Khóa luận tốt nghiệp đại học: Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) bằng phương pháp in vitro

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ----------o0o---------

ĐỖ NGỌC HÀ

Tên đề tài:

“NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LAN HÀI TRẦN LIÊN

(Paphiopedilum tranlienianum) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Lớp

: K48 - CNSH

Khoa

: CNSH – CNTP

Khoá học

: 2015 – 2020

Giảng viên HD

: ThS. Nguyễn Thị Tình

Thái Nguyên, năm 2020

LỜI CẢM ƠN

Được sự đồng ý của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công

nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, trong thời gian thực tập tốt nghiệp em

đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan Hài Trần Liên

(Paphiopedilum tranlienianum) bằng phương pháp in vitro”.

Lời đầu tiên trong khoá luận này em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám

hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực

phẩm cùng các thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn

thành khóa luận tốt nghiệp này.

Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân

thành tới cô giáo ThS. Nguyễn Thị Tình giảng viên khoa Công nghệ Sinh học

và Công nghệ Thực phẩm đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và hướng dẫn em trong

thời gian thực hiện đề tài.

Đồng thời, em xin cảm ơn các thầy cô và các anh chị kỹ thuật viên trên

phòng cấy mô tế bào thực vật Khoa CNSH-CNTP đã tạo điều kiện giúp đỡ và

hướng dẫn cho em trong suốt thời gian thực tập, cảm ơn bạn bè đã hết lòng

động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất và luôn là

chỗ dựa tinh thần cho em trong suốt thời gian thực tập.

Trong quá trình thực tập, cũng như là quá trình làm báo cáo thực tập thời

gian có hạn nên đề tài không thể tránh khỏi những sai sót. Em rất mong nhận

được những ý kiến đóng góp của thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn

thiện hơn Thực phẩm cùng các thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện thuận

lợi cho em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.

Lời cuối em xin kính chúc các thầy, cô giáo trong nhà trường, trong khoa

Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm, cùng các bạn sinh viên có sức

khoẻ, thành công trong cuộc sống.

Thái Nguyên, ngày tháng năm

Sinh viên thực hiện

Đỗ Ngọc Hà

iii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ chức Bảo

tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) .................................................... 8

Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian khử trùng của

H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng (sau 14 ngày nuôi cấy) . 34

Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng

tái sinh phôi lan ............................................................................. 36

Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân

nhanh phôi Trần liên (sau 6 tuần nuôi cấy) .................................. 38

Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin

đến khả năng nhân nhanh phôi của lan Hài Trần liên ................... 40

Bảng 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ

đến khả năng nhân nhanh giống (sau 30 ngày nuôi cấy) ............. 42

Bảng 4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ

cây lan hài Trần liên (sau 6 tuần nuôi cấy) .................................... 45

Bảng 4.7 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính

đến khả năng ra rễ cây lan hài Trần liên (sau 6 tuổi nuôi cấy) ..... 47

Bảng 4.8. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới khả năng sinh trưởng

và phát triển của lan Trần liên ...................................................... 49

DANH MỤC HÌNH, BIỂU ĐỒ

Hình 2.1: Hình ảnh về cây lan Hài Paphiopedilum tranlienianum ................ 13

Hình 3.1. Quả lan Hài Trần Liên .................................................................... 23

Hình 3.2: Sơ đồ nghiên cứu nhân giống loài lan Hài Trần liên ...................... 26

Biểu đồ 4.1. Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%) lan Hài Trần Liên................. 35

Biểu đồ 4.2. Tỷ lệ tái sinh phôi lan (%) ......................................................... 37

Biểu đồ 4.3. Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ BA ..... 39

Biểu đồ 4.4. Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp

với Kinetin .................................................................................... 41

Biểu đồ 4.5. Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp

với Kinetin và TDZ ....................................................................... 43

Biểu đồ 4.6. Tỷ lệ mẫu ra rễ lan chịu ảnh hưởng của nồng độ NAA ............ 45

Biểu đồ 4.7. Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ NAA kết

hợp với than hoạt tính ................................................................... 47

Biểu đồ 4.8. Tỷ lệ sống lan ảnh hưởng của giá thể ........................................ 49

: Gamborg cs, 1976

: 6-Benzyl amino purine

BAP

: Cộng sự

: Công thức

: Coeficient of Variation – Hệ số biến động

: Đối chứng

Đ/C

: Least Singnificant DifferenceTest

LSD

: Murashighe và Skoog, 1962

: Môi trường

: Gibberellic acid

GA3

: α-Napthalene acetic acid

NAA

: Indole-3-acetic acid

IAA

: Indole-3-butyric acid

IBA

International Union

for Conservation of Nature and

IUCN

Natural Resources - Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế

: Paphiopedilum tranlienuanum

tranlienuanum

P. malipoens

: Paphiopedilum malipones

WPM

: Woody Plant Medium – Lioyd và Mc Cown, 1980

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i

DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ iii

DANH MỤC HÌNH, BIỂU ĐỒ ....................................................................... iv

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .................................................................. v

MỤC LỤC ........................................................................................................ vi

PHẦN 1. MỞ ĐẦU .......................................................................................... 1

1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................... 1

1.2 Mục đích nghiên cứu ................................................................................... 1

1.3 Yêu cầu của đề tài ....................................................................................... 2

1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài ....................................... 2

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3

2.1. Tổng quan về Lan Hài ................................................................................ 3

2.1.1. Phân loại và nguồn gốc ........................................................................... 3

2.1.2. Đặc điểm hình thái .................................................................................. 4

2.1.3. Sinh thái................................................................................................... 6

2.1.4. Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam ............................................................ 7

2.2 Tổng quan về Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) .................. 11

2.2.1 Nguồn gốc và sự phân bố của Hài Trần Liên (Paphiopedilum

tranlienianum) ở Việt Nam ............................................................................. 11

2.2.2 Hình Thái................................................................................................ 12

2.2.3. Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng loài lan Hài Trần Liên .................. 13

2.3.4. Tổng quan về môi trường nuôi cấy và các thành phần dinh dưỡng sử dụng

trong nghiên cứu môi trường nhân nhanh lan Hài Trần Liên ......................... 14

2.4. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan hài trên thế giới và trong nước

......................................................................................................................... 19

vii

2.4.1. Trên thế giới .......................................................................................... 19

2.4.2. Trong nước ............................................................................................ 21

PHẦN 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

......................................................................................................................... 23

3.1. Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu .................................................. 23

3.1.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu .............................................................. 23

3.1.2. Hoá chất sử dụng ................................................................................... 23

3.1.3. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu................................................................. 24

3.2. Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu .............................................. 24

3.2.1. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................... 24

3.2.2. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 24

3.2.3. Thời gian nghiên cứu ............................................................................ 25

3.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 25

3.4. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 25

3.4.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro .................................................. 25

3.4.2. Phương pháp nghiên cứu quy trình nhân giống .................................... 26

3.4.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm .............................................................. 31

3.5. Phương pháp thu thập, xử lý số liệu và chỉ tiêu đánh giá ........................ 31

3.5.1. Thu thập số liệu ..................................................................................... 31

3.5.2. Các chỉ tiêu theo dõi .............................................................................. 31

PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................... 34

4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của chất khử trùng

H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng ......................................................... 34

4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái

sinh phôi lan Hài Trần Liên ............................................................................ 36

4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ một số Cytokinine đến khả

năng nhân nhanh cây lan Hài Trần Liên ......................................................... 38

viii

4.3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh

chồi của cây lan Hài Trần Liên ....................................................................... 38

4.3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến

khả năng nhân nhanh phôi lan hài Trần Liên .................................................. 40

4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetine, TDZ đến khả

năng nhân nhanh giống cây ............................................................................. 42

4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả

năng ra rễ cây lan ............................................................................................ 44

4.4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của

cây lan ............................................................................................................. 44

4.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả năng

ra rễ của cây lan hài Trần liên ......................................................................... 46

4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới khả năng sinh trưởng và phát

triển của lan ..................................................................................................... 48

Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 51

5.1. Kết luận .................................................................................................... 51

5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 52

PHẦN 1

MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề

Lan Hài là loài hoa đẹp có giá trị thẩm mĩ và kinh tế cao. Được người yêu

hoa trong và ngoài nước tìm kiếm, điều này đã dẫn đến hầu hết các loài lan hài

trên thế giới cũng như của Việt Nam rơi vào mức báo động nguy cơ tuyệt chủng

ngoài tự nhiên.

Hài Trần Liên (hài Bắc Thái) là một trong số loài lan hài đặc hữu của Việt

Nam, có khu phân bố hẹp (khu vực Bắc Kạn và Thái Nguyên), hiện lan hài

Trần Liên được tìm thấy ở khu vực đệm của Hồ Ba Bể - nơi xuất hiện nhiều

loài phong lan, địa lan có giá trị thẩm mỹ.

Hài Trần Liên được nhiều nhà sưu tầm lan quan tâm bởi kiểu dáng độc

đáo với điểm nhấn cánh môi của hoa uốn cong giống hình chiếc hài và hai cánh

bên lượn sóng, màu đỏ thẫm, hấp dẫn người chơi lan.

Hài Trần Liên tái sinh bằng phôi nếu kết hợp được với loài nấm cộng sinh,

do đó khả năng tái sinh trong tự nhiên thấp, đây là nguyên nhân thứ 2 khiến

loài hoa có giá trị này được liệt kê vào phụ lục 1 của công ước CITES và danh

mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quý hiếm (nhóm 1) của Nghị định

số 32/2006/NĐ –CP ngày 30/3/2006.

Xuất phát từ thực tiễn trên em tiến hành đề tài: “Nghiên cứu khả năng

nhân nhanh lan Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) bằng

phương pháp in vitro”.

1.2 Mục đích nghiên cứu

- Nghiên cứu thành công quy trình nhân nhanh giống lan hài trần liên từ

phôi bằng phương pháp in vitro.

1.3 Yêu cầu của đề tài

- Xác định nồng độ và thời gian khử trùng mẫu trong dung dịch H2O2 đến

hiệu quả tạo vật liệu vô trùng.

- Xác định được ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy đến khả năng tái

sinh phôi của cây Hài Trần Liên

- Xác định được ảnh hưởng của nồng độ một số Cytokinine đến khả năng

nhân nhanh Hài Trần Liên

- Xác định được ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả

năng ra rễ cây Hài Trần Liên.

- Xác định ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây Hài Trần Liên.

1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

* Ý nghĩa khoa học của đề tài

- Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học và bổ sung

vào kiến thức lý thuyết được học thông qua hoạt động thực tiễn

- Giúp bản thân sinh viên học hỏi kiến thức, tích lũy được kinh nghiệm

thực tế cũng như tác phong làm việc, nghiên cứu khoa học phục vụ cho cho

công tác sau này.

* Ý nghĩa thực tiễn

Đề xuất được quy trình nhân nhanh giống lan hài Trần Liên

(paphiopedilum tranlienianum) bằng phương phán nuôi cấy in vitro, góp phần

bảo tồn giống hoa quý hiếm trước nguy cơ tuyệt chủng đồng thời tạo nguồn vật

liệu cho nghiên cứu khoa học.

PHẦN 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Tổng quan về Lan Hài

2.1.1. Phân loại và nguồn gốc

2.1.1.1. Phân loại

Lan Hài là một nhóm rất khác biệt trong họ lan. Chúng dễ dàng được nhận

ra bởi cấu trúc hoa khác thường với một cánh hoa giữa hình túi sâu trông giống

một chiếc hài nằm ở vị trí thấp nhất của hoa. Chiếc môi đặc sắc và hình dạng

khác thường của hoa tạo nên vẻ bề ngoài dễ dàng phân biệt lan Hài với các loài

lan khác. Vì vậy nó trở thành tên chung của loài lan này.

Về mặt thực vật học, các loài lan Hài thuộc vào 5 chi là:

- Chi Cypripedium có khoảng 50 loài, thường được gọi là hài Vệ nữ, phân

bố ở các vùng ôn đới và núi của bán cầu bắc.

- Chi Mexipedium, chi Phragmipedium và chi Selenipedium gồm khoảng

25 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Mĩ.

- Chi Paphiopedilum có khoảng 75 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á

từ Nam Ấn Độ và Đông Hymalaya đến Philippine, New Guinea và Quần đảo

Solomon.

Ở Việt Nam các loài lan Hài đều thuộc chi Paphipedilum, thuộc tông

Cypripedioideae, họ phụ Epidendroideae, họ lan (Orchidaceae), bộ lan

(Orchidales), phân lớp hành (Liliidae), lớp một lá mầm (Monocotyledoneae),

ngành hạt kín (Angiospermatophyta), giới thực vật (Plantae).[1]

2.1.1.2. Nguồn gốc

Chi Paphiopedilum có nguồn gốc từ vùng lục địa Đông Nam Á, trong đó

có Việt Nam. Các loài nguyên thuỷ nhất của chi này được tìm thấy chủ yếu ở

Trung Quốc và Bắc Việt Nam, mỗi loại trong chi này đều có khu phân bố rất

hạn chế.

