Khóa luận tốt nghiệp đại học: Nghiên cứu khả năng nhân giống lan hài Vân Nam (Paphiopedilum callosum) từ phôi bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ----------o0o---------

NGUYỄN THỊ THU HẰNG

Tên đề tài:

“NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN GIỐNG LAN HÀI VÂN NAM

(Paphiopedilum callosum) TỪ PHÔI BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY

IN VITRO”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Khoa

: CNSH - CNTP

Khoá học

: 2015 - 2020

Thái Nguyên, năm 2020

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ----------o0o---------

NGUYỄN THỊ THU HẰNG

Tên đề tài

“NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN GIỐNG LAN HÀI VÂN NAM

(Paphiopedilum callosum) TỪ PHÔI BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY

IN VITRO”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Lớp : K47 CNSH

Khoa

: CNSH - CNTP

Khoá học

: 2015 - 2019

Giảng viên hướng dẫn: ThS. Nguyễn Thị Tình

Thái Nguyên, năm 2020

LỜI CẢM ƠN

Được sự đồng ý của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công

nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, trong thời gian thực tập tốt nghiệp em đã

thực hiện đề tài:“Nghiên cứu khả năng nhân giống lan hài Vân Nam

(Paphiopedilum callosum) từ phôi bằng kỹ thuật nuôi cấy invitro”.

Trang đầu tiên của khoá luận này em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu nhà

trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm cùng các

thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên

cứu này.

Đặc biệt, em xin cám ơn ThS. Nguyễn Thị Tình đã giúp đỡ và tạo điều kiện

tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp.

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất và luôn là chỗ

dựa tinh thần cho em trong suốt thời gian thực tập, cảm ơn bạn bè đã hết lòng động

viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.

Trong quá trình thực tập, cũng như là quá trình làm báo cáo thực tập thời gian

có hạn không tránh khỏi những sai sót. Em rất mong nhận được những ý kiến đóng

góp của thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn.

Lời cuối em xin kính chúc các thầy, cô giáo trong nhà trường, trong khoa Công

nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm, cùng các bạn đồng nghiệp sức khoẻ, thành

công trong cuộc sống.

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2020

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Thu Hằng

Bảng 3.1. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu .......................................................... 21

Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân

nhanh chồi từ phôi lan hài Vân Nam (sau 40 ngày nuôi cấy) .... 28

Bảng 4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả năng

nhân nhanh chồi của cây lan hài Vân Nam ................................ 30

Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ

đến khả năng nhân nhanh giống lan hài Vân Nam (sau 30 ngày

nuôi cấy) ...................................................................................... 33

Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ

cây lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) ............................. 36

Bảng 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến

khả năng ra rễ cây lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) ............ 38

DANH MỤC BẢNG

iii

Hình 2.1. Hình ảnh về cây lan hài Vân Nam (Paphiopedilum callosum) ...... 10

Hình 3.1. Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng

đến khả năng tái sinh, nhân nhanh chồi từ phôi và ra rễ của cây lan

hài Vân Nam ................................................................................... 23

Hình 4.1. Hình ảnh ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi

lan hài Vân Nam (sau 40 ngày nuôi cấy) ........................................ 30

Hình 4.2. Hình ảnh BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi của

cây lan hài Vân Nam ....................................................................... 32

Hình 4.3. Hình ảnh ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả

năng nhân nhanh giống lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) . 35

Hình 4.4. Hình ảnh rễ bị ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ cây

lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) ........................................ 37

Hình 4.5. Hình ảnh rễ bị ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến

khả năng ra rễ cây lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) ......... 40

DANH MỤC HÌNH

Biểu đồ 4.1. Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài

Vân Nam (sau 40 ngày nuôi cấy) .................................................... 28

Biểu đồ 4.2. BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi của cây lan

hài Vân Nam ................................................................................... 31

Biểu đồ 4.3. Ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả năng

nhân nhanh giống lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) .......... 33

Biểu đồ 4.4. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ cây lan hài Vân

Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) ........................................................... 36

Biểu đồ 4.5. Ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả năng ra

rễ cây lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy) ............................. 39

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i

DANH MỤC BẢNG ......................................................................................... ii

DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... iii

DANH MỤC BIỂU ĐỒ ................................................................................... iv

MỤC LỤC ......................................................................................................... v

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................... viii

MỤC LỤC

Phần 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................ 1

1.1.Đặt vấn đề .................................................................................................... 1

1.2. Mục tiêu của đề tài ..................................................................................... 1

1.3. Yêu cầu của đề tài ...................................................................................... 2

1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn.................................................................... 2

1.4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài .................................................................... 2

1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài ..................................................................... 2

Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 3

2.1. Tổng quan về lan Hài (Paphiopedilum) ..................................................... 3

2.1.1. Phân loại và nguồn gốc ........................................................................... 3

2.1.2. Đặc điểm hình thái .................................................................................. 4

2.1.3. Sinh thái................................................................................................... 5

2.1.4. Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam ............................................................ 6

2.2. Giới thiệu về giống lan hài Vân Nam ........................................................ 8

2.2.1. Nguồn gốc và sự phân bố ........................................................................ 8

2.2.2. Hình thái .................................................................................................. 8

2.2.3. Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng giống lan hài Vân Nam ................ 10

2.3. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật ..................................... 12

2.3.1. Sự phân hoá tế bào ................................................................................ 12

2.3.2. Sự phản phân hoá tế bào ....................................................................... 12

2.3.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật ... 12

2.3.4. Môi trường dinh dưỡng ......................................................................... 13

2.4. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài trên thế giới và trong nước ...... 17

2.4.1. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài trên thế giới ................. 17

2.4.2. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài trong nước ................... 19

Phần 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 21

3.1. Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu .................................................. 21

3.1.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu .............................................................. 21

3.1.2. Hoá chất sử dụng ................................................................................... 21

3.1.3. Thiết bị,dụng cụ nghiên cứu.................................................................. 21

3.2. Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu .............................................. 22

3.2.1. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................... 22

3.2.2. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 22

3.2.2. Thời gian nghiên cứu ............................................................................ 22

3.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 22

3.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetin, TDZ đến

khả năng nhân nhanh chồi lan hài Vân Nam .................................................. 22

3.3.2. Nội dung 2: Xác định môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan hài Vân Nam. ... 22

3.4. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 22

3.4.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy mô ........................................................ 22

3.4.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 23

3.4.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm .............................................................. 23

3.5. Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu .................................................... 26

3.5.1. Thu thập số liệu ..................................................................................... 26

3.5.2. Các chỉ tiêu theo dõi .............................................................................. 26

3.5.3. Phương pháp sử lý số liệu ..................................................................... 27

vii

Phần 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................. 28

4.1. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetin, TDZ đến khả năng nhân

nhanh chồi từ phôi lan hài Vân Nam. ............................................................. 28

4.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh

chồi lan hài Vân Nam (sau 40 ngày nuôi cấy) ................................................ 28

4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả năng

nhân nhanh giống lan hài Vân Nam ................................................................ 30

4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến

khả năng nhân nhanh giống lan hài Vân Nam ................................................ 32

4.4. Kết quả nghiên cứu môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan hài Vân Nam.

......................................................................................................................... 35

4.4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của

cây lan hài Vân Nam ....................................................................................... 35

4.4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến

khả năng nhân nhanh cây lan hài Vân Nam .................................................... 38

Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 41

5.1. Kết luận .................................................................................................... 41

5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 41

TÀI LIỆU THAM KHẢ0 ............................................................................. 42

PHỤ LỤC

viii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

: Thidiazol TDZ

: 6-Benzyl amino purine BA

: Cộng sự CS

: Công thức CT

: Coeficient of Variation CV

: Đối chứng Đ/C

: 6-Furfurylaminopurine Kinetin

: Least Singnificant Difference Test LSD

: Murashighe và Skoog, 1962 MS

: Môi trường MT

: α-Napthalene acetic acid NAA

P. malipoens : Paphiopedilum malipones

THT : Than hoạt tính

TN : Thí nghiệm

RE : Robert Ernst

Phần 1

MỞ ĐẦU

1.1.Đặt vấn đề

Lan Hài thuộc họ lan Orchidaceae, là một trong những họ lớn nhất và cũng

mang lại nhiều giá trị kinh tế, khoa học trong ngành thực vật hạt kín. Hài Vân Nam

(Paphiopedilum callosum) là một trong những loài lan đặc hữu quý hiếm của Việt

Nam. Đặc điểm của giống lan này là cánh hoa hình trứng hơi nhọn, có lông tơ trắng

ở gốc, lông nhung ở mặt trong. Hoa có mùi thơm ngọt dịu, lá đài và cánh hoa có màu

xanh táo, có đốm và sọc tím-hồng. Cánh môi nằm ngang, màu xanh nhạt có đốm tím

hồng ở mặt trong, hình túi sâu nhìn như chiếc hài [5].

Hiện nay, trong quá trình phát triển kinh tế xã hội có nhiều loài lan quý hiếm

đang bị đe doạ tuyệt chủng. Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật việc ứng

dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống đã trở nên phổ biến. Nuôi cấy

mô tạo ra những giống cây trồng sạch bệnh, chất lượng tốt, đồng đều cao và hệ số

nhân lớn trong thời gian ngắn. Đồng thời góp phần giảm tốc độ tuyệt chủng của chúng

trong tự nhiên rất cần những nghiên cứu một cách có hệ thống [6].

Việt Nam là một quốc gia có trữ lượng hoa lan và các loài lan đặc hữu vào bậc

nhất thế giới. Tuy nhiên hiện nay rất nhiều loài đã không còn xuất hiện ngoài tự nhiên

nếu Việt Nam không có chính sách bảo tồn nhanh các loài thực vật bản địa, các loài

hoang dã thì tương lai rất gần Việt Nam sẽ mất hẳn những nguồn vật liệu quý [5].

Xuất phát từ cơ sở khoa học và yêu cầu thực tế khách quan trên, chúng tôi tiến

hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng nhân giống lan hài Vân Nam

(Paphiopedilum callosum) từ phôi bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro”.

1.2. Mục tiêu của đề tài

- Nghiên cứu khả năng ra rễ được loài lan hài Vân Nam có giá trị từ phôi bằng

phương pháp nuôi cấy mô.

1.3. Yêu cầu của đề tài

- Xác định được môi trường nhân nhanh lan hài Vân Nam tái sinh chồi từ quả.

- Xác định môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh cho lan hài Vân Nam.

1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1.4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài

- Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học và bổ sung vào

kiến thức lý thuyết được học thông qua hoạt động thực tiễn.

- Giúp bản thân sinh viên học hỏi kiến thức, tích lũy được kinh nghiệm thực tế cũng

như tác phong làm việc, nghiên cứu khoa học phục vụ cho cho công tác sau này.

- Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dữ liệu khoa học mới về nhân

giống lan hài Vân Nam bằng phương pháp nuôi cấy mô, góp phần làm phong phú cơ

sở dữ liệu về kỹ thuật nuôi cấy mô.

1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

- Đề xuất được quy trình nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô, tạo ra số

lượng giống lan hài Vân Nam góp phần bảo tồn giống đồng thời tạo nguồn vật liệu

cho nghiên cứu khoa học.

Phần 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Tổng quan về lan Hài (Paphiopedilum)

2.1.1. Phân loại và nguồn gốc

2.1.1.1. Phân loại

Chi lan Paphiopedilum gồm khoảng 80 loài lan, nguồn gốc tại vùng Ấn-Mã

Lai (Nam Trung Hoa, Đông Nam Á, hải đảo Thái Bình Dương...), Ấn độ. Việt Nam

có nhiều loài được xem là đặc hữu, nổi tiếng khắp thế giới. Các nhà nghiên cứu về

lan, dựa theo hình dạng của cánh hoa, còn chia Paphiopedilum thành năm chi phụ, và

sau đó từ các chi phụ còn chia thêm thành những nhóm khác nhau. chúng có thể dễ

dàng nhận ra bởi cấu trúc hoa khác thường với một cánh hoa hình túi sâu trông giống

một chiếc hài nằm vị trí thấp nhất của hoa, tạo nên một vẻ bề ngoài rất đặc sắc. Và

do vậy, “Hài” trở thành tên chung của nhóm lan này.

Về mặt thực vật học, các loài lan Hài thuộc vào 5 chi là:

- Chi Cypripedium có khoảng 50 loài, thường được gọi là hài Vệ nữ, phân bố ở

các vùng ôn đới và núi của bán cầu bắc.

- Chi Mexipedium, chi Phragmipedium và chi Selenipedium gồm khoảng 25 loài

phân bố ở vùng nhiệt đới châu Mĩ.

- Chi Paphiopedilum có khoảng 75 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á từ

Nam Ấn Độ và Đông Hymalaya đến Philippine, New Guinea và Quần đảo Solomon.

Ở Việt Nam các loài lan Hài đều thuộc chi Paphipedilum, thuộc tông

Cypripedioideae, họ phụ Epidendroideae, họ lan (Orchidaceae), bộ lan (Orchidales),

phân lớp hành (Liliidae), lớp một lá mầm (Monocotyledoneae), ngành hạt kín

(Angiospermatophyta), giới thực vật (Plantae) [1],[9].

