để loại bỏ hoàn toàn mầm bệnh khỏi mẫu trước khi đưa vào môi trường nuôi

cấy tạo vật liệu ban đầu sạch nấm, sạch vi khuẩn. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm

HgCl2 ở các nồng độ và thời gian khác nhau. Sau 7 ngày theo dõi kết quả thu được

trình bày ở bảng sau:

Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian khử trùng của

dung dịch HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng (sau 7 ngày nuôi cấy)

Chỉ tiêu đánh giá

Công thức

Nồng độ (%)

Thời gian (phút)

Số mẫu đưa vào (mẫu)

Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%)

Tỷ lệ mẫu sống nhiễm (%)

Tỷ lệ mẫu chết (%)

0,00

100

0,00

CT1(Đ/c)

Nước cất vô trùng

HgCl20,1%

HgCl2 0,15%

HgCl2 0,2%

5 10 15 5 10 15 5 10 15

30 30 30 30 30 30 30 30 303

CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 CT7 CT8 CT9 CT10

LSD05 CV (%)

13,33 24,33 46,66 30,00 60,00 49,00 66,66 50,21 35,00 5,4 8,2

86,67 63,34 36,66 51,00 20,00 13,33 20,50 6,67 0,00

0,00 12,33 17,68 19,00 20,00 37,67 12,84 43,12 65,00

Kết quả thí nghiệm đươc thể hiện qua hình 4.1:

66.66

50,21

46.66

24,33

Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%)

13.33

Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%) 70

CT1

CT2

CT3

CT4

CT5

CT6

CT7

CT8

CT9

CT10

Công thức

Hình 4.1. Biểu đồ kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của

HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng (sau 7 ngày nuôi cấy)

Xét tỷ lệ mẫu sống không nhiễm:

Từ kết quả ở bảng 4.1 và hình 4.1 cho thấy:

Các công thức thí nghiệm đều cho tỷ lệ mẫu sống không nhiễm cao hơn công

thức đối chứng (0,00%), từ đó cho thấy nồng độ HgCl2 và thời gian khử trùng có ảnh

hưởng tích cực đến khả năng tiêu diệt nấm, vi khuẩn.

Ở chỉ tiêu mẫu sống không nhiễm, LSD05 đạt 5,4 và giá trị CV(%): 8,2%; cặp

CT7 và CT9 có sự sai khác không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%, các cặp CT khác

có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%.

Ở chỉ tiêu mẫu sống không nhiễm từ CT2 đến CT10 cho tỷ lệ mẫu sống

không nhiễm cao nhất là CT8 (66,66%) và thấp nhất là CT2 (13,33%).

Ở chỉ tiêu mẫu chết từ CT2 đến CT10 cho tỷ lệ mẫu chết cao nhất là CT10

(65%) và thấp nhất là CT2 (0,00%).

Điều này có thể giải thích rẳng khi khử trùng mẫu bằng HgCl2 ở một nồng độ

càng cao, thời gian khử trùng kéo dài thì khả năng tiêu diệt vi khuẩn, nấm tăng, do đó

tỷ lệ mẫu nhiễm giảm. Tuy nhiên HgCl2 là loại hoá chất có khả năng gây độc và làm

chết mẫu nên thời gian khử trùng mẫu kéo dài và nồng độ chất khử trùng cao dẫn đến

sự xâm nhập hoá chất khử trùng vào mẫu gây tỉ lệ mẫu chết.

Hình 4.2. Một số hình ảnh tạo vật liệu vô trùng.

4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái

sinh đoạn thân mang mầm ngủ lan Hài P. micranthum

Mẫu sau khi xử lí vô trùng, cấy chuyển sang các môi trường dinh dưỡng có

chứa các thành phần khoáng khác nhau để đánh giá khả năng tái sinh chồi lan chồi lan

Hài P.micranthum. Chúng tôi thu được kết qủa ở bảng sau:

Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái

sinh chồi lan Hài P. micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy)

Công Môi Số mẫu đưa Tổng số mẫu bật Tỷ lệ tái sinh Hình thái

thức trường vào (mẫu) chồi (chồi) chồi (%) chồi

Xanh đậm, MS 30 20 66,6 1 mập

B5 30 17 56,6 2 Xanh nhạt, mập

WPM 30 8 26,6 3 Xanh nhạt, gầy

8,72 LSD05

CV% 7,7

Kết quả thí nghiệm được thể hiện qua biểu đồ hình 4.3:

Tỉ lệ tái sinh chồi(%)

66.6

56.6

Tỉ lệ tái sinh chồi (%)

26.6

WPM

Hình 4.3. Biểu đồ kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến

khả năng tái sinh đoạn thân mang mầm ngủ lan Hài P. micranthum

Từ bảng 4.2 và biểu đồ hình 4.3 cho thấy:

Ở chỉ tiêu tỷ lệ tái sinh chồi: giá trị LSD05 đạt 8,72 và CV (%): 7,7%.; Các

công thức đều có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy là 95%. CT1 (MS) cho tỷ lệ

chồi tái sinh cao nhất 66,6%. Tiếp theo CT2 (B5) tỷ lệ tái sinh chồi là 56,6%. CT3 cho

tỷ lệ tái sinh chồi thấp nhất 26,6%.

Ở chỉ tiêu hình thái chồi, CT3 (WPM) chồi thu được có màu xanh nhạt và

gầy. Trên môi trường MS cho tỷ lệ tái sinh cao nhất trong thí nghiệm trên quan sát và

thu được chồi có màu xanh đậm và mập. CT2 là môi trường B5 chồi thu được có màu

xanh nhạt và mâp.

Kết quả thí nghiệm cho thấy chồi lan Hài P. micranthum có thể tái sinh tốt trên

nền môi trường chứa hàm lượng dinh dưỡng từ trung bình đến giàu dinh dưỡng. Còn đối

với môi trường nghèo dinh dưỡng hạn chế cho sự tái sinh trưởng và phát triển chồi cây

lan Hài P. micranthum. Từ kết quả trên, chúng tôi chọn môi trường MS làm môi trường

cơ bản cho quá trình nghiên cứu sau của cây lan Hài P.micranthum

MS: 66,6% B5: 56,6% WPM: 26,6%

(Xanh đậm, mập) (Xanh nhạt, mập) (Xanh nhạt, gầy)

Hình 4.4. Hình ảnh ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh chồi lan Hài P. micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy) 4.3. Kết qủa nghiên cứu của một số chất kích thích sinh trưởng và hợp chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum từ đoạn thân mang mầm ngủ 4.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng cuả NAA đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum

Nhân nhanh chồi là giai đoạn gia tăng số lượng chồi trong một thời gian ngắn. Hệ số nhân nhanh phụ thuộc vào thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, ánh sáng). Thảo luận ở phần này, lấy từ kết quả nghiên cứu của các tác giả trong phần tổng quan, nhất là bổ sung các chất kích thích sinh trưởng.