Hầu như tất cả các loài lan đều bắt nguồn từ các tổ tiên kiểu hypoxis có

sáu mảnh bao hoa (ba mảnh bao vòng ngoài gọi là ba lá đài và ba mảnh bao

vòng trong gọi là ba cánh hoa) và sáu nhị đực (ba nhị đực ở vòng ngoài và ba

nhị đực ở vòng trong). Xu hướng tiến hoá của họ Lan là giảm số lượng nhị đực

và sự dính liền giữa nhị đực hữu thụ với nhị cái là sự biến đổi hoa cơ bản nhất

dẫn đến sự tiến hoá của họ Lan. Sự giảm liên tục số lượng nhị đực dẫn đến sự

hình thành các nhóm lan có ba, hai hay một nhị đực tồn tại trong hoa. Trong họ

Lan, chi lan Hài (thuộc tông Cypripedioideae) là dòng tiến hoá có hai nhị đực

còn tồn tại trong hoa

2.1.2. Đặc điểm hình thái

Các loài lan Hài (Paphiopedilum) ở Việt Nam có thể có hình dạng bên

ngoài rất đa dạng tuy nhiên chúng đều mang những đặc điểm hình thái:

- Dạng cây: Là các loài thân cỏ có kích thước trung bình với thân mang

nhiều lá mọc thành hai hàng xếp thành hình quạt, đôi khi có dạng thân bò. Tất

cả các loài đều có thân rễ nhưng đa số rất ngắn[1]

- Lá: thường có dạng lá dài gấp đôi, hình trứng ngược hay bầu dục thuôn

và mở rộng. Mỗi lá có đốt ở gốc, dưới đó là bẹ lá hình chữ V xếp lợp xít lên

nhau trên thân. Độ dài của lá có thể từ 3- 50 cm. Mặt trên của lá có thể có màu

xanh lá cây hoặc khảm bởi các mảng đậm nhạt không đều với các gân màu

xanh lá nổi rõ. Mặt dưới lá có các đốm tím dày đặc hoặc vết tím xỉn chỉ thấy rõ

ở gần gốc lá. Lá của các loài điển hình cho điều kiện sống khô đều dày, mọng

nước và cứng [1]

- Cụm hoa: thường thẳng đứng hay cong. Một số loài có cuống hoa nằm

ngang, một số loài lại có cuống hoa chúc xuống, nhưng hầu hầu các loài đều có

cuống hoa dựng đứng. Phần lớn các loài chỉ có một hoa riêng lẻ. Tuy nhiên

cũng có loài có cụm hoa mang hai hoa, song rất hiếm. Trục cụm hoa có lông tơ

dầy và ngắn hay có lông nhung hoặc nhẵn. Lá hoa của cụm hoa gấp đôi và có

hình dạng rất khác nhau tùy từng loài, từ hình múi giáo hay hình trứng và có

chóp nhọn đến hình bầu dục tròn. Lá hoa thường có ít lông tơ hơn các phần

khác của cụm hoa nhưng nói chung thường có lông ở mép và lông cứng gần

giữa ở mặt ngoài lá, ở một số loài có lá hoa nhẵn.[1]

- Hoa: Gồm hai lá đài ở vòng ngoài, một lá đài lưng, một lá đài hợp và ba

cánh hoa ở vòng trong. Lá đài lưng thường lớn, hướng thẳng lên trên và thường

nổi bật với các vạch hay chấm ở mặt trong. Lá đài lưng nằm đối diện với lá đài

hợp ở vị trí thấp hơn và hướng xuống phía dưới. Lá đài hợp nằm phía sau của

môi thường có một màu tối xỉn và kém nổi bật hơn so với lá đài lưng. Cả hai lá

đều thường có lông tơ dày ở mặt ngoài[1]

Hai cánh hoa bên đều dễ dàng nhận thấy ở hai bên lá đài và thường hơi

xoè xuống dưới theo chiều ngang. Chúng có thể có hình thìa, bầu dục, trứng

rộng hay tròn. Cánh hoa hình mũi giáo hẹp, xoắn ốc hẹp dần từ gốc lên đến

đỉnh. Cánh hoa giữa thứ ba biến dạng rõ rệt thành một môi giống như cái bao

hoặc hình chiếc hài. Môi dạng túi sâu và phồng lên, hình giầy, có lông ở mặt

trong và nhẵn ở mặt ngoài.[1]

Nhị bất thụ của vòng ngoài và nhuỵ cái hợp thành cột nhị- nhuỵ. Hai nhị

đực hữu thụ của vòng trong có chỉ nhị ngắn dính liền ở phía sau núm nhuỵ và

hai bên cuốn cột. Bầu dưới, một ô, đỉnh noãn bên là điểm đặc trưng của chi

này. Hầu hết các loài lan Hài, bầu có lông tơ, hình trụ, màu xanh lá cây hay đỏ

tía xỉn [1]

- Qủa: Dạng quả nang, khô, dài, có một ô với ba van rộng và ba van hẹp.

Qủa mở ở gần đỉnh bằng 6 rãnh nứt. Qủa thường chín trong điều kiên tự nhiên

sau khi thụ phấn từ sáu đến mười tháng [1]

- Hạt: Có hình bầu dục, hình con suốt chỉ ngắn,dạng thuôn dài hay hẹp và

thường có chiều dìa từ 0,4 – 1,1 mm. Phôi nhỏ, dài từ 0,3 – 0,4 mm. Hạt không

có nội nhũ do đó rất khó nảy mầm trong điều kiện tự nhiên [1]

- Rễ: Rễ chùm, có một lớp mô xốp bọc xung quanh các rễ thật, lớp màng

xốp này có vai trò trong việc giữ nước và ngăn chặn ánh sáng gay gắt. Sau khi

rễ trưởng thành thì có dạng sợi mảnh với hệ floem phát triển mạnh và không có

các búi nấm xung quanh rễ [1].

2.1.3. Sinh thái

Các loài lan Hài ở Việt Nam có thể chia thành hai nhóm riêng. Một nhóm

phân bố ở vùng núi đá vôi phía Bắc Việt Nam từ độ cao mặt nước biển lên đến

1600m, nhóm còn lại phân bố ở khu vực có đá mẹ silicat, đá phiến và cát kết ở

độ cao từ 700-2200m. Ngoài ra, có một vài cá thể trong nhóm này còn mọc

bám ở các khe nứt hay rìa của các vách núi dựng đứng đá granit.

Lan Hài của Việt Nam có thể sống trên đất, bám đá và phụ sinh mùn. Các

loài sống trên đất thường mọc ở nơi có ít ánh sáng của tán cây rừng, ở nơi sườn

núi dốc, các nền đất có nhiều lá rơi bị phân huỷ mạnh và giàu chất mùn. Các

loài lan Hài mọc trên đá thường mọc dưới bóng cây của kiểu rừng ít khép tán,

chủ yếu là các mỏm đá và ngay bên dưới các đường đỉnh. Các loài phụ sinh

mùn chủ yếu sống bám trên vỏ cây gỗ trong các vùng rừng mây mù ẩm độ cao

1200-1500m.

Tại Việt Nam, lan Hài thường phân bố ở vùng có lượng mưa lớn, ẩm độ

cao. Tuy nhiên do đặc trưng là vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên chúng

thường phải trải qua một giai đoạn khô hạn. Sự xuất hiện lá dày, dai và mọng

nước là hướng thích nghi tốt để cây có thể sống sót được qua đợt khô hạn định

kỳ và chúng sẽ nhanh chóng phục hồi khi mùa mưa trở lại. Độ ẩm xung quanh

rễ, kiểu đất và độ pH, sự có mặt của các nấm rễ, tác nhân thụ phấn và cường độ

ánh sáng là các nhân tố quan trọng trong sự hình thành và phát triển của quần

thể lan Hài.

Trong rừng nguyên sinh, lan Hài phân bố đều nhau ở các hướng của sườn

núi. Nhưng trong các vùng rừng đã bị xuống cấp, lan Hài có khuynh hướng

phát triển ở các sườn núi phía Bắc, đông Bắc và tây Bắc của núi. Ngày nay,

thường chỉ tìm thấy lan Hài mọc thành từng đám nhỏ. Các nơi sống tự nhiên

bị phá huỷ bởi con người,sự thay đổi các điều kiện môi trường và việc thu hái

lan để bán là những nguyên nhân chính gây ra sự tuyệt chủng nhanh chóng của

lan Hài trên khắp các vùng của Việt Nam.[1]

2.1.4. Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam

Hiện nay, nhu cầu về hoa tươi nói chung và hoa lan nói riêng trên thế

giới cũng như trong nước đang ngày càng gia tăng. Vì vậy việc trồng lan đã trở

thành một ngành kinh tế của nhiều nước trên thế giới và nhiều nước đang phát

triển khu vực Đông Nam Á.

Lan Hài là chủng họ lan có giá trị thương mại cao nhất, được yêu

chuộng, sưu tầm, tìm kiếm nhiều nhất thế giới. Với sự hiện hữu của hơn 20

loài thuộc chi Paphiopedilum, Việt Nam là một trong các quốc gia có nguồn

lan Hài tự nhiên phong phú nhất. Không những phong phú về chủng loại, Việt

Nam còn có nhiều loài lan đặc hữu có giá trị thẩm mĩ cao, được thế giới ưa

chuộng. Điều này đã tạo nên tình trạng thu thập và xuất khẩu lan Hài một cách

ồ ạt, không kiểm soát, dẫn đến việc lan Hài ngày càng hiếm trong tự nhiên.

Đồng thời với tình trạng môi trường tự nhiên bị khai thác cạn kiệt như hiện

Lan Hài và các loài thuộc bộ Lan là những loài thực vật bị đe dọa biến mất

trước tiên khi môi trường sống tự nhiên bị suy thoái. Nền kinh tế phát triển nhanh

chóng dẫn đến ô nhiễm môi trường cùng với diện tích rừng nguyên sinh bị suy giảm

nay, lan Hài càng biến mất nhanh chóng[2]

nhanh chóng do hoạt động khai thác làm giảm đi nơi sống tự nhiên của lan Hài gây

ra nguy cơ tuyệt chủng nhiều loài lan Hài ở Việt Nam hiện nay [1].

Dựa trên những nghiên cứu thực địa gần đây, tình trạng bảo tồn các loài

lan Hài trong tự nhiên theo tiêu chuẩn các thứ hạng về mức độ đe doạ tuyệt

chủng của tổ chức bảo tồn thiên nhiên Quốc tế (IUCN) được tổng kết ở bảng

2.1.

Bảng 2.1. Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ

chức Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN)

Tình trạng Tên loài (tiếng Latinh) Tên loài (tiếng Việt)

Đã bị tuyệt chủng P. vietnamense Hài Việt ngoài thiên nhiên

Đang bị tuyệt chủng p. delenatii Hài Đỏ trầm trọng

P.  aspersum Chưa rõ tên gọi

P. barbigerum var. lokianum Hài Lộc

P. callosum Hài Vân

P. dianthum Hài Xoắn

P. emersonii Hài Hương Lan

P. gratrixianum Hài Đuôi công

P. hangiannum Hài Hằng Đang bị tuyệt chủng

P. helenae Hài hê len

P. henryanum Hài Henry

P.  herrmannii Hài Herman

P. malipoense var. jackii Hài Jack

P. malipoense Hài Giáp

P. micranthum Hài Mốc Hồng

Tình trạng Tên loài (tiếng Latinh) Tên loài (tiếng Việt)

P. purpuratum Hìa Tía

Hài Trần liên P. tralienianum

P. appletonianum Hài Cánh Sen P. concolor Hài Gia Định P. hirsutissimum var. Hài Tiên biến dị Sắp bị tuyệt chủng chiwuawnum Hài Tiên P. hirsutissimum var. esquirolai Hài Lông P. villosun var. annamense

P.  affine Hài Hoà

Chưa rõ tên gọi P.  datalanse Thiếu dẫn liệu

Chưa rõ tên gọi P. villosum var. boxalli

Trên thực tế, mức độ đe doạ tuyệt chủng đối với tất cả các loài lan Hài

Việt Nam được chỉ ra ở bảng trên đây đã bị thay đổi nhiều trong thời gian gần

đây do sự suy giảm nhanh các quần thể được biết. Trong những năm gần đây,

qua các đợt điều tra thực địa đã phát hiện ra tốc độ phá huỷ mạnh mẽ trên diện

rộng của những khu rừng còn sót lại của Việt Nam, chủ yếu trên các đỉnh núi

đá vôi [12],[13],[14]

Sự thay đổi môi trường sống do con người gây nên và việc thu mua với số

lượng lớn để buôn bán hiện nay là nhân tố chính làm suy giảm nhanh chóng số

lượng các loài lan Hài. Tất nhiên, việc phá huỷ nơi sống tự nhiên của chúng có

liên quan đến tốc độ phát triển kinh tế và sự gia tăng dân số của Việt Nam. Các

loài lan Hài rất nhạy cảm với sự thay đổi của môi trường nên bị đe doạ tuyệt

chủng nhiều hơn và sẽ biến mất trước tiên sau khi nơi sống tự nhiên của chúng

bị suy thoái.

Yếu tố thứ hai dẫn đến sự tuyệt chủng của các loài lan Hài ở Việt Nam

trong những năm gần đây là việc thu hái trên diện rộng của người dân địa

phương để bán và xuất khẩu một lượng lớn các loài lan Hài mọc trong tự nhiên

ra nước ngoài. Do không có biện pháp quản lý có hiệu quả việc thu mẫu các

loài thực vật hoang dã với sự giàu có nổi bật của lan Hài đặc hữu của Việt Nam

đã khuyến khích việc thu thập các loài lan từ thiên nhiên với số lượng lớn trên

toàn bộ lãnh thổ.[1]

Nếu không có các biện pháp bảo vệ các khu rừng nguyên sinh khẩn cấp

và hiệu quả thì chắc chắn các sinh vật sẽ phải đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng

trong tương lai gần. Điều này sẽ kéo theo sự tuyệt chủng của một số lượng lớn

các loài hiếm và đặc hữu.