2.1.1.2. Nguồn gốc

Chi Paphiopedilum có nguồn gốc từ vùng lục địa Đông Nam Á, trong đó có

Việt Nam. Các loài nguyên thuỷ nhất của chi này được tìm thấy chủ yếu ở Trung

Quốc và Bắc Việt Nam, mỗi loại trong chi này đều có khu phân bố rất hạn chế.

Hầu như tất cả các loài lan đều bắt nguồn từ các tổ tiên kiểu hypoxis có sáu

mảnh bao hoa (ba mảnh bao vòng ngoài gọi là ba lá đài và ba mảnh bao vòng trong

gọi là ba cánh hoa) và sáu nhị đực (ba nhị đực ở vòng ngoài và ba nhị đực ở vòng

trong). Xu hướng tiến hoá của họ Lan là giảm số lượng nhị đực và sự dính liền giữa

nhị đực hữu thụ với nhị cái là sự biến đổi hoa cơ bản nhất dẫn đến sự tiến hoá của họ

Lan. Sự giảm liên tục số lượng nhị đực dẫn đến sự hình thành các nhóm lan có ba,

hai hay một nhị đực tồn tại trong hoa. Trong họ Lan, chi lan Hài (thuộc tông

Cypripedioideae) là dòng tiến hoá có hai nhị đực còn tồn tại trong hoa [1].

2.1.2. Đặc điểm hình thái

Lan Hài là nhóm lan đã tách riêng khỏi các dòng lan chính qua tiến trình tiến

hóa, tạo ra những túi nhỏ trên hoa và những túi này đã trở thành đặc điểm riêng cho

nhóm lan hài. Túi hay “hài” là một biến thể của cánh hoa thứ ba. Khi thay đổi hình

dạng, các phần khác của hoa Paphiopedilum cũng biến đổi một cách tương xứng: hai

đài hoa hai bên gần như chập lại và nằm ẩn vào phía sau của chiếc túi. Túi được xem

như một cấu tạo của hoa để giúp sự thụ phấn: côn trùng bị dẫn dụ để đến bám vào bờ

túi, mất thăng bằng và rơi vào bên trong túi. Bên trong túi có những lông nhỏ sắp xếp

kiểu bậc thang, côn trùng sẽ ra khỏi hoa theo hai cạnh của túi và trụ, mang theo phấn

hoa trên người [1].

Các loài lan Hài (Paphiopedilum) ở Việt Nam có thể có hình dạng bên ngoài rất

đa dạng tuy nhiên chúng đều mang những đặc điểm hình thái:

- Dạng cây: Là các loài thân cỏ có kích thước trung bình với thân mang nhiều

lá mọc thành hai hàng xếp thành hình quạt, đôi khi có dạng thân bò. Tất cả các loài

đều có thân rễ nhưng đa số rất ngắn [1].

- Lá chia thành 2 nhóm: nhóm lá có đốm xanh bạc, xanh trắng hoặc xậm và

nhóm có lá một màu toàn xanh lục không đốm. Sự khác biệt của lá có thể là do điều

kiện nhiệt độ sinh sống của loài lan hài Paphiopedilum có thể là xanh hoặc là lá gấm

(khảm) là loài có lá kết thành hình quạt hoặc lá xuất phát từ các than ngắn của nó. Dù

chúng thuộc loài có kích cấu lá như thế nào, tồn tại trong vài năm; nhưng chúng chỉ

ra hoa một lần. Không có gì trong việc phân biệt là cây non, cây trưởng

thành (đã có chồi mới và đã ra hoa), hoặc những cây đã già ta thấy ngay những

cuống hoa cũ vẫn còn ở trên thân. Lá của loài này được mô tả là loại lá gập đôi hoặc

lá có gân nổi, sống trâu, và được sắp xếp đối xứng sang hai bên trông giống cái quạt.

Độ dài của lá có thể từ 3- 5 cm, lá thường xanh có đốm trắng điếm xuyến [1].

- Cụm hoa: thường thẳng đứng hay cong. Một số loài có cuống hoa nằm ngang,

một số loài lại có cuống hoa chúc xuống, nhưng hầu như các loài đều có cuống hoa

dựng đứng. Phần lớn các loài chỉ có một hoa riêng lẻ. Tuy nhiên cũng có loài có cụm

hoa mang hai hoa, song rất hiếm. Trục cụm hoa có lông tơ dầy và ngắn hay có lông

nhung hoặc nhẵn. Lá hoa của cụm hoa gấp đôi và có hình dạng rất khác nhau tùy từng

loài, từ hình múi giáo hay hình trứng và có chóp nhọn đến hình bầu dục tròn. Lá hoa

thường có ít lông tơ hơn các phần khác của cụm hoa nhưng nói chung thường có lông

ở mép và lông cứng gần giữa ở mặt ngoài lá, ở một số loài có lá hoa nhẵn [1].

- Hoa: mỗi cành chỉ có một đến hai hoa, kích thước bông hoa lớn từ 12-15cm.

Cụm hoa thẳng, dài 20-25 cm. môi hoa hình túi, cánh lung thường có dạng hình tim

ngược đầu có sọc hay đốm. Hai cánh bên phía sau kết hợp liền với nhau. Còn hai

cánh bên phía trước có thể xòe hai bên hay thả xuống. Chúng thường nở vào mùa

đông, thời gian hoa nở rất lâu tàn có thể từ 2-3 tháng [1].

- Nhị: bất thụ của vòng ngoài và nhuỵ cái hợp thành cột nhị- nhuỵ. Hai nhị

đực hữu thụ của vòng trong có chỉ nhị ngắn dính liền ở phía sau núm nhuỵ và

hai bên cuốn cột [7]. Bầu dưới, một ô, đỉnh noãn bên là điểm đặc trưng của chi

này. Hầu hết các loài lan Hài, bầu có lông tơ, hình trụ, màu xanh lá cây hay đỏ

tía xỉn [1].

2.1.3. Sinh thái

Các loài lan Hài ở Việt Nam có thể chia thành hai nhóm riêng. Một nhóm phân bố

ở vùng núi đá vôi phía Bắc Việt Nam từ độ cao mặt nước biển lên đến 1600m, nhóm

còn lại phân bố ở khu vực có đá mẹ silicat, đá phiến và cát kết ở độ cao từ 700-2200m.

Ngoài ra, có một vài cá thể trong nhóm này còn mọc bám ở các khe nứt hay rìa của

các vách núi dựng đứng đá granit.

Lan Hài của Việt Nam có thể sống trên đất, bám đá và phụ sinh mùn. Các loài

sống trên đất thường mọc ở nơi có ít ánh sáng của tán cây rừng, ở nơi sườn núi dốc,

các nền đất có nhiều lá rơi bị phân huỷ mạnh và giàu chất mùn. Các loài lan Hài mọc

trên đá thường mọc dưới bóng cây của kiểu rừng ít khép tán, chủ yếu là các mỏm đá

và ngay bên dưới các đường đỉnh. Các loài phụ sinh mùn chủ yếu sống bám trên vỏ

cây gỗ trong các vùng rừng mây mù ẩm độ cao 1200-1500m.

Tại Việt Nam, lan Hài thường phân bố ở vùng có lượng mưa lớn, ẩm độ cao.

Tuy nhiên do đặc trưng là vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên chúng thường phải trải

qua một giai đoạn khô hạn. Sự xuất hiện lá dày, dai và mọng nước là hướng thích

nghi tốt để cây có thể sống sót được qua đợt khô hạn định kỳ và chúng sẽ nhanh chóng

phục hồi khi mùa mưa trở lại. Độ ẩm xung quanh rễ, kiểu đất và độ pH, sự có mặt

của các nấm rễ, tác nhân thụ phấn và cường độ ánh sáng là các nhân tố quan trọng

trong sự hình thành và phát triển của quần thể lan Hài.

Trong rừng nguyên sinh, lan Hài phân bố đều nhau ở các hướng của sườn núi.

Nhưng trong các vùng rừng đã bị xuống cấp, lan Hài có khuynh hướng phát triển ở

các sườn núi phía Bắc, Đông Bắc và Tây Bắc của núi. Ngày nay, thường chỉ tìm thấy

lan Hài mọc thành từng đám nhỏ. Các nơi sống tự nhiên bị phá huỷ bởi con người, sự

thay đổi các điều kiện môi trường và việc thu hái lan để bán là những nguyên nhân

chính gây ra sự tuyệt chủng nhanh chóng của lan Hài trên khắp các vùng của Việt

Nam [1].

2.1.4. Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam

Lan Hài là chủng họ lan có giá trị thương mại cao nhất, được yêu chuộng, sưu

tầm, tìm kiếm nhiều nhất thế giới. Với sự hiện hữu của hơn 20 loài thuộc chi

Paphiopedilum, Việt Nam là một trong các quốc gia có nguồn lan Hài tự nhiên

phong phú nhất. Không những phong phú về chủng loại, Việt Nam còn có nhiều

loài lan đặc hữu có giá trị thẩm mĩ cao, được thế giới ưa chuộng. Điều này đã tạo

nên tình trạng thu thập và xuất khẩu lan Hài một cách ồ ạt, không kiểm soát, dẫn

đến việc lan Hài ngày càng hiếm trong tự nhiên. Đồng thời với tình trạng môi trường

tự nhiên bị khai thác cạn kiệt như hiện nay, lan Hài càng biến mất nhanh chóng

[1].

Trước tình hình lan Hài cạn kiệt ngoài thiên nhiên, nhiều chương trình quốc gia

về bảo tồn loài hoa quý này đã được triển khai,chủ yếu là thu thập, phân loại, nghiên

cứu về các loài lan Hài và bảo tồn môi trường sống tự nhiên của chúng. Một công

trình hợp tác quốc tế về lĩnh vực này là mô tả các giống lan Hài ở Việt Nam của nhóm

tác giả Leonid Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc và Nguyễn Tiến Hiệp năm

2004 [1].

Một mạng lưới rộng khắp các khu bảo tồn đã được thành lập ở Việt Nam. Đặc

biệt hàng loạt các khu bảo tồn đã đang bảo tồn các loài lan Hài như:

- Khu bảo tồn Ngọc Linh (Kon Tum), Chue Yang Sinh (Đắc Lắc), Núi Bà (Lâm

Đồng) bảo tồn loài P. appletonianum.

- Khu bảo tồn Mom Ray (Kon tum), Thung Đa Nhim (Lâm Đồng) đang bảo tồn

loài P. callosum.

- Vườn Quốc Gia Ba Bể, khu bảo tồn Cát Bà (Hải Phòng), Hữu Liên (Lạng

Sơn), Pà Cò (Hòa Bình), khu bảo tồn Thượng Đa Nhim (Lâm Đồng) đang bảo tồn

P.dalatensis.

- Vườn Quốc Gia Hoàng Liên Sơn (Lào Cai), Phong Quang (Hà Giang),Pà Cò

(Hòa Bình) đang bảo tồn loài P. dianthum, P.micranthum.

- Khu bảo tồn Na Hang (Tuyên Quang) đang bảo tồn loài P. emersoii,

P.hangianum, P. malipoense varijackii.

- Vườn quốc gia Tam Đảo, Hoàng Liên Sơn đang bảo tồn loài P.gratrixianum.

- Khu bảo tồn Trùng Khánh (Cao Bằng) đang bảo tồn loài P. helanae.

- Vườn quốc gia Ba Bể, khu bảo tồn Na Hang, Hữu Liên, Pà Cồ, Phong Nha

đang bảo tồn loài P. malipoense

Bên cạnh đó, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và ứng dụng phương pháp nuôi

cấy mô tế bào thực vật in vitro nhằm nhân nhanh số lượng lớn lan Hài. Đầu tiên phải

kế đến PGS. TS. Dương Tấn Nhựt, người đầu tiên nuôi cấy thành công lan hài Hồng

năm 2005 [27], [28]. Sau đó đã có nhiều nhà nghiên cứu khác đã nuôi cấy

in vitro thành công nhiều loài lan Hài khác như hài Hằng, hài Tam Đảo bằng

các phương pháp nuôi cấy mô khác nhau, Khoa CNSH – CNTP trường Đại học Nông

Lâm Thái Nguyên bước đầu đã thành công nhân giống bằng phương pháp in vitro

một số loài lan Hài như: Hài Vệ Nữ, Hài Hằng, Hài Helen.

2.2. Giới thiệu về giống lan hài Vân Nam

2.2.1. Nguồn gốc và sự phân bố

Năm 1954, hai nhà thực vật học Trung Quốc là S.C. Chen và Z.H. Tsi đã đưa ra

bản mô tả về Paphipedilum callosum dựa trên tiêu bản thực vật do K.M.Feng thu thập

được năm 1947 ở gần Malipo, đông nam tỉnh Vân Nam, sát biên giới Việt Nam. Tiêu

bản gốc được lưu giữ tại phòng Tiêu bản thực vật thuộc Viện Thực vật Bắc Kinh [16],

[17].

Tuy P. callosum được mô tả năm 1954 nhưng chỉ được đưa vào trồng từ năm

1984. Từ đó P. callosum được xuất đi khỏi Trung Quốc và được trồng phổ biến từ

năm 1984.

