Khóa luận tốt nghiệp đại học: Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào giống lúa J02 và Bắc Thơm số 7

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ HOA

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHUYỂN GEN

VÀO GIỐNG LÚA J02 VÀ BẮC THƠM SỐ 7

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Lớp

: K48 CNSH

Khoa

: CNSH - CNTP

Khóa học

: 2016 - 2020

Người hướng dẫn

: 1. TS. Bùi Tri Thức

2. TS. Nguyễn Tiến Dũng

THÁI NGUYÊN – NĂM 2020

LỜI CẢM ƠN

Được sự đồng ý của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa

Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trong thời gian thực tập tốt

nghiệp em đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào giống

lúa J02 và BắcThơm số 7”.

Trước hết em xin gửi tới Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công

nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm cùng các thầy cô giáo trong Khoa lời chúc

sức khỏe và lời cảm ơn sâu sắc, với sự chỉ bảo, quan tâm và đã tạo điều kiện thuận

lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu này.

Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo TS. Bùi Tri Thức,

giảng viên khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã chỉ bảo, quan tâm

giúp đỡ và hướng dẫn em hoàn thành tốt trong quá trình thực hiện đề tài.

Đồng thời, em xin cảm ơn thầy giáo TS. Nguyễn Tiến Dũng, giảng viên khoa

Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã hướng dẫn và tạo điều kiện tốt nhất

cho em trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp.

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất và luôn là chỗ

dựa tinh thần cho em trong suốt thời gian thực tập, cảm ơn bạn bè đã hết lòng động

viên, giúp đỡ và đồng hành với tôi trong suốt thời gian qua.

Trong quá trình thực tập, cũng như làm báo cáo thực tập với điều kiện thời

gian cũng như kinh nghiệm còn hạn chế không thể tránh được những sai sót. Em rất

mong nhận được sự chỉ bảo, đóng góp ý kiến của các thầy cô và các bạn để em có

điều kiện bổ sung, nâng cao ý thức của mình để đề tài được hoàn thiện hơn và phục

vụ tốt hơn công tác thực tế sau này.

Sau cùng, em xin kính chúc quý thầy, cô trong nhà trường, trong khoa Công

nghệ Sinh học và Công nhệ Thực phẩm dồi dào sức khỏe, tiếp tục sứ mệnh cao đẹp

của mình là truyền đạt kiến thức cho thế hệ sau.

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày… tháng ….năm 2020

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Hoa

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................. i

MỤC LỤC ...................................................................................................................... ii

DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT ...................................................... v

DANH MỤC BẢNG .................................................................................................... vi

DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................... vii

Phần 1. MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1

1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................... 1

1.2 Mục tiêu của đề tài ...................................................................................... 2

1.2.1 Mục tiêu tổng quát ................................................................................... 2

1.2.2 Mục tiêu cụ thể ......................................................................................... 3

1.3 Ý nghĩa khoa học ........................................................................................ 3

Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................. 4

2.1 Giới thiệu về cây lúa ................................................................................... 4

2.1.1 Vai trò của lúa gạo ................................................................................... 4

2.1.2 Giá trị kinh tế và chất lượng dinh dưỡng của cây lúa .............................. 5

2.1.3 Cây trồng biến đổi gen ............................................................................. 7

2.1.4 Các phương pháp - kỹ thuật biến đổi gen (chuyển gen) cây trồng .......... 8

2.1.5 Chỉ thị chọn lọc trong chuyển gen vào thực vật .................................... 13

2.2 Tổng quan tình hình trong nước và trên thế giới ...................................... 14

2.2.1 Tình hình trong nước .............................................................................. 14

2.2.2 Tình hình thế giới ................................................................................... 18

Phần 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 23

3.1 Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu .......................................... 23

3.2 Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 23

3.3 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 24

iii

3.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm ............................................................... 24

3.3.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của chủng vi khuẩn

Agrobacterium ................................................................................................. 25

3.3.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả

chuyển gen ....................................................................................................... 26

3.3.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy ........ 26

3.3.5 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc .......... 27

3.3.6. Phương pháp nhuộm GUS................................................................................. 28

3.3.7. Hoàn thiện quy trình chuyển gen ...................................................................... 28

3.4 Các phương pháp xử lý số liệu .................................................................. 28

Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................... 29

4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chủng khuẩn Agrobacterium ............ 29

4.1.1 Ảnh hưởng của chủng khuẩn đến hiệu quả chuyển gen trên giống lúa JO2 ... 29

4.1.2 Ảnh hưởng của chủng khuẩn đến hiệu quả chuyển gen trên giống lúa

Bắc Thơm .................................................................................................................... 30

4.2. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen ................ 31

4.2.1 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen trên giống lúa JO2

........................................................................................................................................ 31

4.2.2 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen trên giống lúa Bắc

thơm 7 ............................................................................................................................ 32

4.3. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy hiệu quả chuyển gen ................ 33

4.3.1. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen của giống

J02 .................................................................................................................................. 33

4.3.2. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen của giống

Bắc Thơm số 7 .............................................................................................................. 34

4.4. Ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu quả chuyển gen ............ 35

4.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu quả chuyển gen của giống lúa

J02 .................................................................................................................................. 35

4.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu quả chuyển gen đến giống lúa

Bắc Thơm số 7. ............................................................................................................. 36

Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................... 38

5.1 Kết luận ..................................................................................................... 38

5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 39

PHẦN PHỤ LỤC

DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

Từ, thuật ngữ Nghĩa đầy đủ của từ, thuật ngữ

viết tắt (cả tiếng Anh và tiếng Việt)

CRISPER/Cas Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat

GMO Genetically Modified Organisms

NST Nhiễm sắc thể

CT Công thức

GM Genetically Modified

2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu .......................................................... 23

Bảng 4.1. Ảnh hưởng của chủng khuẩn đến hiệu quả chuyển gen trên giống

J02. .................................................................................................. 29

Bảng 4.2. Ảnh hưởng của chủng khuẩn đến hiệu quả chuyển gen trên giống lúa

Bắc thơm 7 ...................................................................................... 30

Bảng 4.3. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen trên

giống lúa JO2 .................................................................................. 31

Bảng 4.4. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen trên

giống Bắc Thơm số 7. ..................................................................... 32

Bảng 4.5. Ảnh hưởng của thời gian đồng lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen

của giống lúa J02 ............................................................................ 33

Bảng 4.6. Ảnh hưởng của thời gian đồng lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen

của giống lúa Bắc Thơm số 7 ......................................................... 34

Bảng 4.7. Ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu quả chuyển gen của

giống lúa J02 ................................................................................... 35

Bảng 4.8. Ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu quả chuyển gen đến

giống lúa Bắc Thơm số 7. ............................................................... 36

vii

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Agrobacterium mang plasmid gây khối u ở thực vật (tumour inducing

plasmid- Ti plasmid), plasmid này chứa các gen vir và vùng gene cần

chuyển (T-DNA). Gen quan tâm được chèn vào vùng T-DNA. Các tế bào

tổn thương thực vật tiết ra hợp chất bảo vệ, hợp chất này kích thích sự biểu

hiện gen vir ở Agrobacterium. Vir protein tạo ra T-strand và một số protein

vir chuyển vaoftees bào thực vật qua kênh vận chuyển. Trong tế bào thực

vật, các protein vir tương tác với T-trand tạo ra phức hệ (T-complex). Phức

hệ này vào nhân tế bào thực vật, T-DNA chèn vào bộ gen thực vật và biểu

hiện gen quan tâm. ................................................................................... 12

Hình 2.2: Sản lượng lúa gạo của Việt Nam từ năm 2013-2018 ................................ 15

Hình 3.1. Sơ đồ quy trình chuyển gen ở lúa [6] ........................................................ 24

Phần 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Để đáp ứng nhu cầu lương thực ngày càng tăng và hạn chế các tác nhân làm

giảm năng suất và chất lượng lúa gạo, hiện nay xu hướng sử dụng các giống lúa biến

đổi gen đang được các nhà nghiên cứu khoa học đặc biệt quan tâm. Một số các nhà

nghiên cứu cũng đã thành công trong tạo giống lúa biến đổi gen như: Daisuke

Tokuhara và cộng sự đã tạo ra giống lúa chuyển gen MucoRice-ARP1có khả năng

cung cấp kháng thể chống Rotavirus [7]; nhóm nghiên cứu tại Viện Di truyền Nông

nghiệp đã chuyển gen thành công vào giống lúa IR64 [13]; Phan Tố Phượng và cộng

sự đã thành công trong việc chuyển gen Xa21 kháng bệnh bạc lá vào cây lúa thông

qua A.tumerfaciens [17]. Trên thực tế hiệu quả chuyển gen ở lúa còn gặp nhiều hạn

chế: tỷ lệ tạo mô sẹo, tỷ lệ nhân nhanh và hiệu quả tái sinh còn thấp, còn phụ thuộc

khả năng xâm nhiễm của A.tumerfaciens dẫn tới hiệu quả biến nạp gen còn thấp (chỉ

khoảng 11%).

Ngoài ra, các nghiên cứu tạo giống truyền thống chủ yếu dựa trên các phương

pháp lai tạo, chọn giống truyền thống nên hiệu quả đạt được không thực sự cao. Hơn

thế nữa, giống lúa Việt Nam còn có những hạn chế như: chịu hạn kém, hạt ngắn đem

lại năng suất và chất lượng kém. Sử dụng một số phương pháp tạo giống mới như:

Chỉnh sửa vector, dùng chỉ thị phân tử, gây đột biến, lai tạo chọn giống truyền

thống,… còn tồn đọng một số hạn chế nhất định. Một số ứng dụng mới trong chọn

giống cây trồng nhờ dùng chỉ thị phân tử, gây đột biến... tuy đã đạt được một số kết

quả nhất định nhưng vẫn có những hạn chế.

Thách thức đặt ra không riêng gì Việt Nam mà là vấn đề chung của các quốc

gia trên toàn thế giới, đặc biệt là các nước nông nghiệp là phải tạo ra nguồn lương

thực lớn mà chỉ sản xuất và canh tác trên một diện tích không thay đổi và có nguy cơ

bị thu hẹp.

Phương pháp chuyển gen ra đời được ví như “chìa khóa đa năng” để mở những

nút thắt vốn gây rất nhiều khó khăn cho các nhà chọn tạo giống truyền thống nhằm

tạo ra một giống cây trồng “hoàn hảo” hơn khi chúng được kết hợp với nhau. Với

hướng nghiên cứu này, các gen quy định những tính trạng quan tâm được chủ động

chuyển vào lúa, từ đó tạo ra các giống lúa mang các đặc tính như mong muốn của con

người.

Vì vậy phương pháp chuẩn gen bằng vi khuẩn Agrobacterium bằng nuôi cấy

phôi non biến nạp gen vào lúa đang được nghiên cứu giải pháp mới trong chọn tạo

các giống lúa. Giải pháp sử dụng các kĩ thuật chuyển gen để cải tạo giống lúa mới có

chứa hàm lượng các vi chất dinh dưỡng cao hơn, hạt dài hơn, năng suất và hiệu quả

cao.

Hơn thế nữa, quy trình chuyển gen vào giống lúa thông qua vi khuẩn

Agrobacterium có những ưu điểm như: gen ít bị đào thải; số lượng bản sao ít hơn do

đó tránh được hiện tượng ức chế lẫn nhau; tồn tại bền vững trong cơ thể thực vật do

sự phụ thuộc chặt chẽ vào hệ thống protein Vir, còn ở những phương pháp khác gen

mục tiêu được tái tổ hợp chuyên biệt nhờ hai trình tự IS hai đầu nhưng dễ dàng bị

tách ra ngay sau đó. Tuy nhiên vẫn còn một số những hạn chế như: có phổ tấn công

giới hạn; gây khối u cho cây hai lá mầm ( do cây một lá mầm là cây thuộc nhóm tiến

hóa nhất, nó tích lũy nhiều cơ chế kháng bệnh hơn cây hai lá mầm như khi bị thương

các tế bào có xu hướng hóa gỗ chứ không phân chia mạnh để tái tạo hoặc tiếp hợp

chất phenol như cây hai lá mầm…) [10].

Do vậy, tôi tiếp tục nghiên cứu về quy trình chuyển gen vào giống lúa thông

qua vi khuẩn Agrobacterium. Với mục tiêu góp phần trong nghiên cứu tạo giống lúa

có kích thước hạt dài, đáp ứng nhu cầu thị trường gạo thế giới, tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào giống lúa J02 và Bắc Thơm số 7”.

1.2 Mục tiêu của đề tài

1.2.1 Mục tiêu tổng quát

Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào giống lúa J02 và Bắc Thơm số 7 thông

qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.

1.2.2 Mục tiêu cụ thể

- Xác định ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen

- Nghiên cứu ảnh hưởng của chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển

gen.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu quả chuyển gen.

- Xây dựng quy trình chuyển gene tối ưu cho giống lúa Việt Nam.

1.3 Ý nghĩa khoa học

- Xây dựng và hoàn thiện được quy trình nghiên cứu chuyển gen của hai

giống lúa Việt Nam là J02 và Bắc Thơm số 7.