Trước tình hình lan Hài cạn kiệt ngoài thiên nhiên, nhiều chương trình

quốc gia về bảo tồn loài hoa quý này đã được triển khai,chủ yếu là thu thập,

phân loại, nghiên cứu về các loài lan Hài và bảo tồn môi trường sống tự nhiên

của chúng. Một công trình hợp tác quốc tế về lĩnh vực này là mô tả các giống

lan Hài ở Việt Nam của nhóm tác giả Leonid Averyanov, Phillip Cribb, Phan

Kế Lộc và Nguyễn Tiến Hiệp năm 2004 [1]

Một mạng lưới rộng khắp các khu bảo tồn đã được thành lập ở Việt Nam.

Đặc biệt hàng loạt các khu bảo tồn đã đang bảo tồn các loài lan Hài như:

- Khu bảo tồn Ngọc Linh (Kon Tum), Chue Yang Sinh (Đắc Lắc), Núi Bà

(Lâm Đồng) bảo tồn loài P. appletonianum.

- Khu bảo tồn Mom Ray (Kon tum), Thung Đa Nhim (Lâm Đồng) đang

bảo tồn loài P. callosum.

- Vườn Quốc Gia Ba Bể, khu bảo tồn Cát Bà (Hải Phòng), Hữu Liên (Lạng

Sơn), Pà Cò (Hòa Bình), khu bảo tồn Thượng Đa Nhim (Lâm Đồng) đang bảo

tồn P.dalatensis.

- Vườn Quốc Gia Hoàng Liên Sơn (Lào Cai), Phong Quang (Hà Giang),Pà

Cò (Hòa Bình) đang bảo tồn loài P. dianthum, P.micranthum.

- Khu bảo tồn Na Hang (Tuyên Quang) đang bảo tồn loài P. emersoii,

P.hangianum, P. malipoense varijackii.

- Vườn quốc gia Tam Đảo, Hoàng Liên Sơn đang bảo tồn loài

P.gratrixianum.

- Khu bảo tồn Trùng Khánh (Cao Bằng) đang bảo tồn loài P. helanae.

- Vườn quốc gia Ba Bể, khu bảo tồn Na Hang, Hữu Liên, Pà Cồ, Phong

Nha đang bảo tồn loài P. malipoense

Bên cạnh đó, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và ứng dụng phương pháp

nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro nhằm nhân nhanh số lượng lớn lan Hài.

Đầu tiên phải kế đến PGS. TS. Dương Tấn Nhựt, người đầu tiên nuôi cấy thành

công lan hài Hồng năm 2005. Sau đó đã có nhiều nhà nghiên cứu khác đã nuôi

cấy in vitro thành công nhiều loài lan Hài khác như hài Hằng, hài Tam Đảo

bằng các phương pháp nuôi cấy mô khác nhau, Khoa CNSH – CNTP trường

Đại học Nông Lâm Thái Nguyên bước đầu đã thành công nhân giống bằng

phương pháp in vitro một số loài lan Hài như: Hài Vệ Nữ, Hài Hằng, Hài Helen.

2.2 Tổng quan về Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum)

2.2.1 Nguồn gốc và sự phân bố của Hài Trần Liên (Paphiopedilum

tranlienianum) ở Việt Nam

2.2.1.1 Nguồn gôc

Lan hài Trần liên - Paphiopedilum Tranlienianum là một loài

lan hài nhỏ, là dài khoảng 8-15cm màu xanh bóng. Loài này có hoa tao nhã với

lá đài lưng trắng có sọc tía nâu, cánh hoa tía nâu lượn sóng rất mạnh ở mép,

môi nâu tía và nhị lép vàng tươi. Hài Trần Liên là loài đặc hữu hẹp ở Việt Nam,

cây ưa râm mát, nở hoa khoảng tháng 9-12, độ bền của hoa khá dài 25-30 ngày.

Lan Hài Trần Liên được mô tả chính thống năm 1988 dựa trên một cây sống

được nhập khẩu từ Việt Nam và được đặt theo tên người Việt Nam đã xuất khẩu

nó, bà Trần Ngô Liên.

2.2.1.2 Phân bố

Lan Hài Trần Liên được phân bố ở việt nam ở các tỉnh : Cao Bằng, Bắc

Kạn, Tuyên Quang (Na Hang) và Thái Nguyên (Đồng Hỷ): Mỏ Ba

2.2.2 Hình Thái

- Lan Hài Trần Liên là loài lan đất, cây mọc thành khối. Cây mọc trên

tầng đá vôi, lớp lá mục và trên rêu.

2.2.2.1. Dạng lá

- Hình dải cỡ 18*1.7 cm, mặt trên màu lục bóng với mép nhạt hơn, mặt

dưới màu lục nhạt với nhiều chấm màu tím ở gốc. Lá bắc hình trứng, cỡ 1.7-

2.5*1.6cm, lông ngắn ở gân giữa và mép tận cùng.

2.2.2.2. Dạng hoa

Cụm hoa: có cuống dài 7-15cm, thường mang 1 hoa. Hoa : Rộng 5.5-6cm

- Lá đài có lông ngắn ở mặt ngoài, lá đài gắn trục hoa màu trắng.Gân

tròn cỡ 3*3-3.5cm.Lá đài kia màu lục nhạt, hình trứng, cỡ 2.5*1.1-1.8cm.Cánh

hoa màu tía- nâu với chóp màu lục,hình khuôn,cỡ 3-3.4*0.7-0.9 cm, bóng. Mép

lượn sóng, có lông trắng,gốc có nhiều lông nâu- tía nhạt. Môi màu đỏ- nâu

thẫm,cỡ 3.7-3.9*1.6cm,

- Nhị lép, hình trứng ngược, 8-10*7-9 mm, có mủ bóng. Bầu dài 3-4 cm,

phủ đầy lông ngắn nâu nhạt. Bông 5-6cm rộng,6-7cm cao.

2.2.2.3. Dạng quả

- Dạng quả nang dài, 3 gờ, hình trụ, mở ở gần đỉnh bằng 6 rãnh nứt. Quả

chín trong điều kiện tự nhiên sau khi thụ phấn từ 6 đến 10 tháng.

2.2.2.4. Dạng gốc

- Gốc chuyển thành màu lục so với màu tía - nâu với chóp màu lục

2.2.2.5. Rễ

Rễ chùm, màu nâu, có lớp mô xốp bọc xung quanh các rễ thật, lớp màng

xốp này có vai trò trong việc giữ nước và ngăn chặn ánh sáng gay gắt. Sau khi

rễ trưởng thành thì có dạng sợi mảnh với hệ floem phát triển mạnh và không có

các búi nấm xung quanh rễ.

Hình 2.1: Hình ảnh về cây lan Hài Paphiopedilum tranlienianum

2.2.3. Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng loài lan Hài Trần Liên

2.2.3.1. Nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng

- Nhiệt độ: Lan Hài được phân chia thành 2 nhóm chính, theo quy luật

chung, những cây có lá màu xanh thường thích sống ở nơi có nhiệt đô lạnh đến

trung bình, ban đêm là từ 13-16°C, ban ngày là 18-24°C. Các loài Hài có lá vằn

thích hợp với điều kiện nhiệt từ trung bình đến ấm, ban đêm là 16-18°C, ban

ngày là 21-25°C.

- Ánh sáng: Lan Hài không cần ánh sáng mặt trời đầy đủ. Hầu hết lan Hài

ưa ánh sáng yếu, điều kiện ánh sáng nhân tạo cho các loài lan từ 11.000-22.000

lux. Nếu lá bị vàng hoặc phát hoa ngắn chứng tỏ chúng đang dư ánh sáng, nếu

lá màu xanh đậm và mềm hoặc phát hoa dài, yếu, chúng đang thiếu ánh sáng.

- Độ ẩm không khí: Không khí ẩm và lưu thông tốt là rất cần thiết, nhất là

trong mùa hè, giúp giảm thiểu nguy cơ nhiễm nấm bệnh và giữ cho cây không

bị khô quá nhanh. Độ ẩm có thể được nâng lên bằng cách đặt chậu cây lên trên

các khay sỏi nhẹ với 50% độ ẩm là lý tưởng.

2.2.3.2. Nhu cầu bón phân

Phân bón: Có thể bón phân NPK với tỉ lệ 20:20:20 hoặc 14:14:14, bổ sung

khoáng Ca2+ 40mg/l và Mg2+ 20-30mg/l. Tưới nước đậm trước và sau khi bón

phân, nếu thấy đầu lá bị nâu khô thì nên dừng hẳn việc tưới phân. Sang chậu

khi giá thể trồng có dấu hiệu mục nát.[4]

2.2.3.3. Giá thể trồng

Trần liên có thể trồng trên giá thể gồm đá vôi trộn thêm chất lá mục, than

củi, xỉ than tổ ong,, sơ dừa, vỏ thông và có thể tưới thêm phân bón 2 lần/ tuần

trong suốt mùa sinh trưởng của cây lan

2.3.4. Tổng quan về môi trường nuôi cấy và các thành phần dinh dưỡng sử

dụng trong nghiên cứu môi trường nhân nhanh lan Hài Trần Liên

Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật thay đổi tuỳ theo loài, bộ

phận, các giai đoạn phát triển, phân hoá khác nhau của mẫu cấy và mục đích

nuôi cấy như duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mầm hoặc tái sinh cây

hoàn chỉnh [5]

Thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật bao gồm

các thành phần chính sau:

2.3.4.1. Nguồn Cacbon

Mô cấy trong môi trường nuôi cấy in vitro khôngcón khả năng tự dưỡng do

không tiến hành quang hợp đầy đủ. Vì vậy, việc bổ sung vào môi trường nuôi

cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều kiện bắt buộc. Nguồn Cacbon cung cấp cho

môi trường nuôi cấy thường là các loại đường, phổ biến nhất là saccharose với

hàm lượng từ 20-30 g/l. Ngoài ra còn có thể sử dụng các loại đường khác như

fructose, rafinose, sorbitol, glucose, maltose, lactose,....những loại đường này

chỉ dùng trong những trường hợp cá biệt.

2.3.4.2. Các nguyên tố khoáng đa lượng, vi lượng

Các chất vô cơ bao gồm thành phần khoáng đa lượng và khoáng vi lượng

có trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật được sử dụng như là thành

phần cơ bản để tổng hợp chất hữu cơ. Các dạng ion của muối khoáng đóng vai

trò quan trọng trong quá trình vận chuyển xuyên màng, điều hoà áp suất thẩm

thấu và điện thế màng.

- Nguyên tố đa lượng:

Quan trọng nhất là các nguyên tố: N, P, K, Mg, Ca, Na, S [11]

+ Nitơ: Thường được sử dụng ở dạng NO3 - hoặc NH4+, hầu hết các loại

thực vật sẽ sử dụng nguồn nitơ này để đồng hoá và tổng hớp nên các sản phẩm

hữu cơ.

+ Phospho: Nhu cầu phospho của mô và tế bào nuôi cấy là rất cao, P có

tác dụng như hệ thống đệm giúp ổn định pH môi trường.

+ Kali: Thường dùng ở dạng KNO3, KH2PO4, KCl.6H2O

+ Canxi: Sử dụng chủ yếu là CaNO3.4H2O, CaCl2.6H2O, CaCl2.2H2O

+ Magie : Sử dụng chủ yếu là MgSO4

+ Lưu huỳnh: Chủ yếu là SO4

- Nguyên tố vi lượng: Chủ yếu là Fe, B, Mn, Cu, Zn, I, Ni... các nguyên

tố vi lượng bổ sung với lượng nhỏ vào môi trường nhưng có vai trò quan trọng

đối với quá trình trao đổi chất, tổng hợp protein, hoạt động phân bào của mô,

tế bào nuôi cấy.

2.3.4.3. Vitamin

Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau.

Đại đa số tế bào thực vật nuôi cấy đều có thể tự tổng hợp vitamin cần thiết,

nhưng số lượng thấp, có thể không đủ duy trì sự sinh trưởng của nó. Các

vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: Thiamin

(vitamin B1), nicotinic acid, pyridoxine (vitamin B6) và myo-inositol.

Vitamin có tác dụng thúc đẩy sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy và trong

nhiều trường hợp nó có vai trò như nguồn cacbon của môi trường nuôi cấy.

- Vitamin B1 (Thiaminee HCl): Là chất bổ sung rất cần thiết cho môi trường

nuôi cấy, có vai trò trong trao đổi hydratcacbon và sinh tổng hợp amino acid.

- Vitamin B6 (Pyridocinen): Là coenzzyme quan trọng trong nhiều phản

ứng trao đổi chất.

- Vitamin B3 (Nicotinic acid): Tham gia tạo coenzyme của chuỗi hô hấp.

- Myo-inositol: Có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào, màng tế bào,

tham gia vận chuyển đường, các nguyên tố khoáng, trao đổi hyđratcacbon.

2.3.4.4. Các chất hữu cơ tự nhiên

- Nước dừa: Chứa nhiều chất dinh dưỡng như inositol, các amino acid,

đường, các chất thuộc nhóm cytokinin, các chất có hoạt tính auxin.

- Dịch thuỷ phân casein: Chứa nhiều amino acid.