Mặc dù đã có một lượng lớn được xuất ra khỏi Trung Quốc nhưng trong một

thời gian dài sự phân bố tự nhiên và nơi sống của chúng vẫn chưa được biết rõ ràng.

Ban đầu nó được thu từ những ngọn núi gần thị trấn Malipo. Bên cạnh địa điểm thu

mẫu chuẩn này, quần thể tự nhiên của loài này cũng được quan sát thấy dọc theo ranh

giới nam của cao nguyên đá vôi Quý Châu ở độ cao 800-1100 m, về phía tây của tỉnh

Quảng Tây. Rất nhiều quần thể của loài lan này được phát hiện ở Bắc Việt Nam thông

qua các đợt nghien cứu thực địa năm 1994-1997.

Lan hài P. callosum phân bố ở phía bắc Việt Nam (Sơn La, Hà Giang, Cao

Bằng, Tuyên Quang, Bắc Cạn, Lạng Sơn, Hòa Bình, Thanh Hóa và Quảng Bình).

Trong 3 thứ kể trên thì var.callosum có sự phân bố rộng nhất và gặp từ 450 đến 1450

m, còn 2 thứ kia chỉ mới gặp ở một hai địa điểm của huyện Na Hang, tỉnh Tuyên

Quang, và chỉ ở độ cao 450 – 650 m [1].

2.2.2. Hình thái

- Dạng thân: Thân cỏ mọc trên đất hay đá, có thân rễ ít nhiều kéo dài với đường

kính 2-3,5 mm [III].

- Dạng lá: Lá hình thuôn hay bầu dục hẹp, cỡ dài 10 – 16 cm rộng 2,5 - 5 cm,

dài, ở mặt trên có những khoang màu lục nhạt - lục thẫm xen kẽ nhau, mặt dưới có

nhiều chấm màu nâu – tía, có đốm tím dày và gờ ở mặt dưới của lá, cuống lá dài 2-4

cm, có lông rìa trắng ở mép gốc [III].

- Dạng hoa: Cụm hoa có cuống mảnh và dài đến 30 - 50 cm, có lông, thường

mang 1 hoa ở đỉnh. Hoa có mùi thơm dịu, lá đài và cánh hoa có màu xanh táo, có

đốm và sọc tím-hồng; môi vàng-xám xanh nhạt, có những đốm tím hồng ở mặt trong,

nhị lép trắng tuyền, nâu thẫm hạt dẻ ở nửa trên; cuống hoa và bầu dài khoảng 4 cm,

có lông trắng và mở ở chóp, rộng đến 8 - 12 cm [III].

Lá đài ở gần trục hoa từ hình trứng rộng đến bầu dục, dài 4 – 7 cm, rộng 1,8 -

4,5 cm, có lông tơ trằng lưa thưa ở mặt trong, không có ở bên ngoài [III].

Lá đài kia từ hình trứng rộng đến trứng - mũi mác, dài 3,8 - 5,3 cm, rộng 2,4 -

4,8 cm.

Cánh hoa hình trứng, hơi nhọn, dài 4 – 7 cm, rộng 3,4 - 5 cm, có lông tơ trắng

ở gốc, lông nhung trắng ở mặt trong.

Môi là túi gần hình cầu, to, nằm ngang, hình túi sâu, dài 4,5 - 6,5 cm rộng 3,8 -

5,4 cm, mép cuốn vào trong.

Nhị lép lồi, hình trứng thuôn - rộng, dài 13 – 14 cm, rộng 11 - 13 mm, cụt ở

chóp, gần như không có cuống, có lông mép trắng và lông nhung ở nửa dưới, có gờ

ở lưng, có bướu lồi tròn trên bề mặt ở nửa trên lưng, có bướu lồi tròn trên bề mặt ở

nửa trên.

- Quả: Dạng quả nang dài, 3 gờ, hình trụ, mở ở gần đỉnh bằng 6 rãnh nứt. Quả

chín trong điều kiện tự nhiên sau khi thụ phấn từ 6 đến 10 tháng [III].

- Rễ: Rễ chùm, màu nâu [31].

Hình 2.1. Hình ảnh về cây lan hài Vân Nam (Paphiopedilum callosum)

2.2.3. Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng giống lan hài Vân Nam

2.2.3.1. Nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng

- Nhiệt độ: Lan Hài được phân chia thành 2 nhóm chính, theo quy luật chung,

những cây có lá màu xanh thường thích sống ở nơi có nhiệt đô lạnh đến trung bình,

ban đêm là từ 13-16°C, ban ngày là 18-24°C. Các loài Hài có lá vằn thích hợp với

điều kiện nhiệt từ trung bình đến ấm, ban đêm là 16-18°C, ban ngày là 21-25°C.

- Ánh sáng: Lan Hài không cần ánh sáng mặt trời đầy đủ. Hầu hết lan Hài ưa

ánh sáng yếu, điều kiện ánh sáng nhân tạo cho các loài lan từ 11.000-22.000 lux [21].

Nếu lá bị vàng hoặc phát hoa ngắn chứng tỏ chúng đang dư ánh sáng, nếu lá màu

xanh đậm và mềm hoặc phát hoa dài, yếu, chúng đang thiếu ánh sáng.

- Độ ẩm không khí: Không khí ẩm và lưu thông tốt là rất cần thiết, nhất là trong

mùa hè, giúp giảm thiểu nguy cơ nhiễm nấm bệnh và giữ cho cây không bị khô quá

nhanh. Độ ẩm có thể được nâng lên bằng cách đặt chậu cây lên trên các khay sỏi nhẹ

với 50% độ ẩm là lý tưởng.

2.2.3.2. Nhu cầu bón phân

Phân bón: Có thể bón phân NPK với tỉ lệ 20:20:20 hoặc 14:14:14, bổ sung

khoáng Ca2+ 40mg/l và Mg2+ 20-30mg/l. Tưới nước đậm trước và sau khi bón phân,

nếu thấy đầu lá bị nâu khô thì nên dừng hẳn việc tưới phân. Sang chậu khi giá thể

trồng có dấu hiệu mục nát [7].

2.2.3.3. Giá thể trồng

P. callosum có thể trồng trên giá thể gồm đá vôi trộn thêm chất lá mục, than

củi, xỉ than tổ ong, sỏi, vỏ thông và có thể tưới thêm phân bón 2lần/ tuần trong suốt

mùa sinh trưởng của cây lan [7].

2.2.3.4.Các phương pháp nhân giống vô tính lan hài Vân Nam

- Phương pháp tách chiết thông thường: Lan hài Vân Nam là loài đơn thân nên

chỉ có thể tách chồi non ra khỏi cây mẹ, trồng vào chính giữa chậu mới. Cần cột chặt

cây vào chậu bằng một cây tựa sau đó phun một dung dịch NAA 0,1 ppm và vitamin

B1 và treo cây vào nơi ẩm mát, thoáng. Sau khi cây bén rễ thì bổ sung thêm chất trồng

vào chậu sau đó đặt cây vào nơi có điều kiện ánh sáng thích hợp cho sự phát triển lâu

dài của cây [7].

- Phương pháp cấy mô: Đây là phương pháp duy nhất hiện nay có thể nhân

giống lan Hài trên quy mô công nghiệp, cây con được sản xuất hoàn toàn giống

nhau từ một cây bố mẹ. So với phương pháp tách chiết thông thường có tốc độ phát

triển 1cây/năm thì phương pháp nuôi cấy mô sẽ sản xuất được khoảng 4triệu

cây/năm. Các loài lan Hài thường được nuôi cấy trên môi trường Murashige &

Skoog 1962, Heller, Vacin & Went có bổ sung chất điều hoà sinh trưởng như NAA,

2,4D, BA, TDZ, Kinetin...trong điều kiện vô trùng hoàn toàn. Nhờ tiến bộ khoa học,

ngày nay người ta có thể cấy nhiều bộ phận khác nhau của cây lan để

hình thành các thể giống protocorm như đỉnh sinh trưởng hay chồi bên, cọng

hoa, lá, đốt thân hoặc rễ [7].

2.3. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

Gottlieb Haberlandt (1902) nhà thực vật học người Đức là người đầu tiên khởi

xướng ý tưởng nuôi cấy mô – tế bào thực vật. Ông đưa giả thuyết về tính toàn năng

của tế bào trong cuốn sách “Thực nghiệm về nuôi cấy tế bào tách rời”. Theo ông, mỗi

tế bất kì của cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một

cơ thể hoàn chỉnh [15].Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ

đã phân hoá đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả sinh

vật đó. Khi gặp điều kiện thuận lợi, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể

hoàn chỉnh. Đó là tính toàn năng của tế bào và là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi

cấy mô tế bào thực vật [2].

2.3.1. Sự phân hoá tế bào

Sự sinh trưởng của tế bào gồm hai giai đoạn: Giai đoạn phân chia tế bào và giai

đoạn dãn của tế bào. Trong hai giai đoạn này tế bào chưa có những đặc trưng riêng

về cấu trúc và chức năng . Sau đó các tế bào bắt đầu phân hoá thành các mô chuyên

hoá để đảm nhận các chức năng khác nhau, các tế bào trong giai đoạn này có đặc

trưng riêng về cấu trúc và chức năng. Có thể nói rằng sự phân hoá tế bào là sự chuyển

tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hoá [11].

2.3.2. Sự phản phân hoá tế bào

Sự phản phân hoá tế bào là qua trình ngược lại với sự phân hoá tế bào. Các tế

bào đã phân hoá trong các mô chức năng không mất đi khả năng phân chia của mình,

trong những điều kiện thích hợp, chúng có thể quay lại đóng vai trò như các mô phân

sinh và có khả năng phân chia để tạo ra các tế bào mới [11].

2.3.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.3.3.1. Vật liệu nuôi cấy

Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho nuôi cấy mô tế bào thực

vật. Vật liệu dùng cho nuôi cấy mô – tế bào thực vật có thể là hầu hết các cơ quan

hay bộ phận của cây (chồi ngọn, chồi bên, phiến lá...), các cấu trúc của phôi (lá mầm,

trụ lá mầm...), các cơ quan dự trữ (củ, thân, rễ..) [15].

Tuy mang cùng lượng thông tin di truyền nhưng các cấu trúc mô khác nhau,

trên cùng cây có thể phát sinh các hình thái khác nhau trong quá trình nuôi cấy, vì

vậy việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy phải căn cứ vào trạng thái sinh lý và tuổi của mẫu,

chất lượng cây lấy mẫu, chất lượng cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu, mục

đích và khả năng nuôi cấy [15].

Mẫu nuôi cấy trước khi đưa vào nuôi cấy phải được vô trùng. Phương pháp phổ

biến nhất trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng hoá chất có khả năng tiêu diệt

vi sinh vật. Hoá chất được lựa chọn để vô trùng mẫu phải đảm bảo 2 điều kiện: Có

khả năng tiêu diệt vi sinh vật tốt và không hoặc ít độc đối với mẫu. Hiệu 1quả vô

trùng tuỳ thuộc vào thời gian, nồng độ và khả năng xâm nhập để tiêu diệt vi sinh vật

của hoá chất. Một số hoá chất thường được sử dụng hiện nay để vô trùng mẫu là:

Ca(OCl)2-hypoclorit canxi, NaClO-hypoclorit natri, oxy già, HgCl2- thuỷ ngân

clorua, chất kháng sinh(gentamicin, ampixilin...) [15].

2.3.3.2. Điều kiện nuôi cấy

- Điều kiện vô trùng: Trong nuôi cấy mô – tế bào thực vật, các thao tác với mẫu

cấy được tiến hành trong điều kiện vô trùng gồm buồng cấy vô trùng, các dụng cụ

cấy vô trùng và môi trường cấy vô trùng nhằm đảm bảo mẫu cấy sẽ không bị nhiễm

vi sinh vật. Để tạo điều kiện vô trùng, buồng cấy phải dùng đèn tử ngoại chiếu trong

30 phút sau đó được lau sạch bằng cồn 90°, dụng cụ và môi trường nuôi cấy thường

được khử trùng ở 121°C trong 25-30 phút.

- Ánh sáng và nhiệt độ: Mẫu nuôi cấy thường được đặt trong phòng ổn định về

ánh sáng và nhiệt độ [15].

2.3.4. Môi trường dinh dưỡng

Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật thay đổi tuỳ theo loài, bộ phận,

các giai đoạn phát triển, phân hoá khác nhau của mẫu cấy và mục đích nuôi cấy như

duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mầm hoặc tái sinh cây hoàn chỉnh [12].

Thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật bao gồm các

thành phần chính sau:

2.3.4.1. Nguồn Cacbon

Mô cấy trong môi trường nuôi cấy in vitro không có khả năng tự dưỡng do

không tiến hành quang hợp đầy đủ. Vì vậy, việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy

nguồn cacbon hữu cơ là điều kiện bắt buộc. Nguồn Cacbon cung cấp cho môi trường

nuôi cấy thường là các loại đường, phổ biến nhất là saccharose với hàm lượng từ 20-

30 g/l. Ngoài ra còn có thể sử dụng các loại đường khác như fructose, rafinose,

sorbitol, glucose, maltose, lactose,... những loại đường này chỉ dùng trong những

trường hợp cá biệt [13].