Với mục đích nhân nhanh lan Hài P. micranthum tái sinh, chúng tôi tiến hành thí nghiệm: mẫu nuôi cấy được thử nghiệm khả năng nhân nhanh chồi trong sau môi trường có bổ sung NAA với nồng độ khác nhau. Thí nghiệm được theo dõi trong 20 ngày:

Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy).

Công thức

Hình thái chồi

Số mẫu nuôi cấy (mẫu)

Tổng số chồi thu được (chồi)

Hệ số nhân chồi (lần)

Nồng độ NAA (mg/l) 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

5 55 21 47 23

30 30 30 30 30

Xanh nhạt, gầy Xanh đậm, mập Xanh nhạt, gầy Xanh nhạt, mập Xanh nhạt, gầy

CT1(Đ/c) CT 2 CT 3 CT 4 CT 5

1,0 1,83 0,7 1,56 0,76 0,14

LSD05

CV%

7,7

Kết quả thí nghiệm được thể hiện qua hình 4.5:

Hệ số nhân chồi (lần) 1.83

1.8

1.56

1.6

1.4

1.2

1,0

Hệ số nhân chồi (lần)

0.76

0.7

0.8

0.6

0.4

0.2

0.5

1.5

Hình 4.5. Biểu đồ kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng

nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy).

Kết quả bảng 4.3 và hình 4.5 cho thấy:

Ở chỉ tiêu nhân nhanh chồi: giá trị LSD05 đạt 0,14 và CV (%): 7,7%. Cặp

CT3 và CT5 có sự sai khác không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%.

Điều này cho thấy NAA có sự ảnh hưởng tích cực tới khả năng tái sinh chồi lan

Hài P. micranthum. Từ CT2 đến CT5 tương ứng với bổ sung NAA ở các nồng độ từ

0,5-2,0 mg/l, sau 20 ngày nuôi cấy thì tổng số chồi thu được nhiều hơn so với công

thức đối chứng (5 chồi). Trong thí nghiệm này, khi sử dụng NAA ở nồng độ 0,5 mg/l

(CT2) cho tổng chồi thu được cao nhất (55 chồi) với hệ số nhân chồi là 1,83 lần.

Ở chỉ tiêu hình thái chồi: khi không bổ sung NAA (CT đối chứng) hệ số nhân

chồi thấp và chồi nhạt màu. CT2 (nồng độ NAA 0,5 mg/l) cho hình thái chồi tốt nhất

(chồi xanh đậm và mập). CT3 cho tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất nhưng chồi xanh nhạt và

gầy. Hình thái chồi giảm khi tăng dần nồng độ NAA.

Kết quả trên được giải thích như sau: NAA là chất điều tiết sinh trưởng thực vật

có tác dụng thúc đẩy sự phân bào và nhân nhanh, kích chồi. Ở CT đối chứng (CT1) vì

không bổ sung NAA nên số mẫu tạo chồi không lớn và ít chồi. Nồng độ NAA 0,5 mg/l

(CT2) cho nhiều chồi và có số chồi lớn nhất là do NAA ở nồng độ này có tác dụng

kích thích sự nhân nhanh chồi lan mạnh nhất đồng thời tạo điều kiện cho cây sinh

trưởng và phát triển tốt nhất. Ở CT3; CT4; CT5; nồng độ NAA lần lượt là 1,0 mg/l;

1,5 mg/l; 2,0 mg/l cho thấy tỷ lệ ra chồi và số chồi giảm dần. , bởi vì NAA ở nồng độ

cao gây ức chế chồi phát triển, số lượng chồi hình thành cũng giảm, chồi sinh ra xanh

nhạt và gầy.

Nồng độ NAA 0,5 mg/l được lựa chọn để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.

(Xanh nhạt, gầy) (Xanh đậm,mập) (Xanh nhạt, gầy) (Xanh nhạt, mập) (Xanh nhạt, gầy)

CT1 CT2 CT3 CT4 CT5

Hình 4.6. Hình ảnh ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng nhân nhanh chồi

lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy).

CT1: 0 mg/l NAA; CT2: 0,5 mg/l NAA; CT3: 1 mg/l NAA; CT4: 1,5 mg/l NAA; CT5: 2 mg/l NAA. 4.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi lan

Hài P. micranthum

BA (6-Benzyl amino purine) là một chất điều hòa sinh trưởng thực vật thuộc nhóm Cytokinin, được sử dụng khá phổ biến trong môi trường nuôi cấy mô nhằm kích thích sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan, kích thích tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ.Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng nồng độ BA từ 0 - 4mg/l để đánh giá sự ảnh hưởng nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi .Các chồi được tạo thành từ môi trường tái sinh sẽ được tách ra và cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh với nồng độ BA thích hợp nhất cho nhân nhanh chồi ở các nồng độ khác nhau để theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu.

Sau 20 ngày nuôi cấy kết quả được trình bày ở bảng 4.4.

Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh lan

Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy)

Nồng độ Số mẫu Tổng số Hệ số nhân Công thức Hình thái chồi BA(mg/l) nuôi cấy chồi thu chồi

(mẫu) được (lần)

(chồi)

0,0 30 Xanh nhạt, mập CT 1(Đ/c) 20 1,0

0,5 30 Xanh nhạt, mập CT 2 45 1,5

1 30 Xanh nhạt, mập CT 3 47 1,56

1,5 30 Xanh đậm, mập CT 4 57 1,9

2,0 30 Xanh đậm, mập CT 5 65 2,16

0,16 LSD05

CV% 5,7

Kết quả thí nghiệm được thể hiện qua hình 4.7:

Hệ số nhân chồi (lần)

2.5

2.16

1.9

1.56

1.5

Hệ số nhân chồi(lần)

0.5

1.5

Hình 4.7. Biêu đồ ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh lan Hài

P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy)

Kết quả bảng 4.4 và hình 4.7 cho thấy:

Ở chỉ tiêu nhân nhanh chồi: LSD05 đạt 0,16 và giá trị CV (%): 5,7%. Các

công thức thí nghiệm đều có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Điều này

cho thấy BA có sự ảnh hưởng tích cực tới khả năng tái sinh chồi lan Hài

P.micranthum. Từ CT2 đến CT5 tương ứng với bổ sung BA ở các nồng độ từ 0,5 - 2,0

mg/l, sau 20 ngày nuôi cấy thì tổng số chồi thu được nhiều hơn hẳn so với công thức

đối chứng (20 chồi). ở các CT2, CT3, CT4 thì hệ số nhân chồi tăng dần lần lượt là: 1,5

lần; 1,56 lần và 1,9 lần. CT5 với nồng độ 2,0 mg/l BA cho tổng chồi thu được cao

nhất (65 chồi) với hệ số nhân chồi là 2,16 lần và khác bệt rõ rệt so vs CT (Đ/c) và các

CT2, CT3, CT4.