- Dịch chiết nấm men: Có hàm lượng khá cao các vitamin nhóm B.

- Nước ép các loại củ quả: Nước ép cà chua, cà rốt, nước ép chuối xanh…

2.3.4.5. Các thành phần khác

- Agar: Chiết xuất từ rong biển, thành phần của agar gồm một số chất hữu

cơ như acid hữu cơ, acid béo, cùng một số nguyên tố vô cơ như Cu, Fe, Zn...

Ngoài tác dụng tạo gel cho môi trường, agar cũng cung cấp một số chất dinh

dưỡng cho tế bào, mô nuôi cấy.

- Than hoạt tính: Dùng để hấp thụ chất màu, các hợp chất thứ cấp gây ức

chế sinh trưởng của mẫu nuôi cấy. Ngoài ra, có thể sử dụng một số chất chống

oxy hoá khác như polyvinyl pyrolodon (PVP), acid ascobic.

2.3.4.6. pH của môi trường

Độ pH của môi trường ảnh hưởng đến khả năng tiếp nhận chất dinh

dưỡng của mẫu từ môi trường nuôi cấy. Đa số pH của môi trường được điều

chỉnh trong khoảng từ 5,5-6,0. Trong quá trình nuôi cấy, pH của môi trường có

thể giảm do mẫu nuôi cấy sản sinh ra các acid hữu cơ.

2.3.4.7. Các chất điều hoà sinh trưởng

Các chất điều hoà sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môi

trường nuôi cấy, có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực

vật. Hiệu quả của chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào: Nồng độ, hoạt tính

của chất điều hoà sinh trưởng và yếu tố nội sinh của mẫu cấy.

Dựa vào hoạt tính sinh lý có thể phân chất điều hoà sinh trưởng làm 2

nhóm: Nhóm chất kích thích sinh trưởng và nhóm ức chế sinh trưởng. Trong

nuôi cấy mô, tế bào thực vật, nhóm chất kích thích sinh trưởng là nhóm thường

được sử dụng.

- Nhóm Auxin: Được phát hiệ lần đầu tiên bởi Charles Darwin và con

trai là Francis Darwin khi thử nghiệm tính hướng sáng trên cây yến mạch, Sau

đó, nhiều nhà khoa họv đã nghiên cứu và dần mở rộng hiểu biết về nhóm chất

này. Auxin trong cơ thể thực vật tập trung nhiều ở các chồi, lá non, hạt nảy

mầm, trong phấn hoa. Auxin có nhiều tác động tới các hiệu ứng sinh trưởng và

phát triển trên cơ thể thực vật. Cụ thể như sau: Auxin có ảnh hưởng tới tính

hướng động của thực vật, tiêu biểu là tính hướng sáng và hướng đất. Auxin gây

ra hiện tượng ưu thế đỉnh (sự sinh trưởng của chồi đỉnh sẽ ức chế chồi nách).

Auxin khởi động việc hình thành rễ bên và rễ phụ do auxin kích thích sự phân

chia của tế bào trụ bì – nơi rễ sẽ sinh trưởng xuyên qua vỏ biểu bì, Ngoài ra,

auxin còn tác động đến việc hình thành chồi hoa, sự phát triển của quả và làm

chậm sự rụng lá.

Các auxin thường được sử dụng là: NAA, IBA, 2,4D (các auxin nhân

tạo), IAA (các auxin tự nhiên). Hoạt tính bcuat các chất này được xếp theo thứu

tự từ yếu đến mạnh như sau: IAA, IBA, NAA, 2,4D. IAA nhạy cảm với nhiệt

độ và dễ phân huỷ trong quá trình hấp khử trùng do đó không ổn định trong

môi trường nuôi cấy môi, NAA và 2,4D không bị biến tính ở nhiệt độ cao. Tuy

nhiên chất 2,4D là chất dễ gây độc nhưng có tác dụng nhạy đến sự phân chia tế

bào và hình thành callus.

- Nhóm Cytokinin: Được phát hiện từ những năm 50 của thế kỷ XX,

chất đầu tiên là Kinetin bắt nguồn từ tinh dịch cá trích. Tiếp đó, đến zeatin tách

từ nội nhũ của hạt ngô non. Đã phát hiện cytokinin ở vi sinh vật, tảo silic, rêu,

dương xỉ, cây lá kim. Zeain có nhiều trong thực vật bậc cao và trong một số vi

khuẩn. Trong thực vật, cytokinin có nhiều trong hạt, quả đang lớn, mô phân

sinh. Cytokinin kích thích hoặc ức chế nhiều quá trình sinh lý, trao đổi chất.

Cùng với auxin, cytokinin điều khiển sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô.

Tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽ kích thích tạo rễ, ngược lại sẽ hình thành chồi.

Cytokinin cảm ứng sự hình thành chồi bên và ức chế ưu thế đỉnh. Quá trình

sinh trưởng dãn dài của tế bào cũng chịu ảnh hưởng của cytokinin. Ngoài ra

cytokinin còn làm chậm sự già hoá.[7]

Trong các chất thuộc nhóm cytokinin thì Kinetin và BAP được sử dụng

phổ biến vì hoạt tính mạnh: Kinetin (phối hợp cùng auxin vơi tỷ lệ thích hợp

có khả năng kích thích phân chia tế bào), BAP (hoạt tính mạnh, bền nhiệt),

ngoài ra có thể sử dụng TDZ, Diphenylurea....[7]

- Nhóm Gibberellin: Được tách chiết lần đầu từ dịch tiết của nâm bởi các

nhà khoa học Nhật Bản vào những năm 1935-1938. Giberellin được tổng hợp

trong các mô đỉnh, tồn tại trong cả hạt non và quả đang phát triển. Giberellin

có tác dụng chính trong việc hoạt hoá phân bào của mô phân sinh lóng, kéo dài

lóng cây. Nó cũng kích thích sự kéo dài của tế bào, tăng kich thước của chồi

nuôi cấy. GA3 là loại gibberellin được sử dụng nhiều nhất [7].

2.4. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan hài trên thế giới và trong nước

2.4.1. Trên thế giới

Thông thường Paphiopedilum có thể được nhân giống bằng gieo trồng hạt

hay tách cây con đã trưởng thành ra khỏi cây mẹ. Tuy nhiên, các phương pháp

này cho hiệu quả nhân giống thấp nên không đáp ứng nhu cầu của thị trường.

Vì vậy, phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật cho phép tạo ra một lượng

lớn cây con trong thời gian ngắn đã trở thành một giả pháp lý tưởng để bảo vệ

lan Hài thoát khỏi nguy cơ tuyệt chủng.

Các nghiên cứu đầu tiên về nuôi cấy mô lan Hài được thực hiện bởi

Bubeck năm 1973. Kể từ đó nhiều nhà nghiên cứu đã cố gắng nhân giống lan

Hài bằng nhiều phương pháp nuôi cấy sử dụng các bộ phận khác nhau của cây.

Một số nghiên cứu đã thành công:

Năm 1975, Stewart và cs tiến hành cảm ứng chồi bên để tạo ra mô sẹo,

đôi khi có sự hình thành một vài cây con trong quá trình nuôi cấy. Tuy nhiên,

các mô sẹo rất khó tái sinh, sau một thời gian nuôi cấy những mô sẹo này sẽ

chết. Vì lý do này, hầu hết các nghiên cứu về nuôi cấy mô Paphiopedilum đều

sử dụng nguồn vật liệu ban đầu từ hạt.[29]

Năm 1980, Nieman đã tiến hành nuôi cấy chồi bên và cây con [24]và

phương pháp này cũng được Sampolinski sử dụng cho nghiên cứu năm

1983.[28]

Năm 1988, Huang đã tiến hành nuôi cấy kéo dài cây in vitro, sau đó cảm

ứng tạo chồi từ chồi nách của cây in vitro được nuôi cấy kéo dài.

Năm 2000, Lin và cs đã tiến hành nuôi cấy mô sẹo từ nguồn protocorm của

hạt một loài lan Hài lai và đã thu được một vài cây con trong ống nghiệm.[23]

Năm 2001, Huang đã tiến hành nhân nhanh hạt giống lan Hài lai giữa P.

philippinese và P. susan trong môi trường MS bổ sung với BAP 13 mM.[20]

Năm 2002 và 2004, Chen và các cộng sự cũng báo cáo rằng có thể cảm

ứng tạo chồi từ thân và lá của lan Hài P. philippinese khi nuôi cấy trên môi

trường MS có bổ sung 2,4D 4,52mM và TDZ 4,5mM.[16][17]

Năm 2005, Dương Tấn Nhựt đã nghiên cứu thành công phương pháp nhân

nhanh giống lan Hài P. delenatii bằng phương pháp sử dụng hạt nảy mầm in

vitro. Từ cây con in vitro, các mô sẹo được cảm ứng từ protocorm có nguồn

gốc từ hạt, được nuôi cấy trên môi trường có chứa 2,4D và TDZ với nồng độ

cao, những mô sẹo này có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh thông qua

bước hình thành PLB. Một phần mô sẹo có thể tái sinh được 3-7 chồi trong 3

tháng và chúng có thể tồn tại trên môi trường nuôi cấy trong 3 năm mà không

mất đi khả năng tái sinh [32]. Ngoài ra, Dương Tấn Nhựt còn nghiên cứu thành

công một phương pháp mới cho phép nhân nhanh giống lan P. delenatii là

phương pháp gây vết thương trên phần gốc thân của cây con in vitro. Phần gốc

sau khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung thêm TDZ, NAA, 2,4D sẽ hình

thành mô sẹo và một số ít xuất hiện protocorm.

Năm 2007, Dương Tấn Nhựt và cộng sự đã nghiên cứu nhân giống thành

công lan Hài Hồng qua các chồi tái sinh từ các đoạn thân của cây non được

nuôi cấy kéo dài in vitro khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung TDZ 1,5

mg/l, BA 2 mg/l, NAA 0,5 mg/l, than hoạt tính 1 g/l, đường 30 g/l, agar 9 g/l.

[25]Khi nuôi cấy trong bóng tối sẽ thu được chồi dài, màu vàng, yếu, còn khi

nuôi cấy dưới ánh sáng đỏ có cường độ thấp sẽ thu được chồi có sự giãn cách

giữa các lá dọc trên thân cây.

Năm 2008, Hong và các cộng sự cũng đã tái sinh chồi từ mô sẹo của cây

con giống P. alma Gavaert khi nuôi cấy trên môi trường MS có Kinetin

4,65mM[18]

Năm 2011, Liao và các cộng sự cũng đã tái sinh chồi từ mô sẹo của cây

con hoàn chỉnh từ nụ hoa của P. deperle và P. armeni. Tuy nhiên, cần rất nhiều

thời gian để cho cây lan Hài ra hoa vì vậy phương pháp này kém hiệu quả hơn

các phương pháp khác.[22]

Người ta cũng tiến hành phương pháp nuôi cấy huyền phù tế bào từ những

dòng mô sẹo có nguồn gốc từ protocorm và nuôi cấy mô sẹo từ những loại mô

khác của Paphiopedilum.

2.4.2. Trong nước

* Về nghiên cứu kỹ thuật trồng và nhân giống lan Hài

Lan Hài đỏ (Hài hồng - P.delenatii) của Phân Viện Sinh học Đà Lạt được

nhân giống thành công bằng phương pháp ứng dụng công nghệ tế bào thực vật.

Sau nhiều lần thử nghiệm nhân giống, từ hai năm qua, những nhà khoa học ở Phân

viện sinh học Đà Lạt đã áp dụng phương pháp mới trong nhân giống hoa lan Hài

đỏ. Các cây sau khi được kéo dài đoạn thân bằng cách sử ánh sáng trắng của đèn

huỳnh quang và ánh sáng đỏ của đèn LED, được cắt thành từng đốt rồi nuôi cấy

trên môi trường MS có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng khác. Kết quả cho

thấy tỷ lệ tạo chồi cao nhất (75%) khi môi trường có bổ sung 2,0mg/l BA, còn trên

môi trường có bổ sung 1,5mg Zeotin hoặc 1,5mgTDZ thì cho chất lượng chồi tốt

nhất. Khi dùnhg phương pháp này, khả năng tạo chồi rất nhanh,,mặt khác cũng

tìm được điều kiện sinh thái cho lan Hài nở hoa. Qua đây, người ta cũng chứng

minh rằng lan Hài đỏ cũng có thể sản xuất vô tính.

Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2005, 2007), đã nhân giống được loài lan

Hài đỏ- một loài Lan đặc hữu của Việt Nam (Paphiopedilum delenatii) bằng

kỹ thuật gây vết thương cơ giới, nuôi cấy lỏng và kéo dài đốt thân có chứa mắt

để tái sinh chồi từ việc sử dụng các hạt lan sáu tháng tuổi được nuôi cấy trên

môi trường Knudson C kết hợp với việc gây vết thương và nuôi cấy trên môi

trường lỏng đã thu được 5,2 chồi/mẫu ban đầu khi nuôi cấy trên môi trường

MS có bổ sung 1,0mg/l TDZ. Còn các cây sau khi được kéo dài đoạn thân bằng

cách sử dụng ánh sang trắng của đèn huỳnh quang và ánh sáng đỏ của đèn LED,

được cắt thành từng đốt rồi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung các chất

diều tiết sinh trưởng khác nhau. Kết quả cho thấy tỷ lệ tạo chồi cao nhất (75%)

khi môi trường có bổ xung 2,0mg/l BA, còn trên môi trường có bổ sung 1,5mg

Zeatin hoặc 1,5mg/l TDZ thì cho chất lượng chồi tốt nhất.[25]

Nguyễn Thị Tình và cộng sự (2017) đã thành công trong nhân nhanh cây lan

Hài gấm (P. concolor) từ phôi trên môi trường MS cải tiến có bổ sung BA 2mg/l

và TDZ 1,0mg/l. Cho hệ số nhân chồi đạt 2,9 lần.