2.3.4.2. Các nguyên tố khoáng đa lượng, vi lượng

Các chất vô cơ bao gồm thành phần khoáng đa lượng và khoáng vi lượng có

trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật được sử dụng như là thành phần cơ bản

để tổng hợp chất hữu cơ [12]. Các dạng ion của muối khoáng đóng vai trò quan trọng

trong quá trình vận chuyển xuyên màng, điều hoà áp suất thẩm thấu và điện thế màng

[14].

- Nguyên tố đa lượng:

+, hầu hết các loại thực vật

Quan trọng nhất là các nguyên tố: N, P, K, Mg, Ca, Na, S.

- hoặc NH4

+ Nitơ: Thường được sử dụng ở dạng NO3

sẽ sử dụng nguồn nitơ này để đồng hoá và tổng hớp nên các sản phẩm hữu cơ.

+ Phospho: Nhu cầu phospho của mô và tế bào nuôi cấy là rất cao, P có tác dụng

như hệ thống đệm giúp ổn định pH môi trường.

+ Kali: Thường dùng ở dạng KNO3, KH2PO4, KCl.6H2O

+ Canxi: Sử dụng chủ yếu là CaNO3.4H2O, CaCl2.6H2O, CaCl2.2H2O

+ Magie: Sử dụng chủ yếu là MgSO4

+ Lưu huỳnh: Chủ yếu là SO4

- Nguyên tố vi lượng: Chủ yếu là Fe, B, Mn, Cu, Zn, I, Ni... các nguyên tố vi

lượng bổ sung với lượng nhỏ vào môi trường nhưng có vai trò quan trọng đối

với quá trình trao đổi chất, tổng hợp protein, hoạt động phân bào của mô, tế

bào nuôi cấy.

2.3.4.3. Vitamin

Hầu hết các tế bào nuôi cấy có khả năng tổng hợp vitamin nhưng không đủ về

lượng nên cần bổ sung, nhất là nhóm vitamin B [15].

- Vitamin B1 (Thiaminee HCl): Là chất bổ sung rất cần thiết cho môi trường

nuôi cấy, có vai trò trong trao đổi hydratcacbon và sinh tổng hợp amino acid [15].

- Vitamin B6 (Pyridocinen): Là coenzzyme quan trọng trong nhiều phản ứng

trao đổi chất.

- Vitamin B3 (Nicotinic acid): Tham gia tạo coenzyme của chuỗi hô hấp [15].

- Myo-inositol: Có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào, màng tế bào, tham

gia vận chuyển đường, các nguyên tố khoáng, trao đổi hyđratcacbon [15].

2.3.4.4. Các chất hữu cơ tự nhiên

- Nước dừa: Chứa nhiều chất dinh dưỡng như inositol, các amino acid, đường,

các chất thuộc nhóm cytokinin, các chất có hoạt tính auxin [15].

- Dịch thuỷ phân casein: Chứa nhiều amino acid [15].

- Dịch chiết nấm men: Có hàm lượng khá cao các vitamin nhóm B [15].

- Nước ép các loại củ quả: Nước ép cà chua, cà rốt, nước ép chuối xanh… [15].

2.3.4.5. Các thành phần khác

- Agar: Chiết xuất từ rong biển, thành phần của agar gồm một số chất hữu cơ

như acid hữu cơ, acid béo, cùng một số nguyên tố vô cơ như Cu, Fe, Zn... Ngoài tác

dụng tạo gel cho môi trường, agar cũng cung cấp một số chất dinh dưỡng cho tế bào,

mô nuôi cấy [15].

- Than hoạt tính: Dùng để hấp thụ chất màu, các hợp chất thứ cấp gây ức chế

sinh trưởng của mẫu nuôi cấy. Ngoài ra, có thể sử dụng một số chất chống oxy hoá

khác như polyvinyl pyrolodon (PVP), acid ascobic [15].

2.3.4.6. pH của môi trường

Độ pH của môi trường ảnh hưởng đến khả năng tiếp nhận chất dinh dưỡng của

mẫu từ môi trường nuôi cấy. Đa số pH của môi trường được điều chỉnh trong

khoảng từ 5,5-6,0. Trong quá trình nuôi cấy, pH của môi trường có thể giảm do

mẫu nuôi cấy sản sinh ra các acid hữu cơ [15].

2.3.4.7. Các chất điều hoà sinh trưởng

Các chất điều hoà sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môi trường

nuôi cấy, có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật. Hiệu quả

của chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào: Nồng độ, hoạt tính của chất điều hoà

sinh trưởng và yếu tố nội sinh của mẫu cấy [15].

Dựa vào hoạt tính sinh lý có thể phân chất điều hoà sinh trưởng làm 2 nhóm:

Nhóm chất kích thích sinh trưởng và nhóm ức chế sinh trưởng. Trong nuôi cấy mô,

tế bào thực vật, nhóm chất kích thích sinh trưởng là nhóm thường được sử dụng

[15].

- Nhóm Auxin: Được phát hiệ lần đầu tiên bởi Charles Darwin và con trai là

Francis Darwin khi thử nghiệm tính hướng sáng trên cây yến mạch, Sau đó, nhiều

nhà khoa học đã nghiên cứu và dần mở rộng hiểu biết về nhóm chất này.

Auxin trong cơ thể thực vật tập trung nhiều ở các chồi, lá non, hạt nảy mầm,

trong phấn hoa. Auxin có nhiều tác động tới các hiệu ứng sinh trưởng và phát triển

trên cơ thể thực vật. Cụ thể như sau: Auxin có ảnh hưởng tới tính hướng động của

thực vật, tiêu biểu là tính hướng sáng và hướng đất. Auxin gây ra hiện tượng ưu thế

đỉnh (sự sinh trưởng của chồi đỉnh sẽ ức chế chồi nách). Auxin khởi động việc hình

thành rễ bên và rễ phụ do auxin kích thích sự phân chia của tế bào trụ bì – nơi rễ sẽ

sinh trưởng xuyên qua vỏ biểu bì. Ngoài ra, auxin còn tác động đến việc hình thành

chồi hoa, sự phát triển của quả và làm chậm sự rụng lá [15].

Các auxin thường được sử dụng là: NAA, IBA, 2,4D (các auxin nhân tạo), IAA

(các auxin tự nhiên). Hoạt tính bcuat các chất này được xếp theo thứu tự từ yếu đến

mạnh như sau: IAA, IBA, NAA, 2,4D. IAA nhạy cảm với nhiệt độ và dễ phân huỷ

trong quá trình hấp khử trùng do đó không ổn định trong môi trường nuôi cấy môi.

NAA và 2,4D không bị biến tính ở nhiệt độ cao. Tuy nhiên chất 2,4D là chất dễ gây

độc nhưng có tác dụng nhạy đến sự phân chia tế bào và hình thành callus [6].

- Nhóm Cytokinin: Được phát hiện từ những năm 50 của thế kỷ XX, chất đầu

tiên là Kinetin bắt nguồn từ tinh dịch cá trích. Tiếp đó, đến zeatin tách từ nội nhũ của

hạt ngô non. Đã phát hiện cytokinin ở vi sinh vật, tảo silic, rêu, dương xỉ, cây lá kim.

Zeain có nhiều trong thực vật bậc cao và trong một số vi khuẩn. Trong thục vật,

cytokinin có nhiều trong hạt, quả đang lớn, mô phân sinh. Cytokinin kích thích hoặc

ức chế nhiều quá trình sinh lý, trao đỏi chất. Cùng với auxin, cytokinin điều khiển sự

phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô. Tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽ kích thích tạo rễ,

ngược lại sẽ hình thành chồi. Cytokinin cảm ứng sự hình thành chồi bên và ức chế ưu

thế đỉnh. Quá trình sinh trưởng dãn dài của tế bào cũng chịu ảnh hưởng của cytokinin.

Ngoài ra cytokinin còn làm chậm sự già hoá [8].

Trong các chất thuộc nhóm cytokinin thì Kinetin và BAP được sử dụng phổ biến

vì hoạt tính mạnh: Kinetin (phối hợp cùng auxin vơi tỷ lệ thích hợp có khả năng kích

thích phân chia tế bào), BAP (hoạt tính mạnh, bền nhiệt), ngoài ra có thể sử dụng

TDZ, Diphenylurea... [8].

- Nhóm Gibberellin: Được tách chiết lần đầu từ dịch tiết của nâm bởi các nhà

khoa học Nhật Bản vào những năm 1935-1938. Giberellin được tổng hợp trong các

mô đỉnh, tồn tại trong cả hạt non và quả đang phát triển. Giberellin có tác dụng chính

trong việc hoạt hoá phân bào của mô phân sinh lóng, kéo dài lóng cây. Nó cũng kích

thích sự kéo dài của tế bào, tăng kich thước của chồi nuôi cấy. GA3 là loại gibberellin

được sử dụng nhiều nhất [8].

2.4. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài trên thế giới và trong nước

2.4.1. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài trên thế giới

Thông thường Paphiopedilum có thể được nhân giống bằng gieo trồng hạt hay

tách cây con đã trưởng thành ra khỏi cây mẹ. Tuy nhiên, các phương pháp này cho

hiệu quả nhân giống thấp nên không đáp ứng nhu cầu của thị trường. Vì vậy, phương

pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật cho phép tạo ra một lượng lớn cây con trong thời

gian ngắn đã trở thành một giả pháp lý tưởng để bảo vệ lan Hài thoát khỏi nguy cơ

tuyệt chủng.

Các nghiên cứu đầu tiên về nuôi cấy mô lan Hài được thực hiện bởi Bubeck

năm 1973 [16]. Kể từ đó nhiều nhà nghiên cứu đã cố gắng nhân giống lan Hài bằng

nhiều phương pháp nuôi cấy sử dụng các bộ phận khác nhau của cây. Một số nghiên

cứu đã thành công:

Năm 1975, Stewart và cs tiến hành cảm ứng chồi bên để tạo ra mô sẹo, đôi khi

có sự hình thành một vài cây con trong quá trình nuôi cấy. Tuy nhiên, các mô sẹo rất

khó tái sinh, sau một thời gian nuôi cấy những mô sẹo này sẽ chết. Vì lý do này, hầu

hết các nghiên cứu về nuôi cấy mô Paphiopedilum đều sử dụng nguồn vật liệu ban

đầu từ hạt [30].

Năm 1980, Nieman đã tiến hành nuôi cấy chồi bên và cây con và phương pháp

này cũng được Sampolinski sử dụng cho nghiên cứu năm 1983 [26].

Năm 1988, Huang đã tiến hành nuôi cấy kéo dài cây in vitro, sau đó cảm ứng

tạo chồi từ chồi nách của cây invtro được nuôi cấy kéo dài [20].

Năm 2000, Lin và cs đã tiến hành nuôi cấy mô sẹo từ nguồn protocorm của hạt

một loài lan Hài lai và đã thu được một vài cây con trong ống nghiệm [24].

Năm 2001, Huang đã tiến hành nhân nhanh hạt giống lan Hài lai giữa

P. philippinese và P. susan trong môi trường MS bổ sung với BAP 13 mM [20].

Ở Ấn Độ Chyuam-Yih Ng và Norihan Mohd (2011), đã nghiên cứu nhân giống

Paphiopedilum trong in vitro thông qua phương pháp hình thành các thể protocorm thứ

cấp từ thể protocorm sơ cấp được phát triển từ callus có nguồn gốc từ thân. Các thể

protocorm được nuôi cấy trên môi trường ½ MS có bổ sung các nồng độ BA và Kinetin

khác nhau (1.0, 2.0, 3.0, và 4.0 μM) để cảm ứng các PLB thứ cấp. Số lượng PLB thứ cấp

được hình thành nhiều nhất trên môi trường ½ MS có bổ sung 4.0 μM Kinetin, trung

bình có 4.1 PLB được hình thành trên mỗi mẫu sau 8 tuần nuôi cấy. Các PLB thứ cấp

được nhân lên từ 9,5-12,1 PLBs mới. Mỗi PLB thứ cấp sau khi được cấy chuyển trên

môi trường ½ MS không có chất điều hòa sinh trưởng và được bổ sung 60 g/l dịch chiết

chuối. Các PLB thành thục này sẽ được nuôi cấy trên môi trường có chứa các chất hữu

cơ khác nhau như nước dừa, dịch chiết chuối, khoai tây, cà chua để tái sinh hình thành

cây con. Trong số các chất hữu cơ được thử nghiệm, việc bổ sung

20% CW trên môi trường ½ MS có kết quảtỷ lệ tái sinh trung bình là 67,9% PLBs,

sau 8 tuần nuôi cấy.Trong những năm gần đây, nhờ các thành tựu khoa học và sự phát

triển về công nghệ sinh học được ứng dụng rộng rãi cùng với phương tiện giao thông

phát triển mạnh mẽ, việc xuất, nhập khẩu hoa lan ngày càng tăng với quy mô rộng

lớn. Vì có giá trị kinh tế cao nên rất nhiều nước đã tập trung vào việc nghiên cứu hoa

lan có chất lượng cao để phục vụ cho thị trường trong nước và xuất khẩu.