Ở chỉ tiêu hình thái chồi, khi không bổ sung BA (CT1 - CT Đ/c) và CT2 cho

hình thái chồi tái sinh thấp và chồi nhạt màu, mập. Khi tăng dần nồng độ BA lên 1,0

mg/l (CT3); 1,5 mg/l (CT4) và 2,0 mg/l (CT5) thì hình thái chồi tốt lên đáng kể (chồi

xanh đậm, mập).

Kết quả trên được giải thích như sau: BA là cytokinin có vai trò trong việc hoạt

hóa quá trình phân bào, nhờ đó sẽ có tác dụng cảm ứng cho việc hình thành chồi và phân

hóa chồi. Khi tăng dần nồng độ BA trong môi trường (0 – 2,0 mg/l) thì tỷ lệ chồi tái sinh

tăng đáng kể. Nồng độ BA 2,0 mg/l đối với cây lan Hài P. micranthum cho tổng chồi thu

được cao nhất đạt 65 chồi với hệ số nhân chồi đạt 2,16 lần.

Nồng độ BA 2,0 mg/l, cho kết quả tốt nhất sẽ được sử dụng nghiên cứu kết hợp

với chất kích thích sinh trưởng khác ở các thí nghiệm tiếp theo.

(Xanh nhạt, mập) (Xanh nhạt, mập) (Xanh nhạt, mập) (Xanh đậm, mập) (Xanh đậm,mập)

CT1 CT2 CT3 CT4 CT5

Hình 4.8. Hình ảnh ảnh nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh

chồi lan P. micranthum ( sau 20 ngày nuôi cấy )

CT1: 0 mg/l BA; CT2: 0,5 mg/l BA; CT3: 1 mg/l BA; CT4: 1,5 mg/l BA; CT5: 2 mg/l BA. 4.3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Giberellin đến khả năng

nhân nhanh chồi lan P. micranthum

Gibberellin (GA3) kích thích sự nảy mầm, nảy chồi của các mầm ngủ, do đó nó

có tác dụng trong việc phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ của chúng. Hàm lượng gibberellin

thường tăng lên lúc chồi cây, củ, căn hành hết thời kỳ nghỉ, lúc hạt nảy mầm.Trong

trường hợp này của gibberellin kích thích sự tổng hợp của các enzyme amilaza và các

enzyme thuỷ phân khác như protease, photphatase... và làm tăng hoạt tính của các

enzyme này, vì vậy mà xúc tiến quá trình phân hủy tinh bột thành đường cũng như

phân hủy các polime thành monome khác, tạo điều kiện về nguyên liệu và năng lượng

cho quá trình nảy mầm. Trên cơ sở đó, nếu xử lý gibberellin ngoại sinh thì có thể phá

bỏ trạng thái ngủ nghỉ của hạt, củ, căn hành kể cả trạng thái nghỉ sâu.

Các chồi được tạo thành từ môi trường tái sinh sẽ được tách ra và cấy chuyển

sang môi trường nhân nhanh với nồng độ BA thích hợp nhất cho nhân nhanh chồi +

giberellin ở các nồng độ khác nhau để theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu. Sau 20

ngày nuôi cấy kết quả được trình bày ở bảng 4.5.

Bảng 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với GA3 đến khả năng

nhân nhanh chồi lan P. micranthum ( sau 20 ngày nuôi cấy )

Hình thái chồi

Công thức

Nồng độ GA3 (mg/l)

Nồng độ BA(mg/l)

Số mẫu nuôi cấy (mẫu)

Hệ số nhân chồi (lần)

Xanh nhạt, mập

Tổng số chồi thu được (chồi) 56

1,86

0,0

CT 1(Đ/c)

Xanh đậm, mập

2,06

0,1

CT 2

Xanh đậm, mập

2,0

2,87

0,3

CT 3

Xanh đậm, gầy

2,46

0,5

CT 4

Xanh nhạt, gầy

2,13

1,0

CT 5

0,47

LSD05

3,6

CV%

Kết quả thí nghiệm được thể hiện qua hình 4.9:

Hệ số nhân chồi (lần )

3.5

2.87

2.46

2.5

2.13

2.06

1.86

Hệ số nhân chồi (lần)2

1.5

0.5

0.1

0.3

0.5

Hình 4.9. Biểu đồ ảnh hưởng của BA tốt nhất kết hợp với Giberellin đến khả

năng nhân nhanh chồi lan P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy)

Kết quả thu được ở bảng 4.5 và hình 4.9 cho thấy:

Ở chỉ tiêu hệ số nhân nhanh chồi: LSD0.5 đạt 0,47 và giá trị CV (%): 3,6%.

Các cặp CT2 và CT5 có sự sai khác không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%, các cặp

công thức khác có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%.

Khi bổ sung nồng độ BA 2,0 mg/l vào môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng tích

cực tới việc nhân nhanh chồi lan Hài P.micranthum. CT3 khi bổ sung BA 2,0 mg/l,

GA3 0,3 mg/l (CT3) vào môi trường nuôi cấy thì cho tổng số chồi thu được là 86 chồi

và hệ số nhân cao nhất là 2,87 lần.

Ở chỉ tiêu hình thái chồi: CT3 (BA 2,0 mg/l + GA3 0,3 mg/l) cho chất lượng

chồi thu được xanh đậm, mập.

Vậy trong khuôn khổ thí nghiệm này, để nâng cao hệ số nhân chồi cần bổ sung

BA 2,0 mg/l, GA3 0,3 mg/l, sẽ thu được tổng số chồi là 86 với hệ số nhân chồi là 2,87

lần.

(Xanh nhạt, mập) (Xanh đậm, mập) (Xanh đậm, mập) (Xanh đậm, gầy) (Xanh đậm, gầy)

CT1 CT2 CT3 CT4 CT5

Hình 4.10. Hình ảnh ảnh hưởng của BA kết hợp với GA3 đến khả năng nhân

nhanh chồi lan P. micranthum ( sau 20 ngày nuôi cấy )

CT1: 2,0mg/l BA + 0,0mg/l GA3; CT2: 2,0mg/l BA + 0,1mg/l GA3; CT3: 2,0mg/l BA + 0,3mg/l GA3;CT4: 2,0mg/l BA + 0,5mg/l GA3;CT5: 2,0mg/l BA + 1,0mg/l GA3. 4.3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả năng nhân

nhanh chồi lan P. micranthum

Theo Van Staden và cs (1975), dịch chiết chuối chứa nhiều thành phần dinh

dưỡng quan trọng về mặt sinh lý là serotonin, norepinephrine cùng với dopamine và

một số catechomaline chưa xác định [34]. Việc bổ sung dịch nghiền chuối vào môi

trường nuôi cấy hoa lan thường kích thích sự sinh trưởng bởi dịch chuối có hàm lượng

fructose, glucose và nitrat cao, khi được bổ sung vào môi trường nuôi cấy làm tăng

hàm lượng đường cũng như hàm lượng khoáng của môi trường. Tác dụng kích thích

của dịch chiết chuối hiệu quả do khả năng ổn định pH của môi trường nuôi cấy. Bổ

sung dịch chiết chuối vào môi trường đóng vai trò như một chất kháng acid và trung

hòa nồng độ acid. Ngoài ra, dịch chiết chuối có chứa một hàm lượng lớn như sắt, kali,

vitamin B6, B12 và trypthophan thúc đẩy PLBs tăng trưởng [25].Việc bổ sung dịch

chiết dinh dưỡng vào môi trường nuôi cấy đa số loài lan đều đem lại các hiệu quả khác

nhau. Việc bổ sung dịch chiết chuối có tác dụng kích thích đối với khả năng tạo

protocorm và sinh trưởng chồi [16]. Do đó chúng tôi tiến hành bổ sung dịch chiết

chuối vào môi trường nuôi cấy để khảo sát khả năng nhân nhanh chồi loài lan Hài P.

micranthum.