Nguyễn Thị Tình và cộng sự (2018) nhân giống thành công loài lan hài giáp

P. malipoense trên môi trường MS có bổ sung BA 2mg/l và NAA 0,3mg/l cho hệ

số nhân chồi 3,28 lần.

Nguyễn Thị Tình và cộng sự (2018) nhân giống thành công loài lan hài Xuân

Cảnh Paphiopedilum Canhii) trong môi trường MS có bổ sung BA với nồng độ

2mg/l + Kinetine 1mg/l + TDZ 1mg/l cho hệ số nhân chồi đạt 2,93 lần.

PHẦN 3

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu

3.1.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Loài Hài Trần Liên (Paphiopedilum

tranlienianum) khỏe mạnh, sạch bệnh lưu giữ tại nhà lưới khoa CNSH - CNTP,

Trường Đại Học Nông Lâm.

- Vật liệu nghiên cứu:

+ Phôi lan Hài Trần Liên 8 tháng tuổi sau khi thụ phấn tại Khoa CNSH

– CNTP.

+ Một số chất kích thích sinh trưởng

Hình 3.1. Quả lan Hài Trần Liên

3.1.2. Hoá chất sử dụng

- Hoá chất khử trùng: cồn 70°, Ôxy già (H2O2).

- Môi trường MS, B5, WPM, đường sacharose, agar,...

- Một số chất kích thích sinh trưởng ở thực vật thuộc nhóm

auxin(NAA,...), nhóm cytokinin (BA,.Kinitine, TDZ)..

3.1.3. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu

Bảng 3.1. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu

Thiết bị Dụng cụ

Cân phân tích Pank cấy

Máy khuấy từ Dao kéo

Máy đo PH Đèn cồn

Lò vi sóng Cốc đong, ống đong

Nồi hấp vô trùng Bình tam giác

Tủ sấy Đĩa (hạt đậu, peptri)

Hệ thống giàn đèn Chun nịt

Box cấy vô trùng Giấy thấm

Cùng các trang thiết bị, dụng cụ khác phục vụ nghiên cứu của Phòng Thí

nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm

3.2. Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.2.1. Phạm vi nghiên cứu

+ Nghiên cứu nồng độ và thời gian khử trùng mẫu quả trong dung dịch

H2O2 đến hiệu quả tạo vật liệu vô trùng.

+ Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh phôi cây

Hài Trần Liên từ quả

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến khả

năng tái sinh, nhân nhanh chồi và ra rễ cây Hài Trần Liên

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây Hài Trần Liên

3.2.2. Địa điểm nghiên cứu

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật, Khoa CNSH

– CNTP, Trường Đại Học Nông Lâm.

3.2.3. Thời gian nghiên cứu

- Thời gian: từ tháng 12/2019 – tháng 7/2020

3.3. Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu nồng độ và thời gian khử trùng mẫu trong dung dịch H2O2

đến hiệu quả tạo vật liệu vô trùng.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái

sinh phôi Hài Trần liên từ quả

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Cytokine đến khả năng nhân nhanh

của lan Hài Trần liên

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh

chồi của cây lan hài Trần liên

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetine đến khả

năng nhân nhanh chồi của cây lan hài Trần liên.

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA,Kinetine, TDZ đến khả năng

nhân nhanh của chồi lan Hài Trần Liên.

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính (THT) đến

khả năng ra rễ của cây lan Trần Liên.

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của cây lan hài

Trần Liên

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả

năng ra rễ của cây lan hài Trần Liên.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới khả năng sinh trưởng và phát

triển của lan Hài Trần Liên giai đoạn vườn ươm.

3.4. Phương pháp nghiên cứu

3.4.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro

- Sử dụng môi trường MS, B5, WPM bổ sung Agar 5,5 g/l, Đường 30g/l,

nước dừa 150ml/l, Inositol 100mg/l, pH: 5,6-5,8.

- Các chất kích thích sinh trưởng sử dụng bổ sung vào môi trường nuôi

cấy có hàm lượng thay đổi tùy theo từng thí nghiệm.

- Môi trường hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC, áp suất 1,0 atm trong 20 phút

- Sau khi cấy xong đưa mẫu vào phòng nuôi với điều kiện nuôi cấy nhiệt

độ phòng từ 22oC – 25oC, độ ẩm: 60 – 65% quang chu kì 14h sáng 10h tối.

Tiến hành theo dõi mẫu.

Quả

Khử trùng (cồn 70º,xà phòng,H2O2)

3.4.2. Phương pháp nghiên cứu quy trình nhân giống

Tái sinh phôi

Nhân nhanh chồi

Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh

Vườn ươm

Hình 3.2: Sơ đồ nghiên cứu nhân giống loài lan Hài Trần liên

3.4.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu nồng độ và thời gian khử trùng mẫu trong

dung dịch H2O2 đến hiệu quả tạo vật liệu vô trùng.

Các bước tiến hành vô trùng mẫu như sau:

- Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu: Mẫu lấy là quả của cây lan Hài Trần liên đem

rửa sạch dưới vòi nước, loại bỏ hết phần đất bẩn, dùng xà phòng để rửa, sau

đó tráng lại bằng nước cất.

- Khử trùng mẫu: Tiến hành trong box cấy vô trùng, khử trùng sơ bộ bằng

cồn 70° trong 30 giây, tráng lại 3 - 5 lần bằng nước cất vô trùng, sau đó khử

trùng tiếp bằng dung dịch H2O2 để tiêu diệt nấm, vi khuẩn. Sau đó tráng lại

bằng nước. Đặt mẫu lên giấy thấm và để khô tự nhiên trong box. Sau đó dùng

pank, dao, kéo cắt bỏ phần mẫu ngấm hoá chất trên mẫu và cấy vào môi trường

nuôi cấy.Tiến hành theo dõi mẫu.

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng cuả nồng độ, thời gian của chất khử

trùng của H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng cây lan Hài Trần liên

Các công thức được bố trí như sau:

Hóa chất Công thức Thời gian (phút)

CT1 (Đ/C) 0

10 CT2

15 CT3 H2O2 1%

20 CT4

10 CT5

15 CT6 H2O22%

20 CT7

10 CT8

15 CT9 H2O2 3 %

20 CT10

3.4.3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của loại môi trường dinh dưỡng

đến khả năng tái sinh phôi lan Hài Trần Liên

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại môi trường nuôi

cấy đến khả năng tái sinh phôi lan Hài Trần Liên

- Mẫu sau khi khử trùng, được cấy sang các môi trường nuôi cấy khác

nhau Các môi trường nuôi cấy được bổ sung thêm Đường 30g/L + Agar 5,5g/L

+ Nước dừa 150 ml/L + Inositol 100mg/l, để nghiên cứu ảnh hưởng của một số

môi trường đến khả năng tái sinh phôi lan Hài Trần Liên.

Công thức thí nghiệm được bố trí như sau:

CT Môi trường Chất bổ sung

1 Muashige & Skoog (MS) Đường 30g/L + Agar 5,5g/L +

Nước dừa 150 ml/L + Inositol, 2 Woody Plant Medium (WPM)

pH 5,6 – 5,8. 3 Gamborg’s (B5)

- Mẫu có kích thước tương đồng sau khi khử trùng được đưa vào môi

trường tái sinh, sau đó đặt trong phòng nuôi cấy với điều kiện thích hợp. Tiến

hành theo dõi, quan sát phôi tái sinh và chất lượng phôi tái sinh.

3.4.3.3. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Cytokinine đến khả

năng nhân nhanh chồi lan Hài Trần Liên

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng

nhân nhanh chồi của cây lan hài Trần Liên

- Phôi tái sinh được cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi

trường nền (Môi trường nền gồm thành phần khoáng đa lượng, vi lượng,

vitamin là thành phần của môi trường MS bổ sung: Đường 30 g/l + Nước dừa

150 ml/l + Agar 5,5 g/l + Inositol 100mg/l, pH 5,6 – 5,8.), có bổ sung chất kích

thích sinh trưởng (BA) để theo dõi khả năng nhân phôi của mẫu.

- Theo dõi, quan sát số chồi chất lượng chồi

Thí nghiệm được bố trí như sau:

CT 1(Đ/c): MT nền + BA 0,0 mg/l

CT 2: MT nền + BA 1,0 mg/l

CT 3: MT nền + BA 2,0 mg/l

CT 4: MT nền + BA 3,0 mg/l

CT 5: MT nền + BA 4,0 mg/l

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với kinitine đến khả

năng nhân nhanh chồi lan Hài Trần Liên từ phôi

- Các phôi được tạo thành từ môi trường tái sinh sẽ được tách ra và cấy

chuyển sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi trường nền + A(nồng độ BA

thích hợp nhất ở thí nghiệm 3) + kinetine ở các nồng độ khác nhau để theo dõi

khả năng nhân chồi.

Thí nghiệm được bố trí như sau:

CT 1 (Đ/c): MT nền +A+ 0,0 mg/l Kinetine

CT 2: MT nền + A + 0,3 mg/l Kinetine

CT 3: MT nền + A + 0,5 mg/l Kinetine

CT 4: MT nền + A + 1,0 mg/l Kinetine

CT 5: MT nền + A +2,0 mg/l Kinetine

Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ

Các chồi được tạo thành từ môi trường tái sinh sẽ được tách ra và cấy chuyển

sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi trường nền + A + B (nồng độ Kinetin thích

hợp nhất cho nhân nhanh chồi đã xác định ở thí nghiệm 4) + TDZ ở các nồng độ

khác nhau để theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu.

Thí nghiệm được bố trí như sau:

CT 1 (Đ/c): MT nền + A + B + TDZ 0,0 mg/l

CT 2: MT nền + A + B + TDZ 0,5 mg/l

CT 3: MT nền + A + B + TDZ 1,0 mg/l

CT 4: MT nền + A + B + TDZ 1,5 mg/l

đến khả năng nhân nhanh chồi của cây Hài Trần Liên.

CT 5: MT nền + A + B + TDZ 2,0 mg/l

3.4.3.4.. Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt

tính đến khả năng ra rễ của cây lan Hài Trần Liên

Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của cây

lan Hài Trần Liên

- Chồi sinh trưởng và có từ 2-3 lá, cây cao 2-3 cm thì cấy chuyển sang môi

trường ra rễ gồm: MT nền có bổ sung NAA ở các nồng độ khác nhau để theo

dõi khả năng tạo rễ của mẫu.

- Đưa mẫu vào phòng cây. Quan sát và theo dõi số rễ và chất lượng rễ.

Thí nghiệm được bố trí như sau:

CT 1 (Đ/c): MT nền +0,0 NAA mg/l

CT 2: MT nền +0,5 NAA mg/l

CT 3: MT nền +1,0 NAA mg/l

CT 4: MT nền +1,5 NAA mg/l

CT 5: MT nền +2,0 NAA mg/l

Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính

đến khả năng ra rễ của cây lan Hài Trần Liên

- Chồi sinh trưởng và có từ 2-3 lá thì cấy chuyển sang môi trường ra rễ gồm:

MT nền + B (nồng độ NAAthích hợp nhất cho ra rễ đã được xác định ở thí nghiệm

7) + THT ở các nồng độ khác nhau để theo dõi khả năng ra rễ của mẫu.

Thí nghiệm được bố trí như sau:

CT 1 (Đ/c): MT nền + B + THT 0,0 g/l

CT 2: MT nền + B + THT 0,5 g/l

CT 3: MT nền + B + THT 1,0 g/l

CT 4: MT nền + B + THT 1,5 g /l

CT 5: MT nền + B + THT 2,0 g/l

3.4.3.5. Nội dung 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới khả năng sinh

trưởng và phát triển của lan Hài Trần Liên

Công thức thí nghiệm được bố trí như sau:

Công Thức(CT)

Giá thể

CT1

Đất

CT2

Than

CT3

Sơ dừa

CT4

Dớn

CT5

Vỏ thông

3.4.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm

- Điều kiện thí nghiệm: Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng Công nghệ

sinh học thực vật (Khoa CNSH - CNTP) trong điều kiện nhiệt độ phòng (25ºC ±

2, độ ẩm 60 - 65%, thời gian chiếu sáng 14h sáng, 10h tối cường độ chiếu sáng

2000 – 2500 lux.

- Bố trí thí nghiệm: Tất cả các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hoàn

toàn với 3 lần lặp lại, mỗi lần cấy trong 30 bình thủy tinh thể tích 250ml, 500

ml) có chứa 70 ml môi trường, mỗi bình cấy 1 mẫu.). Điều chỉnh giá trị pH =

5,6 – 5,8 và bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng trước khi hấp khử trùng ở

121oC, trong 15 - 20 phút.

3.5. Phương pháp thu thập, xử lý số liệu và chỉ tiêu đánh giá

3.5.1. Thu thập số liệu

- Đếm số mẫu không nhiễm, mẫu sống nhiễm, mẫu chết.