Năm 2002 và1982, Chen và các cộng sự cũng báo cáo rằng có thể cảm ứng tạo

chồi từ thân và lá của lan Hài P. philippinese khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ

sung 2,4D 4,52 mM và TDZ 4,54 mM [17] [18].

2.4.2. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài trong nước

Tại Việt Nam cũng đã có nhiều nhà khoa học tiến hành nuôi cấy mô lan Hài

nhằm nhân giống một số loài lan Hài quý hiếm góp phần bảo tồn loài lan Hài khỏi

nguy cơ tuyệt chủng như:

Hoàng Thị Giang và cộng sự (2010) nghiên cứu nhân giống in vitro và nuôi

trồng giống lan Hài P. hangianum perner Gurss (Hài Hằng). Kết quả nghiên cứu cho

thấy, môi trường nhân nhanh protocorm và tạo chồi là môi trường RE có bổ sung

nước dừa 150ml/l và chuối chín 100g/l cho hệ số nhân cao nhất (4,3 lần). Bổ sung α-

NAA 0,4 mg/l - 0,6mg/l vào môi trường cho khả năng ra rễ tốt nhất. Các kết quả thí

nghiệm ngoài vườn ươm cho thấy, cây đạt tiêu chuẩn ra vườn ươm cao 3 - 4 cm, có

từ 3 - 4 lá, 4 - 5 rễ [3].

Năm 2005, Dương Tấn Nhựt đã nghiên cứu thành công phương pháp nhân

nhanh giống lan hài P. delenatii bằng phương pháp sử dụng hạt nảy mầm in vitro. Từ

cây con in vitro, các mô sẹo được cảm ứng từ protocorm có nguồ gốc từ hạt, được

nuôi cấy trên môi trường có chứa 2,4D và TDZ với nồng độ cao, những mô sẹo này

có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh thông qua bước hình thành PLB. Một phần

mô sẹo có thể tái sinh được 3 - 7 chồi trong 3 tháng và chúng có thể tồn tại trên môi

trường nuôi cấy trong 3 năm mà k mất đi khả năng tái sinh. Ngoài ra, Dương Tấn

Nhựt còn nghiên cứu thành công một phương pháp mới cho phép nhân nhanh giống

lan P. delenatii là phương pháp gây vết thương trên phần gốc thân của

cây con in vitro. Phần gốc sau khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung thêm

TDZ, NAA, 2,4D sẽ hình thành mô sẹo và một số ít xuất hiện protocorm [27].

Năm 2011, Liao và các cộng sự cũng đã tái sinh chồi từ mô sẹo của cây con

hoàn chỉnh từ nụ hoa của P. deperle và P. armeni. Tuy nhiên, cần rất nhiều thời gian

để cho cây lan Hài ra hoa vì vậy phương pháp này kém hiệu quả hơn các phương

pháp khác [22].

Ở Việt Nam, nhóm tác giả Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc và Nguyễn

Tiến Hiệp đã có những nghiên về mặt thực vật học đối với lan Hài Việt Nam thông

qua những chuyến khảo sát thực tế. Trong cuốn sách “Lan Hài Việt Nam” nhóm tác

giả đã giới thiệu khá đầy đủ và chi tiết các loài lan Hài có ở Việt Nam cùng các đánh

giá về thực trạng của các loài này [1].

Phần 3

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu

3.1.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Giống lan hài Vân Nam (Paphiopedilum callosum)

trồng tại vườn cây của Khoa CNSH-CNTP, Trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên.

- Vật liệu: từ quả hài Vân Nam.

3.1.2. Hoá chất sử dụng

- Môi trường MS, đường sacharose, agar, than hoạt tính...

- Một số chất kích thích sinh trưởng thực vật thuộc nhóm auxin (IBA, NAA,...),

nhóm cytokinin (BA,...), nhóm gibberellin (GA3).

3.1.3. Thiết bị,dụng cụ nghiên cứu

Bảng 3.1. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu

Thiết bị Dụng cụ

Cân phân tích Pank cấy

Máy khuấy từ Dao kéo

Máy đo PH Đèn cồn

Lò vi sóng Cốc đong, ống đong

Nồi hấp vô trùng Bình tam giác

Hệ thống giàn đèn Chun nịt

Box cấy vô trùng Giấy thấm

Cùng các trang thiết bị, dụng cụ khác phục vụ nghiên cứu của Phòng Thí nghiệm

Khoa Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm.

3.2. Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.2.1. Phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng

nhân nhanh chồi từ phôi lan hài Vân Nam.

3.2.2. Địa điểm nghiên cứu

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật, Khoa CNSH –

CNTP, Trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên.

3.2.2. Thời gian nghiên cứu

- Thời gian: từ 3/1/2020 đến 10/7/2020.

3.3. Nội dung nghiên cứu

3.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetin, TDZ đến khả

năng nhân nhanh chồi lan hài Vân Nam

- Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài Vân Nam.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh

chồi lan hài Vân Nam.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả năng

nhân nhanh chồi lan hài Vân Nam

3.3.2. Nội dung 2: Xác định môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan hài Vân Nam.

3.4. Phương pháp nghiên cứu

3.4.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy mô

- Sử dụng môi trường MS, RE bổ sung Agar 5,5 g/l, Đường 30g/l, Nước dừa

150ml/l, Inositol 100mg/l, 0,5 g/l THT, pH: 5,6 - 5,8.

- Các chất kích thích sinh trưởng sử dụng bổ sung vào môi trường nuôi cấy có

hàm lượng thay đổi tùy theo từng thí nghiệm.

- Môi trường hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1,0 atm trong 20 phút

3.4.2. Phương pháp nghiên cứu

Sử dụng môi trường MS

Nhân nhanh chồi ( môi trường nền có bổ sung BA,kinetin,TDZ )

Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh (Môi trường nền bổ sung lần lượt NAA và THT )

Hình 3.1. Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích

sinh trưởng đến khả năng tái sinh, nhân nhanh chồi từ phôi và ra rễ của cây

lan hài Vân Nam

3.4.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm

- Điều kiện thí nghiệm: Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng Công nghệ

sinh học thực vật (Khoa CNSH-CNTP) trong điều kiện nhiệt độ phòng (25ºC ± 2, độ

ẩm 60 – 65%, 14h sáng/10h tối, cường độ chiếu sáng 2000 – 2500 lux.

Tất cả các thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, mỗi công thức

3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình 3 mẫu.

3.4.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của của nồng độ BA, Kinetin, TDZ đến

khả năng nhân nhanh chồi từ phôi lan hài Vân Nam.

- Quả tái sinh từ phôi sẽ hình thành chồi được tách và cấy chuyển sang môi

trường nhân nhanh gồm: Môi trường nền, có bổ sung chất kích thích sinh trưởng (BA,

Kinetin, TDZ) để theo dõi khả năng nhân quả của mẫu.

- Theo dõi, quan sát số chồi, chất lượng chồi.

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân

nhanh chồi từ phôi của cây lan hài Vân Nam.

- Chồi tái sinh được tách và cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi

trường nền (Môi trường nền gồm thành phần khoáng đa lượng, vi lượng,

vitamin là thành phần của môi trường MS bổ sung: Đường 30 g/l + Nước dừa

150 ml/l + Agar 5,5 g/l + Inositol 100mg/l + 0,5g/l THT , pH 5,6 – 5,8.), có bổ sung

chất kích thích sinh trưởng (BA) để theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu.

- Theo dõi, quan sát số chồi, chất lượng chồi.

Các chồi được tạo thành từ môi trường tái sinh sẽ được tách ra và cấy chuyển

sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi trường nền + BA ở các nồng độ khác nhau để

theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu.

Thí nghiệm được bố trí như sau:

CT 1 (Đ/c): MT nền + BA 0,0 mg/l

CT 2: MT nền + BA 0,5 mg/l

CT 3: MT nền + BA 1 mg/l

CT 4: MT nền + BA 1,5mg/l

CT 5: MT nền + BA 2 mg/l

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả năng

nhân nhanh chồi của cây lan hài Vân Nam

Các chồi được tạo thành từ môi trường tái sinh sẽ được tách ra và cấy chuyển

sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi trường nền + A (nồng độ BA thích hợp nhất

cho quá trình tái sinh phôi ở thí nghiệm 3) + Kinetin ở các nồng độ khác nhau để theo

dõi khả năng nhân chồi của mẫu.

Thí nghiệm được bố trí như sau:

CT 1(Đ/c): MT nền + A + Kinetin 0,0 mg/l

CT 2: MT nền + A + Kinetin 0,5 mg/l

CT 3: MT nền + A + Kinetin 1,0 mg/l

CT 4: MT nền + A + Kinetin 1,5 mg/l

CT 5: MT nền + A + Kinetin 2,0 mg/l

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetin, TDZ đến khả năng

nhân nhanh chồi lan hài Vân Nam.

Các chổi được tạo thành từ môi trường tái sinh sẽ được tách ra và cấy chuyển

sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi trường nền + A + B (nồng độ Kinetin thích

hợp nhất cho nhân nhanh chồi đã xác định ở thí nghiệm 4) + TDZ ở các nồng độ khác

nhau để theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu.

Thí nghiệm được bố trí như sau:

CT 1 (Đ/c): MT nền + A + B + TDZ 0,0 mg/l

CT 2: MT nền + A + B + TDZ 0,5 mg/l

CT 3: MT nền + A + B + TDZ 1,0 mg/l

CT 4: MT nền + A + B + TDZ 1,5 mg/l

CT 5: MT nền + A + B + TDZ 2,0 mg/l

3.4.3.2. Nội dung 2: Xác định môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan hài Vân Nam.

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của lan hài

Vân Nam.

- Chồi sinh trưởng tốt và có từ 2 - 3 lá thì cấy chuyển sang môi trường ra rễ

gồm: MT nền có bổ sung NAA với các nồng độ khác nhau để theo dõi khả năng

tạo rễ của mẫu.

- Đưa mẫu vào phòng cây. Quan sát và theo dõi số rễ và chất lượng rễ.

Thí nghiệm được bố trí như sau:

CT 1 (Đ/c): MT nền + 0,0 mg/l NAA

CT 2: MT nền + 0.3 mg/l NAA

CT 3: MT nền + 0,5 mg/lNAA

CT 4: MT nền + 1,0mg/l NAA

CT 5: MT nền + 1,5 mg/l NAA

Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả

năng ra rễ của cây lan hài Vân Nam.

Chồi sinh trưởng và có lá từ 2 - 3 lá thì cấy chuyển sang môi trường ra rễ gồm

: MT nền + C (nồng độ NAA thích hợp nhất cho ra rễ đã xác định ở thí nghiệm 6) +

THT ở các nồng độ khác nhau để theo dõi khả năng ra rễ của mẫu.

Đưa mẫu vào phòng cây. Quan sát và theo dõi số rễ và chất lượng rễ.

Thí nghiệm được bố trí như sau:

CT 1 (Đ/c): MT nền + C +0,0 g/l THT

CT 2: MT nền + C + 0,5 g/l THT

CT 3: MT nền + C + 1,0 g/l THT

CT4: MT nền + C + 1,5 g/l THT

CT 5: MT nền + C + 2 g/l THT

3.5. Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu

3.5.1. Thu thập số liệu

- Đếm số mẫu sống không nhiễm, số mẫu sống nhiễm, số mẫu sống nhiễm.

- Đếm số chồi: Đếm tổng số chồi hình thành trên các mẫu cây ban đầuvà nhánh

trên một mẫu nuôi cấy ban đầu.

- Đếm số lượng rễ, độ dài của rễ.

3.5.2. Các chỉ tiêu theo dõi

- Chỉ tiêu theo dõi khử trùng mẫu

+ Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm:

Tổng số mẫu sống không nhiễm (mẫu)

Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%) = × 100 Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) + Tỷ lệ mẫu sống nhiễm:

Tổng số mẫu sống bị nhiễm (mẫu)

Tỷ lệ mẫu sống nhiễm (%) = × 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)

+Tỷ lệ mẫu chết:

Tổng số mẫu chết (mẫu) Tỷ lệ mẫu chết (%) = × 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)

- Chỉ tiêu theo dõi chồi: Tổng số mẫu nảy chồi (mẫu) Tỷ lệ tái sinh chồi (%) = × 100%

Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) Tổng chồi thu được Hệ số nhân chồi (lần) = × 100% Tổng chồi nuôi cấy

Chất lượng chồi:

+ Sinh trưởng tốt: Chồi mập, khỏe, xanh.

+ Sinh trưởng trung bình: Chồi mập, khỏe, xanh nhạt.

+ Sinh trưởng kém: Chồi nhỏ, yếu, trắng vàng.

- Chỉ tiêu theo dõi ra rễ:

Tổng số chồi ra rễ (chồi) Tỷ lệ chồi ra rễ (%) = × 100% Tổng số mẫu nuôi cấy (mẫu)

Tổng số rễ thu được

Tổng số mẫu cấy

Số rễ trung bình/chồi (rễ) = Chất lượng rễ:

+ Rễ tốt: Rễ khỏe, dài, có màu trắng.