- Giúp sinh viên tiếp cận với nghiên cứu khoa học, ứng dụng lý thuyết vào

thực tiễn, nâng cao năng lực nghiên cứu và kỹ năng thực hành trong phòng thí

nghiệm

- Giúp sinh viên tiếp cận với nghiên cứu khoa học, ứng dụng lý thuyết vào thực

tiễn, nâng cao năng lực nghiên cứu và kỹ năng thực hành trong phòng thí nghiệm.

- Đề tài hoàn thiện quy trình chuyển gene trên hai giống lúa J02 và Bắc

thơm số 7 góp phần tạo tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo về chuyển gene vào

giống lúa J02 và Bắc Thơm số 7 Việt Nam, phục vụ công tác cải tạo năng xuất,

chất lượng giống lúa Việt Nam.

Phần 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về cây lúa

2.1.1 Vai trò của lúa gạo

Lúa gạo là nguồn lương thực chủ yếu nuôi sống hàng tỷ người trên thế giới.

Sản lượng lúa gia tăng trong thời gian qua đã mang lại sự an sinh cho con nguời, đặc

biệt đối với dân nghèo: gạo là nguồn cung cấp thức ăn chủ yếu. Các nước nghèo

thường dùng gạo là nguồn lương thực chính, khi thu nhập tăng lên mức tiêu thụ gạo

có xu hướng giảm xuống, thay thế bằng các loại thức ăn cung cấp nhiều protein và

vitamin hơn là năng lượng. Bangladesh và Thái Lan có mức tiêu thụ gạo cao nhất vào

những năm 1960 (tương đương 180 kg/người/năm), đến năm 1988 giảm xuống còn

khoảng 150 kg. Ở Việt Nam hiện nay mức tiêu thụ gạo bình quân vẫn còn ở mức cao,

khoảng 120 kg/người/năm. Tuy nhiên có thể nói, trên khắp thế giới, ở đâu cũng có

dùng đến lúa gạo hoặc các sản phẩm từ lúa gạo. Khoảng 40% dân số trên thế giới lấy

lúa gạo làm nguồn lương thực chính. Trên thế giới có hơn 110 quốc gia có sản xuất

và tiêu thụ gạo với các mức độ khác nhau. Lượng lúa được sản xuất ra và mức tiêu

thụ gạo cao tập trung ở khu vực Châu Á. Năm 1980, chỉ riêng ở Châu Á đã có hơn

1,5 tỷ dân sống nhờ lúa gạo, chiếm trên 2/3 dân số Châu Á. Con số này theo ước đoán

đã tăng lên gần gấp đôi [6].

Như vậy bên cạnh sự thu hút về nguồn lực con người thì sự thu hút nguồn lực

đất đai cũng lại khẳng định rõ vị trí của lúa gạo trong nền kinh tế quốc dân. Trong

những năm gần đây, Việt Nam có tổng sản lượng lúa hàng năm đứng thứ 5 trên thế

giới, nhưng lại là nước xuất khẩu gạo đứng hàng thứ 2 thế giới hiện nay với sản lượng

gạo xuất khẩu bình quân trên dưới 4 triệu tấn/năm. Thái Lan luôn là nước xuất khẩu

gạo dẫn đầu thế giới, hơn hẳn Việt Nam (thứ 2) cả về số lượng và giá trị, do có thị

trường truyền thống rộng hơn và chất lượng gạo cao hơn. Mỹ, Ấn Độ, Pakistan cũng

là những nước xuất khẩu gạo quan trọng, sau Việt Nam.

2.1.2 Giá trị kinh tế và chất lượng dinh dưỡng của cây lúa

Giá trị kinh tế

Trên thế giới cơ cấu sản xuất lương thực, lúa gạo chiếm 26,5%. Sản lượng lúa

đã vượt lên đứng thứ nhất trong các cây lương thực với tổng sản lượng là 650 triệu

tấn/năm. Mặc dù diện tích trồng lúa gạo đứng sau lúa mì nhưng sản lượng lúa năm

1993 đã đứng vị trí thứ nhất với tổng sản lượng là 573 triệu tấn/năm. Đặc biệt trong

những năm gần đây với sự phát triển của khoa học kỹ thuật trong công tác chọn tạo

giống và canh tác, phân bón thì năng xuất và chất lượng lúa gạo không ngừng tăng

lên [7].

Trên thế giới khoảng 40% dân số coi lúa gạo là cây lương thực chính, tới 25%

dân số sử dụng lúa gạo trên 1/3 khẩu phần ăn hàng ngày. Ở Việt Nam 100% dân số

sử dụng gạo làm lương thực chính. Trong lúa gạo chứa đầy đủ các thành phần dinh

dưỡng như tinh bột (62,5%), protein (7-10%), lipit (1-3%), xenlulo (10,9%), nước

11%...[22]. Ngoài ra gạo còn chứa một số chất khoáng và vitamin nhóm B, các axit

amin thiết yếu như: lizin, triptophan, threonin... chất lượng gạo thay đổi theo thành

phần axit amin, điều này phụ thuộc vào từng giống. Do thành phần các chất dinh

dưỡng tương đối ổn định và cân đối nên lúa gạo đã được sử dụng rộng rãi trong nhiều

lĩnh vực.

Chất lượng dinh dưỡng của lúa

Theo Yoshida (1981) [12], tinh bột là thành phần chủ yếu chiếm trên 80%

trong hạt gạo, nó được hình thành từ hai đại phân tử là amylose và amylopectin. Hàm

lượng amylose có thể được coi là tính trạng quan trọng nhất trong phẩm chất cơm vì

nó có tính chất quyết định tới việc cơm dẻo, mềm hay cứng. Hàm lượng amylose

càng thấp thì cơm càng mềm. Hàm lượng tinh bột trong hạt gạo thường có mối tương

quan nghịch với hàm lượng đạm. Nếu hàm lượng đạm trong hạt tăng thì hàm lượng

tinh bột trong hạt gạo thường giảm. Liều lượng phân bón thích hợp không những làm

giảm hàm lượng đạm mà còn làm tăng hàm lượng tinh bột.

Theo IRRI (2013), hàm lượng amylose khác nhau ở các giống lúa, hàm lượng

này càng thấp thì cơm càng mềm dẻo. Các giống lúa nếp thường có hàm lượng

amylose nhỏ hơn 2%, các giống lúa tẻ thường có hàm lượng amylose cao hơn. Các

giống lúa thuộc nhóm Japonica có hàm lượng amylose thấp hơn các giống thuộc

nhóm Indica. Hàm lượng amylose cũng tham gia quyết định tới độ bạc của hạt gạo.

Những giống có hàm lượng amylopectin cao thường có cấu trúc phân tử khá lỏng lẻo

vì thế đã tạo ra rất nhiều lỗ nhỏ trên bề mặt tinh bột và kết quả là toàn bộ nội nhũ có

màu trắng đục, do đó hàm lượng amylose tỷ lệ nghịch với độ bạc của hạt gạo. Vì vậy,

hướng nghiên cứu trong thời gian tới là phải dung hòa được cả hai yếu tố tỷ lệ trắng

trong và độ dẻo [4].

Japonica, nhiệt độ tăng vào thời gian này làm giảm hàm lượng amylose trong

hạt gạo. Hàm lượng amylose cũng biến động trong cùng một giống lúa; Tuy nhiên,

mức biến động thường chỉ dưới 2%. Các chân đất khác nhau cũng tạo ra sự biến động

hàm lượng amylose trên cùng một giống lúa, lúa trồng ở vùng đất phèn thường có

hàm lượng amylose cao hơn các vùng đất khác. Ngoài ra, lúa trồng ở vụ Mùa cũng

cho hàm lượng amylose cao hơn vụ Xuân. Nhìn chung, sự biến động hàm lượng

amylose của một số giống lúa dưới tác động của môi trường chỉ dao động trong

khoảng 6%. Amylose có cấu tạo mạch thẳng không phân nhánh tạo thành từ 300 -

1000 gốc glucose nhờ vào liên kết α-(1-4) glucose. Amylose phân bố bên trong hạt

tinh bột nên tan trong nước nóng, nhưng độ nhớt không cao, dễ lắng cặn, gây phản

ứng tủa với butanol và pentanol, bị nhiệt hóa hồ. Ở lúa, amylose có trọng lượng phân

tử là 100-200 kDa, chuỗi amylose tạo thành có dạng xoắn lò xo với 6 gốc glucose

trên một vòng, mỗi vòng xoắn hấp thụ một phân tử iodine vào bên trong tạo thành

dung dịch màu xanh, khi đun nóng thì iodine tách ra làm mất màu xanh. Người ta đã

dựa vào đặc tính này để xác định hàm lượng amylose có trong tinh bột. Mặc dù hàm

lượng protein trong gạo chỉ dao động khoảng 7%, nhưng protein trong lúa gạo vẫn

được coi là protein có phẩm chất cao, do nó có hàm lượng lysine cao. Với các nước

coi lúa gạo là thức ăn chính thì hàm lượng protein cao trong lúa gạo là nguồn bổ sung

protein cực kỳ quan trọng [13].

Theo Vũ Tiên Hoàng và cs (1988) [9], hàm lượng protein không giống nhau ở

các giống lúa. Thông thường, các giống lúa nếp có hàm lượng protein cao hơn các

giống lúa tẻ. Trong thời gian qua, các nhà chọn tạo giống trên Thế giới và Việt Nam

đã có nhiều thành công trong việc chọn tạo ra giống lúa có hàm lượng protein cao.

Gần đây nhất, các nhà chọn tạo giống của Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm đã

tạo ra các giống lúa P4, P6… có hàm lượng protein trên 10%. Hàm lượng protein là

tính trạng có cơ chế di truyền rất phức tạp và chịu tác động mạnh mẽ của môi trường.

Khi nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ không khí và nhiệt độ nước trong ruộng

đến hàm lượng protein.

Nguyễn Trọng Khanh (2016) [10] đã kết luận: nhiệt độ không khí hoặc nhiệt

độ nước trong ruộng cao sau khi lúa trỗ sẽ làm tăng hàm lượng protein và tỷ lệ hạt

chắc. Qua đó làm tăng năng suất hạt và năng suất protein trên một đơn vị diện tích.

Bên cạnh đó, hàm lượng protein cũng có quan hệ chặt chẽ với lượng phân bón đặc

biệt là phân đạm. Phân đạm có tác dụng tăng cường quá trình tổng hợp protein mà

không thay đổi đặc tính, phẩm chất của giống.

2.1.3 Cây trồng biến đổi gen

Một loài cây điển hình có từ 20.000 đến 40.000 gen. Các gen này chứa thông

tin chuyên biệt và cần thiết để cây hình thành lá, rể, hoa và hạt; nẩy mầm và sinh

trưởng; tiến hành quá trình quang hợp và hô hấp; sản sinh ra các loại hợp chất dự trữ

và hợp chất giúp cây chống chọi lại bệnh hại và sâu bọ; và giúp cây thích nghi với

các điều kiện môi trường như nóng, lạnh hoặc khô hạn [4].

Toàn bộ thông tin chứa trong DNA của cây lúa, nếu được thể hiện đầy đủ các

nucleotide (ATGC) sẽ có độ dài của khoảng 40.000 trang giấy. Mỗi gen trung bình ít

hơn một trang.

Từ xa xưa, việc gen cây trồng được “chuyển đổi”, “biến đổi” đã xảy ra trong

tự nhiên thông qua các hình thức như chọn lọc tự nhiên; thuần hóa cây trồng, lai tạo

giống, ghép cây ... Sinh học hiện đại gần đây đã bổ sung phương thức “biến đổi gen”

một cách chủ động bằng các kỹ thuật sinh học có kiểm soát. Cây trồng chuyển gen

(Genetically Modified Crop - GMC) là một trong các loại sinh vật biến đổi gen. Cũng

như sinh vật biến đổi gen, cây chuyển gen là một thực vật

mang một hoặc nhiều gen “lạ” được đưa vào bằng công nghệ hiện đại. Những

gen được tạo đưa vào (gen chuyển) có thể được phân lập từ những loài thực vật có

quan hệ họ hàng hoặc từ những loài khác biệt hoàn toàn với vật chủ [4].

2.1.4 Các phương pháp - kỹ thuật biến đổi gen (chuyển gen) cây trồng

Kỹ thuật chuyển gen cho phép nhà tạo giống cùng lúc đưa vào một thực vật

những gen mong muốn từ những sinh vật sống khác nhau, không chỉ giữa các loài

cây lương thực hay những loài có họ gần.

Có hai hình thức chuyển gen chủ yếu là chuyển gen trực tiếp và chuyển gen

gián tiếp. Chuyển gen cụ thể trên từng đối tượng sinh vật có phương pháp kỹ thuật

đặc trưng, gọi chung là kỹ thuật di truyền.