Bảng 4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả năng nhân

nhanh lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy)

Nồng độ

Tổng số

dịch

Số mẫu

Hệ số

Chiều

chồi thu

Công

chiết

nuôi cấy

nhân chồi

cao cây

Hình thái chồi

được

thức

chuối

(mẫu)

(lần)

(cm)

(chồi)

(g)

2,23

2,5

Xanh đậm, mập

CT1(Đ/c)

1,93

2,2

Xanh nhạt, gầy

100

CT 2

1,84

2,1

Xanh nhạt, gầy

120

CT 3

1,66

Xanh nhạt, gầy

150

CT 4

1,43

1,7

Xanh nhạt, gầy

180

CT 5

0,15

LSD05

CV (%)

4,6

Kết quả thí nghiệm được thể hiện qua hình 4.11:

Hệ số nhân chồi (lần)

2.5

2.23

1.93

1.84

1.66

1.43

1.5

Hệ số nhân chồi (lần)

0.5

100

120

150

180

Hình 4.11. Biểu đồ ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả năng nhân nhanh

chồi lan P. Micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy )

Kết quả thu được ở bảng 4.6 và hình 4.11 cho thấy:

Ở chỉ tiêu hệ số nhân chồi: LSD0.5 đạt 0,15 và giá trị CV (%): 4,6 % . Có thể

thấy rằng việc bổ sung dịch chiết đậu chuối vào môi trường nuôi cấy không có hiệu

quả tác động đến khả năng nhân nhanh của chồi lan Hài P.micranthum. CT1 khi không

bổ sung dịch chuối thì cho hệ số nhân chồi cao nhất là 2,23 lần

Ở chỉ tiêu hình thái chồi: CT2, CT3, CT3, CT4, CT5 đều cho chất lượng chồi

xanh nhạt, gầy. Nồng độ dịch chiết chuối là 100, 120, 150, 180 ml cùng với chiều cao

chồi đạt được lần lượt là 2,2 cm; 2,1cm; 2cm; 1,7cm. Cho thấy hệ số nhân chồi và

chiều cao cây giảm dần, bởi vì ở nồng độ dịch chiết chuối cao gây ức chế chồi phát

triển, chồi yếu nên hệ số nhân chồi giảm, chất lượng chồi sinh ra xanh nhạt và gầy.

Vậy trong khuôn khổ thí nghiệm này, để nâng cao hệ số nhân chồi không cần

bổ sung dịch chiết chuối, thu được số chồi lớn nhất là 67 chồi với hệ số nhân chồi là

2,23 và cho chồi xanh đậm, mập.

(Xanh đậm, mập) (Xanh nhạt, gầy) (Xanh nhạt, gầy) ( Xanh nhạt, gầy) (Xanh nhạt, gầy)

CT1 CT2 CT3 CT4 CT5

Hình 4.12. Biểu đồ ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả năng nhân nhanh

chồi lan P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy)

CT1: 0g/l DCC; CT2: 100g/l DCC; CT3: 120g/l DCC; CT4: 150g/l DCC; CT5: 180g/l DCC. 4.4 .Kết quả nghiên cứu môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của lan Hài P.

micranthum từ mầm ngủ

Bộ rễ là cơ quan quan trọng đối với tất cả các loài thực vật. Trong nuôi cấy mô,

sau khi nhân chồi với số lượng lớn, giai đoạn tiếp theo là tạo cây hoàn chỉnh để đưa ra

ngoài vườn ươm. Một cây khi được chuyển ra môi trường tự nhiên cần phải có bộ rễ

khỏe mạnh, hoàn chỉnh giúp cây có khả năng hút nước và dinh dưỡng khoáng tốt, làm

tiền đề cho sự sinh trưởng và phát triển sau này. Vì vậy, giai đoạn kích thích tạo rễ của

các chồi là giai đoạn quan trọng và không thể thiếu. Sau khi kết thúc giai đoạn nhân

nhanh tạo ra số lượng chồi lan Hài P.micranthum đồng nhất và khỏe mạnh, các chồi

tạo thành đạt tiêu chuẩn sẽ được tách ra đưa vào mỗi trường kích thích ra rễ.

Chất kích thích sinh trưởng được dùng chủ yếu ở giai đoạn này thuộc nhóm

auxin. Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng IAA và IBA (có dụng kích thích chồi

tạo rễ ) với các nồng độ khác nhau trong từng công thức thí nghiệm để nghiên cứu ảnh

hưởng của nồng độ IAA và IBA đến khả năng ra rễ của cây lan Hài P.micranthum.

4.4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn

chỉnh của lan Hài P. micranthum.

Bảng 4.7. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây

Công thức

hoàn chỉnh của lan Hài P.micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy )

Nồng độ IAA (mg/l)

Số mẫu nuôi cấy (mẫu)

Tỷ lệ chồi ra rễ (%)

Hình thái rễ

CT1(Đ/c)

0,0

Số chồi ra rễ (mẫu) 4

13,3

Ngắn, nhỏ

CT 2

0,3

Ngắn, nhỏ

CT 3

0,5

56,6

Ngắn, mập

CT 4

1,0

Ngắn, mập

CT 5

2,0

26,6

Ngắn, nhỏ

LSD05 CV (%)

11,6 14,3

Kết quả thí nghiệm được thể hiện qua hình 4.13:

Tỉ lệ chồi ra rễ (%)

56.6

Tỉ lệ chồi ra rễ (%)

26.6

13.3

0.3

0.5

Hình 4.13. Biểu đồ ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh

của lan Hài P. micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy)

Từ bảng kết quả bảng 4.7 và hình 4.13 cho thấy: Ở chỉ tiêu tỷ lệ mẫu ra rễ: LSD05 đạt 11,6 và giá trị CV (%): 14,3%. Các công thức khác nhau có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Nồng độ IAA có tỉ lệ mẫu ra rễ cao hơn hẳn so với công thức đối chứng (0 mg/l IAA). Trong thí nghiệm này, tỷ lệ mẫu ra rễ cao nhất đạt được ở CT4 là 80%, tiếp theo là CT3 đạt 56,6%, CT2 đạt 40%, CT5 đạt 26,6%.