- Đếm số chồi: đếm tổng số phôi và nhánh trên một mẫu nuôi cấy ban đầu.

- Đếm số lượng rễ, độ dài của rễ.

3.5.2. Các chỉ tiêu theo dõi

- Chỉ tiêu theo dõi khử trùng mẫu

+ Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm:

Tổng số mẫu sống không nhiễm (mẫu)

Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%) = × 100%

Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)

+ Tỷ lệ mẫu sống nhiễm:

Tổng số mẫu sống bị nhiễm (mẫu)

Tỷ lệ mẫu sống nhiễm (%) = × 100%

Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)

+Tỷ lệ mẫu chết:

Tổng số mẫu chết (mẫu)

Tỷ lệ mẫu chết (%) = × 100%

Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)

- Chỉ tiêu theo dõi phôi:

Tổng số mẫu nảy phôi (mẫu)

Tỷ lệ tái sinh phôi (%) = × 100%

Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)

Tổng chồi thu được

Hệ số nhân chồi = × 100%

Tổng chồi nuôi cấy

Chất lượng chồi:

+ Sinh trưởng tốt: Chồi mập, khỏe, xanh

+ Sinh trưởng trung bình: Chồi mập, khỏe, xanh nhạt

+ Sinh trưởng kém: Chồi nhỏ, yếu, trắng vàng

- Chỉ tiêu theo dõi ra rễ:

Tổng số chồi ra rễ (chồi)

Tỷ lệ chồi ra rễ (%) = × 100%

Tổng số mẫu nuôi cấy (mẫu)

Chất lượng rễ,màu sắc

+ Rễ tốt: Rễ khỏe, dài,có màu trắng,nhiều lông hút.

+ Rễ trung bình: Rễ khỏe, ngắn.có màu trắng hơi vàng

+ Rễ kém: Rễ ngắn, nhỏ.vàng hoặc màu đen.

PHẦN 4

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của chất khử

trùng H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng

Trong quá trình nuôi cấy in vitro, vô trùng mẫu cấy là giai đoạn khởi đầu

và quyết định sự thành công của quá trình nuôi cấy. Để có được vật liệu khởi

đầu sạch nấm và vi khuẩn, việc lựa chọn chất khử trùng, nồng độ, thời gian rất

quan trọng. Qua quá trình nghiên cứu và tìm hiểu khả năng tạo mô sạch trong

nuôi cấy in vitro trên đối tượng Phong lan nói chung và lan Hài nói riêng, chúng

tôi nhận thấy có nhiều nhất chất hóa học có hoạt tính diệt nấm và vi khuẩn mạnh

như Calcium hypochlorid Ca(OCl)2, thuỷ ngân clorua (HgCl2), hydroxid

(H2O2),....Tuy nhiên HgCl2 được nhiều nhà nghiên cứu sử dụng bởi chúng có

hoạt tính khử trùng tốt, cho tỷ lệ mẫu sống không nhiễm cao,nhưng lại gây ô

nhiễm môi trường, độc hại, dễ gây bệnh hiểm nghèo cho con người nên không

sử dụng. Hydroxid (H2O2) có hiệu quả khử trùng kém hơn nhưng lại không gây

hại cho môi trường và con người nên được chọn sử dụng cho các nghiên cứu

lien quan trong thí nghiệm

Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian khử

trùng của H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng (sau 14 ngày nuôi cấy)

Chỉ tiêu đánh giá

Công thức

Nồng độ (%)

Thời gian (phút)

Số mẫu đưa vào (mẫu)

Tỷ lệ mẫu chết (%)

Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%)

Tỷ lệ mẫu sống nhiễm (%)

Nước cất

0,00

100

0,00

CT1(Đ/c)

vô trùng

15,33

73,44

11,23

CT2

H2O2 1%

27,67

35,55

36,78

CT3

Chỉ tiêu đánh giá

Công thức

Nồng độ (%)

Thời gian (phút)

Số mẫu đưa vào (mẫu)

Tỷ lệ mẫu chết (%)

Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%) 41,00

Tỷ lệ mẫu sống nhiễm (%) 38,89

20,11

CT4

52,22

36,14

11,64

CT5

CT6

58,55

24,12

19,33

H2O2 2%

46,33

9,22

40,45

CT7

1,25

28,79

59,96

CT8

65,55

17,24

17,21

CT9

H2O2 3%

31,45

2,56

65,99

CT10

5,8

LSD05

7,9

CV (%)

65.55

59.96

58.55

52.22

46.33

31.45

27.67

15.33

CT1(Đ/c)

CT2

CT3

CT4

CT5

CT6

CT7

CT8

CT9

CT10

tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%)

Biểu đồ 4.1. Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%) lan Hài Trần Liên

Từ kết quả nghiên cứu cho thấy:

Khi khử trùng mẫu ở nồng độ H2O2 1% trong 15 phút cho thấy tỷ lệ mẫu

sông không nhiễm đạt ở mức cao nhất là 65,55%, tỷ lệ mẫu chết ở mức 17,21%.

Ở nồng độ H2O2 2% thì mẫu được khử trùng trong 20phút cho ra tỷ lệ mẫu

sống không nhiễm đạt ở mức cao nhất là 46,33%, tỷ lệ mẫu chết ở mức là

40,45%.Trong 20 phút khử trùng mẫu bằng 1% H2O2 cho ra tỷ lệ mẫu sống

không nhiễm đạt ở mức cao nhất lầ 41,00% và tỷ lệ mẫu chết ở mức 20,11%.

Kết quả thí nghiệm cho thấy dung dịch H2O2 ở nồng độ thấp nhất 1% ít ảnh

hưởng đến mẫu, tỷ lệ mẫu chết cao nhất ở mức 20,11% nhưng hiệu quả khử

trùng thấp. Khi nồng độ H2O2 tăng lên 2% thì hiệu quả của khử trùng khá cao

đạt mức 65,55% khử trùng trong 15 phút nhưng khi tăng lên theo thời gian khử

trùng lên 20 phút thì tỷ lệ mẫu sống không nhiễm giảm mạnh xuống 43,33% và

tỷ lệ mẫu chết khá cao 40,45%. Cho thấy nếu nồng độ và thời gian không phù

hợp thì sẽ không đạt hiệu quả khử trùng tốt nhất. Như vậy, nồng độ H2O2 3%

và thời gian khử trùng 15 phút là phù hợp và tốt nhất trong thí nghiệm cho tỷ

lệ mẫu sống không nhiễm đạt 65,55% và tỷ lệ mẫu chết ở mức tương đối thấp

17,21%.

4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh

phôi lan Hài Trần Liên

Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả

năng tái sinh phôi lan

Công thức Môi trường Tỷ lệ tái sinh (%) Tổng mẫu nuôi cấy (mẫu ) Chất lượng phôi Tổng mẫu tái sinh phôi (mẫu)

CT1 MS 30 20 66,67 Xanh đậm, mập

CT2 WPM 30 14 46,67 Xanh nhạt, mập

CT3 B5 30 8 26,67 Xanh nhạt, gầy

6,8 6,5 LSD.05 CV

Tỷ lệ tái sinh (%)

66.67

46.67

Tỷ lệ tái sinh (%)

26.67

CT1

CT2

CT3

Biểu đồ 4.2. Tỷ lệ tái sinh phôi lan (%)

Từ kết quả nghiên cứu cho thấy :

Kết quả ở bảng 4.2 cho thấy: giá trị CV (%): 6, % và LSD.05 đạt 6,5%; các

công thức đều có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy là 95%.

Ở CT1 (MS) cho tỷ lệ phôi tái sinh cao nhất 66,67 %, thu được phôi có

màu xanh, mập. Tiếp theo CT2 (WPR) tỷ lệ tái sinh phôi là 47,67 % phôi thu

được màu xanh nhạt, mập. CT3 cho tỷ lệ tái sinh phôi thấp nhất 26,67%.. phôi

thu được màu xanh nhạt, gầy.

Kết quả thí nghiệm cho thấy phôi lan có thể tái sinh tốt trên nền môi

trường giàu dinh dưỡng.. Từ kết quả trên, chúng tôi chọn môi trường MS

làm môi trường cơ bản cho quá trình nghiên cứu sau của cây lan .

4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ một số Cytokinine đến

khả năng nhân nhanh cây lan Hài Trần Liên

4.3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân

nhanh chồi của cây lan Hài Trần Liên

BA (6-Benzylaminopurine) là một chất điều hòa sinh trưởng thực vật

thuộc nhóm cytokinin, được sử dụng khá phổ biến trong môi trường nuôi cấy

mô nhằm kích thích sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ

các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ.

Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng

nhân nhanh phôi Trần liên (sau 6 tuần nuôi cấy)

Tổng số

Tổng

Hệ số nhân

Nồng độ BA

chồi tạo

CT

mẫu cấy

Chất lượng chồi

chồi

(mg/l)

thành

(mẫu)

(lần)

(chồi)

Trắng vàng,

0,17

1

nhỏ, yếu

Trắng vàng,

0,7

2

nhỏ, yếu

Xanh, mập, khỏe

3 1,8

30

Xanh nhạt,

1,56

4

khỏe, mập

Trắng vàng,

0,68

5

nhỏ, yếu

0,12

LSD05

CV(%)

8,7

1.8

1.56

1.6

1.4

1.2

hệ số nhân chồi ( lần)

0.7

0.8

0.68

0.6

0.4

0.17

0.2

Biểu đồ 4.3. Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ BA

Từ kết quả nghiên cứu cho thấy:

Giá trị CV (%): 8,7% và LSD05 đạt 0,12 % thì các công thức thí nghiệm đều

có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Điều này cho thấy BA có sự ảnh

hưởng tích cực tới khả năng nhanh nhanh chồi lan Hài Trần liên.

Từ CT2 đến CT5 tương ứng với bổ sung BA ở các nồng độ từ 1,0-5,0 mg/l,

sau 40 ngày nuôi cấy thì tổng số chồi thu được nhiều hơn so với công thức đối chứng

(CT1). Khi sử dụng BA ở nồng độ 3,0 mg/l (CT4) cho tổng chồi thu được cao nhất

(47chồi) với hệ số nhân chồi là 1,56 lần. Ỏ CT2 (nồng độ BA 1,0 mg/l) thu được (21

chồi) cho hình thái chồi tốt (chồi xanh đậm và mập). CT2 và CT4 cho tỷ lệ tái sinh

chồi cao nhất chồi xanh đậm và mập. Khi tăng dần nồng độ BA trong môi trường (0

– 2,0 mg/l) thì tỷ lệ chồi tái sinh tăng đáng kể. Nồng độ BA 4,0 mg/l đối với cây lan

Hài P. Trần liên cho tổng chồi thu được cao nhất đạt 47 chồi. Khi tăng nồng độ BA

lên, tỷ lệ tái sinh có xu hướng giảm dần, điều này có thể giải thích là nồng độ BA

thích hợp kích thích cây sinh trưởng, tuy nhiên khi nồng độ BA tăng cao vượt quá

ngưỡng cần thiết có thể gây ức chế khả năng tạo chồi.

4.3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin

đến khả năng nhân nhanh phôi lan hài Trần Liên

Cũng như BA, Kinetin (6-furfurolaminopurrine) là một chất kích thích

sinh trưởng thực vật thuộc nhóm cytokinin, được sử dụng khá phổ biến trong

nuôi cấy mô- tế bào nhằm kích thích sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ

mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi

phụ. Do vậy, chúng tôi tiến hành đánh giá ảnh hưởng của việc bổ sung kinetin

thí nghiệm sau 12 tuần theo dõi được trình bày trong bảng 4.4

vào môi trường nuôi đến khả năng nhân nhanh cây lan Hài Trần liên. Kết quả

Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với

Kinetin đến khả năng nhân nhanh phôi của lan Hài Trần liên

(sau 6 tuần nuôi cấy).

Kinetin (6-furfurolaminopurrine) là một chất kích thích sinh trưởng thực

vật thuộc nhóm cytokinin, được sử dụng khá phổ biến trong nuôi cấy mô- tế

bào nhằm kích thích sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ

các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ [3].

Chất lượng chồi

Công thức

Nồng độ BA (mg/l)

Nồng độ Kinetin (mg/l)

Tổng phôi nuôi cấy (phôi)

Tổng chồi thu được

Hệ số nhân chồi (lần)

0,0

0,7

CT1

0,5

1,53

CT2

1,0

65 2,17

CT3

Nhỏ,yếu, trắng Mập, xanh nhạt, Xanh khỏe, mập

1,5

1,9

CT4

Xanh nhạt khỏe, mập

0,89

CT5

LSD05 CV(%)

Nhỏ yếu trắng vàng ,

0,16 5,8

hệ số nhân chồi (lần)

2.5

2.17

1.9

1.53

1.5

hệ số nhân (lần)

0.89

0.7

0.5

CT1

CT2

CT3

CT4

CT5

Biểu đồ 4.4. Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ BA

kết hợp với Kinetin

Ở chỉ tiêu hệ số nhân chồi với giá trị LSD05 đạt 0,16, cặp CT2 và CT4 có sự sai

khác không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%, các công thức khác có sự sai khác có

ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%.