2.1.4.1 Phương pháp chuyển gen trực tiếp

- Kỹ thuật siêu âm

- Kỹ thuật điện xung

- Kỹ thuật PEG

- Kỹ thuật vi tiêm

- Kỹ thuật bắn gen

- Kỹ thuật chuyển gen bằng sốc nhiệt

2.1.4.2 Phương pháp chuyển gen gián tiếp

a) Biến nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium

- Vi khuẩn Agrobacterium

Agrobacterium tumefaciens và Agrobacterium rhizogenes là hai loài vi khuẩn

gây bệnh cho thực vật được sử dụng như các vector tự nhiên để mang các gen ngoại

lai vào mô và tế bào thực vật. A. tumefaciens có chứa một plasmid lớn kích thước

khoảng 200 kb gọi là Ti-plasmid (tumor inducing plasmid) chính là tác nhân truyền

bệnh cho cây. Khi cây bị nhiễm A. tumefaciens qua các vết thương, biểu hiện bệnh

rõ nhất là các khối u được hình thành ở ngay chỗ lây nhiễm. Sự hình thành khối u sau

đó có thể tiếp tục mà không cần thiết phải có sự hiện diện của vi khuẩn. Khả năng

này có được do A. tumefaciens đã chuyển một đoạn DNA của Ti-plasmid (T-DNA)

xâm nhập vào hệ gen của cây bị bệnh [11].

- Plasmid

Trong thế giới động-thực vật đều tồn tại các thể plasmid, đó là các vòng DNA

tự sinh sản độc lập. Ở vi khuẩn và động-thực vật, plasmid liên quan tới yếu tố giới

tính của tế bào, đến khả năng chống chịu các loại kháng sinh... Đặc điểm quan trọng

của plasmid là chúng có thể liên kết vào nhiễm sắc thể nhưng cũng có thể tồn tại bên

ngoài nhiễm sắc thể một cách độc lập.

Các plasmid của Agrobacterium được sử dụng vào công nghệ gen thực vật ở

hai dạng vector cis và trans. Đây là hai dạng vector rất thuận lợi để tái tổ hợp gen

ngoại lai và chuyển vào tế bào thực vật. Dạng cis chỉ sử dụng Ti-plasmid và tế bào

vật chủ là Agrobacterium tumefaciens mà không có sự tham gia của plasmid và vi

khuẩn khác. Vùng T-DNA của Ti-plasmid được thiết kế lại để gắn những gen ngoại

lai mong muốn, các phần còn lại của Ti-plasmid vẫn được giữ nguyên.

Agrobacterium tumefaciens được dùng làm tế bào vật chủ để nhân lên nhiều bản sao

của Ti-plasmid và chuyển gen. Dạng trans hay binary là dạng sử dụng hai hay nhiều

loại plasmid và vi khuẩn cùng lúc, ví dụ: vi khuẩn E. coli và Agrobacterium, plasmid

trong trường hợp này thích ứng với cả E. coli và Agrobacterium. Trước tiên, plasmid

của E. coli chứa đoạn T-DNA được giới hạn bởi bờ phải (right border-RB) và bờ trái

(left border-LB) mang gen ngoại lai được thiết kế và nhân lên trong vi khuẩn E. coli.

Tiếp đến plasmid mang gen ngoại lai được chuyển nạp vào vi khuẩn Agrobacterium

nhờ một helper plasmid (quá trình triparental matting). Vi khuẩn Agrobacterium đã

mang sẵn một loại plasmid khác chứa vùng vir (virulence region) có chức năng quan

trọng trong quá trình chuyển gen ngoại lai. Sự tồn tại song song hai plasmid này đã

tương tác lẫn nhau trong việc chuyển gen vào tế bào thực vật. Như vậy, gen ngoại lai

và vùng DNA giúp quá trình chuyển gen (vùng vir) không nằm trên cùng một plasmid

nên hệ chuyển gen này được gọi là hệ trans [11].

- Vùng T-DNA

Vùng T-DNA được nghiên cứu rất kỹ. Đó là một đoạn DNA có kích thước 25

kb trong đó chứa gen mã hóa cho sinh tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen

gây khối u (oncogenes). Trong Ti-plasmid, vị trí của T-DNA được giới hạn bằng RB

và LB. Ngoài T-DNA, trên Ti-plasmid còn có các vùng DNA mã hóa cho việc tái

sinh plasmid (replication), cho khả năng lây nhiễm và tiếp hợp (vùng vir), cho việc

tiêu hóa opine (opine catabolism) [9].

Trong các vùng DNA của Ti-plasmid, ngoài T-DNA, được nghiên cứu nhiều

hơn cả là vùng DNA phụ trách khả năng lây nhiễm còn gọi là vùng vir. Sản phẩm

hoạt động của các gen nằm trong vùng vir dưới tác động kích thích của các hợp chất

phenol tiết ra từ vết thương là một loạt các protein đặc hiệu như virE2, virB, virD,

virD2, virC1... Các protein này nhận biết các vết thương ở các cây chủ thích hợp (hầu

hết là cây hai lá mầm), kích thích sản sinh ra các đoạn T-DNA, bao bọc che chở các

đoạn DNA này và giúp chúng tiếp cận với hệ gen của cây chủ một cách an toàn [8].

Khi cây nhiễm A. tumefaciens, do T-DNA nạp vào trong hệ gen của cây chủ bắt

đầu hoạt động và sản sinh ra auxin, cytokinin và opine, toàn bộ sinh trưởng của cây

bị rối loạn, các tế bào phân chia vô tổ chức và tạo ra các khối u. Opine được vi khuẩn

sử dụng như một loại “thức ăn”. Nhờ gen chuyển hóa opine trên Ti-plasmid. Cơ chế

lây nhiễm của A. rhizogenes đối với cây hai lá mầm cũng tương tự, nhưng trong vùng

T-DNA của A. rhizogenes chỉ có gen sản sinh ra auxin, vì thế sự thay đổi hình thái

chính của thực vật là chúng tạo ra rất nhiều rễ tơ (hairy roots) khi bị nhiễm bệnh [8].

Trên thực tế bệnh cây, Agrobacterium chỉ gây hại ở cây hai lá mầm, vì vậy

người ta cho rằng chúng chỉ có thể đưa T-DNA vào hệ gen các cây hai lá mầm. Gần

đây, nhiều tác giả đã chứng minh khi nhiễm vi khuẩn, các cây một lá mầm cũng có

thể sản xuất opine và có thể khai thác khả năng biến nạp gen của Agrobacterium vào

cây một lá mầm.

- Chuyển DNA ngoại lai vào tế bào và mô thực vật nhờ Agrobacterium

tumefaciens

Cơ chế gây bệnh của các Agrobacterium là sau khi xâm nhiễm vào tế bào, chúng

gắn đoạn T-DNA vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật, dẫn đến sự rối loạn các

chất sinh trưởng nội sinh, tạo ra khối u (trường hợp A. tumefaciens) hoặc rễ tơ (trường

hợp A. rhizogenes). Khả năng chuyển gen này đã được khai thác để chuyển gen ngoại

lai vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật theo ý muốn.

Để gắn T-DNA vào tế bào thực vật, đầu tiên vi khuẩn A. tumefaciens phải tiếp

xúc với thành tế bào thực vật bị tổn thương. Quá trình này được thực hiện nhờ các

gen chvA và chvB. Gen chvB mã hoá một protein liên quan đến hình thành β-1,2

glucan mạch vòng, trong khi đó gen chvA xác định một protein vận chuyển, định vị

ở màng trong của tế bào vi khuẩn. Protein vận chuyển giúp vận chuyển β-1,2 glucan

vào khoảng giữa thành tế bào và màng sinh chất. β-1,2 glucan giữ vai trò quan trọng

để vi khuẩn Agrobacterium tiếp xúc với thành tế bào thực vật. Nếu không có sự tiếp

xúc này, sẽ không có sự dẫn truyền T-DNA [8].

Các sản phẩm protein của vùng vir có tác dụng cho việc dẫn truyền T-DNA từ vi

khuẩn vào tế bào thực vật. Các loại protein đó rất cần thiết cho quá trình cắt T-DNA khỏi

Ti-plasmid, cảm ứng thay đổi màng tế bào thực vật mà chúng tiếp xúc, tham gia di

chuyển phần T-DNA qua màng vi khuẩn tới tế bào chất của tế bào thực vật, vận chuyển

tới nhân rồi cuối cùng xâm nhập vào genome của cây chủ. Thực chất chỉ riêng T-DNA

của Ti-plasmid được chuyển vào genome tế bào thực vật, mà không còn phần nào khác.

Quá trình dẫn truyền chỉ do sản phẩm của các gen vir (vùng vir) và gen chv quyết định

mà không liên quan đến các gen khác trên T-DNA. Tuy nhiên, chuỗi DNA 25 bp (RB

và LB của T-DNA) có vai trò là vị trí cảm ứng cho các sản phẩm của tổ hợp các gen

vùng vir, đặc biệt là protein từ gen virE mang chúng dẫn truyền vào tế bào thực vật.

Chúng hoạt động như các tín hiệu nhận biết và khởi động quá trình dẫn truyền. Trước

hết gen virA trong tổ hợp gen vùng vir được phosphoryl hoá nhờ tác động của các hợp

chất phenol như acetosyringone giải phóng ra từ các tế bào thực vật tổn thương. Sản

phẩm của quá trình này lại tiếp tục phosphoryl hóa gen virG. Sản phẩm của gen virG

liên tiếp làm hoạt hóa toàn bộ các gen vir còn lại, mà hai gen cuối cùng được hoạt hóa

là gen virB và virE. Trước đó, khi gen virD được hoạt hoá, sản phẩm của nó cảm ứng

nhận biết RB và LB của T-DNA và làm đứt phần T-DNA ra khỏi DNA của Ti-plasmid

thành các sợi đơn [8]. Đồng thời quá trình phosphoryl hóa này cũng làm thay đổi thẩm

xuất màng tế bào thực vật, màng tế bào bị mềm ra và bị thủng. Các sợi đơn T-DNA được

gắn vào protein do gen virE tổng hợp và dịch chuyển về phía màng tế bào vi khuẩn.

Ngay sau đó, sợi T-DNA được trượt từ vi khuẩn vào tế bào thực vật. Cầu nối chính là sự

tiếp hợp (conjugation) giữa hai tế bào do cảm ứng sản phẩm gen virB mà thành. Khi T-

DNA đã được chuyển giao vào tế bào thực vật, chúng nhanh chóng xâm nhập vào

genome tế bào thực vật (integration) được ổn định và di truyền như các gen bình thường

khác [8].

Hình 2.1: Agrobacterium mang plasmid gây khối u ở thực vật (tumour inducing

plasmid- Ti plasmid), plasmid này chứa các gen vir và vùng gene cần chuyển (T-

DNA). Gen quan tâm được chèn vào vùng T-DNA. Các tế bào tổn thương thực vật

tiết ra hợp chất bảo vệ, hợp chất này kích thích sự biểu hiện gen vir ở

Agrobacterium. Vir protein tạo ra T-strand và một số protein vir chuyển vaoftees

bào thực vật qua kênh vận chuyển. Trong tế bào thực vật, các protein vir tương tác

với T-trand tạo ra phức hệ (T-complex). Phức hệ này vào nhân tế bào thực vật, T-

DNA chèn vào bộ gen thực vật và biểu hiện gen quan tâm.

b) Chuyển gen nhờ virus và phage

Kỹ thuật làm biến đổi gen cho cây trồng (chuyển gen) là một số trong các kỹ

thuật di truyền trong sinh học, dùng để gắn một gen mới, quy định cho một đặc tính

(tính trạng) có lợi (ví dụ như tính kháng bệnh hoặc sâu bọ).

Kỹ thuật chính trong chuyển gen gồm có: DNA tái tổ hợp/Biến nạp; Gắn DNA

thành các cấu trúc tái tổ hợp mới và đưa DNA vào một sinh vật mới.

Vì vậy kỹ thuật chuyển gen được cho là công cụ hữu hiệu trong việc tạo giống

mới và đã được ứng dụng rộng rãi trên thế giới ở nhiều loại cây trồng trong đó có lúa.

2.1.5 Chỉ thị chọn lọc trong chuyển gen vào thực vật

Các gen chỉ thị chọn lọc chung nhất mã hóa các protein khử độc các nhân tố

ức chế trao đổi chất như các kháng sinh hoặc chất diệt cỏ (herbicide). Các gen chỉ thị

sàng lọc thường được sử dụng là các gen β-glucuronidase (gusA) [8].

Bằng các phương pháp sinh học phân tử có thể tạo ra các cấu trúc DNA

plasmid, trong đó ngoài các gen khởi động (promoter gene), các gen của vi khuẩn

Agrobacterium giúp cho DNA plasmid gắn được vào bộ gen thực vật, gen ngoại lai

cần chuyển vào... còn có các gen giúp phân lập ra tế bào hoặc mô thí nghiệm.

Lắp ghép vào DNA plasmid với mục đích này được gọi là gen chỉ thị chọn lọc

hay gen chỉ thị sàng lọc [8].

Gen chỉ thị chọn lọc thường dùng nhất là các gen mã hóa cho một số enzyme chỉ

có trong vi khuẩn ở điều kiện tự nhiên mà không có trong giới thực vật. Sau khi

chuyển gen, nếu thấy enzyme vi khuẩn hoạt động thì có thể suy ra là toàn bộ DNA

plasmid đã được gắn vào bộ gen của thực vật và gen ngoại lai mà ta cần chuyển đã

trở thành một bộ phận của bộ máy di truyền thực vật [8].