Ở chỉ tiêu hình thái rễ: CT1, CT2, CT5 cho chất lượng rễ ngắn, nhỏ. CT3,

CT4 tương ứng với nồng độ IAA lần lượt là 0,5; 1,0g/l cho rễ ngắn và mập.

Kết quả trên được giả thích như sau: IAA có dụng kích thích chồi tạo rễ. CT đối chứng (CT1) vì không bổ sung IAA nên số mẫu tạo rễ không lớn và ít rễ. Nồng độ IAA 1,0 mg/l (CT4) cho nhiều cây ra rễ và có số rễ lớn nhất là do IAA ở nồng độ này có tác dụng kích thích chồi lan ra rễ mạnh nhất đồng thời tạo điều kiện cho cây sinh trưởng và phát triển tốt nhất. CT5 nồng độ IAA là 2,0 mg/l cho thấy tỷ lệ ra rễ và số rễ giảm, bởi vì IAA ở nồng độ cao gây ức chế chồi phát triển, chồi yếu nên số lượng rễ hình thành cũng giảm, rễ sinh ra dài và nhỏ.

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy khi bổ sung IAA ở nồng độ 1,0 mg/l

cho tỷ lệ cây ra rễ cao nhất đạt 80%.

CT1 CT2 CT3 CT4 CT5

(Ngắn, nhỏ) (Ngắn, nhỏ) (Ngắn, mập) (Ngắn, mập) (Ngắn, nhỏ)

Hình 4.14. Hình ảnh ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của lan

Hài P. micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy )

CT1: 0 mg/l IAA; CT2: 0,3 mg/l IAA; CT3: 0,5 mg/l IAA; CT4: 1,0 mg/l IAA; CT5: 2 mg/l IAA.

4.4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn

chỉnh của lan Hài P.micranthum

Bảng 4.8. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây

hoàn chỉnh của lan Hài P. micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy)

Hình thái rễ

Công thức

Nồng độ IBA (mg/l)

Số mẫu nuôi cấy (mẫu)

Số chồi ra rễ (mẫu)

Tỷ lệ chồi ra rễ (%)

0,0

Ngắn, nhỏ

CT1(Đ/c)

23,3

0,3

Ngắn, nhỏ

CT 2

53,3

0,5

Ngắn, mập

CT 3

1,0

Ngắn, mập

CT 4

93,3

2,0

Ngắn, nhỏ

CT 5

43,3

9,72

LSD05

CV (%)

9,1

Kết quả thí nghiệm được thể hiện qua hình 4.15:

Tỉ lệ chồi ra rễ (%)

100

93.3

53.3

43.3

Tỉ lệ chồi ra rễ (%)

23.3

0.3

0.5

Hình 4.15. Biểu đồ ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh

của lan Hài P. micranthum(sau 40 ngày nuôi cấy )

Từ bảng kết quả 4.7 và hình 4.15 cho thấy: Ở chỉ tiêu tỷ lệ mẫu ra rễ: LSD05 đạt 9,72% và giá trị CV (%): 9,1%. Các công thức khác nhau có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Nồng độ IBA có tỉ lệ mẫu ra rễ cao hơn hẳn so với công thức đối chứng (0 mg/l IBA). Trong thí nghiệm này, tỷ lệ mẫu ra rễ cao nhất đạt được ở CT4 là 93,3%, tiếp theo là CT3 đạt 70%, CT2 đạt 53,3, CT5 đạt 43,33%.

Ở chỉ tiêu hình thái rễ: CT1, CT2, CT5 cho chất lượng rễ ngắn, nhỏ. CT3,

CT4 tương ứng với nồng độ IBA lần lượt là 0,5; 1,0g/l cho rễ ngắn và mập.

Kết quả trên được giả thích như sau: IBA có dụng kích thích chồi tạo rễ. CT đối chứng (CT1) vì không bổ sung IBA nên số mẫu tạo rễ không lớn và ít rễ. Nồng độ IBA 1,0 mg/l (CT4) cho nhiều cây ra rễ và có số rễ lớn nhất là do IBA ở nồng độ này có tác dụng kích thích chồi lan ra rễ mạnh nhất đồng thời tạo điều kiện cho cây sinh trưởng và phát triển tốt nhất. CT5 nồng độ IBA 2,0 mg/l cho thấy tỷ lệ ra rễ và số rễ giảm dần, bởi vì IBA ở nồng độ cao gây ức chế chồi phát triển, chồi yếu nên số lượng rễ hình thành cũng giảm, rễ sinh ra dài và nhỏ.

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy khi bổ sung IBA ở nồng độ 1,0 mg/l

cho tỷ lệ cây ra rễ cao nhất đạt 93,3%.

CT1 CT2 CT3 CT4 CT5

(Ngắn, nhỏ) (Ngắn, nhỏ) (Ngắn, mập) (Ngắn, mập) (Ngắn, nhỏ)

Hình 4.16. Một số hình ảnh ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn

chỉnh của lan Hài P. micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy )

CT1: 0 mg/l IBA; CT2: 0,3 mg/l IBA; CT3: 0,5 mg/l IBA; CT4: 1,0 mg/l IBA; CT5: 2 mg/l IBA.

Phần 5

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.1. Kết luận

Trong khuôn khổ các thí nghiệm nghiên cứu chúng tôi đưa ra một số kết luận

nghiên cứu sau:

 Xác định được nồng độ và thời gian khử trùng trong dung dịch Hgcl2 cho

đoạn thân mang chồi ngủ của cây lan Hài P. micranthum nồng độ 0,2% xử lý trong 5

phút đạt tỷ lệ mẫu sống không nhiễm đạt 66,66%.

 Xác định được môi trường dinh dưỡng thích hợp cho tái sinh chồi cây lan Hài

P. micranthum từ mầm ngủ là môi trường: MS + Đường 30g/l + Agar 5,5g/l; pH = 5,6-

5,8 tỷ lệ mẫu tái sinh đạt 66,6%.

 Xác định được hàm lượng chất kích thích sinh trưởng tăng hệ số nhân nhanh

chồi lan hài P. micranthum từ mầm ngủ vào môi trường dinh dưỡng MS: 0,5 mg/l

NAA; 2,0 mg/l BA; 0,3 mg/l GA3, hệ số nhân chồi đạt 2,87 lần.

 Xác định được giai đoạn nhân nhanh chồi lan hài không cần bổ sung dịch

chiết chuối vì làm giảm hệ số nhân chồi từ 2,87 xuống còn 2,23.

 Xác định được chất kích thích ra rễ tạo cây hoàn chỉnh là IBA 1,0 mg/l

(93,3%) thích hợp hơn nồng độ IAA (80%) cho giai đoạn ra rễ, rễ có chất lượng tốt,

trên môi trường: MS + Đường 30g/l + Agar 5,5g/l + 100mg/l Inostol, pH = 5,6 - 5,8.

5.2. Kiến nghị

 Nghiên cứu điều kiện ngoại cảnh (giá thể, ẩm độ, nhiệt độ, dinh dưỡng) đến

sinh trưởng và phát triển lan Hài P. micranthum giai đoạn vườn ươm để hoành thiện

công nghệ nhân giống in vitro đối với loài lan hài quý và có giá trị này.