+ Rễ trung bình: Rễ khỏe, ngắn, có màu trắng hơi vàng.

+ Rễ kém: Rễ ngắn, nhỏ,màu vàng hoặc màu đen.

3.5.3. Phương pháp sử lý số liệu

Các số liệu thu thập được thống kê và xử lý theo phương pháp thống kê toán

học bằng phần mềm Microsoft office Excel 2010 và phần mềm IRRISTAT 5.0

Phần 4

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

4.1. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetin, TDZ đến khả năng nhân

nhanh chồi từ phôi lan hài Vân Nam.

4.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh

chồi lan hài Vân Nam (sau 40 ngày nuôi cấy)

Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân

nhanh chồi từ phôi lan hài Vân Nam (sau 40 ngày nuôi cấy)

Chất lượng chồi Công thức Nồng độ BA (mg/l) Số bình mẫu nuôi cấy (bình) Số bình tái sinh chồi(bình) Hệ số nhân nhanh chồi (lần)

0,0 30 6 0,2 1 (Đ/c)

0,5 1 1,5 2,0 30 30 30 30 56 20 45 21 2 3 4 5

Mới nhú, chiều cao chồi thấp. Xanh đậm, mập Xanh, gầy,dài Xanh nhạt, mập Xanh, ngắn LSD05 CV% 1,87 0,67 1,5 0,7 0,24 8,5

Kết quả thí nghiêm được biểu thị qua biểu đồ 4.1:

hệ số nhân nhanh chồi (lần)

1.87

1.8

1.5

1.6

1.4

1.2

hệ số nhân nhanh chồi (lần)

0.7

0.8

0.67

0.6

0.4

0.2

CT1

CT2

CT3

CT4

CT5

Biểu đồ 4.1. Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài

Vân Nam (sau 40 ngày nuôi cấy)

Kết quả bảng 4.1.1 và biểu đồ 4.1 cho ta thấy giá trị CV (%): 8,5% và LSD05

đạt 0,24 thì các công thức khác nhau có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy

95%. Điều này cho thấy BA có sự ảnh hưởng tích cực tới khả năng tái sinh chồi

lan Hài Vân Nam.

Ở chỉ tiêu tỷ lệ tái sinh chồi: CT2 có tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất là 1,87 lần cho

chất lượng chồi xanh đâm và mập (kết quả đem lại tốt nhất). Tiếp theo là CT4 đạt

1,5% chất lượng chồi thu được xanh nhạt, mập; CT3 đạt 0,67 lần chất lượng chồi thu

được là xanh, gầy, dài; CT5 đạt 0,7 lần chất lượng chồi thu dược xanh, ngắn.

Kết quả trên được giải thích như sau: BA là cytokinin có vai trò trong việc

hoạt hóa quá trình phân bào, nhờ đó sẽ có tác dụng cảm ứng cho việc hình thành

chồi và phân hóa chồi. Nồng độ BA 0,5 mg/l (CT2) cho nhiều chồi và có số chồi

lớn nhất là do BA ở nồng độ này có tác dụng kích thích sự nhân nhanh chồi lan

mạnh nhất đồng thời tạo điều kiện cho cây sinh trưởng và phát triển tốt nhất. Ở

CT3; CT4; CT5; nồng độ BA lần lượt là 1mg/l; 1,5 mg/l; 2,0 mg/l cho tỷ lệ tái

sinh có xu hướng giảm dần.

Tác giả Dương Tấn Nhựt (2007) [31], Nồng độ BA thích hợp nhất cho tái sinh

chồi của lan hài P. delenatii khi nuôi cấy trên môi trường MS là 2,0 mg/l, tỷ lệ tái

sinh chồi là 75% sau 30 ngày nuôi cấy.

So sánh kết quả nghiên cứu của chúng tôi với kết quả nghiên cứu của tác giả

trên thấy kết quả nghiên cứu của tôi hoàn toàn phù hợp. Điều này chứng tỏ BA có tác

dụng tích cực trong việc nhân nhanh chồi lan Hài nói chung và kích thích nhân nhanh

chồi lan Hài Vân Nam nói riêng. Vì vậy công thức bổ sung BA nồng độ 0,5mg/l vào

môi trường nền được chọn để sử dụng trong nghiên cứu các thí nghiệm nhân nhanh

tiếp theo BA kết hợp với Kinetin.

CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 (xanh gầy, ngắn) (xanh đậm, mập) (xanh gầy, ngắn) (xanh nhạt, mập) (xanh, gầy)

Hình 4.1. Hình ảnh ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài Vân Nam (sau 40 ngày nuôi cấy) CT1: 0 mg/l ; CT2: 0,5 mg/l BA; CT3: 1 mg/l BA; CT4: 1,5 mg/l BA; CT5: 2 mg/l BA. 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả năng

nhân nhanh giống lan hài Vân Nam

BA có vai trò trong việc hoạt hóa quá trình phân bào, có tác dụng cảm ứng cho

việc tạo thành chồi và phân hóa chồi vì vậy chúng có khả năng tăng hệ số nhân chồi

trong nuôi cấy in vitro.

Kinetin là một dẫn xuất của bazơ nitơ adenin có tác dụng làm tăng sự phân chia

tế bào, duy trì sự sống của mô, định hướng tế bào trong con đường phân

hoá và tăng cường tổng hợp chất diệp lục ở lá cây. Do đó trong thí nghiệm này, tôi

sử dụng nồng độ BA 0,5 mg/l thích hợp nhất trong quá trình tái sinh (công thức thích

hợp nhất ở thí nghiệm trước kết hợp với kinetin ở các nồng độ để thử nghiệm khả

năng nhân nhanh giống lan hài Vân Nam.

Bảng 4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi của cây lan hài Vân Nam

Công thức

Hệ số nhân chồi (lần)

Chất lượng chồi

Nồng độ BA (mg/l)

0,5

CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 CT 5

Nồng độ Kinetin (mg/l) 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Số mẫu nuôi cấy (mẫu) 30 30 30 30 30

Tổng số chồi thu được (chồi) 47 48 57 67 56

Xanh đậm, mập Xanh đậm, mập Xanh đậm, mập Xanh đậm, mập Xanh nhạt, mập

LSD05 CV (%)

1,87 1,9 1,96 2,23 1,93 0,2 6,8

Kết quả thí nghiệm được thể hiện qua biểu đồ 4.2:

Hệ số nhân chồi (lần)

2.3

2.23

2.2

2.1

1.96

1.93

1.9

Hệ số nhân chồi (lần)

1.87

1.9

1.8

1.7

1.6

CT 1

CT 2

CT 3

CT 4

CT 5

Biểu đồ 4.2. BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi của cây lan

hài Vân Nam

Qua bảng 4.2 và biểu đồ 4.2 ta nhận thấy:

Khi bổ sung thêm kinetin vào môi trường nuôi cấy thì kinetin có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài. Khi bổ sung kinetin vào môi trường nuôi cấy ở các nồng độ từ 0,5 đến 2 mg/l thì hệ số nhân chồi dao động từ 1,87 lần đến 1,93 lần, chất lượng chồi cũng tốt hơn so với khi không bổ sung.

Trong thí nghiệm này nồng độ Kinetin 1,5 mg/l cho tổng số chồi thu được là 67 chồi và hệ số nhân cao nhất là 2,23 lần, chồi thu được xanh đậm, mập. Tuy nhiên, nồng độ Kinetin từ 0,5; 1,0 mg/l thu được tổng số chồi và hệ số nhân giảm với CT2, CT3, lần lượt là 47 chồi, 48 chồi, tương ứng vợi hệ số nhân là 1,9 ; 1,96 lần, chất lượng chồi xanh đậm, mập; nồng độ Kinetin 2 mg/l cho tổng số chồi thu được là 57 chồi và hệ số là 1,93 chồi thu được xanh nhạt, mập.

Kết quả thí nghiệm thu được được giải thích như sau: Ở CT đối chứng (CT1) do môi trường nuôi cấy không bổ sung Kinetin nên khả năng tạo chồi thấp hơn so với các công thức có bổ sung Kinetin. Ở CT2, CT3, Kinetin có nồng độ là 0,5 – 1,0 mg/l làm tăng hệ số nhân chồi nhưng không đáng kể, do nồng độ thấp nên các chồi mẫu hầu như không tiếp xúc với Kinetin trong môi trường nuôi cấy, vì vậy nên mẫu phân chia yếu nên chỉ tạo ít chồi mới. Khi nồng độ Kinetin đạt 1,5 mg/l (CT4), Kinetin

kích thích mẫu phân chia mạnh nhất nên số chồi mới sinh ra nhiều nhất. Ở CT5 tương ứng với nồng độ 2,0 mg/l Kinetin hệ số nhân chồi thấp hơn so với CT4. Nồng độ Kinetin thích hợp sẽ kích thích chồi sinh trưởng, tuy nhiên khi nồng độ Kinetin tăng cao, vượt quá ngưỡng cần thiết có thể ức chế khả năng tạo chồi.

(xanh đậm, mập) (xanh đậm, mập) (xanh đậm, mập) (xanh đậm, mập) (xanh nhạt, gầy)

CT1 CT2 CT3 CT4 CT5

Hình 4.2. Hình ảnh BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi của

cây lan hài Vân Nam

CT1: 0,5 mg/l BA+ 0mg/l Kinetin ; 0,5 mg/l BA+ 0,5mg/l Kinetin CT3: 0,5 mg/l

BA+ 1mg/l Kinetin; CT4: 0,5 mg/l BA+ 1,5mg/l Kinetin;CT5: 0,5 mg/l BA+ 2mg/l

Kinetin.

4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả

năng nhân nhanh giống lan hài Vân Nam

TDZ là cytokinin ít bị phân huỷ bởi emzyme nội sinh so với các cytokinin khác,

do đó nó có hoạt tính cao và có thể cho hệ số nhân chồi cao hơn các cytokinin khác.

Vì vậy trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng nồng độ BA kết hợp với Kinetin thích

hợp nhất trong quá trình nhân nhanh (công thức thích hợp nhất ở thí nghiệm trước)

kết hợp với TDZ ở các nồng độ để nghiên cứu ảnh hưởng của BA, Kinetin, TDZ đến

khả năng nhân nhanh giống lan hài Vân Nam.

Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ

đến khả năng nhân nhanh giống lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy)

Tổng số Hệ số Nồng độ Nồng độ Số mẫu Công Nồng độ chồi thu nhân Chât lượng Kinetin TDZ nuôi cấy thức được chồi chồi BA (mg/l) (mg/l) (mg/l) (mẫu) (chồi) (lần)

30 0,0 65 2,17 Xanh đậm, mập CT 1

30 0,5 73 2,43 Xanh đậm, mập CT 2

CT 3 0,5 1,5 30 1,0 85 2,83 Xanh đậm, mập

30 1,5 62 2,07 Xanh, bé CT 4

30 2,0 59 1,19 Xanh, bé CT 5

0,17 LSD05

4,0 CV (%)

Kết quả thí nghiệm được biểu thị qua biểu đồ 4.3:

Hệ số nhân chồi (lần)

2.83

2.43

2.5

2.17

2.07

1.5

Hệ số nhân chồi (lần)

1.19

0.5

CT 1

CT 2

CT 3

CT 4

CT 5

Biểu đồ 4.3. Ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả năng

nhân nhanh giống lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy)

Từ kết quả bảng 4.3 và biểu đồ 4.3 ta nhận thấy:

Ở chỉ tiêu hệ số nhân chồi với giá trị LSD05 đạt 0,17 các công thức trong thí

nghiệm có sự sai khác có ý so với công thức đối chứng ở mức độ tin cậy 95%.

Khi bổ sung BA 0,5 mg/l, Kinetin 1,5 mg/l và TDZ từ 0,0 - 2,0 mg/l vào môi

trường nuôi cấycho thấy ảnh hưởng đến khả năng nhân chồi cây lan hài Vân Nam.

Các công thức có bổ sung TDZ đều cho hệ số nhân chồi cao hơn công thức đối chứng

không bổ sung TDZ (công thức đối chứng có hệ số nhân chồi đạt 2,17 lần). Khi tăng

nồng độ TDZ từ 0,0 - 1,0 mg/l tổng số chồi thu được và hệ số nhân chồi có xu hướng

tăng lên, ở công thức đối chứng TDZ nồng độ 0,5 mg/l cho tổng số chồi thu được

là 73 chồi và hệ số nhân là 2,43lần. Trong thí nghiệm này, nồng độ TDZ 1,0 mg/l

cho tổng số chồi thu được là 85 chồi và hệ số nhân cao nhất là 2,83 lần. Tuy nhiên,

nồng độ TDZ từ 1,5 - 2,0 mg/l thu được tổng số chồi và hệ số nhân giảm, ở CT4

tổng số chồi thu được là 62 chồi và hệ số nhân là 2,07 lần; CT5 tổng số chồi thu

được là 59 chồi và hệ số chồi là 1,19 lần.