Các gen chỉ thị thường dùng nhất là các gen: gus A, npt II, lux, cat, nos và bar.

- Gen npt II. Gen mã hóa cho neomycin phosphotransferase, đây là một

enzyme vi sinh vật có trọng lượng phân tử khoảng 25 kD, xúc tác cho phản ứng

phosphoryl hóa một số kháng sinh gốc aminoglycoside như neomycin, kanamycin và

G148. Trong phản ứng này, nhóm γ phosphate của ATP được gắn vào phân tử chất

kháng sinh làm nó trở nên bất hoạt do ngăn trở sự liên kết của kháng sinh với ribosome

[8].

- Gen bar. Gen bar là tên gọi của gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin

acetyltransferase (PAT), có tác dụng làm mất độc tính của phosphinothricin (PPT),

là hoạt chất chính của thuốc trừ cỏ như Bialaphos và Basta. Gen bar được tạo dòng

đầu tiên từ một dòng vi khuẩn Streptomyces hygroscopicus. Phương pháp đơn giản

nhất để kiểm tra sự có mặt của gen bar là phương pháp trực tiếp. Mô, tế bào hoặc cây

chuyển gen được đặt trên môi trường có các nồng độ phosphinothricin khác nhau

(hoặc các thuốc trừ cỏ tương ứng) và so sánh sinh trưởng của mô, tế bào hoặc cây đối

chứng đặt trên cùng môi trường [8].

- Gen gus A. Gen mã hóa cho sinh tổng hợp enzyme β-glucuronidase. β-

glucuronidase là một hydrolase xúc tác cho sự phân giải các β-glucuronide, sản phẩm

phân giải có màu xanh chàm đặc trưng, dễ nhận biết. β-glucuronide thường dùng nhất

trong phản ứng để nhận biết sự tồn tại của gen gus A là X-Gluc (5-bromo-4-chloro-

3-indolyl-β-D-glucuronide). Dung dịch X-Gluc không màu dưới tác động của

enzyme β-glucuronidase sẽ chuyển sang màu xanh chàm [8].

- Gen lacZ. Gen mã hóa cho enzyme β-galactosidase có trọng lượng phân tử

116 kD. Gen lacZ ở E. coli được dùng rất phổ biến trong công nghệ gen và đã có sẵn

các hệ thống phương pháp kiểm tra rất nhạy với thuốc thử X-Gal. Sự tồn tại hoạt động

của lacZ trong tế bào thực vật đã được khẳng định. Vì vậy trước khi kiểm tra sự có

mặt của gen lacZ ngoại lai, cần phải bất hoạt gen lacZ nội sinh bằng glutaraldehyde

[8].

- Gen cat. Được phân lập và tạo dòng từ dòng vi khuẩn Tn9, là gen gây khả năng

kháng chloramphenicol ở vi khuẩn nói chung. Gen cat đã được dùng rộng rãi trong

công nghệ gen động vật và thực vật vì gen cat mã hóa cho enzyme chloramphenicol

acetyltransferase (CAT). Enzyme này xúc tác phản ứng acetyl hóa hai vị trí trên phân

tử chloramphenicol và làm nó bất hoạt [8].

2.2 Tổng quan tình hình trong nước và trên thế giới

2.2.1 Tình hình trong nước

Việt Nam là một trong những nước có nghề truyền thống trồng lúa nước cổ

xưa nhất thế giới. Nông nghiệp trồng lúa vừa đảm bảo an ninh lương thực quốc gia,

vừa là cơ sở kinh tế sống còn của đất nước. Dân số nước ta đến nay hơn 90 triệu

người, trong đó dân số ở nông thôn chiếm gần 80% và lực lượng lao động trong nghề

trồng lúa chiếm

khoảng 70% lực lượng lao động cả nước. Điều đó cho thấy lĩnh vực nông

nghiệp trồng lúa thu hút đại bộ phận lực lượng lao động cả nước, đóng vai trò rất lớn

trong nền kinh tế quốc dân. Bên cạnh đó, ưu thế lớn của nghề trồng lúa còn thể hiện

rõ ở diện tích canh tác trong tổng diện tích đất nông nghiệp cũng như tổng diện tích

trồng cây lương thực. Ngành trồng trọt chiếm 4/5 diện tích đất canh tác trong khi đó

lúa giữ vị trí độc tôn, gần 85% diện tích lương thực. Theo báo cáo của Tổng cục thống

kê, sản lượng lúa cả năm 2013 ước tính đạt 55,7 (Tạ/ha), sản lượng năm 2014 ước

tính đạt 57,5 (Tạ/ha), sản lượng năm 2015 ước tính đạt 55,6 (Tạ/ha), năm 2016 sản

lượng lúa gạo đạt 55,8 (Tạ/ha), sản lượng năm 2017 đạt 55,5 ( Tạ/ha) và năm 2018

đạt 58,1 (Tạ/ha) [11].

Nguồn: Tổng cục thống kê năm 2018

Hình 2.2: Sản lượng lúa gạo của Việt Nam từ năm 2013-2018

Việt Nam là nước nông nghiệp, trong đó nghề trồng lúa đóng vai trò chủ đạo

trong cơ cấu cây trồng, nên lúa có ý nghĩa quan trong trong nền kinh tế, xã hội nước ta.

Cùng với việc áp dụng các biện pháp chọn, tạo giống mới có năng suất, chất lượng cao

và khả năng chống chịu tốt nên sản lượng lúa gạo nước ta không ngừng tăng lên, đã góp

phần quan trọng đưa bình quân lương thực đầu người tăng lên.

Cùng một số thành tựu cũng như mốc quan trọng trong chọn tạo giống cây

trồng như:

- Năm 1980: Lần đầu tiên thực hiện chuyển AND ngoại lai vào cây nhờ

Agrobacterium.

- Năm 1093: Tạo marker chọn lọc như chỉ thị màu sắc, chỉ thị với kháng sinh,

thiết kế lại plasmid Ti (loại bỏ gen gây khối u, cải gen mong muốn vào plasmid Ti).

- Năm 1984: Thực hiện chuyển gen trực tiếp và gián tiếp vòa tế bào

protoplast.

- Năm 1992: chuyển gen cho lúa mì

- Năm 1999: Chuyển gen tạo giống lúa có giá trị dinh dưỡng và hàm lượng

vitamin A cao.

- Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm với phương pháp thu thập nguồn

vật liệu giống lúa cạn chịu hạn địa phương và các dòng lúa cải tiến nhập nội từ Viện

Nghiên cứu lúa Quốc tế (IRRI) với phương pháp lai hữu tính kết hợp với gây đột biến

để tạo ra các tổ hợp lai có khả năng chịu hạn khá và năng suất cao như CH2, CH3,

CH 133, CH5, HD8, P6, XH8…trồng rộng rãi ở vùng Trung du miền núi phía Bắc,

Trung bộ, Đông Nam Bộ và Tây Nguyên.

- Viện Di truyền Nông nghiệp tạo ra hàng loạt giống lúa nổi tiếng như DT10,

DT11, A20, DT33, DT122, DT22, DT37, ĐS1,VS1, Khang Dân đột biến, DT68…có

năng suất cao chống chịu sâu bệnh tốt, thích ứng rộng là những giống chủ lực của

miền Bắc vào những thập niên 90 của thế kỉ trước và tiếp tục phát huy ở thời gian

hiện nay.

- Việt Nam cũng đã làm chủ được công nghệ sản xuất lúa lai hai và ba dòng

như Việt Lai 20,TH3-3,TH3- 4, TH3-5… của Trường Đại học Nông Nghiệp 1 Hà

Nội, các giống HYT 100, HYT 103, HYT 108,... của Viện Cây lương thực và Cây

thực phẩm.

Hiện nay, Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm vẫn tiếp tục đẩy mạnh

công tác nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu hạn và cho ra giống lúa chịu hạn mới đã

được công nhận là giống được phép sản xuất thử.

Từ năm 2000, Viện công nghệ sinh học đã tạo được 2 giống lúa DR1, DR2

có khả năng chịu hạn khá và cho năng suất ổn định ở vùng khó khăn về nước, hai

giống lúa này được gieo trồng rộng rãi ở các tỉnh miền núi phía Bắc, rất thích hợp

cho chân đất bạc màu nghèo dinh dưỡng và không chủ động tưới nước [9].

Một số kết quả nghiên cứu chọn tạo giống lúa ở Việt Nam những năm gần đây:

- Thu thập đánh giá nguồn vật liệu giống lúa địa phương phục vụ chọn tạo

giống lúa cho vùng canh tác nhờ nước trời vùng núi Tây Bắc Việt Nam của Trường

Đại học nông nghiệp 1 Hà Nội để làm vật liệu di truyền lai tạo giống lúa cho vùng

núi phía Bắc Việt Nam như G4, G6, G10, G13, G14, G19, G22, G24... [9].

- Chọn giống lúa lai hai dòng Việt Lai 20 của Trường Đại học nông nghiệp 1

Hà Nội có thời gian sinh trưởng 110-115 ngày, tiềm năng năng suất 8-10 tấn/ha, chất

lượng dinh dưỡng cao, thích hợp cho hệ thống canh tác 3-4 vụ/năm ở các tỉnh phía

Bắc.

- Nghiên cứu các giống lúa phẩm chất cao phục vụ đồng bằng sông Cửu Long

của Viện nghiên cứu lúa đồng bằng sông Cửu Long với phương pháp ứng dụng công

nghệ sinh học hợp với khảo nghiệm đồng ruộng để chọn tạo giống lúa ngắn ngày,

năng suất cao, chất lượng gạo tốt như OM1490, OM2517, OM3536, OM2717,

OM2718, OM3405, OM4495, OM4498, OM2514 trồng rộng rãi ở vùng sản xuất

ngập lũ Đồng bằng sông Cửu Long [7].

- Tạo giống lúa biến đổi gen giàu chất vi dinh dưỡng của Viện nghiên cứu

lúa đồng bằng sông Cửu Long dùng phương pháp Agrobacterium và hệ thống chọn

lọc manose chuyển gen với vector pCaCar, pEun3 mang gen psy, crtI vào giống lúa

IR6, MTL250, Tapei309 tạo ra các dòng lúa giàu Vitamine A giúp giảm suy dinh

dưỡng của cộng đồng dân cư nghèo với gạo là thực phẩm chính [6].

- Hiện nay, Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm vẫn tiếp tục đẩy mạnh

công tác nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu hạn và cho ra giống lúa chịu hạn mới đã

được công nhận là giống được phép sản xuất thử.

- Từ năm 2000, Viện công nghệ sinh học đã tạo được 2 giống lúa DR1, DR2

có khả năng chịu hạn khá và cho năng suất ổn định ở vùng khó khăn về nước, hai

giống lúa này được gieo trồng rộng rãi ở các tỉnh miền núi phía Bắc, rất thích hợp

cho chân đất bạc màu nghèo dinh dưỡng và không chủ động tưới nước [6].

Như vậy, ở Việt Nam mới chỉ có một số nghiên cứu sử dụng các phương

pháp lai truyền thống nhằm chọn tạo các giống lúa phục vụ cho các tỉnh khu vực

Đồng bằng sông Cửu Long. Các nghiên nghiên cứu tạo giống lúa có năng suất cao,

chất lượng tốt phục vụ cho sự phát triển kinh tế xã hội khu vực Trung du Miền núi

phía Bắc Việt Nam còn khá hạn chế. Đặc biệt việc sử dụng các phương pháp hiện đại

ứng dụng công nghệ chỉnh sửa hệ gen để tạo giống lúa năng suất cao phù hợp với

Khu vực Trung du, miền núi phía Bắc còn chưa được quan tâm nghiên cứu. Việc

nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chỉnh sửa hệ gen nhằm tạo ra các dòng giống lúa có

năng suất cao có ý nghĩa rất quan trọng, góp phần xóa đói, giảm nghèo cho các đồng

bào khu vực miền núi [4].

2.2.2 Tình hình thế giới

a) Công nghệ chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas9 trên cây lúa

Vấn đề quan tâm lớn nhất của công nghệ CRISPR/Cas là khả năng di truyền

của các gen đột biến và sự có mặt của các gen chuyển trong cây. Nhiều báo cáo đã

chứng minh rằng các đột biến một hay nhiều điểm đều có thể di truyền một cách ổn

định ở các thế hệ (Yan et al., 2016; Wang et al., 2014; Ji et al. 2015; Pan et al. 2016).

Pan và cộng sự (2016) [20], [17] đã chứng minh tính di truyền của các đột biến gen

PDS ở loài Solanum lycopersicum. Tương tự, Fauser và cộng sự (2014) cũng chứng

minh CRISPR/Cas tạo ra các dòng cà chua đột biến di truyền qua các thế hệ T0, T1

và T2. Liang và cộng sự (2017) đã tạo ra 5 dòng lúa mì đột biến không mang gen

ngoại lai từ 100 phôi non bằng công cụ CRISPR/Cas9 RNPs [17].