 Nghiên cứu thêm ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng khác đến

khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum.

 Cần nghiên cứu bảo tồn và phát triển các loài lan hài của Việt Nam.

 Nghiên cứu thêm nồng độ của BA > 2mg/l đến khả năng nhân nhanh lan Hài

P. micranthum.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tài liệu tiếng việt

1. Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc, Nguyễn Tiến Hiệp (2008), Lan Hài Việt

Nam, Nxb Giao thông Vận tải TP Hồ Chí Minh.

2. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (2002), Công nghệ sinh học thực vật

trong cải tiến giống cây trồng, Nxb Khoa học và Kỹ thuật.

3. Võ Văn Chi (2017), Sách tra cứu tên cây cỏ Việt Nam, NXB Giáo Dục.

4. Trịnh Đình Đạt (2009), Công nghệ sinh học (Công nghệ di truyền), tập 4, NXB

Giáo dục.

5. Trương Thị Đẹp (2017), Thực vật dược, NXB Y học, Hà Nội.

6. Hoàng Thị Giang, Nguyễn Quang Thạch, Mạch Hồng Thắm, Đỗ Thị Thu Hà

(2010), Nghiên cứu nhân giống in vitro và nuôi trồng giống lan Hài quý P.

hangianum perner Gurss (Hài Hằng) thu thập ở Việt Nam, Tạp chí Khoa học và

Phát triển 2010 - tập 8, số 2, tr. 194-201, Trường Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội.

7. Trần Thị Lệ, Trương Thị Bích Phượng, Trần Thị Triêu Hà (2008), Giáo trình Công

nghệ sinh học thực vật, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.

8. Vũ Quốc Luận, Trịnh Thị Hương, Nguyễn Phúc Huy, Đỗ Khắc Thịnh, Dương Tấn

Nhựt (2014), “ Ảnh hưởng của các chất bổ sung hữu cơ lên quá trình sinh

trưởng và phát triển của chồi lan Vân Hài (Paphiopedilum callosum) nuôi cấy

intro.

9. Mai Xuân Lương (2005), Công nghệ sinh học thực vật, Nxb Đại học Đà Lạt.

10. Nguyễn Thị Tuyết Mai (2011), “ Nghiên cứu tạo dòng biến dị in vitro ở cây lan

Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii) và Vân Hài ( Paphiopedilum callosum)

bằng phương pháp chiếu xạ”, Luận văn thạc sĩ sinh học, Trường Đại học Khoa

học Tự nhiên TP HCM.

11. Nguyễn Công Nghiệp (2006), Trồng hoa lan, Nxb Trẻ.

12. Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu và ứng

dụng, Nxb Nông nghiệp.

13. Nguyễn Kim Thanh, Nguyễn Thuận Châu (2005), Giáo trình sinh lý học thực vật,

Nxb giáo dục, Hà Nội.

14. Nguyễn Quang Thạch (2009), Cơ sở công nghệ sinh học – T3, Nxb Giáo dục.

15. Nguyễn Thiện Tịnh (2001), Lan Việt Nam, Nxb Nông nghiệp Tp Hồ Chí Minh.

16. Bùi Trang Việt (2002), Sinh lý thực vật đại cương, Nxb Đại học Quốc gia Thành

phố Hồ Chí Minh 8. Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2009),

Công nghệ sinh học tập 2 – Công nghệ sinh học tế bào, Nxb Giáo dục.

17. Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2002), Công nghệ sinh học –

T2, Nxb Giáo dục.

18. Sách đỏ Việt Nam (Phần II: Thực vật): Phần 1 - NXB Khoa học Tự nhiên và

Công nghệ.

19. Hoàng Thị Sản (2002), Phân loại học thực vật, Nxb Giáo dục.

20. YDVN.NET - Bách khoa toàn thư Y Dược Việt Nam

II. Tài liệu tiếng anh

21. Chen T. Y., Chen J. T., Chang W. C. (2004), “Plant regeneration through direct

shoot bud formation from leaf culture of Paphiopedilum orchids”, Plant Cell,

Tissue and Organ Culture 76, p. 11-15.

22. Hong P. I., Chen J. T., Chang W. C. (2008), “ Plant regeneration via protocorm-

like body formation and shoot multiplication from seed-derived callus of a

maudiae type slipper orchid”, Acta Physiol. Pant 30, p. 755-759

23. Huang L. C. (1988), “A procedure for asexual multiplication of Paphiopedilum in

vtro’’, American Orchid Society Bulletin 57, p. 274-278.

24. Huang L. C., Lin C. J., Kou C. I., Huang B. L., Murashige T. (2001),

“Paphiopedilum cloning in vitro”, Scientia Horticulturae 91, p. 111-121.

25. Liao Y. J., Tsai Y. C., Sun Y. W., Lin R. S., Wu F. S. (2011), “In vitro shoot

induction and plant regeneration from flower buds in Paphiopedilum orchids”,

In vitro Cell, Dev. Biol. plant 47, p 702-709.

26. Lin Y.H., Chang c., Chang W.C. (2000), “Plant regeneration from callus culture of a

Paphiopedilum hybird”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 62, P.21-25.

27. Nieman D. (1980), “Plantlet formation of Paphiopedilum flower stem”, American

Orchid Society Bulletin 49, p. 372-373.

28. Nhut D. T, Thuy D. T. T., Luan V. Q., Don N. T., Khiem D. V., Tran Thanh Van

K. (2005), “ Micropropagation of Paphiopedilum delenatii via stem node

culture”, Vietnam – Korea International Symposium, Bio-Technology & Bio-

System Engineering, p. 184-190.

29. Sampolinski J. (1983), “Formation of plantlets on Paphiopedilum flower stem”,

Orchid Review 91, p. 229.

III. Trang Web

30. www.vuonhoalan.net

PHỤ LỤC 1: MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

Bảng 1: Thành phần cơ bản của môi trường MS (Muashige & Skoog)

Amount to Final Stock take Bottle Component Solution concentratic preparation (mg/l) (g/l) (ml)

1.650,0 82,5 NH4NO3 20 I 1.900,0 95 KNO3

37 370,0 MgSO4.7H2O

2,23 22,3 MnSO4.4H2O 10 II 1,058 10,6 ZnSO4.7H2O

0,0025 0,025 CuSO4.5H2O

44 440,0 CaCl2.2H2O

KI 0,083 0,83 10 III

0,0025 0,025 CoCl2.6H2O

17 170,0 KH2PO4

0,62 6,2 10 H3BO4 IV

0,025 0,25 Na2MoO4.2H2O

2,784 27,85 FeSO4.7H2O 10 V 3,724 37,25 Na2EDTA.2H2O

mg/100ml

100 Nicotinic acid 0,5 0,5

100 Glycine 2,0 2,0 Vitamin 100 Thiamine acid 0,1 0,1

100 Pyridocine HCl 0,5 0,5

30.0000,0 Sucrose

5.500,0 Agar

5,6 - 5,8 pH

Bảng 2: Thành phần cơ bản của môi trường B5 (Gamborg cs, 1976)