Khi bổ sung BA 2,0 mg/l, Kinetin từ 0-2mg/l vào môi trường nuôi cấy ta thấy

có ảnh hưởng tới khả năng nhân nhanh chồi lan . Khi tăng nồng độ Kinetin từ 0-1

mg/l hệ số nhân chồi có xu hướng tăng, cụ thể là hệ số nhân chồi tăng từ 0,7 (CT1)

đến 2,17(CT3). Trong thí nghiệm này nồng độ Kinetin 1,0 mg/l cho tổng số chồi thu

được là 65 chồi và hệ số nhân cao nhất là 2,17 lần. Nồng độ Kinetin từ 1,5 – 2,0 mg/l

thu được tổng số chồi và hệ số nhân giảm dần với CT4, CT5 lần lượt là 57 chồi, 50

chồi tương ứng vợi hệ số nhân là 1,9 ; 0,89 lần.

Chất lượng chồi ở thí nghiệm được đánh giá từ mức kém đến mức tốt. Với CT

đối chứng (Kinetin 0,0 mg/l) cho chất lượng chồi thu được kém. Khi tăng dần nồng

độ Kinetin từ 0,5- 1,0 mg/l thì chất lượng chồi cải thiện từ kém lên tốt, trong thí

nghiệm này CT bổ sung Kinetin từ 1-1,5 mg/l cho chất lượng chồi tốt nhất. Tăng

Từ kết quả nghiên cứu cho thấy :

nồng độ Kinetin từ 1,5-2 mg/l thì chất lượng chồi thấp xuống, chồi thu được chất

lượng trung bình.

Vì vậy ở thí nghiệm này để nhân nhanh chồi lan cần bổ sung 2mg/l BA +

1mg/l Kinetin.

4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetine, TDZ đến khả năng

nhân nhanh giống cây

Bảng 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và

TDZ đến khả năng nhân nhanh giống (sau 30 ngày nuôi cấy)

Tổng số

Hệ số

Nồng độ

Số mẫu

Công

Nồng độ

chồi thu

nhân

Chât lượng

Kinetin

TDZ

nuôi cấy

thức

được

chồi

BA(mg/l)

(mg/l)

(mẫu)

(chồi)

(lần)

Xanh

0,0

1,87

nhạt,mập,

CT 1

khỏe

0,5

2,06 Xanh đậm,gầy

CT 2

Xanh,khỏe,

CT 3

2,0

1,0

2,83

85

mập

Xanh,khỏe,

1,5

2,46

CT 4

mập

Xanh nhạt

2,0

2,16

CT 5

khỏe, mập

0,14

LSD05

4,4

CV (%)

2.83

2.46

2.5

2.16

2.06

1.87

1.5

Hệ số nhân chồi(lân)

0.5

CT 1

CT 2

CT 3

CT 4

CT 5

Biểu đồ 4.5. Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ BA

kết hợp với Kinetin và TDZ

Ở chỉ tiêu hệ số nhân chồi với giá trị LSD05 đạt 0,14, cặp CT2 và CT5 có sự sai

khác không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%, các công thức khác có sự sai khác có

ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%.

Khi bổ sung BA 2,0 mg/l, Kinetin 1,0 mg/l và TDZ từ 0,0-2,0 mg/l vào môi

trường nuôi cấy có ảnh hưởng đến khả năng nhân chồi cây lan hài Trần Liên. Các

công thức có bổ sung TDZ đều cho hệ số nhân chồi cao hơn công thức đối chứng

không bổ sung TDZ (công thức đối chứng có hệ số nhân chồi đạt 1,87 lần). Khi tăng

nồng độ TDZ từ 0,0-1,0 mg/l tổng số chồi thu được và hệ số nhân chồi có xu hướng

tăng lên, cụ thể ở công thức đối chứng TDZ nồng độ 0,0 mg/l cho tổng số chồi thu

được là 56 chồi và hệ số nhân là 1,87 lần., Nồng độ TDZ 1,0 mg/l cho tổng số chồi

thu được là 85 chồi và hệ số nhân cao nhất là 2,83 lần. Nồng độ TDZ từ 1,5- 2,0

mg/l thu được tổng số chồi và hệ số nhân giảm dần với CT4, CT5 lần lượt là 74

chồi, 65 chồi chồi tương ứng với hệ số nhân là 2,46 ; 2,16 lần.

Từ kết quả nghiên cứu cho thấy :

Với CT đối chứng (TDZ 0,0 mg/l) cho chất lượng chồi thu được xanh nhạt,

mập khỏe. Khi tăng dần nồng độ TDZ từ 0,5-1,0 mg/l thì chất lượng chồi cũng cải

thiện từ chồi xanh nhạt, mập, khỏe lên chồi xanh khỏe mập, trog khuôn khổ thí

nghiệm này, CT bổ sung TDZ từ 1-1,5 mg/l cho chất lượng chồi tốt nhất. Tăng

nồng độ TDZ từ 1,5-2,0 mg/l thì chất lượng chồi thấp xuống, chồi thu được

nhỏ,yếu, trắng vàng.

Như vậy TDZ là chất kích thích sinh trưởng có tác dụng kích thích tế bào

phân chia hình thành chồi mới. Ở công thức đối chứng không có TDZ trong môi

trường nuôi cấy nên khả năng tạo chồi thấp hơn các công thức bổ sung TDZ. Ở

CT2 với nồng độ TDZ 0,5 mg/l có tác dụng kích thích phát triển chồi mới nhưng

do nồng độ TDZ thấp nên mẫu ít chịu tác động kích thích phân chia tế bào của

chất này. Ở CT 3 cho hệ số nhân chồi cao nhất là do TDZ 1,0 mg/l kích thích mẫu

sinh trưởng và phát triển tốt nhất, đồng thời tế bào phân chia mạnh mẽ nhất. Khi

nồng độ TDZ tăng dần từ 1,5 – 2,0 mg/l ứng với CT4, CT5 có sự hình thành của

nhiều chồi nhỏ nhưng những chồi này không thể kéo dài hoặc bị biến dạng, nồng

độ TDZ càng cao thì hệ số nhân chồi càng giảm dần.

4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả

năng ra rễ cây lan

4.4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của

cây lan

Ra rễ là khâu cuối cùng của qúa trình nuôi cấy in vitro. Chất kích thích sinh

trưởng được dùng chủ yếu ở giai đoạn này thuộc nhóm auxin. Trong đó, IBA và NAA

là những chất kích thích đượng dùng phổ biến trong nuôi cấy mô nhằm thúc đẩy quá

trình phân bào và kích thích sự hình thành rễ.

Bảng 4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng

ra rễ cây lan hài Trần liên (sau 6 tuần nuôi cấy)

Nồng độ

Số mẫu

Tỷ lệ mẫu

Công thức

NAA

nuôi cấy

ra rễ

Chất lượng rễ

ra rễ (%)

(mg/l)

(mẫu)

Ngắn nhỏ

CT1(Đ/c)

0,0

Ngắn, mập

CT 2

0,5

22 73,33

Ngắn, nhỏ

CT 3

1,0

Ngắn, nhỏ

CT 4

1,5

23,33

Ngắn, nhỏ

CT 5

2,0

6,5

LSD05

8,7

CV(%)

73.33

Tỷ lệ mãu ra rễ (%)

23.33

CT1(Đ/c)

CT 2

CT 3

CT 4

CT 5

Biểu đồ 4.6. Tỷ lệ mẫu ra rễ lan chịu ảnh hưởng của nồng độ NAA

Từ kết quả nghiên cứu cho thấy :

Với giá trị LSD.05 đạt 6,5 các công thức khác nhau có sự sai khác có ý nghĩa ở mức

độ tin cậy 95%. Tỷ lệ mẫu ra rễ cao nhất đạt được ở CT 2 là 73,33%, chất lượng

rễ thu được ngắn, mập. Tiếp theo là CT3 đạt 60%, CT4 đạt 40%, CT5 đạt

23,33%, rễ thu được ngắn, nhỏ. Kết quả trên được giả thích như sau: NAA có

dụng kích thích chồi tạo rễ. Ở CT đối chứng (CT1) vì không bổ sung NAA nên

số mẫu tạỏ ra thấp và ít rễ. Nồng độ NAA 0,5 mg/l (CT2) cho nhiều cây ra rễ

và có số rễ lớn nhất là do NAA ở nồng độ này có tác dụng kích thích chồi lan

ra rễ mạnh nhất đồng thời tạo điều kiện cho cây sinh trưởng và phát triển tốt

nhất. Ở CT3, CT4, CT5, nồng độ NAA lần lượt là 1,0 mg/l, 1,5 mg/l, 2,0 mg/l

cho thấy tỷ lệ ra rễ và số rễ giảm dần, bởi vì NAA ở nồng độ cao gây ức chế

chồi phát triển, chồi yếu nên số lượng rễ hình thành cũng giảm, rễ sinh ra dài

và nhỏ.

4.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả

năng ra rễ của cây lan hài Trần liên

Than hoạt tính là một hợp chất vô cơ thường được sử dụng trong giai

đoạn ra rễ trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. THT có vai trò là tạo điều kiện

tối cho môi trường nuôi cấy, hấp thụ các chất độc và các chất ức chế sinh trưởng

thực vật. Ngoài ra, THT còn có khả năng làm giảm hiện tượng thuỷ tinh thể ở

một số loài thực vật. Để số mẫu nuôi cấy có thể ra nhiều rễ với chất lượng rễ

tốt, trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng nồng độ NAA 0,4 mg/l thích hợp

nhất cho quá trình ra rễ kết hợp với THT ở các hàm lượng khác nhau để thử

nghiệm khả năng ra rễ của cây lan .

Bảng 4.7 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt

tính đến khả năng ra rễ cây lan hài Trần liên (sau 6 tuổi nuôi cấy)

Nồng độ THT (g/l)

Tỷ lệ mẫu ra rễ (%)

Chất lượng rễ

Công thức

Nồng độ NAA (mg/l)

Số mẫu nuôi cấy (mẫu) 30

73,33

Ngắn, mập

CT 1

0,0

Tổng số chồi ra rễ (chồi) 20

CT 2

0,5

Ngắn mập

0,5

CT 3

1,0

Dài mập

90

CT 4

1,5

86,67

Dài nhỏ

CT 5

2,0

Dài nhỏ

5,5

LSD05

CV (%)

6,2

100

86.67

73.33

Tỷ lệ mẫu ra rễ (%)

CT 1

CT 2

CT 3

CT 4

CT 5

Biểu đồ 4.7. Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ NAA

kết hợp với than hoạt tính

Từ kết quả nghiên cứu cho thấy :

Ở chỉ tiêu số lượng rễ: Với giá trị LSD05 đạt 5,5% các công thức thí nghiệm có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Số lượng rễ thấp nhất ở công thức đối chứng với 20 rễ, số lượng rễ cao nhất khi bổ sung THT 1,0 g/l (CT3) với 27 rễ. Khi tăng dần hàm lượng THT thì đồng thời số lượng rễ giảm

dần xuống. Nguyên nhân là do THT 1 g/l tạo điều kiện cho cây sinh trưởng tốt nhất nên tạo nhiều rễ nhất, tuy nhiên hàm lượng THT tăng cao vượt quá ngưỡng cần thiết sẽ ức chế cây sinh trưởng và phát triển nên số lượng rễ sinh ra thấp. Tỷ lệ cây ra rễ với giá trị LSD05 đạt 5,, Cặp CT2 và CT5 có sự sai khác không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%, các công thức khác trong thí nghiệm đều có sự sai khác nhau có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Các công thức có bổ sung than hoạt tính đều có tỷ lệ mẫu ra rễ cao hơn công thức đối chứng không bổ sung than hoạt tính (CT 1). Ở CT3 với hàm lượng than hoạt tính 1,0 g/l cho tỷ lệ mẫu rễ cao nhất là 90%. Tăng dần hàm lượng than hoạt tính từ 1,5 – 2,0 g/l tương ứng với CT4, CT5 thì tỷ lệ mẫu ra rễ có xu hướng giảm dần.

Ở chỉ tiêu chất lượng rễ: Các CT1, CT2, CT5 cho chất lượng rễ ngắn, mập. Ở CT3 và CT4 tương ứng với hàm lượng than hoạt tính 1,0 ; 1,5 g/l cho rễ dài và mập.

Ở công thức đối chứng không bổ sung than hoạt tính có số mẫu ra rễ ít nhất. Ở các công thức có bổ sung than hoạt tính, hàm lượng than hoạt tính tăng thì khả năng ra rễ cùa cây cũng tăng, số lượng rễ tăng. THT 0,5 g/l (CT2) tạo điều kiện tối kích thích chồi ra rễ nhiều hơn CT1 (công thức Đ/c). Ở CT3 môi trường nuôi cấy có THT 1,0 g/l, ở hàm lượng này, THT thúc đẩy cây ra rễ nhanh và mạnh nhất. Tuy nhiên khi tăng dần hàm lượng THT lên 1,5 g/l (CT4) và 2 g/l (CT5) thì ánh sáng không thể chiếu tới rễ mọc trong các bình nuôi cấy nên sẽ hạn chế sự phát triển của rễ, đồng thời THT ở hàm lượng cao sẽ ngăn cản quá trình trao đổi chất của chồi nên cũng hạn chế sự hình thành rễ của chồi. 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới khả năng sinh trưởng và phát triển của lan

Đưa cây ra ngoài vườn ươm là giai đoạn quan trọng bao gồm việc tạo rễ, huấn luyện thích nghi với điều kiện thay đổi của nhiệt độ, độ ẩm, sự mất nước, sâu bệnh và chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng hoàn toàn. Việc lựa chọn giá thể phù hợp để ra cây ngoài vườn ươm là một khâu phải thực hiện tỉ mỉ và thận trọng. Giá thể phù hợp là giá thể cho tỉ lệ cây sống cao, cây sinh

trưởng, phát triển tốt.Vì vậy, thành công của giai đoạn này có ý nghĩa quan trọng quyết định tới hiệu quả nhân giống

Để nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới khả năng sinh trưởng và phát triển của lan , chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên trên các loại giá thể khác nhau: sơ dừa, dớn, đất, than, vỏ thông. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.8:

Bảng 4.8. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới khả năng sinh

trưởng và phát triển của lan Trần liên

Loại giá thể Công thức (CT) Số cây ra (cây) Số cây sống (cây) Số cây chết (cây) Tỷ lệ cây chết (%)

Đất Than Sơ dừa Dớn

7 28 21 16 13 30 30 30 30 30 CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 CT5 Vỏ thông

CT 1

CT 2

CT 3

CT 4

CT5

Tỷ lệ cây sống (%)

Tỷ lệ cây sống (%) 7 28 16 21 13 Chiều cao cây (cm) 4 5 5,5 4 4 23,33 70 93,33 53,33 43,33 7,5 9,1 18 2 4 7 17 LSD05 CV%

Biểu đồ 4.8. Tỷ lệ sống lan ảnh hưởng của giá thể

Bảng kết quả ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sinh trưởng và phát

triển của cây con: Với giá trị LSD05 đạt 7,5% các công thức thí nghiệm có sự

sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%.