Phương pháp chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 đã được áp dụng ở gần 20 loài cây

trồng cho đến nay (Ricroch et al., 2017) [19], trong đó cây lúa đã và đang được quan

tâm với mục đích cải thiện các đặc tính nông sinh học liên quan đến năng suất, khả

năng chống chịu stress sinh học và phi sinh học [19].

Cải thiện năng suất và chất lượng

Zhou và cộng sự (2016) [16] ứng dụng kỹ thuật CRISPR/Cas9 tạo ra các đột

biến đặc hiệu gen TMS5 để tạo ra 11 dòng lúa indica TGMS mới. Trong một thí

nghiệm tương tự, công nghệ CRISPR/Cas9 đã được sử dụng để huớng đến gen mục

tiêu Carbon Starved Anther (CSA) giúp cây có khả năng thụ phấn trong điều kiện

ngày ngắn và ngày dài ở lúa japonica để phát triển lúa lai hai dòng PGMS 9522csa

và JY5Bcsa và một dòng rP(T)GMS145 (Li và cs., 2016) [20]. Các kết quả trên cho

thấy, CRISPR/Cas9 có tiềm năng ứng dụng để tạo các dòng TGMS trong nhân giống

lúa lai hai dòng [20].

Sự hư hỏng hạt trong quá trình bảo quản làm giảm chất lượng và khả năng nảy

mầm gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng. Khả năng lưu trữ hạt giống lúa bị chi phối

chủ yếu bởi các enzyme lipoxygenase (LOX) xúc tác quá trình khử oxy của axit béo

để tạo thành hydroperoxit. Ba trong số 14 protein LOX (LOX1, LOX2 và LOX3) có

chức năng riêng biệt trong cây lúa có tác động bất lợi đến thời gian bảo quản hạt

giống. Ma và cộng sự (2015) [23] ứng dụng công nghệ TALEN để tạo đột biến hiệu

quả cho gen LOX3 sử dụng một cặp monome. Kết quả cho thấy hạt của các dòng đột

biến có khả năng lưu trữ được cải thiện [23].

Cải thiện khả năng chống chịu stress sinh học

Wang và cộng sự (2016) [18] đã sử dụng công nghệ CRISPR/Cas9 SSN để

chỉnh sửa gen mục tiêu sERF922 tại một và nhiều vị trí. Trong số 21 dòng đột biến

được tạo ra tất cả đều mang các allele đột biến tăng khả năng kháng bệnh và di truyền

sang các thế hệ T0, T1 và T2 [18].

Cải thiện kháng stress phi sinh học

Gần đây, đột biến dựa trên chỉnh sửa bộ gen đã được ứng dụng để tạo ra các

giống lúa chịu thuốc diệt cỏ (Li và cs, 2016; Sun và cs, 2016) [20]. Theo Li và cộng

sự (2016) đã thay thế gen bằng kỹ thuật TALEN dựa trên tái tổ hợp tương đồng (HR)

trên cây lúa và tạo ra đột biến điểm kép gen OsALS tăng khả năng chống chịu thuốc

diệt cỏ. Hiệu suất đột biến là 6,3% và ổn định cho khả năng chịu thuốc diệt cỏ mạnh.

Trong một thí nghiệm tương tự, HR qua trung gian CRISPR/Cas9 đã được thực hiện

để tạo nhiều đột biến điểm riêng lẻ trong gen ALS ở lúa (Sun và cs, 2016) [20]. Sàng

lọc kiểu hình cho thấy cây dại mọc sau 36 ngày phun bispyribac natri (BS) trong khi

các dòng đột biến chỉnh sửa gen có khả năng chịu đựng với BS và sinh trưởng bình

thường. Do đó, công nghệ chỉnh sửa bộ gen có thể là công cụ hiệu quả để tạo ra cây

lúa kháng thuốc diệt cỏ đồng hợp tử [20].

Cây lúa nhạy cảm với nhiệt độ thấp, đặc biệt là ở giai đoạn cây con. Do đó,

cải thiện khả năng chịu lạnh có thể tăng cường đáng kể năng suất lúa. TIFY1b, một

yếu tố phiên mã, là một trong những yếu tố chịu lạnh liên quan đến gen được phát

hiện trên cây lúa. Công nghệ CRISPR/Cas9 đã được sử dụng để chỉnh sửa TIFY1b

và gen tương đồng TIFY1a (Huang và cs, 2017) [21]. Các đột biến điểm đăc hiệu đã

được quan sát thấy ở cây lúa T0. Nghiên cứu chỉ ra rằng các dòng đột biến TIFY1 có

thể được tiếp tục sử dụng để nghiên cứu vai trò của gen TIFY1 trong sự thích nghi

của cây lúa với nhiệt độ thấp [21].

Cải thiện dinh dưỡng cây trồng

Chỉnh sửa bộ gen cũng có thể được sử dụng để sửa đổi gen lúa dẫn đến các

giống không độc hại và lành mạnh hơn. Cadmium (Cd) là một kim loại nặng có độc

tính cao, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe ở những người tiêu thụ gạo như

một loại lương thực chính. Hàm lượng Cd trong các giống indica tương đối nhiều

hơn so với các giống lúa japonica và cần được kiểm soát về an toàn thực phẩm (Arao

và Ishikawa, 2006; Grant và cs, 2008) [21]. Một số biện pháp như xử lý đất, xử lý ô

nhiễm, ngập đồng ruộng và sử dụng than đã được thực hiện để giảm mức Cd nhưng

chúng chỉ có hiệu quả ở một mức độ nào đó. Các cách tiếp cận thông thường để phát

triển các giống lúa Cd thấp là một thách thức rất lớn và các chiến lược mới cho các

dòng lúa hấp thu ít Cd là bắt buộc đối với sức khỏe cộng đồng. Hệ thống chỉnh sửa

CRISPR/Cas9 gần đây đã được sử dụng để phát triển các dòng lúa indica với mức

tích lũy Cd thấp bằng cách loại bỏ gen vận chuyển kim loại OsNramp5 (Tang và cs,

2017) [22]. Thử nghiệm thực địa các dòng lúa indica đột biến cho thấy nồng độ Cd

trong hạt OsNramp5 luôn thấp [22].

hơn 0,05 mg/kg, so với nồng độ Cd cao từ 0,33 đến 2,90 mg/kg trong hạt gạo indica

loại hoang dại mà không ảnh hưởng đến năng suất cây trồng. Hệ thống chỉnh sửa bộ

gen dự kiến sẽ được sử dụng trong tương lai gần để giảm thiểu nhiều rủi ro ô nhiễm

kim loại nặng trong hạt gạo [22].

b) Chuyển gen trên cây lúa

Một trong những công trình nghiên cứu đánh dấu bước tiến bộ quan trọng

trong kỹ thuật chuyển gen lúa sử dụng A. tumefaciens là công trình của Hiei et al.

(1994) [11]. Nhóm nghiên cứu này đã xây dựng được quy trình chuyển gen hiệu quả

cho một số giống lúa nhóm Japonica như Tsukinohikari, Asanohikari và Koshihikari.

Từ đó, kỹ thuật này được áp dụng rộng rãi và cải tiến ở nhiều phòng thí nghiệm trên

thế giới [11].

Hiện nay, trên thế giới việc xác định chức năng gen ở cây lúa rất được chú

trọng và giữ một vai trò quan trọng trong nghiên cứu cơ bản cũng như nghiên cứu

ứng dụng. Bằng phương pháp nghiên cứu chức năng gen có thể khám phá ra được

các gen kiểm soát những đặc điểm nông sinh học quan trọng như năng suất, chất

lượng hạt, tính chống chịu stress sinh học và phi sinh học, hiệu quả sử dụng dinh

dưỡng. Thành công trong kỹ thuật chuyển gen lúa mở đường cho việc nghiên cứu

chức năng gen theo các hướng: gây bất hoạt gen, gây siêu biểu hiện gen và đánh giá

mức độ hoạt động của promoter thông qua biểu hiện của gen chỉ thị [11].

Vì vậy chọn giống lúa đột biến được bắt đầu từ những năm 1960 và cho đến

năm 2006 đã có rất nhiều giống lúa đột biến được đưa ra sản xuất trên thế giới. Năm

1966, Nhật Bản đã đưa ra sản xuất giống lúa Remei - là một giống đột biến của từ

giống lúa địa phương chịu lạnh Fujiminori - có đặc điểm thấp cây, chống đổ, được

ưa chuộng và thường được sử dụng trong việc lai tạo với các giống lúa khác. Hiện

nay đã có hơn 60 giống lai tạo từ giống Remei được trồng ở Nhật Bản và đặc biệt là

giống lúa Ikuhikari được tạo ra bằng cách lai giữa Remei và giống lúa đặc sản

Koshihikari để đưa gen chống đổ sd1 vào giống lúa Koshihikari. Giống lúa đột biến

từ giống Pandawangi là một giống lúa địa phương nổi tiếng về hương thơm, vị ngon

và có thêm đặc tính kháng bệnh rầy nâu BHP type 1. Một trong những công trình

nghiên cứu đánh dấu bước tiến bộ quan trọng trong kỹ thuật chuyển gen lúa sử dụng

A. tumefaciens là công trình của Hiei et al. (1994) [11]. Từ đó, kỹ thuật này được áp

dụng rộng rãi và cải tiến ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới [11].

Tại Ấn Độ, ba giống lúa chất lượng là Basmati 370, Pusa Basmati 1 và

Pakistan Basmati được sử dụng làm vật liệu cho chọn giống đột biến. Các giống này

được xử lý chiếu xạ bằng tia gamma với liều chiếu 100, 150 và 200 Gray. Qua thế hệ

M7 đã chọn lọc được 15 dòng đột biến từ giống Basmati 370, 07 dòng đột biến từ

giống Pusa Basmati 1 và 10 dòng đột biến từ giống lúa Pakistan Basmati. Trong số

các dòng đột biến nhận được, thấy xuất hiện một dòng đột biến triển vọng là CR2007,

có nguồn gốc từ Basmati 370. Dòng CR2007 có chất lượng tương tự như giống

Basmati gốc, nhưng có năng suất vượt trội so với giống gốc và còn có đặc tính kháng

đạo ôn cổ bông, bệnh đốm nâu [11].

Phần 3

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu

Giống lúa: Giống lúa J02 và giống lúa thuần Bắc Thơm số 7

Vi khuẩn : chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình

chuyển gen ở cây lúa thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.

Thiết bị sử dụng và dụng cụ nghiên cứu

Bảng 3.1. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu

Thiết bị Dụng cụ

Cân phân tích Pank

Máy khuấy từ Đèn cồn

Máy đo PH Cốc đong, ống đong

Lò vi sóng Đĩa (hạt đậu, peptri)

Nồi hấp vô trùng Bình tam giác

Tủ sấy Màng bọc

Hệ thống giàn đèn Chun nịt

Máy cất nước Túi nilon

Box cấy vô trùng Giấy thấm

Cùng các trang thiết bị, dụng cụ khác phục vụ nghiên cứu của Phòng Thí

nghiệm Khoa CNSH&CNTP.

3.2 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của chủng khuẩn vi Agrobacterium đến

hiệu quả chuyển gen.

Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả

chuyển gen.

Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả

chuyển gen.

Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu quả

chuyển gen.

Nội dung 5: Nghiên cứu hoàn thiện quy trình chuyển gen.

3.3 Phương pháp nghiên cứu

Hình 3.1. Sơ đồ quy trình chuyển gen ở lúa [6]

3.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm

a. Phương pháp bố trí thí nghiệm

- Điều kiện thí nghiệm: Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng Công nghệ

sinh học thực vật (Khoa CNSH & CNTP) trong điều kiện nhiệt độ phòng (25ºC ±

2, độ ẩm 60 - 65%, thời gian chiếu sáng 16h/ngày, cường độ chiếu sáng 2000 –

2500 lux.

- Bố trí thí nghiệm: Tất cả các thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên

hoàn toàn mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 100 mẫu.

b. Khử trùng hạtvà tạo mô sẹo

Hạt lúa chín được tách bỏ vỏ trấu, sau đó khử trùng bằng viên khử trùng

EFFERVESCENT (không độc hại) nồng độ 5g/200ml nước trong thời gian 20 phút.

Tiếp đến, hạt được khử trùng bằng cồn 70% trong thời gian 3 phút. Hạt được tráng

sạch với nước cất khử trùng 3-4 lần, sau đó thấm khô bằng giấy thấm trước khi đưa

vào nuôi cấy. Hạt được nuôi cấy tạo môi sẹo trên môi trường N6+2mg/l 2,4D ở điều

kiện nhiệt độ 25OC, thời gian chiếu sáng 16h/ngày. Mỗi công thức thí nghiệm tiến

hành 100 mẫu.

3.3.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của chủng vi khuẩn Agrobacterium

Vi khuẩn A. tumefaciens được cất giữ trong glycerol ở -80OC được cấy trải

trên đĩa peptri chứa môi trường LB (Yeast Extract Powder 5g/L, pepton hoặc trypton

10g/L, agar 12g/L) nuôi cấy trong 3 ngày ở 28oC. Chuyển vi khuẩn A. tumefaciens từ

đĩa nuôi cấy (lấy đầy một loop kim cấy) vào ống falcon 50 mL đã khử trùng có chứa

40 mL môi trường lây nhiễm AAM+AS.