Muối khoáng Nồng dộ (mg/l)

134 (NH4)2SO4

150 CaCl2.2H2O

246 MgSO4.7H2O

2.258 KNO3

10 MnSO4.2H2O Đa lượng

KI 0.75

0.25 Na2MoO4.2H2O

150 Na2H2PO4.2H2O

2.0 ZnSO4.7H2O

37.2 Na2EDTA.2H2O

3 H3BO3

0.025 CoCl2.6H2O Vi lượng

0.025 CuSO4.5H2O

27.8 FeSO4.7H2O

Myo- inositol 100

Nicotinic acid 1

Pyrodoxine HCl 1

Thiamine 10 Các chất hữu cơ

Đường 30

Bảng 3: Thành phần cơ bản của môi trường WPM (Woody Plant Medium

Lioyd và Mc Cown, 1980)

Muối khoáng Nồng độ (mg/l)

0.25 CuSO4.5H2O

37.2 Na2EDTA.2H2O

Vi lượng 6.20 H3BO3

22.30 MnSO4.H2O

27.8 FeSO4.7H2O

ZnSO4.7H2O 8.6

96 CaCl2.2H2O

556 Ca(NO3)2.4H2O

170 KH2PO4 Đa lượng 990 K2SO4

370 MgSO4.7H2O

400 NH4NO3

0.25 NaMoO4.2H2O

Myo – inositol 100

Pyridoxine HCl 0.5

Glycine 2.0

Các chất hữa cơ Nicotinic acid 0.5

Thiamine HCl 1.0

Agar 6

Đường 30

PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ hóa chất và thời gian khử

BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLMS FILE HGCL2 11/ 5/19 10:58

------------------------------------------------------------------ :PAGE 1

Nghien cuu anh huong cua nong do va thoi gian khu trung bang HgCl2 den

kha nang tao vat lieu vo trung

VARIATE V003 TLMS

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER

SQUARES SQUARES LN

=============================================================================

1 CT 9 11659.9 1295.54 120.96 0.000 2

* RESIDUAL 20 214.215 10.7107

-----------------------------------------------------------------------------

* TOTAL (CORRECTED) 29 11874.1 409.451

-----------------------------------------------------------------------------

BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLMN FILE HGCL2 11/ 5/19 10:58

------------------------------------------------------------------ :PAGE 2

Nghien cuu anh huong cua nong do va thoi gian khu trung bang HgCl2 den

kha nang tao vat lieu vo trung

VARIATE V004 TLMN

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER

SQUARES SQUARES LN

=============================================================================

1 CT 9 16461.1 1829.02 109.66 0.000 2

* RESIDUAL 20 333.567 16.6783

-----------------------------------------------------------------------------

* TOTAL (CORRECTED) 29 16794.7 579.128

-----------------------------------------------------------------------------

BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLMC FILE HGCL2 11/ 5/19 10:58

------------------------------------------------------------------ :PAGE 3

nghien cuu anh huong cua nong do va thoi gian khu trung bang

HgCl2 den kha nang tao vat lieu vo trung

VARIATE V005 TLMC

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER

SQUARES SQUARES LN

=============================================================================

1 CT 9 26002.5 2889.17 268.94 0.000 2

* RESIDUAL 20 214.855 10.7427

-----------------------------------------------------------------------------

trùng bằng HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng

* TOTAL (CORRECTED) 29 26217.4 904.048

-----------------------------------------------------------------------------

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE HGCL2 11/ 5/19 10:58

------------------------------------------------------------------ :PAGE 4

nghien cuu anh huong cua nong do va thoi gian khu trung bang

HgCl2 den kha nang tao vat lieu vo trung

MEANS FOR EFFECT CT

-------------------------------------------------------------------------------

CT NOS TLMS TLMN TLMC

1 3 0.000000 0.000000 100.000

2 3 13.3300 84.4400 2.23000

3 3 23.3300 63.3300 13.3400

4 3 46.6633 36.6600 16.6767

5 3 30.0033 50.8867 19.1100

6 3 60.0033 20.9967 19.0300

7 3 50.5500 13.3300 36.1200

8 3 66.6600 20.0067 13.3333

9 3 53.3300 6.67000 40.0000

10 3 40.1100 0.000000 59.8900

SE(N= 3) 1.88951 2.35785 1.89233

5%LSD 20DF 5.57399 6.95557 5.58231

-------------------------------------------------------------------------------

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE HGCL2 11/ 5/19 10:58

------------------------------------------------------------------ :PAGE 5

nghien cuu anh huong cua nong do va thoi gian khu trung bang

HgCl2 den kha nang tao vat lieu vo trung

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1

VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT |

(N= 30) -------------------- SD/MEAN | |

NO. BASED ON BASED ON % | |

OBS. TOTAL SS RESID SS | |

TLMS 30 39.230 20.235 3.2727 8.3 0.0000

TLMN 30 32.086 24.065 4.0839 12.7 0.0000

TLMC 30 28.442 30.067 3.2776 11.5 0.0000

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái

sinh chồi của cây lan Hài P. micranthum

BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLBC FILE B2 12/ 5/19 0:25 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh chồi của cây lan Hài P. micranthum VARIATE V003 TL LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 T 2 2599.60 1299.80 87.52 0.001 3 2 R 2 140.926 70.4631 4.74 0.089 3 * RESIDUAL 4 59.4080 14.8520 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 2799.93 349.992 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE B2 12/ 5/19 0:25 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh chồi của cây lan Hài P. micranthum MEANS FOR EFFECT T ------------------------------------------------------------------------------- T NOS TL 1 3 66.6667 2 3 56.6567 3 3 26.6667 SE(N= 3) 2.22501 5%LSD 4DF 8.72156 ------------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT R ------------------------------------------------------------------------------- R NOS TL 1 3 46.6667 2 3 47.7667 3 3 55.5567 SE(N= 3) 2.22501 5%LSD 4DF 8.72156 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE B2 12/ 5/19 0:25 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh chồi của cây lan Hài P. micranthum F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |T |R | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TLBC 9 49.997 18.708 3.8538 7.7 0.0013 0.0887

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng nhân nhanh

BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSNC FILE B3 11/ 5/19 22:40 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng nhân nhanh chồi lan P.micranthum từ mầm ngủ VARIATE V003 LN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES TL ============================================================================= 1 T 4 5.66773 1.41693 231.59 0.000 3 2 R 2 .112000E-02 .559998E-03 0.09 0.913 3 * RESIDUAL 8 .489465E-01 .611831E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 5.71780 .408414 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE B3 11/ 5/19 22:40 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng nhân nhanh chồi lan P.micranthum từ mầm ngủ ------------------------------------------------------------------------------- T NOS TL 1 3 0.166667 2 3 1.833333 3 3 0.700000 4 3 1.566667 5 3 0.763333 SE(N= 3) 0.451601E-01 5%LSD 8DF 0.147263 ------------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT R ------------------------------------------------------------------------------- R NOS TL 1 5 0.998000 2 5 1.01400 3 5 1.01800 SE(N= 5) 0.349809E-01 5%LSD 8DF 0.114069 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE B3 11/ 5/19 22:40 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng nhân nhanh chồi lan P.micranthum từ mầm ngủ F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |T |R | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | HSNC 15 1.0100 0.63907 0.78220E-01 7.7 0.0000 0.9129

chồi lan P. micranthum từ mầm ngủ

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng BA đến khả năng nhân nhanh chồi lan

BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSNC FILE CAY 15/ 5/19 1:21 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 Nghiên cứu ảnh hưởng BA đến khả năng nhân nhanh chồi lan P.micranthum từ mầm ngủ VARIATE V003 TL LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 T 4 3.85600 .964000 123.91 0.000 3 2 R 2 .875999E-02 .438000E-02 0.56 0.594 3 * RESIDUAL 8 .622396E-01 .777995E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 3.92700 .280500 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE CAY 15/ 5/19 1:21 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 Nghiên cứu ảnh hưởng BA đến khả năng nhân nhanh chồi lan P.micranthum từ mầm ngủ MEANS FOR EFFECT T ------------------------------------------------------------------------------- T NOS TL 1 3 0.666667 2 3 1.500000 3 3 1.566667 4 3 1.900000 5 3 2.166667 SE(N= 3) 0.509246E-01 5%LSD 8DF 0.166060 ------------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT R ------------------------------------------------------------------------------- R NOS TL 1 5 1.52600 2 5 1.58000 3 5 1.57400 SE(N= 5) 0.394460E-01 5%LSD 8DF 0.128630 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE CAY 15/ 5/19 1:21 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 Nghiên cứu ảnh hưởng BA đến khả năng nhân nhanh chồi lan P.micranthum từ mầm ngủ F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |T |R | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | HSNC 15 1.5600 0.52962 0.88204E-01 5.7 0.0000 0.5944

P. micranthum từ mầm ngủ

Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Giberellin đến khả

năng nhân nhanh chồi lan P. micranthum từ mầm ngủ

BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSNC FILE CC 28/ 5/19 13:18 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Giberellin đến khả năng nhân nhanh chồi lan P. micranthum từ mầm ngủ. VARIATE V003 TL LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 T 4 1.74016 .435040 63.65 0.000 3 2 R 2 .278533E-01 .139267E-01 2.04 0.192 3 * RESIDUAL 8 .546799E-01 .683499E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 1.82269 .130192 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE CC 28/ 5/19 13:18 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Giberellin đến khả năng nhân nhanh chồi lan P. micranthum từ mầm ngủ. MEANS FOR EFFECT T ------------------------------------------------------------------------------- T NOS TL 1 3 1.86667 2 3 2.06333 3 3 2.83333 4 3 2.46667 5 3 2.13333 SE(N= 3) 0.157319E-01 5%LSD 8DF 0.465649 ------------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT R ------------------------------------------------------------------------------- R NOS TL 1 5 2.21200 2 5 2.30800 3 5 2.29800 SE(N= 5) 0.369729E-01 5%LSD 8DF 0.120565 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE CC 28/ 5/19 13:18 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Giberellin đến khả năng nhân nhanh chồi lan P. micranthum từ mầm ngủ. F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |T |R | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | HSNC 15 2.2727 0.36082 0.82674E-01 3.6 0.0000 0.1919

Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả năng nhân

nhanh chồi lan Hài P. micranthum từ mầm ngủ BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSNC FILE 111 13/ 5/19 9:10 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum từ mầm ngủ. VARIATE V003 HS SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 4 1.06843 .267107 37.66 0.000 3 2 R 2 .653333E-01 .326667E-01 4.61 0.046 3 * RESIDUAL 8 .567333E-01 .709166E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 1.19049 .850352E-01 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE 111 13/ 5/19 9:10 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum từ mầm ngủ. MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------- CT NOS HS 1 3 1.43333 2 3 2.23333 3 3 2.93333 4 3 1.83333 5 3 1.66667 SE(N= 3) 0.486198E-01 5%LSD 8DF 0.158544 ------------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT R ------------------------------------------------------------------------------- R NOS HS 1 5 1.90600 2 5 1.80600 3 5 1.74600 SE(N= 5) 0.376608E-01 5%LSD 8DF 0.122808 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE 111 13/ 5/19 9:10 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum từ mầm ngủ. F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT |R | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | HSNC 15 1.8193 0.29161 0.84212E-01 4.6 0.0001 0.0464

Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây

hoàn chỉnh của lan Hài P. micranthum BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLMRR FILE IAA 14/5/19 10:57 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 Nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của lan Hài P. micranthum VARIATE V003 VAR03 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 T 4 8133.33 2033.33 53.02 0.000 3 2 R 2 4.47560 2.23780 0.06 0.944 3 * RESIDUAL 8 306.813 38.3517 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 8444.62 603.187 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE IAA 14/ 5/19 10:57 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 Nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của lan Hài P. micranthum MEANS FOR EFFECT VAR01 ------------------------------------------------------------------------------- T NOS TL 1 3 13.3333 2 3 40.0000 3 3 56,6667 4 3 80.0000 5 3 26.6667 SE(N= 3) 3.57546 5%LSD 8DF 11.6592 ------------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT VAR02 ------------------------------------------------------------------------------- RNOS TL 1 5 43.3340 2 5 42.6640 3 5 44.0020 SE(N= 5) 2.76954 5%LSD 8DF 9.03118 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE IBA 14/ 5/19 10:57 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 Nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của lan Hài P. micranthum F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |T |R | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TLMRR 15 43.333 24.560 6.1929 14.3 0.0000 0.9435

Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây

hoàn chỉnh của lan Hài P. micranthum BALANCED ANOVA FOR VARIATE TL FILE TL 14/ 5/19 15:31 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của lan Hài P. micranthum VARIATE V003 TL LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 T 4 8466.67 2116.67 79.35 0.000 3 2 R 2 31.1422 15.5711 0.58 0.584 3 * RESIDUAL 8 213.414 26.6767 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 8711.22 622.230 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TL 14/5/19 15:31 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của lan Hài P. micranthum MEANS FOR EFFECT T ------------------------------------------------------------------------------- T NOS TL 1 3 23.3333 2 3 70.0000 3 3 93,3333 4 3 53.3333 5 3 43.3333 SE(N= 3) 2.98198 5%LSD 8DF 9.72395 ------------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT R ------------------------------------------------------------------------------- R NOS TL 1 5 55.3340 2 5 58.6680 3 5 55.9980 SE(N= 5) 2.30984 5%LSD 8DF 7.53214 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TL 14/ 5/19 15:31 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của lan Hài P. micranthum F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |T |R | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TLMRR 15 56.667 24.945 5.1649 9.1 0.0000 0.5837