Chất lượng chồi: Với CT đối chứng (TDZ 0,0 mg/l) cho chất lượng chồi thu

được xanh nhạt, mập. Khi tăng dần nồng độ TDZ từ 0,5 - 1,0 mg/l thì chất lượng

chồi xanh nhạt, mập lên chồi xanh đậm mập, trong khuôn khổ thí nghiệm này, CT

bổ sung TDZ từ 0,5 - 1,0 mg/l cho chất lượng chồi tốt nhất. Tăng nồng độ TDZ từ

1,5 - 2,0 mg/l thì chất lượng chồi giảm xuống, chồi thu được xanh, bé.

Kết quả thí nghiệm được giải thích như sau: TDZ là chất kích thích sinh

trưởng có tác dụng kích thích tế bào phân chia hình thành chồi mới. Ở công thức

đối chứng không có TDZ trong môi trường nuôi cấy nên khả năng tạo chồi thấp

hơn các công thức bổ sung TDZ. Ở CT2 với nồng độ TDZ 0,5 mg/l có tác dụng

kích thích phát triển chồi mới nhưng do nồng độ TDZ thấp nên mẫu ít chịu tác

động kích thích phân chia tế bào của chất này. Ở CT3 cho hệ số nhân chồi cao

nhất là do TDZ 1,0 mg/l kích thích mẫu sinh trưởng và phát triển tốt nhất, đồng

thời tế bào phân chia mạnh mẽ nhất. Khi nồng độ TDZ tăng dần từ 1,5 – 2,0 mg/l

ứng với CT4, CT5 cho thấy chồi nhỏ nhưng những chồi này không thể kéo dài

hoặc bị biến dạng, nồng độ TDZ càng cao thì hệ số nhân chồi càng giảm dần.

Kết luận trong khuôn khổ thí nghiệm này, để nâng cao hệ số nhân chồi cần

bổ sung BA 0,5 mg/l; Kinetin 1,5 mg/l, TDZ 1,0 mg/l sẽ thu được số chồi lớn nhất

là 85 với hệ số nhân chồi là 2,83.

(xanh đậm, mập) (xanh đậm, mập) (xanh đậm , mập) ( xanh ,bé ) (xanh, bé )

CT1 CT2 CT3 CT4 CT5

Hình 4.3. Hình ảnh ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả

năng nhân nhanh giống lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy)

CT1: 0,5 mg/l BA+ 0mg/l Kinetin + 0mg/lTDZ+ ; CT2 0,5 mg/l BA+ 0,5mg/l

Kinetin + 0,5mg/lTDZ ; CT3: 0,5 mg/l BA+ 1mg/l Kinetin + 1mg/lTDZ; CT4: 0,5

mg/l BA+ 1,5mg/l Kinetin + 1,5mg/lTDZ;CT5: 0,5 mg/l BA+ 2mg/l Kinetin +

2mg/lTDZ

4.4. Kết quả nghiên cứu môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan hài Vân Nam.

4.4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của

cây lan hài Vân Nam

Bộ rễ là cơ quan rất quan trọng đối với tất cả các loài thực vật. Trong nuôi cấy

mô, sau khi nhân chồi với số lượng lớn, giai đoạn tiếp theo là tạo cây hoàn chỉnh để

đưa ra ngoài vườn ươm. Khi một cây muốn chuyển ra tự nhiên thì có một bộ rễ khỏe

mạnh, hoàn chỉnh giúp cây có khả năng hút nước và dinh dưỡng khoáng tốt, làm tiền đề

cho sự sinh trưởng và phát triển sau này. Vì vậy, giai đoạn kích thích tạo rễ của các chồi

là giai đoạn quan trọng và không thể thiếu. Sau khi kết thúc giai đoạn nhân nhanh tạo ra

số lượng chồi lan hài Vân Nam đồng nhất và khỏe mạnh, các chồi tạo thành đạt tiêu

chuẩn sẽ được tách ra đưa vào mỗi trường kích thích ra rễ.

NAA là chất điều tiết sinh trưởng thực vật có tác dụng thúc đẩy sự phân bào và

hình thành rễ nhánh, rễ lá. Với những ưu điểm như vậy, chúng tôi đã chọn NAA để

thử nghiệm khả năng ra rễ của cây lan hài Vân Nam.

Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ

cây lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy)

Công thức Chất lượng rễ

CT1(Đ/c) CT 2 CT 3 CT 4 CT 5 Nồng độ NAA (mg/l) 0,0 0,3 0,5 1,0 1,5 Số mẫu nuôi cấy (mẫu) 30 30 30 30 30 Số mẫu ra rễ (mẫu) 5 26 21 18 23

Tỷ lệ mẫu ra rễ (%) 16,67 86,67 70 60 76,67 2,92 8,2 Ngắn, nhỏ, đen Dài, mập, trắng Ngắn, nhỏ,đen Ngắn, nhỏ,đen Ngắn, nhỏ,đen LSD05 CV(%)

Kết quả thí nghiệm được thể hiện qua biểu đồ 4.4:

Tỷ lệ mẫu ra rễ (%)

100

86.67

76.67

Tỷ lệ mẫu ra rễ (%)

16.67

CT1

CT2

CT3

CT4

CT5

Biểu đồ 4.4. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ cây lan hài Vân

Nam (sau 30 ngày nuôi cấy)

Từ bảng kết quả 4.4 và biểu đồ 4.4 cho ta thấy: giá trị CV (%) là 8,2 và LSD05

đạt 2,92; các công thức khác nhau có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Nồng

độ NAA có tác dụng rõ rệt đến sự hình thành rễ đối với cây lan Hài P.callusum.

Xét về tỷ lệ mẫu ra rễ thì CT2 chiếm tỷ lệ cao nhất 86,67%, tiếp theo CT5 đạt

được 76,67%, CT3 đạt được 70%, CT4 60%.

Xét về chất lượng rễ thì CT2 thu được rễ có chất lượng tốt: rễ dài, mập, có màu

trắng.

Kết quả trên được giả thích như sau: NAA là chất kich thích chồi tạo ra rễ. Công

thức đối chứng 1 (CT1) chưa bổ sung NAA nên số mẫu ra rễ thấp, nhỏ. Nồng độ

NAA 0,3 mg/l CT2 thì tỷ lệ chồi ra rễ cao nhất, khỏe nhất; đồng thời tạo điều kiện

cây phát triển. Còn CT3, CT4, CT5 nồng độ NAA từ 0,5; 1,0; 1,5; chất lượng ra rễ

thu được giảm dần, bởi vì nồng độ NAA cao có khả năng gây ức chế chồi ra rễ, số

lượng rễ hình thành cũng giảm, ngắn và nhỏ.

Vì vậy, trong khuôn khổ thí nghiệm này để kích thích ra rễ cây lan hài Vân Nam cần

bổ sung vào môi trường nuôi cấy NAA 0,3 mg/l.

CT1 CT2 CT3 CT4 CT5

(Ngắn, nhỏ, đen) (Dài, mập, trắng) (Ngắn, nhỏ, đen) (Ngắn, nhỏ, đen) (Ngắn, nhỏ)

Hình 4.4. Hình ảnh rễ bị ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ cây

lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy)

CT1: 0 mg/l NAA; CT2: 0,3 mg/l NAA; CT3: 0,5 mg/l NAA; CT4: 1 mg/l NAA;

CT5: 1,5 mg/l NAA.

4.4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả

năng nhân nhanh cây lan hài Vân Nam

Than hoạt tính là một hợp chất vô cơ thường được sử dụng trong giai đoạn ra rễ

trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Than hoạt tính có vai trò là tạo điều kiện “tối” cho

môi trường nuôi cấy, hấp thụ các chất độc và các chất ức chế sinh trưởng thực vật.

Ngoài ra, than hoạt tính còn có khả năng làm giảm hiện tượng thuỷ tinh thể ở một số

loài thực vật. Để số mẫu nuôi cấy có thể ra nhiều rễ với chất lượng rễ tốt, trong thí

nghiệm này chúng tôi sử dụng nồng độ NAA 0,3 mg/l thích hợp nhất cho quá trình

ra rễ kết hợp với than hoạt tính ở các hàm lượng khác nhau để thử nghiệm khả năng

ra rễ của cây lan hài Vân Nam.

Bảng 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính

đến khả năng ra rễ cây lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy)

Nồng độ Nồng độ Số mẫu Tỷ lệ Số rễ trung Công THT nuôi cấy chồi ra bình trên Chất lượng rễ NAA thức (mg/l) (g/l) (mẫu) rễ (rễ) chồi(rễ)

0,0 30 48 1,6 Ngắn, nhỏ CT 1

CT 2 0,5 30 90 3 Dài mập 0,3 1,0 30 79 2,63 Dài, mập CT 3

1,5 30 75 2,5 Ngắn, nhỏ CT 4

2,0 30 58 1,93 Ngắn, nhỏ CT 5

0,78 LSD05

5,8 CV(%)

Kết quả thí nghiệm được thể hiện qua biểu đồ 4.5:

Số rễ trung bình trên chồi( chồi)

3.5

2.63

2.5

1.9

1.6

Số rễ trung bình trên chồi( chồi)

1.5

0.5

CT 1

CT 2

CT 3

CT 4

CT 5

Biểu đồ 4.5. Ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả năng ra

rễ cây lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy)

Từ bảng kết quả 4.7 và 4.5 cho thấy: Số rễ trung bình chồi trên rễ với giá trị

LSD05 đạt 0,78; công thức khác trong thí nghiệm đều có sự sai khác nhau có ý nghĩa

ở mức độ tin cậy 95%. Các công thức có bổ sung than hoạt tính đều có tỷ lệ mẫu ra

rễ cao hơn công thức đối chứng không bổ sung than hoạt tính CT1. Ở CT2 với hàm

lượng than hoạt tính 0,5 g/l cho số rễ trung nình chồi trên rễ cao nhất là 90 chồi. Tăng

dần hàm lượng than hoạt tính từ 1,0; 1,5; 2,0 tương ứng với CT3; CT4; CT5 có cho

tỷ lệ mẫu rễ giảm dần.

Ở chỉ tiêu chất lượng rễ: Các CT2, CT3 cho chất lượng rễ dài, mập. Ở CT1;

CT4 và CT5 tương ứng với hàm lượng than hoạt tính 1,5 g/l; 2,0g/l cho rễ ngắn, và

nhỏ. CT2 cho chất lượng ra tốt nhất là dài, mập.

Kết quả trên được giả thích như sau: Ở CT1 chưa có than hoạt tính thì cho tỷ lệ

ra rễ ít nhất. Ở các công thức có bổ sung than hoạt tính, hàm lượng than hoạt tính tăng

thì khả năng ra rễ cùa cây cũng tăng, số lượng rễ tăng. THT 0,5 g/l (CT2) ở hàm

lượng này THT thúc đẩy cây ra rễ nhanh và mạnh nhất. Ở CT3, CT4, CT5 tạo điều

kiện tối kích thích chồi ra rễ nhiều hơn CT1 (công thức Đ/c). Tuy nhiên khi tăng dần

hàm lượng THT lên 1 g/l (CT3) ; 1,5 g/l (CT4) và 2,0 g/l (CT5) đồng thời THT ở hàm

lượng cao sẽ ngăn cản quá trình trao đổi chất của chồi nên cũng hạn chế sự hình thành

rễ của chồi.

Từ kết quả thí nghiệm cho thấy hàm lượng THT thích hợp nhất cho cây lan hài

Vân Nam ra rễ là 0,5 g/l, khi đó tổng số rễ là 90 rễ và cho rễ dài, mập.

CT1 CT2 CT3 CT4 CT5

(ngắn , nhỏ) (dài, mập) (dài, mập) (ngắn, nhỏ) (ngắn , nhỏ)

Hình 4.5. Hình ảnh rễ bị ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến

khả năng ra rễ cây lan hài Vân Nam (sau 30 ngày nuôi cấy)

CT1: 0,3 mg/l NAA +0g/lTHT; CT2: 0,3 mg/l NAA + 0,5g/lTHT; CT3: 0,3 mg/l

NAA + 1g/lTHT; CT4: 0,3 mg/l NAA + 1,5g/lTHT; CT5: 0,3 mg/l NAA+ 2g/lTHT

Phần 5

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.1. Kết luận

Trong khuôn khổ thí nghiệm chúng tôi đưa ra một số kết quả sau:

- Hàm lượng BA tốt nhất cho sự phát sinh chồi lan hài Vân Nam (Paphiopedilum

callosum) là: Môi trường MS + 0,5 mg/l BA với tỷ lệ tái sinh chồi đạt 66,67%.

- Hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng tốt nhất cho giai đoạn nhân nhanh

chồi lan hài Vân Nam là BA 0,5 mg/l + Kinetin 1,5 mg/l + TDZ 1,0 mg/l thu được hệ

số nhân chồi đạt 2,23 lần.

- Hàm lượng chất kích thích với than hoạt tính tốt nhất ở giai đoạn ra rễ là

NAA 0,3mg/l + nồng độ than hoạt tính 0,5g/l cho số rễ trung bình trên chồi tốt nhất

là 3, tổng số chồi ra rễ 90 chồi.

5.2. Kiến nghị

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh chồi lan

hài Vân Nam.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng khác đến khả năng

nhân nhanh chồi Vân Nam.