Bốn chủng vi khuẩn A.tumfaciens AGL1, EHA105, GV3101 và LBA4404

được sử dụng để chuyển gen cho giống lúa Bắc Thơm số 7 trong nghiên cứu này. Thí

nghiệm được tiến hành như sau: mô sẹo và hạt lúa 5 ngày tuổi sẽ được xử lý với 50

ml các chủng khuẩn A. tumefaciens khác nhau đã được chuẩn bị sẵn trong môi trường

AAM trước khi cấy lên môi trường đồng nuôi cấy N6D-AS và nuôi cấy trong 3 ngày.

Tiếp đó, chuyển lên môi trường N6D để sàng lọc và kiểm tra hiệu quả chuyển gen.

Các chủng khuẩn này cùng mang một cấu trúc vector có chứa gen chọn lọc kháng

Glufocinate. Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn với 5 công thức và 3 lần nhắc

lại, 100 mẫu/ lần nhắc lại. Thí nghiệm gồm các công thức như sau:

Công thức 1: Không dùng vi khuẩn (đối chứng)

Công thức 2: Chủng vi khuẩn AGL1

Công thức 3: Chủng vi khuẩn EHA105

Công thức 4: Chủng vi khuẩn GV3101

Công thức 5: chủng vi khuẩn LBA4404

Các chỉ tiêu theo dõi gồm số mẫu cấy, số mẫu nhiễm, số mẫu chết, số mẫu

sống trên môi trường chọn lọc được theo dõi sau 7, 14 ngày; số mẫu nhuộm GUS.

3.3.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả

chuyển gen

Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả

chuyển gen được tiến hành với hai giống lúa J02, giống Bắc Thơm số 7. Nghiên cứu

sử dụng chủng vi khuẩn A. tumefacien EHA105, chủng vi khuẩn được sử dụng rất

nhiều trong chuyển gen vào cây lúa trên thế giới.

Mô sẹo và hạt lúa 5 ngày tuổi sẽ được xử lý với 50 ml vi khuẩn EHA105

mang gen chọn lọc đã được chuẩn bị sẵn trong môi trường AAM trước khi cấy lên

môi trường đồng nuôi cấy N6D-AS và nuôi cấy trong 3 ngày. Tiếp đó, mẫu chuyển

lên trên môi trường N6D-GA để kiểm tra hiệu quả chuyển gen. Thí nghiệm được bố

trí ngẫu nhiên hoàn toàn gồm 6 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 100

mẫu.

Công thức 1: 0 phút (đ/c)

Công thức 2: 1 phút

Công thức 3: 2 phút

Công thức 4: 3 phút

Công thức 5: 4 phút

Công thức 6: 5 phút

Các chỉ tiêu theo dõi gồm số mẫu cấy, số mẫu nhiễm, số mẫu sống, số mẫu

chết trên môi trường chọn lọc được theo dõi sau 7, 14 ngày; số mẫu nhuộm GUS.

3.3.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy

Thời gian đồng nuôi cấy ảnh hưởng nhiều đến hiệu quả chuyển gen. Xác định

được thời gian đồng nuôi cấy thích hợp góp phần làm tăng hiệu quả khi chuyển các

gen khác vào cây trồng. Thí nghiệm được tiến hành như sau: hạt gạo và mô sẹo 5

ngày tuổi trên môi trường N6D được ngâm trong dung dịch AAM có chứa vi khuẩn

EHA105 trong 3 phút. Sau đó, mẫu lúa được chuyển lên môi trường N6D-AS nuôi

cấy với 4 mốc thời gian khác nhau . Sau đó, các mẫu này được chuyển sang môi

trường N6D-GA và theo dõi trong 20 ngày. Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hoàn

toàn với 4 công thức, 3 lần nhắc lại, 100 mẫu cho mỗi lần nhắc lại. Các công thức

được bố trí như sau:

Công thức 1: 0 ngày (đ/c)

Công thức 2: 1 ngày

Công thức 3: 2 ngày

Công thức 4: 3 ngày

Công thức 5: 4 ngày

Công thức 6: 5 ngày

Các chỉ tiêu theo dõi gồm số mẫu cấy, số mẫu nhiễm, số mẫu chết, số mẫu

sống trên môi trường chọn lọc được theo dõi sau 7, 14 ngày; số mẫu nhuộm GUS.

3.3.5 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc

Glufocinate là thuốc trừ cỏ tự nhiên, nó có khả năng tiêu diệt những tế bào

thực vật thông thường. Chỉ có những tế bào mang gen kháng lại Glufocinate-

ammonium mới có khả năng sống sót trên môi trường có chứa Glufocinate

ammonium. Nồng độ chất chọn lọc này ảnh hưởng nhiều đến hiệu quả chuyển gen.

Nồng độ chất chọn lọc quá thấpsẽ thu được nhiều cây sau chuyển gen, tuy

nhiên số lượng cây dương tính sẽ thấp và ngược lại, nồng độ chất chọn lọc cao, số

cây sống sẽ rất thấp, nhưng tỷ lệ cây chuyển gen cao. Nếu quá cao sẽ làm chết cả

những tế bào chuyển gen. Do vậy, có nồng độ chất chọn lọc thích hợp sẽ góp phần

nâng cao hiệu quả chuyển gen. Thí nghiệm tiến hành trên môi trường N6D-GA với

7 mức nồng độ chất chọn lọc glufosinate ammonium khác nhau từ 0 – 11 mg/l môi

trường. Thí nghiệm được tiến hành như sau: hạt gạo và mô sẹo 5 ngày tuổi trên môi

trường N6D được ngâm trong dung dịch AAM có chứa vi khuẩn A. tumefaciens

EHA105 trong 3 phút. Sau đó, mẫu lúa được chuyển lên N6D-AS trong 3 ngày và

nuôi cấy trong 3 ngày ở 250C. Sau đó, các mẫu này được chuyển sang môi trường

chọn lọc N6D-GA có chứa Glufocinate ammonium và cefotacim và theo dõi trong

21 ngày. Các chỉ tiêu theo dõi gồm số mẫu cấy, số mẫu nhiễm, số mẫu sống, số mẫu

chết, số mẫu tái sinh trên môi trường chọn lọc được theo dõi sau 7, 14 ngày; số mẫu

nhuộm GUS. Các công thức thí nghiệm được bố trí như sau:

Công thức 1: 1 mg/l

Công thức 2: 3 mg/l

Công thức 3: 5 mg/l

Công thức 4: 7 mg/l

Công thức 5: 9 mg/l

Công thức 6: 11mg/l

3.3.6. Phương pháp nhuộm GUS

Để kiểm tế bào chuyển gen có mang gen GUS hay không, tế bào chuyển gen

được nhuộm với dung dịch 5-Br-4-Cl-3-indolyl β-D-glucuronide cyclohezylamine

trong 48 giờ. Mẫu chuyển gen được rửa bằng dung dịch Ethanol 70% trước khi quan

sát bằng kính lúp soi nổi.

3.3.7. Hoàn thiện quy trình chuyển gen

Kết quả nghiên cứu sẽ được thu thập, tổng hợp so sánh từ đó rút ra quy trình

chuyển gene có hiệu quả chuyển gene cao phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.4 Các phương pháp xử lý số liệu

Số liệu của các thí nghiệm được thu thập hàng tuần. Số liệu tinh được phân

tích sự sai khác theo phương pháp so sánh cặp đôi One-way ANOVA with post-hoc

Tukey HSD (Honestly Significant Difference) trên phần mềm Excel.

Tổng chồi thu được Tổng số mẫu sống (mẫu)  100%  100% Hệ số nhân chồi = Tỷ lệ mẫu sống (%) = Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) Tổng chồi nuôi cấy

Các chỉ tiêu theo dõi sẽ được tính toán theo các công thức sau:

Tổng số mẫu chết (mẫu) Tỷ lệ mẫu chết (%) = Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)

Phần 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chủng khuẩn Agrobacterium

Chủng vi khuẩn A. tumefaciens sử dụng cũng ảnh hưởng nhiều đến hiệu quả

chuyển gen. Để lựa chọn được những chủng khuẩn có hiệu quả chuyển gen cao vào

giống lúa Việt Nam , nhóm nghiên cứu đã tiên hành thí nghiệm về khả năng chuyển

gen của các chủng vi khuẩn khác nhau trên giống lúa giống lúa Bắc thơm số 7.

4.1.1 Ảnh hưởng của chủng khuẩn đến hiệu quả chuyển gen trên giống lúa JO2

Kết quả thử nghiệm khả năng chuyển gen của các chủng vi khuẩn A.

tumefaciens trên giống lúa J02 thu được trong bảng 4.1.

Bảng 4.1. Ảnh hưởng của chủng khuẩn đến hiệu quả chuyển gen

trên giống J02.

Chỉ tiêu đánh giá sau 14 ngày

Công thức

Số bắt màu GUS (mẫu) Số mẫu lây nhiễm trung bình

300 300 300 300 300 Số mẫu sống trung bình 0,0 70,0 100,7 73,0 89,7 Số mẫu chết trung bình 300,0 230,0 199,3 227,0 210,3 0 57 83 60 74 0 dùng vi khuẩn (đ/c) Chủng AGL1 Chủng EHA105 Chủng GV3101 Chủng LBA4404

Tỷ lệ mẫu sống (%) 0,0c 23,3d 33,6a 24,3c 29,9b 1,27 LSD0,05

8,09 CV%

(Ghi chú:a, b, c và d là các nhóm khác nhau có ý nghĩa theo phương pháp phân

tích one-way ANOVA của Tukey HSD, mức ý nghĩa  = 0,05)

Số liệu ở bảng 4.1 chỉ ra rằng, các chủng khuẩn khác nhau có khả năng chuyển

gene khác nhau vào cây lúa JO2. Hiệu quả chuyển gen+ thông qua tỷ lệ mẫu sống

dao động từ 23,3% đến 33,6%. So sánh hiệu quả chuyển gen có thể phân chúng thành

02 nhóm. Nhóm có hiệu quả chuyển gen cao nhất là chủng A. tumefaciens EHA105

với tỷ lệ sống lên đến 33,6%. Tiếp đó là nhóm của chủng LBA4404 cho hiệu quả

chuyển gen đạt 29,9%. Đứng sau là nhóm gồm chủng AGL1 và chủng GV301 có

hiệu quả chuyển gen thấp hơn lần lượt đạt tỷ lệ sống là 23,3 và 24,3%. Ảnh hưởng

của chủng khuẩn đến hiệu quả chuyển gen cũng đã được kiểm tra trên giống lúa Bắc

thơm 7.

4.1.2 Ảnh hưởng của chủng khuẩn đến hiệu quả chuyển gen trên giống lúa

Bắc Thơm

Bảng 4.2. Ảnh hưởng của chủng khuẩn đến hiệu quả chuyển gen

trên giống lúa Bắc thơm 7

Chỉ tiêu đánh giá sau 14 ngày

Công thức

Số mẫu lây nhiễm trung bình Số bắt màu GUS (mẫu) Tỷ lệ mẫu sống (%)

300 300 300 300 300 Số mẫu sống trung bình 0,0 56,7 94,0 61,7 84 Số mẫu chết Trung bình 300,0 243,3 206,0 238,3 216,0 0,0e 18,9d 31,3a 20,6c 28,0b 1,21 0 46 77 51 69 0 dùng vi khuẩn(đ/c) Chủng vi AGL1 Chủng EHA105 Chủng GV3101 Chủng LBA4404 LSD0,05

5,81 CV%

(Ghi chú:a, b, c, d và e là các nhóm khác nhau có ý nghĩa theo phương pháp phân

tích one-way ANOVA của Tukey HSD, mức ý nghĩa  = 0,05)

Số liệu trong bảng 4.2 chỉ ra rằng ảnh hưởng của các chủng khuẩn nêu trên

trên giống Bắc thơm 7. Tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc dao động từ 18,9 đến 31,3 %.

Theo tỷ lệ mẫu sống và số lượng mẫu bắt màu GUS có thể chia các chủng khuẩn

thành 2 nhóm. Nhóm gồm chủng AGL1 và chủng GV3101 cho tỷ lệ mẫu sống sau

chọn lọc thấp hơn lần lượt là 18,9 và 20,6%. Trong khi đó, chủng EHA105 và chủng

LBA4404 cho hiệu quả cao hơn. Tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc lần lượt là 28,0 và

31,3%. Từ kết quả thử nghiệm về tác động của các chủng khuẩn trên giống lúa Bắc

thơm số 7 có thể rút ra rằng chủng EHA105 và chủng LBA4404 cho hiệu quả chuyển

gen cao hơn. EHA105 có phần tốt hơn hẳn sẽ tiếp tục được sử dụng cho các nghiên

cứu tiếp theo. Nhóm nghiên cứu tiếp tục xác định ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi

cấy chủng EHA105 đến hiệu quả chuyển gen.