Giá thể sơ dừa cho tỷ lệ cây sống đạt 93,33%, chiều cao cây là 5,5 cm;

các giá thể còn lại cho tỷ lệ cây sống là 53,33%, 43,33%, 70%, 23,33%;

chiều cao cây đạt 4 cm.. từ đó thấy giá thể sơ dừa ảnh hưởng đến tỉ lệ sống,

sinh trưởng và phát triển của cây con in vitro ngoài vườn ươm thì chỉ tiêu tỷ lệ

cây sống là quan trọng nhất.

Phần 5

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.1. Kết luận

Sau một thời gian nghiên cứu và thử nghiệm nuôi cấy lan hài Trần Liên.

Trong khuôn khổ thí nghiệm chúng tôi đưa ra một số kết quả sau:

- Dung dịch H2O2 25%, thời gian ngâm mẫu 15 phút cho tỷ lệ mẫu sống

không nhiễm đạt cao nhất là 65,55%.

- Môi trường tốt nhất cho tái sinh phôi lan là môi trường MS với tỷ lệ tái

sinh là 66,67%.

- Hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng tốt nhất cho giai đoạn nhân

nhanh chồi lan hài Trần Liên là: 2,0 mg/l BA + 1,0 mg/l Kinetin+1,0mg/l TDZ

bổ sung vào môi trường nuôi cấy cho hệ số nhân đạt 2,83 lần.

- Hàm lượng NAA và THT tốt nhất cho giai đoạn ra rễ là 0,5mg/l NAA+

1g/l THT tỷ lệ ra rễ là 90%, chất lượng rễ dài và mập.

- Gíá thể thích hợp nhất để đưa ra vườn ươm là giá thể sơ dưà 93,33% với

chiều cao cây là 5,5cm.

5.2. Kiến nghị

- Tiếp tục nghiên cứu hợp chất hữu cơ và hàm lượng đường, agar và một

số thành phần khác đến khả năng tái sinh, nhân nhanh lan

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I Tài liệu tiếng việt

1. Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc, Nguyễn Tiến Hiệp(2008), Lan Hài

Việt Nam, Nxb Giao thông Vận tải TP Hồ Chí Minh.

2. Nguyễn Công Nghiệp (2006), Trồng hoa lan, Nxb Trẻ.

3. Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu và ứng

dụng, Nxb Nông nghiệp.

4. Nguyễn Tiến Hiệp, Phan Kế Lộc và Averyanov L. V. (1999),”Một vài số liệu

mới về loài Pinopsida ở dải Bắc Trường Sơn, Hội thảo về đa dạng sinh học

phía Bắc Trường Sơn, Đại học Quốc gia Hài Nội, trang 104-108.

5. Phan Kế Lộc, Averyanov L. V., Nguyễn Tiến Hiệp và Nguyễn Quốc

Bình,(1999),”Số liệu mới về hệ thực vật trong khu vực Ngọc Lĩnh và các vùng

lân cận ở huyện Đắk Glei, tỉnh Kon Tum”, Tạp chí Lâm nghiệp Việt Nam (Hà

Nội), số 12, trang 35-37.

6. Phan Kế Lộc, Nguyễn Tiến Hiệp và Averyanov L. V. (1999a), “Một số loài và

quần xã thực vật bị đe doạ trong dãy núi đá vôi của tỉnh Cao Bằng cần được

bảo vệ trong khu bảo tồn mới được đề xuất”, Tạp chí Lâm nghiệp Việt Nam

(Hà Nội), số 12, trang 35-36.

II. Dịch từ tiếng nước ngoài

7. Bubeck S.K. (1973), A suty of Paphiopedilum meristem culture. Ph.D Thesis,

Rutgers University Microfilm International, Ann Arbor, Mivhigan, The USA,

p.109.

8. Chen T. Y., Chen J. T., Chang W. C. (2002), “Multiple shoot formation and

plant regeneration from stem nodal explants of Paphiopedilum orchids”, In

vitro Cell, Dev. Biol. Plant 38, p. 595-597.

III. Tiếng Anh

9. Chen T. Y., Chen J. T., Chang W. C. (2004), “Plant regeneration through direct

shoot bud formation from leaf culture of Paphiopedilum orchids”, Plant Cell,

Tissue and Organ Culture 76, p. 11-15.

10. Hong P. I., Chen J. T., Chang W. C. (2008), “ Plant regeneration via

protocorm-like body formation and shoot multiplication from seed-derived

callus of a maudiae type slipper orchid”, Acta Physiol. Pant 30, p. 755-759

11. Huang L. C. (1988), “A procedure for asexual multiplication of Paphiopedilum

in vtro, American Orchid Society Bulletin 57, p. 274-278.

12. Huang L. C., Lin C. J., Kou C. I., Huang B. L., Murashige T. (2001),

“Paphiopedilum cloning in vitro”, Scientia Horticulturae 91, p. 111-121.

13. Koopowitz H., Hasegawa N. (1987), “An introduction to slipper orchids, in

Koopowitz H., Hasegawa N (Eds), Novelty slipper orchids, breeding and

cultivating Paphiopedilum hybirds”, Harper & Colloins publisher, Inc, New

York, the USA, p. 19-31.

14. Liao Y. J., Tsai Y. C., Sun Y. W., Lin R. S., Wu F. S. (2011), “In vitro shoot

induction and plant regeneration from flower buds in Paphiopedilum orchids”,

In vitro Cell, Dev. Biol. plant 47, p 702-709.

15. Lin Y.H., Chang c., Chang W.C. (2000), “Plant regeneration from callus

culture of a Paphiopedilum hybird”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 62,

P.21-25.

16. Nieman D. (1980), “Plantlet formation of Paphiopedilum flower stem”,

American Orchid Society Bulletin 49, p. 372-373.

17. Nhut D. T, Thuy D. T. T., Don N. T., Luan V. Q., Hai N. T., Tran Thanh Van

K., Chinnappa C. C. (2007), “In vitro stem elongation of Paphiopedilum

delenatiii Guillaumin and shoot regeneration via stem node culture”,

Propagation of Ornamental Plants 7, p. 29-36.

18. Nhut D. T, Thuy D. T. T., Luan V. Q., Don N. T., Khiem D. V., Tran Thanh

Van K. (2005), “ Micropropagation of Paphiopedilum delenatii via stem node

culture”, Vietnam – Korea International Symposium, Bio-Technology & Bio-

System Engineering, p. 184-190.

19. Nhut D. T., Trang P. T. T., Vu N. H., Thuy D. T. T., Khiem D. V., Binh N. V.,

Tran Thanh Van K. (2005), “ A wounding method and liquid culture in

Paphiopedilum delenatiii propagation”, Propagation of Ornamental Plants

5(3), p.156-161.

20. Sampolinski J. (1983), “Formation of plantlets on Paphiopedilum flower

stem”, Orchid Review 91, p. 229.

21. Stewart J., Button J. (1975), “Tissue culture studies in Paphiopedilum”,

American Orchid Society Bulletin 44, p. 591-599.

22. Van Staden J, stewart J (1975), “Cytokinins in banana fruit”, Zpflanzenphysiol,

76: 280-283

23. phụ lục 1 của công ước CITES và danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quý hiếm (nhóm 1) của Nghị định số 32/2006/NĐ –CP ngày 30/3/2006.

PHỤ LỤC 1

MỘT SỐ HÌNH ẢNH VỀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG LAN

HÀI TRẦN LIÊN (paphiopedilum tranlienuanum) BẰNG PHƯƠNG PHÁP

IN VITRO

Hình ảnh tạo vật liệu vô trùng

Hình ảnh tái sinh phôi lan sau 6 tuần nuôi cấy

Ảnh nhân nhanh chồi lan hài Trần Liên sau 6 tuần nuôi cấy

Ảnh ra rễ lan hài Trần liên sau 6 tuần nuôi cấy

Cây lan Hài Trần Liên

PHỤ LỤC 2: MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

Bảng 1: Môi trường MS

Amount to

Final

Stock

take

Bottle

Component

Solution

concentratic

preparation

(mg/l)

(g/l)

(ml)

1.650,0

82,5

NH4NO3

I

1.900,0

KNO3

370,0

MgSO4.7H2O

2,23

22,3

MnSO4.4H2O

II

1,058

10,6

ZnSO4.7H2O

0,0025

0,025

CuSO4.5H2O

440,0

CaCl2.2H2O

0,083

0,83

III

0,0025

0,025

CoCl2.6H2O

170,0

KH2PO4

0,62

6,2

H3BO4

IV

0,025

0,25

Na2MoO4.2H2O

2,784

27,85

FeSO4.7H2O

V

3,724

37,25

Na2EDTA.2H2O

mg/100ml

100

Nicotinic acid

0,5

100

Glycine

2,0

Vitamin

100

Thiamine acid

0,1

100

Pyridocine HCl

0,5

30.0000,0

Sucrose

5.500,0

Agar

5,6-5,8

pH

Bảng 2: Thành phần cơ bản của môi trường B5 (Gamborg cs, 1976)

Muối khoáng Nồng dộ (mg/l)

134 (NH4)2SO4

150 CaCl2.2H2O

246 MgSO4.7H2O

2.258 KNO3

Đa lượng 10 MnSO4.2H2O

KI 0.75

0.25 Na2MoO4.2H2O

150 Na2H2PO4.2H2O

2.0 ZnSO4.7H2O

37.2 Na2EDTA.2H2O

3 H3BO3

0.025 CoCl2.6H2O Vi lượng

0.025 CuSO4.5H2O

27.8 FeSO4.7H2O

Myo- inositol 100

Nicotinic acid 1

Pyrodoxine HCl 1

Các chất hữu cơ

Thiamine Đường 10 30

Bảng 3: Thành phần cơ bản của môi trường WPM (Woody Plant

Medium Lioyd và Mc Cown, 1980)

Muối khoáng Nồng độ (mg/l)

0.25 CuSO4.5H2O

37.2 Na2EDTA.2H2O Vi lượng 6.20 H3BO3

22.30 MnSO4.H2O

27.8 FeSO4.7H2O

ZnSO4.7H2O 8.6

96 CaCl2.2H2O

556 Ca(NO3)2.4H2O

170 KH2PO4 Đa lượng

990 K2SO4

370 MgSO4.7H2O

400 NH4NO3

0.25 NaMoO4.2H2O

Myo – inositol 100

Pyridoxine HCl 0.5

Glycine 2.0 Các chất hữa cơ

Nicotinic acid 0.5

Thiamine HCl 1.0

Agar 6

Đường 30

Khóa luận tốt nghiệp đại học: Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) bằng phương pháp in vitro

Chủ đề:

Đồ án môn kỹ thuật y sinh

(Paphiopedilum tranlienianum) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Lớp

: K48 - CNSH

Khoa

: CNSH – CNTP

Khoá học

: 2015 – 2020

Giảng viên HD

: ThS. Nguyễn Thị Tình

Thái Nguyên, năm 2020

Công Thức(CT)

Giá thể

Chỉ tiêu đánh giá

Công thức

Nồng độ (%)

Thời gian (phút)

Số mẫu đưa vào (mẫu)

Tỷ lệ mẫu chết (%)

Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%)

Tỷ lệ mẫu sống nhiễm (%)

CT1(Đ/c)

CT2

CT3

Chỉ tiêu đánh giá

Công thức

Nồng độ (%)

Thời gian (phút)

Số mẫu đưa vào (mẫu)

Tỷ lệ mẫu chết (%)

Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%) 41,00

Tỷ lệ mẫu sống nhiễm (%) 38,89

CT4

CT5

CT6

CT7

59,96

CT8

CT9

CT10

5,8

LSD05

7,9

CV (%)

4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh

phôi lan Hài Trần Liên

Tỷ lệ tái sinh (%)

Tổng số

Tổng

Hệ số nhân

Nồng độ BA

chồi tạo

CT

mẫu cấy

Chất lượng chồi

chồi

(mg/l)

thành

(mẫu)

(lần)

(chồi)

1

2

3

1,8

30

4

5

0,12

LSD05

CV(%)

8,7

Biểu đồ 4.3. Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ BA