- Nghiên cứu điều kiện ngoại cảnh (nhiệt độ, giá thể, độ ẩm) đến khả năng phát

triển của lan hài Vân Nam.

TÀI LIỆU THAM KHẢ0

I. Tiếng Việt

1. Leonid Averyyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc, Nguyễn Tiến Hiệp (2004),

Lan Hài Vệt Nam, Nxb Giao thông vận tải.

2. Trịnh Đình Đạt Công nghệ sinh học tập 4 – Công nghệ di truyền (NXB giáo dục

2006) –,173 trang.

3. Hoàng Thị Giang, Nguyễn Quang Thạch, Mạch Hồng Thắm, Đỗ Thị Thu Hà

(2010), “Nghiên cứu nhân giống in vitro và nuôi trồng giống lan hài quý P.

hangianum perner Gurss (Hài Hằng) thu thập ở Việt Nam”, Tạp chí Khoa học và

Phát triển 2010 - tập 8, số 2, tr. 194-201, Trường Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội.

4. Nguyễn Thu Hậu, Nguyễn Trí Minh, Đinh Văn Khiêm, Nguyễn Thị Thanh

Hằng, Cao Đình Hùng, Phan Xuân Nguyên, Nguyễn Đình Sĩ (2013), “Nghiên

cứu nhân giống cỏ ngọt (Stevia rebaudiana Bertond) in vitro”, Hội thảo Quốc

tế Khoa học và Công nghệ phục vụ sản xuất Nông nghiệp Công nghệ cao tỉnh

Lâm Đồng, Đà Lạt ngày 29 tháng 3 năm 2013, trang 239-245.

5. Lê Thị Huyên, Nguyễn Tiến Hiệp (2004), Hình thái và phân loại thực vật, Nhà

xuất bản Nông nghiệp, Trường Đại học Lâm Nghiệp Hà Nội.

6. Trần Thị Lệ, Trương Thị Bích Phượng, Trần Thị Triêu Hà (2008), Giáo trình Công

nghệ sinh học thực vật, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.

7. Nguyễn Công Nghiệp (2006), Trồng hoa lan, Nxb Trẻ.

8. Nguyễn Như Khanh, Nguyễn Văn Đính (2011), Giáo trình các chất điều hoà sinh

trưởng thục vật, Nxb Giáo dục Việt Nam.

9. Hoàng Thị Sản (2002), Phân loại học thực vật, Nxb Giáo dục.

10. Nguyễn Thị Sơn, Nguyễn Thị Lý Anh, Vũ Ngọc Lan, Trần Thế Mai (2012),

“Nhân giống in vitro loài lan Dendrobium fimbriatum Hook (Hoàng thảo long

nhãn)”, Tạp chí Khoa học và Phát triển 2012, tập 10(2), trang 263-271.

11. Nguyễn Kim Thanh, Nguyễn Thuận Châu (2005), Giáo trình sinh lý học thực vật,

Nxb Giáo dục, Hà Nội.

12. Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu và ứng

dụng, Nxb Nông nghiệp.

13. Nguyễn Quang Thạch (2009), Cơ sở công nghệ sinh học – T3, Nxb Giáo dục.

14. Bùi Trang Việt (2002), Sinh lý thực vật đại cương, Nxb Đại học Quốc gia Thành

phố Hồ Chí Minh 8. Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2009),

Công nghệ sinh học tập 2 – Công nghệ sinh học tế bào, Nxb Giáo dục.

15. Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2002), Công nghệ sinh học –

T2, Nxb Giáo dục.

II. Tài liệu tiếng anh

16. Bubeck S.K. (1973), A suty of Paphiopedilum meristem culture. Ph.D Thesis,

Rutgers University Microfilm International, Ann Arbor, Mivhigan, The USA.

17. Chen T. Y., Chen J. T., Chang W. C. (2002), “Multiple shoot formation and plant

regeneration from stem nodal explants of Paphiopedilum orchids”, In vitro Cell,

Dev. Biol. Plant 38, p. 595-597.

18. Chen S. C., Liu. F. Y. (1982), “Notes on some species of Paphiopedilum from

Yunnan”, Acta Bot, Yunnanica 4, p 163-167.

19. Huang L. C. (1988), “A procedure for asexual multiplication of Paphiopedilum

in vtro, American Orchid Society Bulletin 57, p. 274-278.

20. Huang L. C., Lin C. J., Kou C. I., Huang B. L., Murashige T. (2001),

“Paphiopedilum cloning in vitro”, Scientia Horticulturae 91, p. 111-121.

21. Kauth P. (2005), In vitro seed germination and seedling development of

Calopogon tuberosus and Sacolia lanceolata var. lanceolata: Two Florida

native terrestrial orchids, Master thesis, University of Florida.

22. Liao Y. J., Tsai Y. C., Sun Y. W., Lin R. S., Wu F. S. (2011), “In vitro shoot

induction and plant regeneration from flower buds in Paphiopedilum orchids”,

In vitro Cell, Dev. Biol. plant 47, p 702-709.

23. Lin Y. H., Chang C., Chang W. C. (2000), “Plant regeneration from callus

culture of a Paphiopedilum hybrid”, Plant. Cell. Tiss. Org. Cult. Vol 62, pp. 21

– 25.

24. Liu ZJ, Liu KW, Chen LJ (2006), “Conservation ecology of endangered species

Paphiopedilum armeniacum (Orchidaceae)”,Acta Ecol Sinica, Volume 26(9),

pp. 2791–2800.

25. Nieman D. (1980), “Plantlet formation of Paphiopedilum flower stem”,

American Orchid Society Bulletin 49, p. 372-373.

26. Nhut D. T, Thuy D. T. T., Luan V. Q., Don N. T., Khiem D. V., Tran Thanh

Van K. (2005), “ Micropropagation of Paphiopedilum delenatii via stem node

culture”, Vietnam – Korea International Symposium, Bio-Technology & Bio-

System Engineering, p. 184-190.

27. Nhut D. T., Trang P. T. T., Vu N. H., Thuy D. T. T., Khiem D. V., Binh N. V.,

Tran Thanh Van K. (2005), “ A wounding method and liquid culture in

Paphiopedilum delenatiii propagation”, Propagation of Ornamental Plants

5(3), p.156-161.

28. Stewart J., Button J. (1975), “Tissue culture studies in Paphiopedilum”,

American Orchid Society Bulletin 44, p. 591-599.

III. www.vuonhoalan.net

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1

MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

Bottle Component Stock Solution (g/l) Final concentratic (mg/l) Amount to take preparation (ml)

82,5 1.650,0 NH4NO3 20 I 95 1.900,0 KNO3

37 370,0 MgSO4.7H2O

2,23 22,3 MnSO4.4H2O 10 II 1,058 10,6 ZnSO4.7H2O

0,0025 0,025 CuSO4.5H2O

44 440,0 CaCl2.2H2O

KI 0,083 10 0,83 III

0,0025 0,025 CoCl2.6H2O

17 170,0 KH2PO4

0,62 10 6,2 H3BO4 IV

0,025 0,25 Na2MoO4.2H2O

2,784 27,85 FeSO4.7H2O 10 V 3,724 37,25 Na2EDTA.2H2O

mg/100ml

Nicotinic acid 100 0,5 0,5

Glycine 100 2,0 2,0 Vitamin Thiamine acid 100 0,1 0,1

Pyridocine HCl 100 0,5 0,5

30.0000,0 Sucrose

5.500,0 Agar

5,6-5,8 pH

PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi của cây lan

hài Vân Nam.

BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSNC FILE TN3 21/ 6/20 22:15 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 Anh huong cua nong do BA den kha nang nhân nhanh choi tu phoi cua cay lan hai Van Nam VARIATE V003 HSNC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 T 4 5.51829 1.37957 87.49 0.000 3 2 R 2 .585334E-02 .292667E-02 0.19 0.835 3 * RESIDUAL 8 .126147 .157684E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 5.65029 .403592 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN3 21/ 6/20 22:15 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 Anh huong cua nong do BA den kha nang nhân nhanh choi tu phoi cua cay lan hai Van Nam MEANS FOR EFFECT T ------------------------------------------------------------------------------- T NOS HSNC 1 3 0.200000 2 3 1.86667 3 3 0.666667 4 3 1.50000 5 3 0.703333 SE(N= 3) 0.724991E-01 5%LSD 8DF 0.236412 ------------------------------------------------------------------------------- Anh huong cua nong do BA den kha nang nhân nhanh choi tu phoi cua cay lan hai Van Nam MEANS FOR EFFECT R ------------------------------------------------------------------------------- R NOS HSNC 1 5 0.996000 2 5 1.00600 3 5 0.960000 SE(N= 5) 0.561576E-01 5%LSD 8DF 0.183124 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN3 21/ 6/20 22:15 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 Anh huong cua nong do BA den kha nang nhân nhanh choi tu phoi cua cay lan hai Van Nam F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |T |R | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | HSNC 15 0.98733 0.63529 0.12557 8.5 0.0000 0.8347

Khóa luận tốt nghiệp đại học: Nghiên cứu khả năng nhân giống lan hài Vân Nam (Paphiopedilum callosum) từ phôi bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

Chủ đề:

Đồ án môn kỹ thuật y sinh

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ----------o0o---------

NGUYỄN THỊ THU HẰNG

Tên đề tài:

“NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN GIỐNG LAN HÀI VÂN NAM

(Paphiopedilum callosum) TỪ PHÔI BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY

IN VITRO”

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Khoa

: CNSH - CNTP

Khoá học

: 2015 - 2020

Thái Nguyên, năm 2020

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ----------o0o---------

NGUYỄN THỊ THU HẰNG

Tên đề tài

“NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN GIỐNG LAN HÀI VÂN NAM

(Paphiopedilum callosum) TỪ PHÔI BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY

IN VITRO”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Lớp : K47 CNSH

Khoa

: CNSH - CNTP

Khoá học

: 2015 - 2019

Giảng viên hướng dẫn: ThS. Nguyễn Thị Tình

Thái Nguyên, năm 2020

Phần 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................ 1

Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 3

Phần 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 21

Phần 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................. 28

Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 41

TÀI LIỆU THAM KHẢ0 ............................................................................. 42

PHỤ LỤC

2.1. Tổng quan về lan Hài (Paphiopedilum)

hệ số nhân nhanh chồi (lần)

Công thức

Hệ số nhân chồi (lần)

Chất lượng chồi

Nồng độ BA (mg/l)

CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 CT 5

Nồng độ Kinetin (mg/l) 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Số mẫu nuôi cấy (mẫu) 30 30 30 30 30

Tổng số chồi thu được (chồi) 47 48 57 67 56

Xanh đậm, mập Xanh đậm, mập Xanh đậm, mập Xanh đậm, mập Xanh nhạt, mập

LSD05 CV (%)

1,87 1,9 1,96 2,23 1,93 0,2 6,8

Hệ số nhân chồi (lần)

Hệ số nhân chồi (lần)

Tỷ lệ mẫu ra rễ (%)

Số rễ trung bình trên chồi( chồi)

5.1. Kết luận

I. Tiếng Việt

hài Vân Nam.

Tài liệu liên quan

Tóm tắt luận án Tiến sĩ: Đánh giá sự hiện diện một số kim loại nặng trong nghêu trắng Meretrix lyrate và môi trường sống của chúng

Tiểu luận môn Biến đổi khí hậu: Tác động của biến đổi khí hậu đến sức khỏa con người

Tiểu luận môn Biến đổi khí hậu: Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu đến sinh vật ngoại lai xâm lấn

Tiểu luận môn Biến đổi khí hậu: Biến đổi khí hậu và bệnh không lây nhiễm trên thế giới

Khoá luận tốt nghiệp ngành Kỹ thuật y sinh: Thiết kế và thi công mô hình camera đo thân nhiệt và nhắc nhở người không đeo khẩu trang

Đề tài nghiên cứu khoa học: Thiết kế, chế tạo đồ gá hàn ống vi sinh theo tiêu chuẩn Din 188-50

Đề tài nghiên cứu khoa học: Nghiên cứu, thiết kế và điều khiển hệ thống rối nước tư động

Đề tài nghiên cứu khoa học: Nghiên cứu, thiết kế và chế tạo máy làm bánh truyền thống Việt Nam

Đề tài nghiên cứu khoa học: Tối ưu hóa quá trình điều chế đĩa sử dụng một lần từ thân cây chuối

Đồ án tốt nghiệp Công nghệ thực phẩm: Thiết kế nhà máy sản xuất rau quả

Tài liêu mới

Khóa luận tốt nghiệp: Thiết kế các chức năng điều khiển trong nhà thông minh sử dụng logic mờ

Khóa luận tốt nghiệp: Tính toán, thiết kế, lắp đặt và khảo nghiệm hệ thống tuabin gió với bộ điều khiển MPPT

Báo cáo thực tập: Tại Nhà máy Ama cao Hà Nam, Khu đô thị An Lac Green Symphony (Hoài Đức - Hà Nội)

Thuyết minh đồ án: Hệ thống vận chuyển cho dây chuyền sản xuất dây điện năngsuất 20 sp/phút

Đồ án tổng hợp: Thiết kế máy nghiền vật liệu phế thải dẫn động 2 trục