4.2. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen

Thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả được thực hiện

trên hai giống lúa JO2 và Bắc thơm 7 được trồng khá phổ biến ở Việt Nam.

4.2.1 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen trên giống lúa

JO2

Để xác định ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen giống

lúa JO2, mô sẹo 5 ngày tuổi từ hạt gạo được lây nhiễm với chủng khuẩn A.

tumefaciens EHA105. Kết quả chỉ ra ở bảng 4.3.

Bảng 4.3. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen trên

giống lúa JO2

Chỉ tiêu đánh giá sau 14 ngày

Công thức Số mẫu lây nhiễm trung bình Số bắt màu GUS (mẫu)

0 phút (đ/c)

1 phút 2 phút 3 phút 4 phút 5 phút

LSD0,05 CV% 300 300 300 300 300 300 Số mẫu sống trung bình 0,0 58,7 64,7 101,7 105,7 105,3 Số mẫu chết trung bình 300,0 241,3 235,3 198,3 194,3 194,7 Tỷ lệ mẫu sống (%) 0,0f 19,6e 21,6d 33,9c 35,2 a 35,1b 1,32 3,28 0 48 53 81 83 84

(Ghi chú:a ,b, c, d, e và f là các nhóm khác nhau có ý nghĩa theo phương pháp phân

Qua bảng số liệu cho thấy thay đổi thời gian lây nhiễm làm ảnh hưởng đến

tích one-way ANOVA của Tukey HSD, mức ý nghĩa  = 0,05)

hiệu quả chuyển gen. Tăng thời gian lây nhiễm từ 0 phút đến 3 phút hiệu quả chuyển

gen tăng. Tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc tăng từ 0,0% lên 33,9%. Tuy nhiên, khi tiếp

tục tăng thời gian lây nhiễm lên 4 phút hoặc 5 phút, hiệu quả chuyển gen không thay

đổi. Tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc lần lượt là 35,3% và 35,1% không khác biệt so với

công thức lây nhiễm trong 3 phút. Kết quả này có thể lý giải như sau: khi thời gian

tiếp súc không đủ lâu, vi khuẩn dễ dàng bị tách ra khỏi khối mô sẹo khi ta nhấc mẫu

ra khỏi dung dịch.

Khi mẫu để trong dung dịch khoảng 3 phút sẽ đảm bảo đủ thời gian cho vi

khuẩn kịp bám ổn định trên khối mô sẹo. Từ đó hiệu quả chuyển gen được cải thiện.

Tuy nhiên khi tăng thời gian lên 4 hoặc 5 phút không làm thay đổi sự tiếp súc của vi

khuẩn A. tumefaciens với khối mô sẹo. Từ đó không gây lên sự khác biệt giữa công

thức lây nhiễm trong 3 phút với các công thức lây nhiễm lâu hơn trong 4 phút và 5

phút. Thí nghiệm cũng được tiến hành tương tự với giống lúa Bắc thơm số 7.

4.2.2 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen trên giống lúa

Bắc thơm 7

Thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả được thực hiện

trên giống lúa Bắc thơm 7 được trồng khá phổ biến ở Việt Nam. Kết quả được thể

hiện ở bảng 4.4

Bảng 4.4. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen trên

giống Bắc Thơm số 7.

Chỉ tiêu đánh giá sau 14 ngày

Công thức Số mẫu lây nhiễm trung bình Số bắt màu GUS (mẫu)

0 phút (đ/c) 1 phút 2 phút 3 phút 4 phút 5 phút 300 300 300 300 300 300 Số mẫu sống trung bình 0,0 52,0 53,0 83,7 82,0 86,7 Số mẫu chết trung bình 300,0 248,0 247,0 216,3 218,0 213,3 Tỷ lệ mẫu sống (%) 0,0f 17,3e 17,7d 27,9b 27,3 c 28,9a 0 43 43 69 67 69

0,32 LSD0,05

CV% 1,44

(Ghi chú: a, b, c, d, e và f là các nhóm khác nhau có ý nghĩa theo phương pháp phân

tích one-way ANOVA của Tukey HSD ,có mức ý nghĩa  = 0,05).

Kết quả chuyển gen trên giống lúa Bắc thơm 7 có phần thấp hơn so với kết

quả thu được ở giống JO2 ở cùng một mốc thời gian. Mặc dù vậy, số liệu ở bảng 4.2

chỉ ra kết qủa tương tự như kết quả thử nghiệm trên giống lúa JO2 về ảnh hưởng của

thời gian lây nhiễm. Khi tăng thời gian lây nhiễm từ 0 phút đến 3 phút, tỷ lệ sống

tăng từ 0,0% lên đến 27,9%. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng thời gian lây nhiễm không

làm tăng hiệu quả chuyển gene số mẫu chuyển gen ở các công thức này không có sự

sai khác ý nghĩa. Từ kết quả này chỉ ra rằng thời gian lây nhiễm 3 phút là phù hợp

cho chuyển gen vào cây lúa JO2 và Bắc thơm 7. Thời gian lây nhiễm này sẽ được sử

dụng vào các thí nghiệm sau.

4.3. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy hiệu quả chuyển gen

Thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen

được tiến hành trên hai giống lúa JO2 và Bắc thơm 7 sử dụng chủng vi khuẩn A.

tumefaciens EHA105.

4.3.1. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen của giống

J02

Thử nghiệm ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen

của giống lúa JO2 được thể hiện trong bảng 4.5

Bảng 4.5. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen của

giống lúa J02

Chỉ tiêu đánh giá sau 14 ngày

Công thức Số mẫu lây nhiễm trung bình Số bắt màu GUS (mẫu) Tỷ lệ mẫu sống (%)

0 ngày (đ/c) 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày

LSD0,05 CV% 300 300 300 300 300 300 Số mẫu sống trung bình 0,0 32,0 59,0 97,0 92,0 69,3 Số mẫu chết trung bình 300,0 268,0 241,0 203,0 208,0 230,7 0,0f 10,7e 19,7d 32,3a 30,7b 23,1c 1,08 7,64 0 26 48 80 75 57

(Ghi chú: a, b, c, d, e và f là các nhóm khác nhau có ý nghĩa theo phương pháp

phân tích one-way ANOVA của Tukey HSD ,có mức ý nghĩa  = 0,05).

Kết quả trong bảng 4.4 chỉ ra rằng việc thay đổi thời gian đồng nuôi cấy sẽ

làm thay đổi hiệu quả chuyển gen thông qua tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc. Khi tăng

thời gian đồng nuôi cấy từ 0 ngày lên 3 ngày, hiệu quả chuyển gen cũng tăng lên từ

0 đến 32,3%.

Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng thời gian đồng nuôi cấy lên 4 hoặc 5 ngày không

làm tăng hiệu quả chuyển gen. Ngược lại, hiệu quả chuyển gen có phần giảm đi. Thí

nghiệm cũng được thử nghiệm trên giống lúa Bắc thơm 7.

4.3.2. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen của giống

Bắc Thơm số 7

Kết quả thử nghiệm ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả

chuyển gen của giống Bắc thơm 7 được thể hiện trong bảng 4.6.

Bảng 4.6. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen của

giống lúa Bắc Thơm số 7

Chỉ tiêu đánh giá sau 14 ngày

Công thức

Số mẫu đồng nuôi cấy trung bình

0 ngày (đ/c) 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày

Số mẫu chết trung bình 300,0 271,0 247,3 209,7 215,0 233,0

Tỷ lệ mẫu sống trung bình (%) 0,0f 9,7e 17,6d 30,1a 28,3b 22,3c 1,32 3,95

Số bắt màu GUS (mẫu) 0 24 43 74 70 55

300 300 300 300 300 300 LSD0,05 CV%

Số mẫu sống trung bình 0,0 29,0 52,7 90,3 85,0 67,0 (Ghi chú: a, b, c, d, e và f là các nhóm khác nhau có ý nghĩa theo phương pháp

phân tích one-way ANOVA của Tukey HSD ,có mức ý nghĩa  = 0,05).

Kết quả bảng 4.6 chỉ ra tương tự như kết quả thu được trên giống lúa JO2.

Tăng thời gian đồng nuôi cấy từ 1 đến 3 ngày góp phần tăng tỷ lệ mẫu sống từ 9,7%

lên 30,1%. Tiếp tục tăng thời gian đồng nuôi cấy lên 4 ngày không làm thay đổi hiệu

quả chuyển gen. Tuy nhiên, khi tăng thời gian đồng nuôi cấy lên 5 ngày hiệu quả

chuyển gen bắt đầu giảm đi. Kết quả này có thể giải thích như sau: tăng thời gian

đồng nuôi cấy từ 1-3 ngày sẽ làm số lượng vi khuẩn tăng số lượng lên rất nhiêu. Từ

đó, góp phần làm tăng cơ hội để vi khuẩn A. tumefaciens thực hiện quá trình đưa gene

vào vật chủ. Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng thời gian lên thì số lượng vi khuẩn sẽ dần

chết đi và sinh ra độc tố làm ảnh hưởng tiêu cực đến chủng vi khuẩn còn sống, đồng

thời ảnh hưởng đến cả tế bào chuyển gen. Từ đó làm giảm hiệu quả chuyển gen. Kết

hợp kết quả thu được từ thử nghiệm về thời gian đồng nuôi cấy trên hai giống lúa

trên, rút ra thời gian đồng nuôi cấy thích hợp là 3 ngày.

4.4. Ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu quả chuyển gen

Nồng độ chất chọn lọc ảnh hưởng rất nhiều đến sự sàng lọc tế bào chuyển gen

cũng sự tái sinh của chúng. Nếu nồng độ chất chọn lọc thấp ta sẽ thu được nhiều tế

bào sau chuyển gen. Tuy nhiên sẽ rất khó để phân biệt đâu là tế bào mang gen chuyển,

đâu là tế bào không mang gen vì tất cả chúng đều sinh trưởng được trên môi trường

đó. Ngược lại, nếu nồng độ chất chọn lọc quá cao có thể tiêu diệt cả tế bào mang gen

chuyển, từ đó gây khó khăn cho việc tái sinh cây sau chuyển gen. Thí nghiệm về ảnh

hưởng của nồng độ chất chọn lọc được tiến hành trên hai giống lúa JO2 và Bắc thơm

4.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu quả chuyển gen của giống

lúa J02

Kế quả thử nghiệm ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến tỷ lệ tái sinh của

giống lúa JO2 được thể hiện trong bảng 4.6.

Bảng 4.7. Ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu quả chuyển gen của

giống lúa J02

Chỉ tiêu đánh giá sau 14 ngày

Công thức

Số mẫu lây nhiễm trung bình

Số mẫu sống trung bình

Số mẫu chết trung bình

Tỷ lệ mẫu sống trung bình (%)

Số bắt màu GUS (mẫu)

0 mg/l (đ/c) 1 mg/l 3 mg/l 5 mg/l 7 mg/l 9 mg/l 11 mg/l

300 300 300 300 300 300 300

300,0 258,3 142,3 112,3 68,0 43,0 36,0

0,0 41,7 157,7 187,7 232,0 257,0 264,0

100,0a 86,1b 47,4c 37,4d 22,7e 14,3f 12,0g 0,61 2,94

0 4,6 39,3 80,1 95,6 95,3 94,4

LSD0,05 CV%

(Ghi chú: a, b, c, d, e, f và g là các nhóm khác nhau có ý nghĩa theo phương pháp

phân tích one-way ANOVA của Tukey HSD ,có mức ý nghĩa  = 0,05).

Kết quả bảng 4.7 chỉ ra rằng khi tăng nồng độ chất chọn lọc sẽ làm giảm tỷ lệ

sống của mẫu sau chuyển gen từ 100% xuống còn 12%. Đồng thời làm tăng tỷ lệ mẫu

bắt màu GUS từ 0% đến 95.6%. Công thức không bổ sung glufocinat-ammonium

cho số mẫu sống cao nhất 100%. Tuy nhiên tỷ lệ bắt màu GUS lại là thấp nhất 0%.

Trong khi đó, công thức 5mg glufocinat-ammonium/l môi trường cho số mẫu sống

chỉ đạt 37,4% nhưng số mẫu bắt màu GUS đạt cao nhất 80,1 %. Ở các công thức có

nồng độ chất chọn lọc cao hơn, tỷ lệ mẫu sống giảm đi một cách đáng kể từ đó làm

cho số mẫu bắt màu GUS cũng giảm đi theo lần lượt là 65, 41, và 34 mẫu. Thí nghiệm

cũng được tiến hành với giống lúa Bắc thơm 7.

4.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu quả chuyển gen đến giống

lúa Bắc Thơm số 7.

Kết quả thử nghiệm ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến tỷ lệ tái sinh

cây chuyển gen giống lúa Bắc thơm 7 được thể hiện ở bảng 4.8.

Bảng 4.8. Ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu quả chuyển gen đến

giống lúa Bắc Thơm số 7.

Chỉ tiêu đánh giá sau 14 ngày

Công thức Số mẫu lây nhiễm trung bình Số bắt màu GUS (mẫu)

0 mg/l (đ/c) 1 mg/l 3 mg/l 5 mg/l 7 mg/l 9 mg/l 11 mg/l

Số mẫu sống trung bình 300,0 265,3 150,7 108,3 74,0 45,0 35,7 Số mẫu chết trung bình 0,0 34,7 149,3 191,7 226,0 255,0 264,3 Tỷ lệ mẫu sống trung bình (%) 100,0a 88,4b 50,2c 36,1d 24,7e 15,0f 11,9g 0,64 2,88 0 4,9 39,8 79,4 94,6 93,3 95,4 300 300 300 300 300 300 300 LSD0,05 CV%

(Ghi chú: a, b, c, d, e, f và g là các nhóm khác nhau có ý nghĩa theo phương pháp

phân tích one-way ANOVA của Tukey HSD ,có mức ý nghĩa  = 0,05).

Kết quả ở bảng 4.8 chỉ ra tương tự như kết quả thu được với giống lúa JO2.

Khi tăng nồng độ chất chọn lọc làm giám tỷ lệ mẫu sống đồng thời làm tăng tỷ lệ

mẫu nhuộm GUS. Công thức sử dụng 5mg Glufocinate/ lit môi trường cho số mẫu

bắt màu GUS cao nhất 76,4%. Mẫu sống trên môi trường chọn lọc tiếp tục được theo

dõi đến 28 ngày.

Kết quả chỉ ra không có sự khác biệt về tỷ lệ mẫu tái sinh. Kết quả này có thể

giải thích như sau: Glufocinate là một loại thuốc trừ cỏ tự nhiên, nó tác động chính

lên sự sàng lọc tế bào thực vật có chứa gen kháng Glufocinate. Tuy nhiên không ảnh

hưởng đến khả năng tái sinh sư các chất kích thích sinh trưởng.

Phần 5

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.1 Kết luận

Trong khuôn khổ các thí nghiệm nghiên cứu chúng tôi đưa ra một số kết luận

nghiên cứu sau:

- Hai chủng khuẩn A.tumefaciens EHA105 và LBA4404 cho hiệu quả chuyển

gen cao ở cả hai giống lúa thử nghiệm. Tỷ lệ sống sau chọn lọc đạt 33,6 và 29,9 cho

giống lúa J02 và 31,3 và 28,0% 28,0% cho giống lúa Bắc Thơm.

- Thời gian lây nhiễm hiệu quả là 3 phút, khi đó hiệu quả chuyển gen thông

qua môi trường chọn lọc của giống J02 và Bắc Thơm lần lượt là 33,9 và 27,9%

- Thời gian đồng nuôi cấy vi khuẩn A.tumefaciens với tế bào mô sẹo trong 3

ngày cho tỷ lệ chuyển gen cao. Tỷ lệ sống sau chọn lọc lần lượt cho giống J02 và Bắc

Thơm số 7 khi thời gian đồng nuôi cấy 3 ngày đạt lần lượt là 32,3% và 30,1%.

- Nồng độ chất chọn lọc không gây ảnh hưởng đến khả năng chuyển gen của

cả hai giống lúa J02 và Bắc Thơm số 7. Nó góp phần làm tăng hiệu quả sàng lọc tế

bào chuyển gen trên môi trường chọn lọc.

- Nghiên cứu thành công quy trình chuyển gen ở hai giống lúa J02 và Bắc

Thơm số 7.

5.2. Kiến nghị

- Nghiên cứu thêm ảnh hưởng của một số chủng vi khuẩn khác đến khả năng

lây nhiễm của hai giống lúa J02 và Bắc Thơm số 7.

- Nghiên cứu thêm về thời gian đồng nuôi cấy để cho hiệu quả tốt nhất đạt tỉ

lệ thành công cao.

- Nghiên cứu về điều kiện ngoại cảnh( ẩm độ, nhiệt độ,ánh sáng, dinh dưỡng)

đến khả năng sinh trưởng và phát triển của hai giống lúa J02 và Bắc Thơm số 7.

- Nghiên cứu thêm về nồng độ chất chọn lọc đến hiệu quả chuyển gen của hai giống

lúa J02 và Bắc Thơm số 7.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng việt

1. Chu Hoàng Mậu (2005), Cơ sở và phương pháp sinh học phân tử, Nxb Đại học

Sư phạm.

2. Lê Trần Bình (2008), Phát triển cây trồng chuyển gen ở Việt Nam Nxb Khoa học

tự nhiên và công nghệ.

3. Trần Thị Lệ, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Quốc Dũng (2006), Giáo trình công nghệ

gen trong nông nghiệp, Huế .

4. Nguyễn Đức Thành (2003), Chuyển gen vào thực vật, Nhà xuất bản Khoa học và

Kỹ thuật Hà Nội.

5. Hoàng Thị Giang, Mai Đức Chung, Nguyễn Thị Huế, Jérémy Lavarenne,

Mathieu Gonin, Nguyễn Thanh Hải, Đỗ Năng Vịnh, Pascal Gantet (2015) “Hoàn

thiện quy trình chuyển gen cho giống lúa Taichung 65 thông qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens”, tạp chí Khoa học và Phát triển.

6. Vũ Tuyên Hoàng, Trương Văn Kính, Nguyễn Thị Then (1988), “ Kết quả xây

dựng quỹ gen và chọn tạo giống lúa mới”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Nông

nghiệp, (số 11).

7. Nguyễn Trọng Khanh (2016), “Nghiên cứu chọn tạo giống lúa chất lượng tốt

cho vùng đồng bằng sông Hồng”, Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp.

8. Nguyễn Hoàng Lộc (2007), Theo nhập môn công nghệ sinh học, Nhà xuất bản

Đại học Huế.

9. Phan Thị Thu Hiền (2012), "Khả năng tạo callus và tái sinh cây của tập đoàn 31

giống lúa nương miền Bắc Việt Nam phục vụ công tác chuyển gen", Tạp chí

Khoa học và Phát triển, tập 10 (số 4: 567-575).

10. Trịnh Đình Đạt (2006), Công Nghệ Sinh Học Tập 4-Công Nghệ Di Truyền

173 Trang.

Tiếng Anh

11. Chan M.T., Lee T.M., Chang H.H. (1992). Transformation of indica rice (Oryza sativa

L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Physiol., 33: 577-583.

12. Yoshida (1981), Fundamentals of rice crop science, The International rice

research institute, Los Banos, Philippines.

13. Hiei Y., Ohta S., Komari T., Kumashiro T. (1994). Efficient transformation of

rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the

boundaries of the T- DNA. PlantJ.,6:271-282.

14. Jenning P.R, W.R Coffmen and H.E Kauffman (1979), Rice improvement, IRRI,

Los Bnaros, Philippines, pp. 101-102

15. P.D. Hsu, D.A. Scott, J.A.Weinstein, F.A. Ran, S. Konermann, V. Agarwala, Y.

Li, E.J. Fine, X. Wu, O. Shalem (2013), “DNA targeting specificity of RNA-

guided Cas9 nucleases”, Nat. Biotechnol.

16. Koornneef, M., Bade, J., Hanhart, C., Horsman, K., Schel, J., Soppe, W.,

Verkerk, R. & Zabel, P, (1993) Plant J. 3 , 131-141.

17. Cheng M. Fry J.E., S. Pang, I. Zhou, T.W.L. Conner, Y. Wang (1992). “Genetic

transfomation of the wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens”. Plant.

Physiol, 115, pp. 971-980.

18. Zhou H, He M, Li J, Chen L, Huang Z, Zheng S, (2016), Development of

commercial thermo-sensitive genic male sterile rice accelerates hybrid rice

breeding using the CRISPR/Cas9-mediated TMS5 editing system. Sci. Rep.

6:37395.

19. Wang, Y., Cheng, X., Shan, Q., Zhang, Y., Liu, J., Gao, C. et al, (2014)

Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers

heritable resistance to powdery mildew. Nat. Biotechnol. 32, 947–951.

20. Wang F, Wang C, Liu P, Lei P, Hao W, Gao Y, et al. (2016), Enhanced rice blast

resistance by CRISPR/ Cas9-targeted mutagenesis of the ERF transcription factor

gene OsERF922. PLoS One 11:e0154027.

21. Ricroch A, Clairand P, Harwood W, (2017), Use of CRISPR systems in plant

genome editing: toward new opportunities in agriculture. Emerg. Top. Life Sci.1,

169–182.

22. Li Q, Zhang D, Chen M, Liang W, Wei J, Qi Y, et al (2016), Development of

japonica photo-sensitive genic male sterile rice lines by editing carbon starved

anther using CRISPR/Cas9. J. Genet. Genomics 43, 415–419.

23. Huang X.Z, Zeng X.F, Li J.R., Zhao D.G, (2017), Construction and analysis of

tify1a and tify1b mutants in rice (Oryza sativa) based on CRISPR/Cas9

technology. J. Agric. Biotechnol. 25, 1003–1012.

24. Shao G, Xie L, Jiao G, Wei X, Sheng Z, Tang S, et al. (2017), CRISPR/CAS9-

mediated editing of the fragrant gene Badh2 in Rice. Chin. J. Rice Sci. 31, 216–222.

PHẦN PHỤ LỤC: HÌNH ẢNH

Ảnh hưởng vi khuẩn LBA4404 Ảnh hưởng của vi khuẩn EHA105

giống J02) sau 03 ngày (giống Bắc Thơm số 7) sau 03 ngày

Lây nhiễm 3 phút Lây nhiễm 3 phút

(giống Bắc Thơm số 7) sau 07 ngày (giống J02) sau 07 ngày

Đồng lây nhiễm 3 ngày Đồng lây nhiễm 3 ngày

(giống J02) (giống Bắc Thơm số 7)

Khóa luận tốt nghiệp đại học: Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào giống lúa J02 và Bắc Thơm số 7

Chủ đề:

Đồ án môn kỹ thuật y sinh

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ HOA

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHUYỂN GEN

VÀO GIỐNG LÚA J02 VÀ BẮC THƠM SỐ 7

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Lớp

: K48 CNSH

Khoa

: CNSH - CNTP

Khóa học

: 2016 - 2020

Người hướng dẫn

: 1. TS. Bùi Tri Thức

2. TS. Nguyễn Tiến Dũng

THÁI NGUYÊN – NĂM 2020

LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................. i

MỤC LỤC ...................................................................................................................... ii

DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT ...................................................... v

DANH MỤC BẢNG .................................................................................................... vi

DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................... vii

Phần 1. MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1

1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................... 1

1.2 Mục tiêu của đề tài ...................................................................................... 2

1.2.1 Mục tiêu tổng quát ................................................................................... 2

1.2.2 Mục tiêu cụ thể ......................................................................................... 3

1.3 Ý nghĩa khoa học ........................................................................................ 3

Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................. 4

2.1 Giới thiệu về cây lúa ................................................................................... 4

2.1.1 Vai trò của lúa gạo ................................................................................... 4

2.1.2 Giá trị kinh tế và chất lượng dinh dưỡng của cây lúa .............................. 5

2.1.3 Cây trồng biến đổi gen ............................................................................. 7

2.1.4 Các phương pháp - kỹ thuật biến đổi gen (chuyển gen) cây trồng .......... 8

2.1.5 Chỉ thị chọn lọc trong chuyển gen vào thực vật .................................... 13

2.2 Tổng quan tình hình trong nước và trên thế giới ...................................... 14

2.2.1 Tình hình trong nước .............................................................................. 14

2.2.2 Tình hình thế giới ................................................................................... 18

Phần 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 23

3.1 Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu .......................................... 23

3.2 Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 23

3.3 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 24

3.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm ............................................................... 24

3.3.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của chủng vi khuẩn

Agrobacterium ................................................................................................. 25

3.3.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả

chuyển gen ....................................................................................................... 26

3.3.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy ........ 26

3.3.5 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc .......... 27

3.3.6. Phương pháp nhuộm GUS................................................................................. 28

3.3.7. Hoàn thiện quy trình chuyển gen ...................................................................... 28

3.4 Các phương pháp xử lý số liệu .................................................................. 28

Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................... 29

4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chủng khuẩn Agrobacterium ............ 29

4.1.1 Ảnh hưởng của chủng khuẩn đến hiệu quả chuyển gen trên giống lúa JO2 ... 29

4.1.2 Ảnh hưởng của chủng khuẩn đến hiệu quả chuyển gen trên giống lúa

Bắc Thơm .................................................................................................................... 30

4.2. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen ................ 31

4.2.1 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen trên giống lúa JO2

........................................................................................................................................ 31

4.2.2 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen trên giống lúa Bắc

thơm 7 ............................................................................................................................ 32

4.3. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy hiệu quả chuyển gen ................ 33

4.3.1. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen của giống

J02 .................................................................................................................................. 33

4.3.2. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen của giống

Bắc Thơm số 7 .............................................................................................................. 34

4.4. Ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu quả chuyển gen ............ 35

4.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu quả chuyển gen của giống lúa

J02 .................................................................................................................................. 35

4.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu quả chuyển gen đến giống lúa

Bắc Thơm số 7. ............................................................................................................. 36

Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................... 38

5.1 Kết luận ..................................................................................................... 38

5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 38